寄生曲霉及其在亞硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶基因和基因工程菌制備中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種寄生曲霉及其在亞硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶基因和含有亞硝酸鹽還原酶的基因工程菌制備中的應(yīng)用，寄生曲霉的保藏編號(hào)為CCTCC M2013662。本發(fā)明提供一種高效低能耗、對(duì)亞硝酸鹽降解效果好、降解快速可靠的寄生曲霉。并且該寄生曲霉可在亞硝酸鹽還原酶制備、亞硝酸鹽還原酶基因制備及含有亞硝酸鹽還原酶的基因工程菌制備中有良好應(yīng)用。
CCTCC NO:M2013662
2013.12.11
【專(zhuān)利說(shuō)明】寄生曲霉及其在亞硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶基因和 基因工程菌制備中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種曲霉及其應(yīng)用，尤其涉及一種寄生曲霉，以 及該寄生曲霉在亞硝酸鹽還原酶制備、亞硝酸鹽還原酶基因制備及含有亞硝酸鹽還原酶的 基因工程菌制備中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 亞硝酸鹽是自然界中最常見(jiàn)的含氮化合物之一，其來(lái)源也十分廣泛，亞硝酸鹽是 一種有害的化學(xué)物質(zhì)，亞硝酸鹽與人體血液作用，形成高鐵血紅蛋白，從而使血液失去攜氧 功能，使人缺氧中毒，輕者頭昏、心悸、嘔吐、口唇青紫，重者神志不清、抽搐、呼吸急促，搶救 不及時(shí)可危及生命。不僅如此，亞硝酸鹽在人體內(nèi)還可與仲胺類(lèi)作用形成亞硝胺類(lèi)，后者在 人體內(nèi)達(dá)到一定劑量時(shí)是致癌、致畸、致突變的物質(zhì)，可嚴(yán)重危害人體健康。
[0003] 隨著我國(guó)水產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展,養(yǎng)殖密度和規(guī)模逐漸增大,養(yǎng)殖水的水質(zhì)污染也隨 之加重，其中亞硝酸鹽含量過(guò)高是水質(zhì)污染的主要因素之一，因?yàn)閬喯跛猁}的含量超標(biāo)會(huì) 嚴(yán)重危害魚(yú)類(lèi)等水產(chǎn)動(dòng)物的正常生長(zhǎng)。
[0004] 目前降低水質(zhì)中以及食品中殘留的亞硝酸鹽含量的方法很多，比如離子交換法、 反滲透法、電滲析法、微生物降解法、化學(xué)法等。但是，這些方法存在很多問(wèn)題，其中反滲透 法、電滲析法、離子交換法均是將亞硝酸鹽集中于介質(zhì)或廢液中，易造成二次污染，且效率 低、投資較大，主要用于對(duì)工業(yè)用水的處理；化學(xué)還原法盡管可以將亞硝酸根還原為無(wú)害的 氮?dú)?，但其反?yīng)需要在較高溫度下進(jìn)行，效率也較低，不適宜于對(duì)養(yǎng)殖水和食品的處理；化 學(xué)氧化法雖具有設(shè)備簡(jiǎn)單、處理費(fèi)用相對(duì)較低的優(yōu)點(diǎn)，但僅適用于對(duì)亞硝酸鹽含量較低、處 理量較少的地下深水的處理，不適宜于對(duì)養(yǎng)殖水和食品的處理。生物法具有高效低耗的優(yōu) 點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種高效低能耗、 對(duì)亞硝酸鹽降解效果好、降解快速可靠的寄生曲霉。
[0006] 本發(fā)明進(jìn)一步要解決的技術(shù)問(wèn)題在于，提供該寄生曲霉在亞硝酸鹽還原酶制備、 亞硝酸鹽還原酶基因制備和含有亞硝酸鹽還原酶的基因工程菌制備中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：
[0008] 一種寄生曲霉（Aspergillus sp.JFS)，保藏編號(hào)為 CCTCC NO :M 2013662,保藏 時(shí)間：2013年12月11日，保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：湖北省武漢市 武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心。該寄生曲霉的GenBank登錄號(hào)為KJ847706、KJ847707和 KJ847708。
[0009] 本發(fā)明的寄生曲霉（Aspergillus parasiticus) JFS是從重慶市榮昌縣金佛鎮(zhèn)的 一個(gè)魚(yú)池水樣中分離得到。該寄生曲霉菌株是一株可以強(qiáng)烈降解亞硝酸鹽的真菌。
[0010] 將該菌株JFS接種在察氏平板上，將平板置于30°C恒溫培養(yǎng)，觀(guān)察菌落的特征：該 菌株JFS在培養(yǎng)4天時(shí)，菌落直徑為2. 6cm，此時(shí)，菌落正面呈現(xiàn)出4個(gè)同心圈形，菌落最中 間是乳白色菌絲狀，由里向外第二層有很多金黃色孢子，由里向外第三層有很多白色孢子， 最外層是乳白色菌絲，菌落背面為淺棕色。9天時(shí)菌落直徑5. 0cm，此時(shí)，平板上有很多白 色孢子和墨綠色孢子，同時(shí)平板上出現(xiàn)了很多棕黑色液滴，平板背面為深棕色。孢子的顏色 隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)由淺到深，最初為淡黃色，然后變?yōu)榫G色，最后變?yōu)樽睾谏?br> [0011] 載玻片溫室培養(yǎng)顯微觀(guān)察和電子顯微鏡觀(guān)察：營(yíng)養(yǎng)菌絲有隔、分枝、透明，分生孢 子梗自菌絲生出，可單生或?qū)ι?，直立，?xì)長(zhǎng)，大都簡(jiǎn)單，頂端漸粗，末端擴(kuò)展成由1列小梗 排列成木柵狀的頂囊，頂囊球形，小梗上有成串的2. 81-3. 6 μ m的球形分生孢子，分生孢子 頭猶如花菜樣、表面不光滑。
[0012] 將寄生曲霉菌株JFS在察氏平板上培養(yǎng)3-6天后，提取其基因組DNA，對(duì)該DNA進(jìn) 行擴(kuò)增，并分別用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，切割所需DNA目的條帶測(cè)序。對(duì)菌 株JFS的ITS rDNA序列、β -Tubulin gene序列和Calmodulin gene序列的PCR產(chǎn)物測(cè)序 后發(fā)現(xiàn)其 ITS rDNA 序列共有 576bp，i3_Tubulin gene 序列共有 522bp，Calmodulin gene 序 列共有749bp。分別將其ITS rDNA序列、β-Tubul in gene序列和Calmodul in gene序列輸 入NCBI GenBank中blast，用MEGA5. 2. I軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，菌株JFS均與Aspergillus parasiticus 和 Aspergillus arachidicola(目前種 Aspergillus arachidicola 的概念還 不清楚）聚到了同一個(gè)分支，親緣關(guān)系最近。
[0013] 綜上，通過(guò)綜合菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)、分生孢子形態(tài)、培養(yǎng)條件及分子生物學(xué) 鑒定結(jié)果，該菌株屬于真子囊菌亞綱散囊菌目發(fā)霉科曲霉屬的寄生曲霉（Aspergillus parasiticus)〇
[0014] 由于本發(fā)明的寄生曲霉菌株JFS能在亞硝酸鹽為唯一氮源的培養(yǎng)基中較好的生 長(zhǎng)，有很強(qiáng)、很快的降解亞硝酸鹽的能力，在初始濃度為4mg/L的亞硝酸鈉培養(yǎng)液中120h的 亞硝酸鈉降解率為99. 8%，在亞硝酸鈉的濃度高達(dá)20. Og/L時(shí)仍能較好的生長(zhǎng)，并且發(fā)現(xiàn) 亞硝酸鈉的濃度越高該菌株生長(zhǎng)得越好，在有氧和無(wú)氧條件下該菌株均能較好的生長(zhǎng)。本 發(fā)明的寄生曲霉菌株JFS除了利用亞硝酸鹽合成自身的結(jié)構(gòu)蛋白及功能蛋白以外，還將有 毒的亞硝酸鹽降解為無(wú)毒的硝酸鹽和NH4+，同時(shí)該菌株還可以繼續(xù)利用產(chǎn)物硝酸鹽。
[0015] 本發(fā)明的寄生曲霉菌株JFS的發(fā)現(xiàn)，填補(bǔ)了真菌在降解亞硝酸鹽方面的空白。相 對(duì)現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的寄生曲霉在亞硝酸鹽降解過(guò)程中實(shí)現(xiàn)高效低能耗，且對(duì)亞硝酸鹽降 解效果好、降解快速可靠。
[0016] 由于該菌株對(duì)亞硝酸鹽有很強(qiáng)的降解能力，可應(yīng)用于蛋白酶工程及基因工程：
[0017] 本發(fā)明寄生曲霉應(yīng)用的第一種實(shí)施方案為：寄生曲霉在亞硝酸鹽還原酶的制備中 應(yīng)用。采用本發(fā)明寄生曲霉來(lái)制備亞硝酸鹽還原酶，能降低培養(yǎng)成本，并且能為亞硝酸鹽還 原酶的制備提供充足來(lái)源，使其可直接用于去除食品原料和養(yǎng)殖水中的亞硝酸鹽。
[0018] 本發(fā)明寄生曲霉應(yīng)用的第二種實(shí)施方案為：寄生曲霉在亞硝酸鹽還原酶基因的制 備中應(yīng)用。寄生曲霉的應(yīng)用提供了更方便的途徑，來(lái)研究自然界中亞硝酸鹽還原酶基因的 多樣性。
[0019] 本發(fā)明寄生曲霉應(yīng)用的第三種實(shí)施方案為：寄生曲霉在含有亞硝酸鹽還原酶的基 因工程菌制備中的應(yīng)用。采用本發(fā)明的寄生曲霉能更方便制備更多種類(lèi)的基因工程菌，擴(kuò) 展其應(yīng)用范圍。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020] 下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，附圖中：
[0021] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的菌株生長(zhǎng)四天時(shí)的照片；
[0022] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例1的菌株生長(zhǎng)九天時(shí)的照片；
[0023] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例1的在光學(xué)顯微鏡下的分生孢子梗和分生孢子頭；
[0024] 圖4-6都是本發(fā)明實(shí)施例1的在電子顯微鏡下的分生孢子頭；
[0025] 圖7是本發(fā)明實(shí)施例1的菌株JFS基于ITS rDNA序列的基因同源性的系統(tǒng)發(fā)育 樹(shù)；
[0026] 圖8是本發(fā)明實(shí)施例1的菌株JFS基于β -Tubulin基因序列的基因同源性的系 統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；
[0027] 圖9是本發(fā)明實(shí)施例1的菌株JFS基于Calmodulin基因序列的基因同源性的系 統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；
[0028] 圖10是本發(fā)明實(shí)施例1的亞硝酸鈉濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；
[0029] 圖11是本發(fā)明實(shí)施例1的培養(yǎng)液中亞硝酸鈉濃度隨培養(yǎng)時(shí)間變化趨勢(shì)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 為了對(duì)本發(fā)明的技術(shù)特征、目的和效果有更加清楚的理解，現(xiàn)對(duì)照附圖詳細(xì)說(shuō)明 本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】。
[0031] 實(shí)施例1、寄生曲霉菌株JFS的篩選、培養(yǎng)、鑒定和性能檢測(cè)
[0032] 1.寄生曲霉菌株JFS的篩選：
[0033] ⑴材料
[0034] a.樣品：采自四川成都、四川宜賓及重慶榮昌等地的水樣、土樣、朽木、兔糞和羊 糞共20個(gè)樣品。
[0035] 樣品處理及保存：其中采集的土樣、朽木、兔糞和羊糞全部于采回后立即在陰涼 干燥處晾干，晾干后置于干凈的牛皮紙信封內(nèi)保存。水樣在采集后直接使用（用的是新鮮 水）。

【權(quán)利要求】
1. 一種寄生曲霉，其特征在于，其保藏編號(hào)為CCTCC M2013662。
2. 如權(quán)利要求1所述的寄生曲霉，其特征在于，所述的寄生曲霉的菌落、菌絲、分生 孢子特征分別為：菌落正面呈現(xiàn)出同心圈形，菌落中心是乳白色菌絲狀，由里向外的第二 層有金黃色孢子，由里向外的第三層有白色孢子，最外層是乳白色菌絲，菌落背面為淺棕 色；營(yíng)養(yǎng)菌絲有隔、分枝、透明；分生孢子梗自菌絲生出，可單生或?qū)ι?，直立，?xì)長(zhǎng)，大都 簡(jiǎn)單，頂端漸粗，末端擴(kuò)展成由1列小梗排列成木柵狀的頂囊，頂囊球形，小梗上有成串的 2. 81-3. 6 y m的球形分生孢子，分生孢子頭猶如花菜樣、表面不光滑，產(chǎn)生棕色分泌液。
3. 權(quán)利要求1所述的寄生曲霉在亞硝酸鹽還原酶的制備中應(yīng)用。
4. 權(quán)利要求1所述的寄生曲霉在亞硝酸鹽還原酶基因的制備中應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求1所述的寄生曲霉在含有亞硝酸鹽還原酶的基因工程菌制備中應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/81GK104312925SQ201410370569
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年7月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月30日
【發(fā)明者】劉冰花, 楊林, 蒲小龍, 羅亞雄, 袁管明 申請(qǐng)人:成都大學(xué)