基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開發(fā)的紅掌ssr引物對(duì)及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開發(fā)的紅掌SSR引物對(duì)及試劑盒。本發(fā)明提供22對(duì)紅掌SSR引物的序列及鑒定紅掌親緣關(guān)系和遺傳特性的試劑盒。本發(fā)明的22對(duì)引物在50個(gè)紅掌品種中具有多態(tài)性，對(duì)50個(gè)紅掌品種進(jìn)行的遺傳多樣性分析與植物分類常識(shí)相吻合，可以直接把本發(fā)明提供的22對(duì)引物應(yīng)用于更多的紅掌植物品種上，進(jìn)行種質(zhì)資源遺傳多樣性分析。
【專利說明】基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開發(fā)的紅掌SSR引物對(duì)及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及SSR引物，具體地說是一套基于紅掌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開發(fā)的SSR引物對(duì)及 試劑盒，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 紅掌是天南星科花燭屬多年生常綠草本植物，其花型美觀、花期長，觀賞性高，在 全球熱帶花卉貿(mào)易中僅次于蘭花名列第二。我國自20世紀(jì)90年代開始引種紅掌，目前已成 為我國主產(chǎn)花卉之一，其種質(zhì)類型也越來越多，主要是從形態(tài)特征方面來區(qū)分，同種異名、 同名異種現(xiàn)象普遍存在，無法反映真實(shí)的親緣關(guān)系和遺傳特性，給品種收集、保存和利用帶 來影響，給紅掌新品種培育和資源利用帶來困難。因此應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)紅掌種質(zhì)資源 多樣性進(jìn)行系譜分析是必要的。
[0003] 隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源遺傳多樣性分析以及 輔助育種工作中。AFLP、ISSR、RAPD等標(biāo)記均是采用無基因組序列信息的標(biāo)記，盡管有一定 的實(shí)用性，但隨機(jī)性強(qiáng)，穩(wěn)定性差。與其他分子標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記具有共顯性好、重復(fù)性好 等優(yōu)點(diǎn)，是目前進(jìn)行遺傳多樣性分析和圖譜構(gòu)建等的首選標(biāo)記。
[0004] 目前，紅掌SSR應(yīng)用很少。NCBI數(shù)據(jù)庫中紅掌核苷酸序列僅141條，甚至花燭屬 序列也僅793條。2013年，臺(tái)灣大學(xué)Jau-Yueh Wang et al.利用GeneBank公布的花燭屬 序列開發(fā)了 8對(duì)SSR引物，具有多態(tài)性的僅有4對(duì)，同時(shí)他利用同科Colocasia esculenta 屬的EST序列開發(fā)了 32對(duì)引物，僅得到1對(duì)多態(tài)性可用引物，利用同科Zantedeschia aethiopica屬的EST序列開發(fā)了 60對(duì)引物，也僅得到1對(duì)多態(tài)性可用引物，6對(duì)SSR引物 中他選擇其中多態(tài)性大于90 %的4對(duì)引物在28個(gè)紅掌品種上應(yīng)用，相對(duì)信息量較少。而分 子標(biāo)記的數(shù)量影響著種質(zhì)資源遺傳多樣性分析的準(zhǔn)確性和遺傳圖譜構(gòu)建的精確性，現(xiàn)有的 紅掌SSR分子標(biāo)記數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足紅掌分子生物學(xué)研究的需求。為了提高EST-SSR標(biāo)記 的密度和提高更多紅掌品種鑒定的效果，有必要開發(fā)更多的SSR引物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開發(fā)的紅掌SSR引物對(duì)及試劑 盒。本發(fā)明利用紅掌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所得的unigene以及MISA軟件尋找SSR，開發(fā)了 SSR引物， 合成了 200對(duì)，經(jīng)6個(gè)不同紅掌品種篩選，及50個(gè)紅掌品種驗(yàn)證，得到22個(gè)不同于前人的 具有較高多態(tài)性的通用型引物。
[0006] 一種基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開發(fā)的紅掌SSR引物對(duì)，在檢測(cè)過程中使用一對(duì)或多對(duì)引 物；所述引物共有22對(duì)，分別為：
[0007] 第1對(duì)引物，其序列如SEQ ID N0 :1和SEQ ID N0 :2所示；
[0008] 第2對(duì)引物，其序列如SEQ ID N0 :3和SEQ ID N0 :4所示；
[0009] 第3對(duì)引物，其序列如SEQ ID N0 :5和SEQ ID N0 :6所示；
[0010] 第4對(duì)引物，其序列如SEQ ID N0 :7和SEQ ID N0 :8所示；
[0011] 第5對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10所示；
[0012] 第6對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :11和SEQ ID NO :12所示；
[0013] 第7對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :13和SEQ ID NO :14所示；
[0014] 第8對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :15和SEQ ID NO :16所示；
[0015] 第9對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :17和SEQ ID NO :18所示；
[0016] 第10對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :19和SEQ ID NO :20所示；
[0017] 第11對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :21和SEQ ID NO :22所示；
[0018] 第12對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :23和SEQ ID NO :24所示；
[0019] 第13對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :25和SEQ ID NO :26所示；
[0020] 第14對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :27和SEQ ID NO :28所示；
[0021] 第15對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :29和SEQ ID NO :30所示；
[0022] 第16對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :31和SEQ ID NO :32所示；
[0023] 第17對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :33和SEQ ID NO :34所示；
[0024] 第18對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :35和SEQ ID NO :36所示；
[0025] 第19對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :37和SEQ ID NO :38所示；
[0026] 第20對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :39和SEQ ID NO :40所示；
[0027] 第21對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :41和SEQ ID NO :42所示；
[0028] 第22對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :43和SEQ ID NO :44所示。
[0029] 一種鑒定紅掌親緣關(guān)系和遺傳特性的試劑盒，包括上述的一對(duì)或多對(duì)引物。
[0030] 一種所述的紅掌SSR引物對(duì)的應(yīng)用。
[0031] 本發(fā)明的有益效果是：
[0032] 本發(fā)明的22對(duì)SSR引物是通過來源于3個(gè)種且形態(tài)差異大的6個(gè)品種篩選得到， 在50個(gè)紅掌品種（表1)中均具有多態(tài)性（部分如圖2)，在50個(gè)紅掌品種中進(jìn)行的遺傳 多樣性分析與紅掌分類常識(shí)相吻（圖3)，是穩(wěn)定存在的新標(biāo)記，可以直接將本發(fā)明所提供 的22個(gè)引物對(duì)應(yīng)用于更多紅掌品種上，進(jìn)行種質(zhì)資源和遺傳多樣性分析，為紅掌分子標(biāo)記 輔助育種奠定了良好的基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033] 圖1是基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開發(fā)紅掌SSR引物對(duì)的流程圖。
[0034] 圖2是本發(fā)明的部分紅掌SSR引物對(duì)在50個(gè)紅掌品種上的擴(kuò)增效果圖。
[0035] 圖3是基于22對(duì)SSR引物構(gòu)建的50個(gè)紅掌品種UPGMA聚類圖。

【具體實(shí)施方式】
[0036] 基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開發(fā)的紅掌SSR引物對(duì)，是通過紅掌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、SSR引物開發(fā)、 DNA提取、SSR引物篩選及品種鑒定等過程得到（圖1)。
[0037] 本發(fā)明中，用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的EST序列開發(fā)紅掌SSR引物對(duì)的具體做法是：
[0038] 一、紅掌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
[0039] 采用Trizol法提取紅掌（阿拉巴馬）葉片總RNA后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富 集真核生物mRNA。加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用 六堿基隨機(jī)引物（random hexamers)合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase Η 和DNA polymerase I合成第二條cDNA鏈，在經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化并加 ΕΒ緩沖液 洗脫之后做末端修復(fù)、加 poly (Α)并連接測(cè)序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小 選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建好的測(cè)序文庫用Illumina HiSeq? 2000進(jìn)行測(cè)序，獲得32391 個(gè) unigene。
[0040] 二、SSR引物開發(fā)
[0041] 利用紅掌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的32391個(gè)unigene，利用MISA軟件尋找到3944個(gè)含有 SSR的重復(fù)基元，選擇SSR位點(diǎn)的重復(fù)基元為二核苷酸重復(fù)次數(shù)> 6次，三、四核苷酸重復(fù) 次數(shù)彡5次，五、六核苷酸重復(fù)次數(shù)彡4次的SSR序列，用軟件Primer3. 0設(shè)計(jì)SSR引物，弓丨 物設(shè)計(jì)的原則為：最終產(chǎn)物長度為100_200bp，引物長度為18-24bp，退火溫度為48-65°C。 挑選其中的200對(duì)引物，委托上海生工生物工程股份有限公司合成。
[0042] 二、品種DNA提取
[0043] 用CTAB (十六烷基三乙基溴化銨）法提取50個(gè)紅掌品種（表1)基因組DNA，具體 步驟：
[0044] 表1本發(fā)明實(shí)現(xiàn)方案中所用到的不同紅掌品種
[0045]

【權(quán)利要求】
1. 一種基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開發(fā)的紅掌SSR引物對(duì)，其特征在于，在檢測(cè)過程中使用一對(duì) 或多對(duì)引物；所述引物共有22對(duì)，分別為： 第1對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示； 第2對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示； 第3對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6所示； 第4對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8所示； 第5對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10所示； 第6對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :11和SEQ ID NO :12所示； 第7對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :13和SEQ ID NO :14所示； 第8對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :15和SEQ ID NO :16所示； 第9對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18所示； 第10對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :19和SEQ ID NO :20所示； 第11對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :21和SEQ ID NO :22所示； 第12對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :23和SEQ ID NO :24所示； 第13對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :25和SEQ ID NO :26所示； 第14對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :27和SEQ ID NO :28所示； 第15對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :29和SEQ ID NO :30所示； 第16對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :31和SEQ ID NO :32所示； 第17對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :33和SEQ ID NO :34所示； 第18對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :35和SEQ ID NO :36所示； 第19對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :37和SEQ ID NO :38所示； 第20對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :39和SEQ ID NO :40所示； 第21對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :41和SEQ ID NO :42所示； 第22對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO :43和SEQ ID NO :44所示。
2. -種鑒定紅掌親緣關(guān)系和遺傳特性的試劑盒，其特征在于，它包括如權(quán)利要求1所 述的一對(duì)或多對(duì)引物。
3. -種如權(quán)利要求1所述的紅掌SSR引物對(duì)的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104195245SQ201410423866
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年8月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月26日
【發(fā)明者】葛亞英, 田丹青, 金亮, 沈曉嵐, 潘曉韻, 劉曉靜 申請(qǐng)人:浙江省蕭山棉麻研究所