提高產(chǎn)率和純度的提取純化根系邊緣細(xì)胞的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種根系邊緣細(xì)胞提取純化的方法；特別是一種提高產(chǎn)率和純度的提取純化根系邊緣細(xì)胞的方法。采用懸空法培養(yǎng)RBCs：當(dāng)初生根的長(zhǎng)度為0.5-4厘米時(shí)，對(duì)RBCs進(jìn)行提取和純化；將泡沫板漂浮在盛有干凈水的超聲波清洗機(jī)中，室溫條件下超聲30-60秒；取出離心管，拿出幼苗植株，離心管底部有白色的沉積物，就是提取到的RBCs；將提取到RBCs的離心管用pH5.5-6.2的磷酸緩沖液配平，離心2-5分鐘，去除上清液；然后用磷酸緩沖液100-200微升懸浮離心管底部的沉積物；該懸浮混合液即為純化的RBCs的溶液。本方法獲得的RBCs數(shù)量高過(guò)現(xiàn)有技術(shù)獲得RBCs數(shù)量的30-50%，RBCs純度高。
【專(zhuān)利說(shuō)明】提高產(chǎn)率和純度的提取純化根系邊緣細(xì)胞的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種根系邊緣細(xì)胞提取純化的方法；特別是一種提高產(chǎn)率和純度的提 取純化根系邊緣細(xì)胞的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 根系邊緣細(xì)胞（root border cells, RBCs)，以前也被學(xué)者稱(chēng)為"根冠脫落細(xì)胞"， 指的是起源于根冠分生組織，由水溶性多糖將其和根尖表皮粘連，當(dāng)根尖浸入水中時(shí)能快 速脫離根尖表皮的一類(lèi)細(xì)胞。這類(lèi)細(xì)胞具有特殊的生理活性和生物學(xué)意義。過(guò)去，人們普 遍認(rèn)為RBCs沒(méi)有活性，只把它作為根系的一個(gè)結(jié)構(gòu)和功能的組分。后來(lái)人們研究發(fā)現(xiàn)，多 數(shù)物種的RBCs脫離母體前的存活率超過(guò)90%，水培的玉米和豌豆的RBCs能存活3個(gè)月以 上，大田中玉米的RBCs的活力也不低于7天。當(dāng)RBCs脫離母體后，生理代謝活動(dòng)發(fā)生了顯 著的改變，在mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)組合成上明顯不同于普通的根系體細(xì)胞，并產(chǎn)生特異的代 謝產(chǎn)物，如抗生素、花青素、根瘤菌誘導(dǎo)的過(guò)氧化物酶和低pH牛乳糖酶等，這些特異性的物 質(zhì)則存在于根系和土壤之間，起到幫助植物根系抵御生物和非生物脅迫的作用。
[0003] 近年來(lái)的研究表明，RBCs能夠保護(hù)根尖免受Al3+毒害、Fe2+毒害、Na+毒害，自毒物 質(zhì)、寄生線(xiàn)蟲(chóng)、致病細(xì)菌、真菌攻擊或者高濃度的二氧化碳的危害。因此具有較多數(shù)目和活 率的RBCs的植物具有較強(qiáng)的抵御外界不良環(huán)境的能力和對(duì)逆境的適應(yīng)能力。所以研究植 物RBCs的數(shù)目和活性也是目前的研究熱點(diǎn)。RBCs的數(shù)目和提取方法有關(guān)，目前主要采用懸 空培養(yǎng)的方法培養(yǎng)RBCs，然后將數(shù)個(gè)根尖浸入盛有水的塑料管中，輕輕搖動(dòng)以提取RBCs。 采用該方法獲得的RBCs數(shù)量少，工作量大，效率低，并且RBCs的純度較低。因此，尋求一種 大量提取和純化RBCs的方法是非常必要的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)率和純度能夠提高的提取純化根系邊緣細(xì)胞的方 法。
[0005] 本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種提高產(chǎn)率和純度的提取純化根系邊緣細(xì)胞的方法，按如下步驟進(jìn)行： (1) RBCs的培養(yǎng)： 采用懸空法培養(yǎng)RBCs :將鐵絲圓環(huán)固定于400-1000毫升的燒杯中，底部盛有50-200 ml無(wú)菌水，將穿孔濾紙置于鐵絲圓環(huán)上；之后把露白種子播于穿孔濾紙上，封口后于 23-27 °C培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)；為了使初生根保持濕潤(rùn)，每1-2小時(shí)對(duì)根尖噴施pH 5. 5-6. 2的 磷酸緩沖液，當(dāng)初生根的長(zhǎng)度為〇. 5-4厘米時(shí)，對(duì)RBCs進(jìn)行提取和純化； (2) RBCs的提?。?取長(zhǎng)度在〇. 5-4厘米初生根的幼苗5-15株，置入盛有100-200微升pH 5. 5-6. 2的磷 酸緩沖液的離心管中，之后將離心管固定在〇. 5±0. 2厘米厚度的泡沫板上，離心管底部透 過(guò)泡沫板并暴露在空氣中的長(zhǎng)度至少〇. 5厘米；將泡沫板漂浮在盛有干凈水的超聲波清洗 機(jī)中，室溫條件下超聲30-60秒；取出離心管，拿出幼苗植株，離心管底部有白色的沉積物， 就是提取到的RBCs ; (3)RBCs的純化： 將提取到RBCs的離心管用pH 5. 5-6. 2的磷酸緩沖液配平，普通離心機(jī)100-400 g離 心2-5分鐘，去除上清液；然后用相同的磷酸緩沖液500-1000微升懸浮離心管底部的沉積 物；然后將200-500微升離心管中的懸浮液混合物轉(zhuǎn)移到5-10毫升的離心管中，再將質(zhì)量 比為30-40%的蔗糖水溶液5-9毫升用注射器緩慢注入到5-10毫升的離心管底部，用pH 5. 5-6. 2的磷酸緩沖液配平，室溫下普通離心機(jī)100-400 g離心2-5分鐘；取出離心管，離心 管底部和中間均有沉積物，底部的沉積物是破碎的細(xì)胞壁，中間的沉積物為RBCs，將5-10 毫升的離心管中間的沉積物轉(zhuǎn)移到100-200微升的離心管中，pH 5. 5-6. 2的磷酸緩沖液配 平，普通離心機(jī)100-400 g離心2-5分鐘，去除上清液；然后用相同的磷酸緩沖液100-200 微升懸浮離心管底部的沉積物；該懸浮混合液即為純化的RBCs的溶液。
[0006] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：采用本方法獲得的RBCs分散度高，基本上都 是一個(gè)個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞。采用傳統(tǒng)的方法獲得的RBCs分散度低，很多細(xì)胞粘連在一起，不方 便科學(xué)研究。本方法獲得的RBCs數(shù)量高過(guò)現(xiàn)有技術(shù)獲得RBCs數(shù)量的30-50%，能為科學(xué)研 究提供足量的RBCs。本方法獲得的RBCs純度高，鏡檢沒(méi)有發(fā)現(xiàn)破碎的細(xì)胞及雜質(zhì)；而傳統(tǒng) 方法獲得的RBCs有較多的破碎細(xì)胞且雜質(zhì)較多。
[0007] 本發(fā)明的優(yōu)選方案是： 將直徑1-2毫米的細(xì)鐵絲纏上塑料膠帶或塑料薄膜，在鐵絲起端1-3厘米處折成直 角，之后以直角為圓心，直徑由小到大繞2-5圈做成鐵絲圓環(huán)；用橡皮筋將鐵絲圓環(huán)固定于 400-1000暈升的燒杯中。
[0008] 將直徑1. 0毫米的細(xì)鐵絲纏上塑料膠帶，在鐵絲起端2厘米處折成直角，之后以直 角為圓心，直徑由小到大繞3圈做成鐵絲圓環(huán)，用橡皮筋將鐵絲圓環(huán)固定于1000毫升的燒 杯中，底部盛有100 ml無(wú)菌水，將穿孔濾紙置于鐵絲圓環(huán)上，之后把20粒露白的黃瓜種子 播于穿孔濾紙上，用塑料薄膜和橡皮筋封口于25°C培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，，每1小時(shí)對(duì)根尖噴 施pH 6. 0的磷酸緩沖液，，當(dāng)初生根的長(zhǎng)度為2. 5厘米時(shí)，對(duì)RBCs進(jìn)行提取和純化； 取長(zhǎng)有2. 5厘米初生根的幼苗10株，置入盛有100微升pH6. 0的磷酸緩沖液的離心管 中，離心管容量500微升，之后將離心管固定在0. 5厘米厚度的泡沫板上，塑料管底部露出 1. 0厘米；將泡沫板漂浮在盛有干凈水的超聲波清洗機(jī)中，室溫條件下超聲50秒取出離心 管，拿出幼苗植株，離心管底部有白色的沉積物，就是提取到的RBCs ; 將提取到RBCs的離心管用pH 6. 0的磷酸緩沖液配平，低速離心機(jī)200 g離心5分鐘， 去除上清液；然后用pH 6. 0的磷酸緩沖液500微升懸浮離心管底部的沉積物；再將500微 升離心管中的懸浮液混合物轉(zhuǎn)移到10毫升的離心管中，再將36%質(zhì)量比的蔗糖水溶液8毫 升用注射器緩慢注入到10毫升的離心管底部，用pH 6. 0的磷酸緩沖液配平，室溫下普通離 心機(jī)200 g離心5分鐘；取出離心管，離心管底部和中間均有沉積物，底部的沉積物是破碎 的細(xì)胞壁，中間的沉積物為RBCs，將10毫升的離心管中間的沉積物轉(zhuǎn)移到200微升的離心 管中，pH 6. 0的磷酸緩沖液配平普通離心機(jī)200 g離心5分鐘，去除上清液；然后用相同的 磷酸緩沖液100微升懸浮離心管底部的沉積物；該懸浮混合液即為純化的RBCs的溶液。

【具體實(shí)施方式】
[0009] 下面實(shí)施例詳述本發(fā)明： 實(shí)施例1 : 采用懸空法培養(yǎng)黃瓜幼苗RBCs。將直徑1. 0毫米的細(xì)鐵絲纏上塑料膠帶，在鐵絲起端 2厘米處折成直角，之后以直角為圓心，直徑由小到大繞3圈做成鐵絲圓環(huán)。用橡皮筋將鐵 絲圓環(huán)固定于1000毫升的燒杯中，底部盛有100 ml無(wú)菌水，將穿孔濾紙置于鐵絲圓環(huán)上。 之后把20粒露白的黃瓜種子播于穿孔濾紙上，用塑料薄膜和橡皮筋封口于25°C培養(yǎng)箱中 黑暗培養(yǎng)。為了使初生根保持濕潤(rùn)，每1小時(shí)對(duì)根尖噴施pH 6.0的磷酸緩沖液，以根尖不 積聚液滴為宜。當(dāng)初生根的長(zhǎng)度為2. 5厘米時(shí)，對(duì)RBCs進(jìn)行提取和純化。 取長(zhǎng)有2. 5厘米初生根的幼苗10株，置入盛有100微升pH6. 0的磷酸緩沖液的離心管 (離心管容量500微升)中，之后將離心管固定在0. 5厘米厚度的泡沫板上，塑料管底部露出 1. 0厘米。將泡沫板漂浮在盛有干凈水的DL-360A超聲波清洗機(jī)中，室溫條件下超聲50秒。 取出離心管，拿出幼苗植株，離心管底部有大量白色的沉積物，就是提取到的RBCs。
[0010] 將提取到RBCs的離心管用pH 6. 0的磷酸緩沖液配平，TDZ4-WS型低速離心機(jī)200 g離心5分鐘，去除上清液。然后用pH 6. 0的磷酸緩沖液500微升懸浮離心管底部的沉積 物。然后將500微升離心管中的懸浮液混合物轉(zhuǎn)移到10毫升的離心管中，再將質(zhì)量比是 36%的蔗糖水溶液8毫升用注射器緩慢注入到10毫升的離心管底部，用pH 6. 0的磷酸緩 沖液配平，室溫下普通離心機(jī)200 g離心5分鐘。取出離心管，離心管底部和中間均有一些 沉積物，底部的沉積物是破碎的細(xì)胞壁，種間的沉積物為RBCs，將10毫升的離心管中間的 沉積物轉(zhuǎn)移到200微升的離心管中，pH 6. 0的磷酸緩沖液配平普通離心機(jī)200 g離心5分 鐘，去除上清液。然后用相同的磷酸緩沖液100微升懸浮離心管底部的沉積物。該懸浮混 合液即為純化的RBCs的溶液，可用于RBCs性質(zhì)的測(cè)定及相關(guān)的科學(xué)研究試驗(yàn)。
[0011] 獲得的黃瓜幼苗RBCs經(jīng)過(guò)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)和采用雙醋酸熒光素（FDA)-碘化丙 啶（PI)雙色熒光法計(jì)算RBCs的活性。發(fā)現(xiàn)每株幼苗產(chǎn)生約7000個(gè)RBCs，其活性為98%， 且沒(méi)有破碎的細(xì)胞及其它雜質(zhì)；而現(xiàn)有技術(shù)獲得的每株黃瓜幼苗的RBCs為5000個(gè)，活性為 95%，鏡檢發(fā)現(xiàn)視野里有較多的破碎細(xì)胞和根系組織。所以本方法獲得的RBCs無(wú)論是單株 植株的產(chǎn)率還是活性均高于現(xiàn)有技術(shù)獲得的RBCs，具有明顯的優(yōu)勢(shì)。
[0012] 和現(xiàn)有的技術(shù)比較，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下： 1、采用本方法獲得的RBCs分散度高，基本上都是一個(gè)個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞。采用傳統(tǒng)的方法 獲得的RBCs分散度低，很多細(xì)胞粘連在一起，不方便科學(xué)研究。
[0013] 2、本方法獲得的RBCs數(shù)量高過(guò)現(xiàn)有技術(shù)獲得RBCs數(shù)量的30-50%，能為科學(xué)研究 提供足量的RBCs。
[0014] 3、本方法獲得的RBCs純度高，鏡檢沒(méi)有發(fā)現(xiàn)破碎的細(xì)胞及雜質(zhì)；而傳統(tǒng)方法獲得 的RBCs有較多的破碎細(xì)胞且雜質(zhì)較多。
【權(quán)利要求】
1. 一種提高產(chǎn)率和純度的提取純化根系邊緣細(xì)胞的方法，按如下步驟進(jìn)行： (1) RBCs的培養(yǎng) 采用懸空法培養(yǎng)RBCs :將鐵絲圓環(huán)固定于400-1000毫升的燒杯中，底部盛有50-200 ml無(wú)菌水，將穿孔濾紙置于鐵絲圓環(huán)上；之后把露白種子播于穿孔濾紙上，封口后于 23-27 °C培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)；為了使初生根保持濕潤(rùn)，每1-2小時(shí)對(duì)根尖噴施pH 5. 5-6. 2的 磷酸緩沖液，當(dāng)初生根的長(zhǎng)度為〇. 5-4厘米時(shí)，對(duì)RBCs進(jìn)行提取和純化； (2) RBCs的提?。? 取長(zhǎng)度在〇. 5-4厘米初生根的幼苗5-15株，置入盛有100-200微升pH 5. 5-6. 2的磷 酸緩沖液的離心管中，之后將離心管固定在〇. 5±0. 2厘米厚度的泡沫板上，離心管底部透 過(guò)泡沫板并暴露在空氣中的長(zhǎng)度至少〇. 5厘米；將泡沫板漂浮在盛有干凈水的超聲波清洗 機(jī)中，室溫條件下超聲30-60秒；取出離心管，拿出幼苗植株，離心管底部有白色的沉積物， 就是提取到的RBCs ; (3) RBCs的純化： 將提取到RBCs的離心管用pH 5. 5-6. 2的磷酸緩沖液配平，普通離心機(jī)100-400 g離 心2-5分鐘，去除上清液；然后用相同的磷酸緩沖液500-1000微升懸浮離心管底部的沉積 物；然后將200-500微升離心管中的懸浮液混合物轉(zhuǎn)移到5-10毫升的離心管中，再將質(zhì)量 比為30-40%的蔗糖水溶液5-9毫升用注射器緩慢注入到5-10毫升的離心管底部，用pH 5. 5-6. 2的磷酸緩沖液配平，室溫下普通離心機(jī)100-400 g離心2-5分鐘；取出離心管，離心 管底部和中間均有沉積物，底部的沉積物是破碎的細(xì)胞壁，中間的沉積物為RBCs，將5-10 毫升的離心管中間的沉積物轉(zhuǎn)移到100-200微升的離心管中，pH 5. 5-6. 2的磷酸緩沖液配 平，普通離心機(jī)100-400 g離心2-5分鐘，去除上清液；然后用相同的磷酸緩沖液100-200 微升懸浮離心管底部的沉積物；該懸浮混合液即為純化的RBCs的溶液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高產(chǎn)率和純度的提取純化根系邊緣細(xì)胞的方法，其特征 在于：將直徑1-2毫米的細(xì)鐵絲纏上塑料膠帶或塑料薄膜，在鐵絲起端1-3厘米處折成直 角，之后以直角為圓心，直徑由小到大繞2-5圈做成鐵絲圓環(huán)；用橡皮筋將鐵絲圓環(huán)固定于 400-1000暈升的燒杯中。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高產(chǎn)率和純度的提取純化根系邊緣細(xì)胞的方法，其特征 在于：將直徑1. 〇毫米的細(xì)鐵絲纏上塑料膠帶，在鐵絲起端2厘米處折成直角，之后以直角 為圓心，直徑由小到大繞3圈做成鐵絲圓環(huán)，用橡皮筋將鐵絲圓環(huán)固定于1000毫升的燒杯 中，底部盛有100 ml無(wú)菌水，將穿孔濾紙置于鐵絲圓環(huán)上，之后把20粒露白的黃瓜種子播 于穿孔濾紙上，用塑料薄膜和橡皮筋封口于25°C培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，，每1小時(shí)對(duì)根尖噴施 pH 6. 0的磷酸緩沖液，，當(dāng)初生根的長(zhǎng)度為2. 5厘米時(shí)，對(duì)RBCs進(jìn)行提取和純化； 取長(zhǎng)有2. 5厘米初生根的幼苗10株，置入盛有100微升pH6. 0的磷酸緩沖液的離心管 中，離心管容量500微升，之后將離心管固定在0. 5厘米厚度的泡沫板上，塑料管底部露出 1. 0厘米；將泡沫板漂浮在盛有干凈水的超聲波清洗機(jī)中，室溫條件下超聲50秒取出離心 管，拿出幼苗植株，離心管底部有白色的沉積物，就是提取到的RBCs ; 將提取到RBCs的離心管用pH 6. 0的磷酸緩沖液配平，低速離心機(jī)200 g離心5分鐘， 去除上清液；然后用pH 6. 0的磷酸緩沖液500微升懸浮離心管底部的沉積物；再將500微 升離心管中的懸浮液混合物轉(zhuǎn)移到10毫升的離心管中，再將36%質(zhì)量比的蔗糖水溶液8毫 升用注射器緩慢注入到10毫升的離心管底部，用pH 6. 0的磷酸緩沖液配平，室溫下普通離 心機(jī)200 g離心5分鐘；取出離心管，離心管底部和中間均有沉積物，底部的沉積物是破碎 的細(xì)胞壁，中間的沉積物為RBCs，將10毫升的離心管中間的沉積物轉(zhuǎn)移到200微升的離心 管中，pH 6. 0的磷酸緩沖液配平普通離心機(jī)200 g離心5分鐘，去除上清液；然后用相同的 磷酸緩沖液100微升懸浮離心管底部的沉積物；該懸浮混合液即為純化的RBCs的溶液。
【文檔編號(hào)】C12N5/04GK104195096SQ201410358583
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年7月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月26日
【發(fā)明者】喬永旭, 張永平, 陳超 申請(qǐng)人:唐山師范學(xué)院