一種快速檢測常見缺失型α-地中海貧血的試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測常見缺失型α-地中海貧血的試劑盒及其使用方法。所述試劑盒包括：一對可以同時(shí)擴(kuò)增α-珠蛋白基因簇中Y1區(qū)段的特征序列y1和Y2區(qū)段的特征序列y2的引物，一對擴(kuò)增α-珠蛋白基因簇中--SEA基因型的引物，一對擴(kuò)增α-珠蛋白基因簇中α2基因的引物、一條特異性檢測Y1區(qū)段的特征序列y1的熒光探針、一條特異性檢測Y2區(qū)段的特征序列y2的熒光探針、一條特異性檢測--SEA基因型擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光探針和一條特異性檢測α2基因擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光探針。本發(fā)明所述試劑盒對α-地中海貧血珠蛋白基因缺失檢測具有高度的靈敏性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性以及較高的特異性。
【專利說明】-種快速檢測常見缺失型α-地中海貧血的試劑盒及其使 用方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種快速檢測常見缺失型α -地中海貧 血的試劑盒及其使用方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 地中海貧血（Mediterranean Anemia)，也稱海洋性貧血（Thalassemia)、庫勒 (Cooley)貧血、珠蛋白合成障礙性貧血，簡稱地貧。地中海貧血是最常見的單基因遺傳疾 病之一，常見的地貧種類有α-地貧和β-地貧，分別由α-蛋白基因簇和β-珠蛋白基 因簇異常表達(dá)引起。在我國，廣西、廣東和海南是地中海貧血的高發(fā)省份，其中廣西α-地 貧的發(fā)病率是15. 5%。中國人群中，缺失型α -地貧的基因型常見基因型為一SEA、-α 3 7 和-α4 2。目前檢測缺失型地中海貧血的主要方法有Gap-PCR、高分辨溶解曲線（HRM， High-Resolution Melting) > MLPA(Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification Assay)、Southern blot分析法等。以上方法單獨(dú)應(yīng)用在地中海貧血基因型檢測中各有優(yōu) 缺點(diǎn)。
[0003] 同源基因定量技術(shù)是一種根據(jù)基因的同源性，采用共同的擴(kuò)增引物對同源基因進(jìn) 行擴(kuò)增，最后采用熒光標(biāo)記法或者探針法對基因的含量進(jìn)行相對定量的方法。α -珠蛋白 基因簇（NG_000006. 1)由調(diào)控因子（HS-40)，α基因 （α 1和α 2)，ζ基因 （ζ 2)，假基因 (Ψ ζ 1，Ψ a 2andW α 1)和Θ組成，其排列順序?yàn)椋号?0-42-屯41-屯〇2-屯〇1-α2-α1- Θ。〇-地中海貧血基因據(jù)其同源性，可劃分為)(1，乂2，￥1，￥2,21和22區(qū)間，其 中-α 3_7 (也稱為右側(cè)缺失）的形成源于Ζ1和Ζ2之間的同源重組，而-α 4_2 (也稱為左側(cè)缺 失）則來源于XI和Χ2之間的同源重組，如圖1所示，圖1中，Υ1和Υ2同源。目前尚未見 有由同時(shí)擴(kuò)增Υ1和Υ2的擴(kuò)增引物構(gòu)成的結(jié)合Taqman技術(shù)的快速檢測常見缺失型α -地 中海貧血的試劑盒的相關(guān)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種基于同源基因定量技術(shù)的快速檢測常見缺 失型α-地中海貧血的試劑盒及其使用方法。采用該試劑盒可以相對定量檢測α-珠蛋白 基因簇中α 1和α 2功能基因的拷貝數(shù)及拷貝數(shù)的變化。
[0005] 本發(fā)明所述的快速檢測常見缺失型α -地中海貧血的試劑盒，包括擴(kuò)增引物和熒 光探針，所述的擴(kuò)增引物為：一對可以同時(shí)擴(kuò)增α-珠蛋白基因簇中Υ1區(qū)段的特征序列 yl和Υ2區(qū)段的特征序列y2的引物Y1Y2-F和Y1Y2-R，一對擴(kuò)增α -珠蛋白基因簇中一SEA 基因型的Gap-PCR引物SEA-F和SEA-R，以及一對擴(kuò)增α -珠蛋白基因簇中α 2基因的引 物A2-F和A2-R ;所述的熒光探針為：一條特異性檢測Υ1區(qū)段的特征序列yl的熒光探針 Yl-Prob，一條特異性檢測Y2區(qū)段的特征序列y2的熒光探針Y2-Prob，一條特異性檢測一SEA 基因型擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光探針SEA-Prob，以及一條特異性檢測α 2基因擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光探針 A2-Prob ；
[0006] 其中：
[0007] 所述的可以同時(shí)擴(kuò)增α -珠蛋白基因簇中Y1區(qū)段的特征序列yl和Y2區(qū)段的特 征序列y2的引物對中，
[0008] Y1Y2-F:5,-TGCACCCACTGGCACTC-3,；
[0009] Y1Y2-R:5,-AGGAAGGAAGGGGTGGACT-3,；
[0010] 所述的擴(kuò)增α -珠蛋白基因簇中一SEA基因型的Gap-PCR引物對中，
[0011] SEA-F: 5，-AGAAGCTGAGTGATGGGTCC-3，；
[0012] SEA-R: 5 ' -TGGACTTAAGTGATCCTCCTGC-3 ' ；
[0013] 所述的擴(kuò)增α -珠蛋白基因簇中α 2基因的引物對中，
[0014] A2-F: 5 ' -TCCTGGCTTCTGTGAGCAC-3 ' ；
[0015] A2-R: 5 ' -GCAGAGAGGTCCTTGGTCTG-3 ' ；
[0016] 所述的特異性檢測Υ1區(qū)段的特征序列yl的熒光探針Yl-Prob為：
[0017] Yl-Prob: 5' -6-FAM-CACCTCCCACCCTTCCCCAGA-BHQ-1-3' ；
[0018] 所述的特異性檢測Y2區(qū)段的特征序列y2的熒光探針Y2-Prob為：
[0019] Y2-Prob:5,-R0X-CTCCCACCCTCCCCCTCGCCA-BHQ-2-3,；
[0020] 所述的特異性檢測一SEA基因型擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光探針SEA-Prob為：
[0021] SEA-Prob:5'-HEX-CTTCGCAGGAACTCGGTCGTCCC-BHQ-1-3' ；
[0022] 所述的特異性檢測α 2基因擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光探針A2-Prob為：
[0023] A2-Prob: 5 ' -CY5-ACCTCCATTGTTGGCACATTCCGGGA-BHQ-2-3 '。
[0024] 本發(fā)明所述的熒光探針中，F(xiàn)AM指羧基熒光素，HEX指六氯-6-甲基熒光素，R0X指 羧基-X-羅丹明，CY5是指花青染料分子5, BHQ-1和BHQ-2是指熒光淬滅基團(tuán)。
[0025] 上述技術(shù)方案中，所述 Y1 區(qū)段的序列為：5' -AGTCCACCCCTTCCTTCCTCACCCTGCAGGAGC TGGCCAGCCTCATCACCCCMCATCTCCCCACCTCCATTCTCCMCCACAGGGCCCTTGTCTCCTCTGTCCTTTCCCCTCC CCGAGCCMGCCTCCTCCCTCCTCCACCTCCTCCACCTMTACATATCCTTMGTCTCACCTCCTCCAGGMGCCCTCAGA CTMCCCTGGTCACCTTGAATGCCTCGTCCACACCTCCAGACTTCCTCAGGGCCTGTGATGAGGTCTGCACCTCTGTGTG TACTTGTGTGATGGTTAGAGGACTGCCTACCTCCCAGAGGAGGTTGAATGCTCCAGCCGGTTCCAGCTATTGCTTTGTTT ACCTGTTTMCCAGTATTTACCTAGCMGTCTTCCATCAGATAG-3';該 Y1 區(qū)段的特征序列 yl 為：5'-TGCA CCCACTGGCACTCCTGCACCTCCCACCCTTCCCCAGMGTCCACCCCTTCCTTCCT-3，。
[0026] 上述技術(shù)方案中，所述Y2區(qū)段的序列為：5' -AGTCCACCCCTTCCTTCCTCACCCCACATCC CCTCACCTACATTCTGCAACCACAGGGGCCTTCTCTCCCCTGTCCTTTCCCTACCCAGAGCCAAGTTTGTTTATCTG ITTACAACCAGTAITTACCTAGCAAGTCTTCCATCAGATAG-3' ；該 Y2 區(qū)段的特征序列 y2 為：5' -TGCA CCCACTGGCACTCCTGCACCTCCCACCCTCCCCCTCGCCAAGTCCACCCCTTCCTTCCT-3'。
[0027] 本發(fā)明所述的快速檢測常見缺失型α -地中海貧血的試劑盒還包括一些現(xiàn)有試 劑盒中常規(guī)且必須的組分，如緩沖液、酶液、MgCl2和dNTP等，具體的，酶液即為DNA聚合酶， 具體可采用康為世紀(jì)所生產(chǎn)的GoldStar Taq DNA Polymerase,緩沖液為與GoldStar Taq DNA Polymerase配套的緩沖液。
[0028] 本發(fā)明還提供采用上述試劑盒進(jìn)行快速檢測常見缺失型α -地中海貧血的方法， 包括以下步驟：
[0029] 1)抽提樣本基因組DNA，制備DNA模板；
[0030] 2)配制反應(yīng)體系，具體為：
[0031] 取可以同時(shí)擴(kuò)增α-珠蛋白基因簇中Y1區(qū)段的特征序列yl和Y2區(qū)段的特征序列 y2的引物Y1Y2-F和Y1Y2-R、擴(kuò)增α -珠蛋白基因簇中一SEA基因型的Gap-PCR引物SEA-F 和SEA-R、擴(kuò)增α-珠蛋白基因簇中α2基因的引物A2-F和A2-R;特異性檢測Y1區(qū)段的特 征序列yl的熒光探針Yl-Prob、特異性檢測Υ2區(qū)段的特征序列y2的熒光探針Y2-Prob、特 異性檢測一 SEA基因型擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光探針SEA-Prob和特異性檢測α 2基因擴(kuò)增產(chǎn)物的熒 光探針A2-Prob ;以及PCR緩沖液、酶液、MgCl2、dNTP、水和DNA模板配制成反應(yīng)體系；
[0032] 3)樣本檢測：分別將配制的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，記錄每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)的熒光 信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)Cq(Cq值的大小可以反映所檢測模板數(shù)的多少）；
[0033] 4)數(shù)據(jù)分析及結(jié)果判定：根據(jù)定量檢測所獲得的Cq值，以正?；蛐停é?α/ α α )樣本為對照標(biāo)本，按下述公式進(jìn)行計(jì)算：
[0034] 待檢樣本的基因 ACq = Cq Y2_Cq Y1 ;
[0035] 待檢樣本的基因 Δ Δ Cq = Δ Cq_待檢樣本_ Δ Cq_正常樣本；
[0036] 待檢樣本的Y1和Y2(這里用Y1和Y2)相對拷貝數(shù)比值R = 2、1 ;
[0037] 根據(jù)R的值結(jié)合下述表1進(jìn)行結(jié)果判定：
[0038] 表 1 :
[0039]

【權(quán)利要求】
1. 一種快速檢測常見缺失型α-地中海貧血的試劑盒，包括擴(kuò)增引物和熒光探針，其 特征在于： 所述的擴(kuò)增引物為：一對可以同時(shí)擴(kuò)增α -珠蛋白基因簇中Υ1區(qū)段的特征序列yl和 Y2區(qū)段的特征序列y2的引物Y1Y2-F和Y1Y2-R，一對擴(kuò)增α -珠蛋白基因簇中一SEA基因型 的Gap-PCR引物SEA-F和SEA-R，以及一對擴(kuò)增α -珠蛋白基因簇中α 2基因的引物A2-F 和 A2-R ; 所述的熒光探針為：一條特異性檢測Υ1區(qū)段的特征序列yl的熒光探針Yl-Prob，一條 特異性檢測Y2區(qū)段的特征序列y2的熒光探針Y2-Prob，一條特異性檢測一SEA基因型擴(kuò)增 產(chǎn)物的熒光探針SEA-Prob，以及一條特異性檢測α 2基因擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光探針A2-Prob ; 其中： 所述的可以同時(shí)擴(kuò)增α -珠蛋白基因簇中Y1區(qū)段的特征序列yl和Y2區(qū)段的特征序 列y2的引物對中， Y1Y2-F:5' -TGCACCCACTGGCACTC-3' ； Y1Y2-R:5, -AGGAAGGAAGGGGTGGACT-3,； 所述的擴(kuò)增α-珠蛋白基因簇中--SEA基因型的Gap-PCR引物對中， SEA-F:5' -AGAAGCTGAGTGATGGGTCC-3' ； SEA-R:5' -TGGACTTAAGTGATCCTCCTGC-3' ； 所述的擴(kuò)增α-珠蛋白基因簇中α 2基因的引物對中， A2-F:5' -TCCTGGCTTCTGTGAGCAC-3' ； A2-R:5' -GCAGAGAGGTCCTTGGTCTG-3' ； 所述的特異性檢測Y1區(qū)段的特征序列yl的熒光探針Yl-Prob為： Yl-Prob:5' -6-FAM-CACCTCCCACCCTTCCCCAGA-BHQ-1-3' ； 所述的特異性檢測Y2區(qū)段的特征序列y2的熒光探針Y2-Prob為： Y2-Prob:5, -R0X-CTCCCACCCTCCCCCTCGCCA-BHQ-2-3,； 所述的特異性檢測一SEA基因型擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光探針SEA-Prob為： SEA-Prob:5' -HEX-CTTCGCAGGAACTCGGTCGTCCC-BHQ-1-3' ； 所述的特異性檢測α 2基因擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光探針A2_Prob為： A2-Prob:5 ' -CY5-ACCTCCATTGTTGGCACATTCCGGGA-BHQ-2-3 '。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測常見缺失型α-地中海貧血的試劑盒，其特征在 于： 所述Υ1區(qū)段的序列為： 5' -AGTCCACCCCTTCCTTCCTCACCCTGCAGGAGCTGGCCAGCCTCATCACCCCAACATCTCCCCACCTCC ATTCTCCAACCACAGGGCCCTTGTCTCCTCTGTCCTTTCCCCTCCCCGAGCCAAGCCTCCTCCCTCCTCCACCTCCT CCACCTAATACATATCCTTAAGTCTCACCTCCTCCAGGAAGCCCTCAGACTAACCCTGGTCACCTTGAATGCCTCGT CCACACCTCCAGACTTCCTCAGGGCCTGTGATGAGGTCTGCACCTCTGTGTGTACTTGTGTGATGGTTAGAGGACTG CCTACCTCCCAGAGGAGGTTGAATGCTCCAGCCGGTTCCAGCTATTGCTTTGTTTACCTGTTTAACCAGTATTTACC TAGCAAGTCTTCCATCAGATAG-3,； 所述Υ2區(qū)段的序列為： 5' -AGTCCACCCCTTCCTTCCTCACCCCACATCCCCTCACCTACATTCTGCAACCACAGGGGCCTTCTCTCC CCTGTCCTTTCCCTACCCAGAGCCAAGTTTGTTTATCTGTTTACAACCAGTATTTACCTAGCAAGTCTTCCATCAGA TAG-3，。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測常見缺失型α-地中海貧血的試劑盒，其特征在 于： 所述 Y1 區(qū)段的特征序列 yl 為：5'-TGCACCCACTGGCACTCCTGCACCTCCCACCCTTCCCCAGAAG TCCACCCCTTCCTTCCT-3' ； 所述 Y2 區(qū)段的特征序列 y2 為：5' -TGCACCCACTGGCACTCCTGCACCTCCCACCCTCCCCCTCGCC AAGTCCACCCCTTCCTTCCT-3'。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測常見缺失型a-地中海貧血的試劑盒，其特征在于： 所述的試劑盒還包括PCR緩沖液、酶液、MgCl 2和dNTP。
5. 采用權(quán)利要求1所述試劑盒進(jìn)行快速檢測常見缺失型a-地中海貧血的方法，包括 以下步驟： 1) 抽提樣本基因組DNA，制備DNA模板； 2) 配制反應(yīng)體系，具體為： 取可以同時(shí)擴(kuò)增a -珠蛋白基因簇中Y1區(qū)段的特征序列yl和Y2區(qū)段的特征序列y2 的引物Y1Y2-F和Y1Y2-R、擴(kuò)增a -珠蛋白基因簇中一SEA基因型的Gap-PCR引物SEA-F和 SEA-R、擴(kuò)增α -珠蛋白基因簇中α 2基因的引物A2-F和A2-R ;特異性檢測Y1區(qū)段的特征 序列yl的熒光探針Yl-Prob、特異性檢測Υ2區(qū)段的特征序列y2的熒光探針Y2-Prob、特異 性檢測一 SEA基因型擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光探針SEA-Prob和特異性檢測α 2基因擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光 探針A2-Prob ;以及PCR緩沖液、酶液、MgCl2、dNTP、水和DNA模板配制成反應(yīng)體系； 3) 樣本檢測：分別將配制的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，記錄每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)的熒光信 號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)Cq ; 4) 數(shù)據(jù)分析及結(jié)果判定：根據(jù)定量檢測所獲得的Cq值，以正?；蛐蜆颖緸閷φ諛?biāo) 本，按下述公式進(jìn)行計(jì)算： 待檢樣本的基因 Λ Cq = Cq Y2_Cq Y1 ; 待檢樣本的基因 Δ ACq= ACqj檢樣本樣本； 待檢樣本的Yl和Y2相對拷貝數(shù)比值Κ=2^Α&1; 根據(jù)R的值結(jié)合下述表1中進(jìn)行結(jié)果判定： 表1 :

其中，當(dāng)R在0. 75?1. 26范圍時(shí)，其結(jié)果匹配上表理論值中的"1";當(dāng)R在1. 8?2. 6 范圍時(shí)，其結(jié)果匹配上表理論值中的"2" ；當(dāng)R在0. 33?0. 53范圍時(shí)，其結(jié)果匹配上表理 論值中的"〇. 5";若R的計(jì)算結(jié)果不在上述定義的R值范圍內(nèi)時(shí)，應(yīng)采用其他方法進(jìn)行輔助 判斷。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：步驟3)中，PCR擴(kuò)增條件為：95°C預(yù)變性 8?10分鐘，然后95°C 15?30秒，60°C退火50?70秒，39?49個(gè)循環(huán)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：PCR擴(kuò)增條件為：95°C預(yù)變性10分鐘，然 后95°C 15秒，60°C退火60秒，40個(gè)循環(huán)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104141014SQ201410417598
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月16日
【發(fā)明者】龍駒 申請人:龍駒