一株脫氨除臭菌株qdn01及其在生物除臭中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株脫氨除臭菌株QDN01及其在生物除臭中的應(yīng)用。本發(fā)明從草根黑土中篩選出一株脫氨除臭菌株，并對(duì)其生物學(xué)特性及對(duì)雞糞的脫氮情況進(jìn)行了研究。通過(guò)生理生化特性及16SrDNA序列分析，該脫氨除臭菌株被鑒定為霍氏腸桿菌屬(Enterobacter?hormaechei)，命名為Enterobacter?hormaechei?QDN01，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址在武漢大學(xué)，保藏號(hào)為CCTCC?NO:M2013670。研究表明，本發(fā)明分離出的QDN01菌株的生物特性穩(wěn)定，菌株繁殖能力快，特別是在添加了淀粉的雞糞中能夠迅速生長(zhǎng)，生長(zhǎng)量達(dá)到2500億cfu/ml，同時(shí)能夠很好的脫氮除臭，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有很明顯的優(yōu)勢(shì)。因此，本發(fā)明的提出為家禽糞便的無(wú)害化生物處理提供了非?？尚袑?shí)用的技術(shù)方案，具有良好的發(fā)展前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一株脫氨除臭菌株QDN01及其在生物除臭中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種脫氨除臭菌，還涉及該菌株在家禽糞便以及工業(yè)廢水的無(wú)害化生 物處理，特別是對(duì)家禽糞便進(jìn)行脫氨除臭中的應(yīng)用。本發(fā)明屬于生物除臭【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著全球工農(nóng)產(chǎn)品的迅猛發(fā)展，人類(lèi)生活水平的不斷提高，臭氣也隨之從產(chǎn)生的 廢棄物中而來(lái)。惡臭污染是一種感知污染，它所存在的有害氣體直接影響了人們的生活與 身體健康，所以惡臭污染己公認(rèn)為是僅次于噪聲污染的六大公害之一。去除臭氣的方法很 多，而微生物去除臭氣已經(jīng)成為高效，環(huán)保，低耗的手段之一，并且在環(huán)境污染中發(fā)揮出巨 大的潛力。
[0003] 造成惡臭的主要原因是畜禽的糞便通過(guò)發(fā)酵和含硫蛋白分解而產(chǎn)生的氨氣、硫化 氫、甲硫醚、甲烷等有毒有害氣體，并且造成空氣中污染度升高，空氣質(zhì)量下降。為解決這一 問(wèn)題，大量的學(xué)者進(jìn)行了一系列的研究。
[0004] 根據(jù)惡臭氣體凈化方法的特點(diǎn)，可把凈化惡臭污染物的方法分為：（1)物理法，如 掩蔽中和法、擴(kuò)散稀釋法、冷凝法、水吸收法、吸附法；（2)化學(xué)法，如化學(xué)洗滌發(fā)、燃燒法、 氧化法等；（3)生物法，如生物過(guò)濾法、生物吸收法、土壤堆肥法等。
[0005] 生物除臭法是近年來(lái)開(kāi)發(fā)處理惡臭氣體的一種方法，它是利用微生物的生物化學(xué) 作用，將惡臭物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無(wú)臭或少臭的物質(zhì)，以達(dá)到去除臭味的目的。原理是惡臭物質(zhì)首先 被溶于水中，而后被微生物吸附吸收進(jìn)入微生物體內(nèi)，作為其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被分解，從而生成無(wú) 惡臭的物質(zhì)。
[0006] 生物脫臭過(guò)程大致有如下三個(gè)階段：
[0007] -階段，惡臭氣體由氣態(tài)轉(zhuǎn)移至液態(tài)中的過(guò)程，該過(guò)程遵循亨利（Henrry)法則。
[0008] 二階段，惡臭氣體的水溶液被微生物菌群吸附并吸收進(jìn)入生物體內(nèi)，而使惡臭成 分從水中去除，其速度接近一般化學(xué)反應(yīng)的速度。
[0009] 三階段，被微生物菌體攝取的惡臭物質(zhì)，成為微生物的能源，通過(guò)微生物新陳代謝 被分解、利用和變成細(xì)胞物質(zhì)而去除。胺類(lèi)、氨氣等含氮惡臭成分，一部分用于構(gòu)成微生物 菌體蛋白質(zhì)，還有一部分轉(zhuǎn)化為亞硝酸或硝酸。酪酸、苯酚、甲醛等不含氮的被分解為〇) 2和 H20等。含硫類(lèi)的惡臭物質(zhì)由真菌、霉菌與硫氧化細(xì)菌等的作用而被氧化成S、S0廣、S04 2、 成為微生物能量的供給源。生物除臭法可分為生物過(guò)濾法（固著態(tài)）、生物吸收法（懸浮 態(tài)）、土壤堆肥法和生物脫臭劑等。
[0010] 過(guò)濾法原理是使收集到的廢氣在適宜的條件下通過(guò)長(zhǎng)滿細(xì)菌真菌放線菌等微生 物的固體載體（填料），氣味物質(zhì)先被填料吸收，然后被填料上的微物氧化分解為二氧化碳 和水等物質(zhì)，從而完成廢氣的除臭過(guò)程。該方法具有設(shè)備簡(jiǎn)單，運(yùn)行費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)；但是反 應(yīng)條件不易控制，占地面積較大。適用于處理大氣量、低濃度的臭氣。
[0011] 吸收法也稱(chēng)生物洗滌法，是先利用洗滌的方法，將惡臭成份轉(zhuǎn)移到水中，然后再采 用活性污泥進(jìn)行受污染水的微生物處理，有效地吸附分解臭氣成分。該法反應(yīng)條件易控制， 運(yùn)行費(fèi)用低，但是需要提供大量氧氣才能維持高效率運(yùn)行。
[0012] 土壤堆肥法的原材料主要是污泥、糞便、垃圾等物質(zhì)，將其混合后通過(guò)好氧發(fā)酵熱 處理從而抑制臭氣的產(chǎn)生。該法的除臭效率較高，但周期較長(zhǎng)。
[0013] 生物脫臭劑一般是指從污水處理廠的活性污泥中或者土壤中馴化篩選高效的脫 臭微生物用于臭氣的治理。根據(jù)微生物除臭原理而開(kāi)發(fā)的生物制劑是將篩選的高效微生物 固定在某種載體上，當(dāng)惡臭物質(zhì)通過(guò)時(shí)即可達(dá)到脫除的目的
[0014] 養(yǎng)殖業(yè)中危害畜禽正常生長(zhǎng)和影響人類(lèi)健康的主要臭氣成分是NH3和H2S，因此 這兩種氣體常作為養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境污染的主要檢測(cè)指標(biāo)，也是衡量微生物除臭劑效果的重要指 標(biāo)。常見(jiàn)的能利用氨的微生物主要有硝化細(xì)菌等。硝化細(xì)菌（nitrifying bacteria)是無(wú) 機(jī)化能自養(yǎng)型微生物，以〇)2作為碳源合成有機(jī)物質(zhì)，在自然界氮素循環(huán)中起著非常重要的 作用。它們所進(jìn)行的硝化作用能把氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，再把亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為硝酸鹽。將 NH3氧化為Ν(Γ的過(guò)程是氨氧化菌和亞硝酸氧化菌兩類(lèi)細(xì)菌連續(xù)作用的結(jié)果。氨氧化菌把 氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，亞硝酸氧化菌再將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽。這兩類(lèi)細(xì)菌都屬于硝化 桿菌科。硝化細(xì)菌在自然界氮素循環(huán)中起著非常重要的作用。硝化細(xì)菌能夠通過(guò)硝化作用 把氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，再進(jìn)一步把亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為硝酸鹽，是含氮物質(zhì)徹底礦化的重要 步驟，在生態(tài)系統(tǒng)的氮循環(huán)中有著重要的作用。
[0015] 世紀(jì)70年代后，各國(guó)相繼在生物除臭領(lǐng)域開(kāi)展了廣泛的研究，其中的德國(guó)和日本 取得的成果最為顯著。從上世紀(jì)的80年代中期開(kāi)始，針對(duì)特定惡臭污染物的高效脫臭菌被 陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用于實(shí)際的脫臭系統(tǒng)的背景菌群中，可以形成脫臭效率更高的優(yōu)勢(shì)菌群落。目 前對(duì)含硫惡臭治理研究比較多的是日本，日本工業(yè)技術(shù)院微生物技術(shù)研究所發(fā)現(xiàn)的"硫桿 菌屬硫化細(xì)菌ΤΚ-Μ"對(duì)硫類(lèi)惡臭物質(zhì)具有非常強(qiáng)的分解能力。大野勝史利用從土壤中分 離到的對(duì)油脂廢水有較強(qiáng)分解能力的枯草芽孢桿菌，該菌對(duì)油脂的臭味具有較好的抑制效 果，現(xiàn)已經(jīng)制成除臭劑產(chǎn)品。栗田工業(yè)與東京工業(yè)大學(xué)開(kāi)發(fā)利用泥炭作載體的亞硝化胞菌 屬等微生物除臭劑，將此填充與反應(yīng)槽中，可去除硫化氫、氨氣能惡臭成分。日本微生物技 術(shù)研究所將污水廠活性污泥在30?40°C下干燥后粉碎，制成除臭劑，填充至柱管中，當(dāng)硫 化氫、硫醇等惡臭通過(guò)時(shí)可具有很好的去除效果。
[0016] 微生物具有來(lái)源廣泛、繁殖迅速、容易培養(yǎng)、對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng)和易變異等特性， 在一定條件下加以馴化，可以在很多方面都有較好的應(yīng)用前景Paneray等最早于1957年開(kāi) 始"利用土壤微生物處理H2S廢氣"的研究 [94°]，隨后的20型細(xì)胞固定化技術(shù)（如包埋法 等）運(yùn)用到生物處理裝置中，可望使惡臭的治理技術(shù)尤其是生物治理技術(shù)出現(xiàn)突破，這也 是環(huán)保工作者今后努力的一個(gè)方向。
[0017] 本發(fā)明主要通過(guò)選擇性培養(yǎng)馴化出降解氨氮與硝態(tài)氮的菌株，并研究其生物特性 與脫氮除臭的效果，從而提供了一種新的微生物除臭菌劑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 本發(fā)明的目的之一是通過(guò)選擇性培養(yǎng)馴化出能夠有效降解氨氮與硝態(tài)氮的脫氨 除臭菌株；
[0019] 本發(fā)明的目的之二是提供所述的菌株在生物脫臭劑中的應(yīng)用；
[0020] 本發(fā)明的目的之三是提供一種除臭菌劑，其含有如上所述的脫氨除臭菌株；
[0021] 本發(fā)明的目的之四是提供一種對(duì)雞糞進(jìn)行脫氨除臭的方法。
[0022] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)的：
[0023] 本發(fā)明從草根黑土中篩選出一株脫氨除臭菌株，并對(duì)其生物學(xué)特性及對(duì)雞糞的脫 氮情況進(jìn)行了研究。通過(guò)生理生化特性及16SrDNA序列分析，該脫氨除臭菌株被鑒定為霍 氏腸桿菌屬（Enterobacter hormaechei)，命名為 Enterobacter hormaechei QDN01，保藏 在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址在武漢大學(xué)，保藏號(hào)為CCTCC N0:M2013670,保藏日期為 2013年12月17日。
[0024] 本發(fā)明發(fā)明人考察了 QDN01菌株的生長(zhǎng)曲線以及在不同溫度（15°C?40°C )、PH 值（?!1 = 5?9)下菌株的生長(zhǎng)情況，在4811內(nèi)培養(yǎng)基中不同(：/^(15:1?73:1)下菌株的生 長(zhǎng)情況，以及硝化與異養(yǎng)硝化72h菌株對(duì)氨氮與硝基氮的降解情況。研究顯示，QDN01菌株 最適合的生長(zhǎng)溫度為30°C，脫氨菌株最適生長(zhǎng)pH為8左右，培養(yǎng)基C/N不同時(shí)菌株以25:1 生長(zhǎng)為最佳，QDN01菌株培養(yǎng)30-32h時(shí)菌數(shù)量基本穩(wěn)定，對(duì)氨氮的去除率達(dá)到64. 75%，對(duì) 硝基氮的去除率達(dá)到70. 62%。此外，將本發(fā)明的菌株用于雞糞的除臭，結(jié)果表明本發(fā)明分 離出的QDN01菌株在添加了淀粉的雞糞中能夠迅速生長(zhǎng)，生長(zhǎng)量能夠達(dá)到2500億cfu/ml， 同時(shí)能夠很好的對(duì)雞糞進(jìn)行脫氮除臭，相較于現(xiàn)有技術(shù)具有明顯優(yōu)勢(shì)。
[0025] 因此，本發(fā)明還提出了所述的脫氨除臭菌株在生物除臭中的應(yīng)用。
[0026] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的生物除臭包括去除家畜糞便中的異味以及工業(yè)廢水 中的惡臭，更優(yōu)選的，所述家畜糞便為雞糞。
[0027] 為了方便使用，本發(fā)明通過(guò)將含有以上所述的脫氨除臭菌株QDN01的菌液吸附在 膨潤(rùn)土上，同時(shí)添加紅糖后得到了一種生物除臭菌劑。
[0028] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的生物除臭菌劑是通過(guò)將含有以上所述的脫氨除臭菌 株QDN01的菌液吸附在于膨潤(rùn)土上制成1.0X10 12個(gè)（菌）/g的菌制劑，同時(shí)按質(zhì)量比添加 1 %的市售紅糖后得到的。
[0029] 實(shí)踐證明，將所述的除臭菌劑均勻拋灑在養(yǎng)殖籠下方的雞糞排泄處（雞糞用淀粉 調(diào)節(jié)C/N比為20-30/1)，使用量為200g菌劑/kg雞糞淀粉，3天撒施1次，通過(guò)示范點(diǎn)養(yǎng)殖 人員和志愿者進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)感官評(píng)價(jià)，4個(gè)示范點(diǎn)的養(yǎng)殖舍內(nèi)空氣質(zhì)量明顯好轉(zhuǎn)，嗆人的氨臭味 消失，腐臭味降低，志愿者表示能在養(yǎng)殖室內(nèi)停留的時(shí)間延長(zhǎng)了。綜合現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)結(jié)果，該菌 劑能夠有效降低養(yǎng)殖舍內(nèi)的氨氣含量，提升空氣質(zhì)量。同時(shí)針對(duì)示范點(diǎn)雞蛋產(chǎn)量進(jìn)行了 20 天的監(jiān)測(cè)，4個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)施用本發(fā)明的除臭菌劑后，雞蛋產(chǎn)量平均增產(chǎn)4-6%，增產(chǎn)幅度較大， 說(shuō)明雞舍內(nèi)的空氣質(zhì)量提升有利于雞身體狀況的提升，從而提升了雞蛋產(chǎn)量。
[0030] 因此，本發(fā)明提出了所述的生物除臭菌劑在生物除臭中的應(yīng)用。
[0031] 其中，所述的生物除臭包括去除家畜糞便中的異味以及工業(yè)廢水中的惡臭，優(yōu)選 的，所述家畜糞便為雞糞。
[0032] 進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了一種對(duì)雞糞進(jìn)行脫氨除臭的方法，其特征在于包括以 下步驟：
[0033] (1)將含有本發(fā)明所述的脫氨除臭菌株QDN01的菌液吸附在膨潤(rùn)土上，同時(shí)添加 紅糖，得到生物除臭菌劑；
[0034] (2)采用淀粉調(diào)節(jié)雞糞C/N比為20-30:1 ;
[0035] (3)將步驟⑴的除臭菌劑均勻拋灑在經(jīng)步驟⑵處理后的雞糞中，3天撒施1 次；
[0036] (4)評(píng)價(jià)除臭效果。
[0037] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，將含有所述的脫氨除臭菌株QDN01的菌液吸附在于膨潤(rùn)土 上制成1. 0 X 1012個(gè)/g的菌制劑，同時(shí)按質(zhì)量比添加1 %的市售紅糖，得到除臭菌劑。
[0038] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，采用淀粉調(diào)節(jié)雞糞C/N比為25:1，將步驟（1)的除臭菌劑按 照使用量為200g菌劑/m 3(雞糞淀粉）均勻拋灑在經(jīng)步驟（2)處理后的雞糞中。
[0039] 以上研究表明，本發(fā)明分離出的QDN01菌株的生物特性穩(wěn)定，菌株繁殖能力快，脫 氨除臭能力佳，，特別是在添加了淀粉的雞糞中能夠迅速生長(zhǎng)，生長(zhǎng)量達(dá)到2500億cfu/ml， 同時(shí)能夠很好的脫氮除臭，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有很明顯的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明的提出為家禽糞便 的無(wú)害化生物處理提供了非常可行實(shí)用的技術(shù)方案，具有良好的發(fā)展前景。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0040] 圖1為QDN01菌株在N1選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)24h稀釋10-8的菌落形態(tài)；
[0041] 圖2為脫氨除臭菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（矢量圖）；
[0042] 圖3為QDN01菌株的生長(zhǎng)曲線；
[0043] 圖4為溫度對(duì)QDN01菌株生長(zhǎng)的影響；
[0044] 圖5為PH對(duì)QDN01菌株生長(zhǎng)的影響；
[0045] 圖6為C/N對(duì)QDN01菌株生長(zhǎng)的影響；
[0046] 圖7為QDN01菌株在0D600下生長(zhǎng)與脫氨氮的變化情況；
[0047] 圖8為QDN01菌株在0D600下生長(zhǎng)與脫硝態(tài)氮的變化情況；
[0048] 圖9為QDN01菌株在血球計(jì)數(shù)板下觀察到的細(xì)菌個(gè)數(shù)；
[0049] 圖10為在三種不同碳氮比下的雞糞淀粉中PH變化；
[0050] 圖11為加入相同量QDN01菌株在三種不同碳氮比下的雞糞淀粉中PH變化；
[0051] 圖12為不加入QDN01菌株的雞糞淀粉中脫臭效果的比較；
[0052] 圖13為加入QDN01菌株的雞糞淀粉中脫臭效果的比較；
[0053] 圖14為不加入QDN01菌株的雞糞淀粉中銨態(tài)氮含量隨時(shí)間變化；
[0054] 圖15為加入QDN01菌株的雞糞淀粉中銨態(tài)氮含量隨時(shí)間變化；
[0055] 圖16為不加入QDN01菌株的雞糞淀粉中硝態(tài)氮含量隨時(shí)間變化；
[0056] 圖17為加入QDN01菌株的雞糞淀粉中硝態(tài)氮含量隨時(shí)間變化；
[0057] 圖18為QDN01菌株的雞糞淀粉中生長(zhǎng)曲線；
[0058] 圖19為不同QDN01菌株接入量的雞糞淀粉中菌體個(gè)數(shù)變化；
[0059] 圖20為不同QDN01菌株接入量的雞糞淀粉中菌懸液在D600吸收度變化。

【具體實(shí)施方式】
[0060] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0061] 實(shí)施例1脫氨除臭菌株QDN01的分離馴化與鑒定
[0062] 1.材料與方法
[0063] 1· 1培養(yǎng)基
[0064] 含氨富集培養(yǎng)基（Ν1選擇培養(yǎng)基）：蔗糖36. 00g，KH2P042. 00g，MgS040 . 50g， NaC12. 00g，氨水 10. 00ml，F(xiàn)eS040. 10g，1% ZnS045. 0ml，瓊脂 20g，蒸餾水 1000ml，pH = 7. 0， 121°C下滅菌 20min，C/N 為 7:1。
[0065] 液體NH3選擇性培養(yǎng)基（N2培養(yǎng)液）：N1培養(yǎng)基不含瓊脂，C/N為7:1。
[0066] 反硝化培養(yǎng)基（DM 培養(yǎng)基）：C6H5Na307 · 2Η203· 00g，ΚΝ030 · 7210g，ΚΗ2Ρ041· 0g， MgS04 · 7H201.0g，蒸餾水定容至 1000ml，調(diào)節(jié)至 PH = 7.0，121°C 滅菌 20min。
[0067] 異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基：C6H5Na307 · 2H205.0g，（NH4)2S040 . 45g，K2HP040.25g， FeS04 · 7Η200· 0025g，NaC10. 125g，MgS040. 06g，MnS04 ·Η200· 001g，蒸餾水定容至 1000ml，調(diào) 節(jié)至 PH = 7· 0,121°C 滅菌 20min。
[0068] 1. 2脫氨除臭菌株的分離馴化
[0069] 取濕地中含氧量較高的草根黑土（Jennifer G. Allen, Marc W. Beutel, Douglas R. Call, et al. Effects of oxygenation on ammonia oxidation potential and microbial diversity in sediment from surface-flow wetland mesocosms[J]. Bioresource Technology, 2010, 101 (4) : 1389-1392.) lOOg 與 500ml 蒸饋水放入 1000ml 維 形瓶中150r/mim，振蕩lh，靜止；將50ml上清液放入150ml N2培養(yǎng)液中，130r/min，30°C恒 溫振蕩3d ;再取10ml渾濁液直接加入190ml的N2培養(yǎng)液中，每3d重復(fù)一次，反復(fù)8次。得 富集的菌液用移液槍取lml稀釋到10'10'10'ΚΓ 9分別取0. lml涂布于N1選擇培養(yǎng)基 上，30°C恒溫培養(yǎng)48h，選擇形貌不同的單一菌落進(jìn)行反復(fù)的馴化培養(yǎng)。
[0070] 1. 3菌株形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察
[0071] 在N1選擇培養(yǎng)基上觀察菌落的形態(tài)、邊緣、顏色、透明度等，并采用番紅染色法在 光學(xué)顯微鏡下拍照觀察菌體的形態(tài)和大小。
[0072] 1. 4生理生化試驗(yàn)
[0073] 采用革蘭氏染色，甲基紅試驗(yàn)，V-P實(shí)驗(yàn)，吲哚試驗(yàn)，H2S產(chǎn)生試驗(yàn)，賴(lài)氨酸脫羧酸， 精氨酸雙水解酶，氧化酶試驗(yàn)，葡萄糖產(chǎn)酸，乙酸鹽利用，檸檬酸鹽，苯丙氨酸脫氨酶，明膠 液化試驗(yàn)，脲酶水解試驗(yàn)，氧化-發(fā)酵試驗(yàn)，鳥(niǎo)酸氨脫羧酶，芽孢染色，葡萄糖產(chǎn)氣，硝酸鹽 還原，運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)，丙二酸試驗(yàn)等對(duì)脫氨除臭菌進(jìn)行生理生化鑒定。具體實(shí)驗(yàn)方法參照《伯 杰細(xì)菌手冊(cè)》第八版。
[0074] 1. 5菌株16SrDNA的序列分析
[0075] 取對(duì)數(shù)期的菌液，離心后收集菌體，提取基因組總DNA，根據(jù)細(xì)菌16SrDNA 的序列設(shè)計(jì)以及合成引物，正向引物：5' -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，反向引物： 5，-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3，。PCR 反應(yīng)體系：10XEx Taq buffer2.0yl，2.5mM dNTP Mixl.6 μ 1,5p Primer1 0.8 μ 1,5p Primer2 0.8 μ 1, TemplateO. 5 μ 1,5u Ex TaqO. 2 μ 1, ddH2014. 1 μ 1，Total volume20y 1。PCR 反應(yīng)條件：95°C變性 5min 后進(jìn)入循環(huán)：95°C 30s -55°C30s -72°C 1.5min -72°C 10min，共24個(gè)循環(huán)；最后在10°C下退火基因擴(kuò)增的 產(chǎn)物經(jīng)純化后由上海美吉生物公司測(cè)序，將所得的序列與Genbank中核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的 16SrDNA序列建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行相似性比對(duì)分析。
[0076] 1. 6環(huán)境條件對(duì)脫氨除臭菌株生長(zhǎng)的影響
[0077] 1. 6. 1脫氨除臭菌株的生長(zhǎng)曲線：取新鮮培養(yǎng)的菌體種子液2ml轉(zhuǎn)接于98ml的N2 液體培養(yǎng)基中，30°C恒溫振蕩（130r/min)，分別在 0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、 26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48h 波長(zhǎng) 600nm 下測(cè)定菌株生長(zhǎng)的 0D 值，以 0D 值的 變化研究菌株的生長(zhǎng)情況。
[0078] 1. 6. 2溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響：取新鮮培養(yǎng)的菌體種子液2ml轉(zhuǎn)接于98ml的N2液 體培養(yǎng)基中，分別置于15、20、25、30、35、401：溫度下振蕩（13017^11)培養(yǎng)2411后，于60011111 波長(zhǎng)處測(cè)定菌體的光密度值（〇D_nm)，以研究溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。
[0079] 1. 6. 3pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響：取新鮮培養(yǎng)的菌體種子液2ml轉(zhuǎn)接于98ml的N2液 體培養(yǎng)基中，分別置于pH為7、7· 5、8、8· 5、9下振蕩（130r/min)培養(yǎng)24h后，于600nm波長(zhǎng) 處測(cè)定菌體的光密度值（〇D_nm)，以研究PH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。
[0080] 1. 6. 4C/N對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響：通過(guò)改變蔗糖和氨水的加入量，調(diào)整N2培養(yǎng)基的 C/N分別為15、25、35、46、54、64、73,取新鮮培養(yǎng)的菌體種子液2ml轉(zhuǎn)接于98ml C/N分別 為15、25、35、46、54、64、73的吧液體培養(yǎng)基中，振蕩（13〇1'/11^11)培養(yǎng)4811，每411于波長(zhǎng)為 600nm處測(cè)定菌體的光密度值（0D 6CI(lnm)，以研究C/N對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。
[0081] 1.7菌株的脫氮性能測(cè)定
[0082] 1. 7. 1脫氨基氮的性能測(cè)定：取新鮮培養(yǎng)的菌體種子液2ml接于98ml的異養(yǎng)硝化 培養(yǎng)基中，130r/min，30°C恒溫培養(yǎng)96h，每6h取2ml于600nm波長(zhǎng)處測(cè)定菌體的光密度值 (0D_nm)，再將樣品4000r/min離心lOmin，取上清液用納氏試劑分光光度法（HJ535-2009， 水質(zhì)氨氮的測(cè)定納氏試劑分光光度法[S])，在波長(zhǎng)420nm下檢測(cè)溶液中氨氮的含量。
[0083] 1.7. 2脫硝基氮的性能測(cè)定：取新鮮培養(yǎng)的菌體種子液2ml接于98ml DM培 養(yǎng)基中，130r/min，30°C恒溫培養(yǎng)96h，每6h取2ml于600nm波長(zhǎng)處測(cè)定菌體的光密度 值（OD_nm)，再將樣品4000r/min離心lOmin，取上清液用紫外分光光度法（陜紅，張 慶忠，張曉娟，等，保存、分析方法等因素對(duì)土壤中硝態(tài)氮測(cè)定的影響[J].分析測(cè)試學(xué) 報(bào)，2013, 32 (12) : 1466-1471.)在波長(zhǎng)210nm下檢測(cè)溶液中硝基氮的含量。
[0084] 2.結(jié)果
[0085] 2. 1QDN01菌株的分離及馴化分析
[0086] 本發(fā)明運(yùn)用草根黑土進(jìn)行篩選菌株，目的是避免與糞便篩選出有同樣功能的病原 菌。通過(guò)選擇性培養(yǎng)基的富集與培養(yǎng)，并通過(guò)硼酸吸收滴定法（吳鵬鳴.環(huán)境空氣質(zhì)量保 證手冊(cè)[M].中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社，1989:184-211)篩選出脫氨效果最好的單一菌株并做進(jìn) 一步試驗(yàn)。
[0087] 2. 2脫氨除臭菌株形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察及生理生化試驗(yàn)
[0088] 由圖1可知，該單一菌株直徑為2?3mm，乳白色，呈橢圓形，表面光滑，隆起，半透 明，無(wú)滲出物，革蘭氏染色為陰性，桿狀。生理生化鑒定結(jié)果如下：
[0089] 表1脫氨除臭菌的生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果
[0090]

【權(quán)利要求】
1. 一種脫氨除臭菌株，命名為Enterobacter hormaechei QDN01，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng) 物保藏中心，其保藏號(hào)為CCTCC N0:M2013670。
2. 權(quán)利要求1所述的脫氨除臭菌株在生物除臭中的應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的生物除臭包括去除家畜糞便中的異味 以及工業(yè)廢水中的惡臭，優(yōu)選的，所述家畜糞便為雞糞。
4. 一種生物除臭菌劑，其特征在于是通過(guò)將含有權(quán)利要求1所述的脫氨除臭菌株的菌 液吸附在膨潤(rùn)土上，同時(shí)添加紅糖后得到的。
5. 如權(quán)利要求4所述的生物除臭菌劑，其特征在于是將含有權(quán)利要求1所述的脫氨除 臭菌株的菌液吸附在于膨潤(rùn)土上制成1. 0X 1〇12個(gè)/g的菌制劑，同時(shí)按質(zhì)量比添加1 %的 市售紅糖，得到除臭菌劑。
6. 權(quán)利要求4或5所述的生物除臭菌劑在生物除臭中的應(yīng)用。
7. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的生物除臭包括去除家畜糞便中的異味 以及工業(yè)廢水中的惡臭，優(yōu)選的，所述家畜糞便為雞糞。
8. -種對(duì)雞糞進(jìn)行脫氨除臭的方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 將含有權(quán)利要求1所述的脫氨除臭菌株的菌液吸附在膨潤(rùn)土上，同時(shí)添加紅糖，得 到生物除臭菌劑； (2) 采用淀粉調(diào)節(jié)雞糞C/N比為20-30:1 ; (3) 將步驟（1)的除臭菌劑均勻拋灑在經(jīng)步驟（2)處理后的雞糞中，3天撒施1次； (4) 評(píng)價(jià)除臭效果。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于將含有權(quán)利要求1所述的脫氨除臭菌株的菌 液吸附在于膨潤(rùn)土上制成1. 0 X 1〇12個(gè)/g的菌制劑，同時(shí)按質(zhì)量比添加1 %的市售紅糖，得 到除臭菌劑。
10. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于采用淀粉調(diào)節(jié)雞糞C/N比為25:1，將步驟 (1)的除臭菌劑按照使用量為200g菌劑/m 3均勻拋灑在經(jīng)步驟（2)處理后的雞糞中。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104152375SQ201410344493
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月18日
【發(fā)明者】王志剛, 田險(xiǎn)峰, 徐偉慧, 尚明慧, 鄭永杰 申請(qǐng)人:齊齊哈爾大學(xué), 黑龍江田雨綠色農(nóng)業(yè)工程有限公司