用于測(cè)量細(xì)胞增殖的雙標(biāo)記法
【專利摘要】本發(fā)明提供了利用核酸的雙脈沖標(biāo)記來(lái)測(cè)量細(xì)胞新生核酸合成的方法。使用核苷類似物進(jìn)行的核酸的第一脈沖標(biāo)記允許確定基線核酸合成速率。使用第二核苷類似物進(jìn)行的核酸的脈沖標(biāo)記允許測(cè)量核酸合成的任何變化?？蓪⒑怂岷铣蓽y(cè)量為細(xì)胞增殖(DNA)或基因表達(dá)(RNA)。該方法在脈沖標(biāo)記之間不需要潛在地引入假象的中間清洗步驟。此外，該方法通過(guò)在用競(jìng)爭(zhēng)性核苷類似物進(jìn)行處理的同時(shí)或在此之前用受試化合物處理細(xì)胞或生物體，可用于就對(duì)細(xì)胞增殖的作用篩選化合物。
【專利說(shuō)明】用于測(cè)量細(xì)胞增殖的雙標(biāo)記法
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?00980117709. 7、申請(qǐng)日為2009年5月14日、發(fā)明名稱為"用 于測(cè)量細(xì)胞增殖的雙標(biāo)記法"的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本公開(kāi)內(nèi)容涉及用于雙脈沖標(biāo)記核酸的方法。
[0003] 相關(guān)領(lǐng)域的描述
[0004] 通常通過(guò)向在其中培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中或飼喂動(dòng)物的飲用水中加入核酸糖類似 物（核苷），或通過(guò)將其注射入待標(biāo)記的動(dòng)物中來(lái)進(jìn)行以測(cè)定生長(zhǎng)速率為目的的脈沖標(biāo)記 細(xì)胞DNA。對(duì)DNA類似物的定時(shí)暴露（其具有將該DNA類似物摻入活躍地合成的DNA的潛 能）被定義為脈沖。用于脈沖標(biāo)記DNA的標(biāo)準(zhǔn)方法包括使用5-溴2' -脫氧尿苷（BrdU)或 放射性標(biāo)記的核苷類似物。
[0005] 用于檢測(cè)BrdU標(biāo)記的DNA或放射性標(biāo)記的DNA的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。例 如，可用抗BrdU單克隆抗體，然后用熒光標(biāo)記的二抗處理含有BrdU標(biāo)記的DNA的細(xì)胞。然 后可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括板測(cè)定、熒光顯微術(shù)、成像、高內(nèi)涵篩選或流式細(xì)胞術(shù)來(lái)顯現(xiàn)和定 量突光標(biāo)記。
[0006] 剖析復(fù)雜的細(xì)胞過(guò)程（包括細(xì)胞增殖），需要跟蹤生物分子（當(dāng)它們?cè)谒鼈兊脑?地（native habitat)中行使功能時(shí)）的能力。近年來(lái)，用于標(biāo)記生物分子的可選工具已從 化學(xué)生物領(lǐng)域顯現(xiàn)出來(lái)一生物正交化學(xué)報(bào)道分子（bioorthogonal chemical reporter)。 已描述了生物正交反應(yīng)部分用于檢測(cè)代謝物和翻譯后修飾的用途（使用疊氮化物部分作 為生物正交化學(xué)報(bào)道分子）。在通過(guò)代謝或通過(guò)化學(xué)修飾導(dǎo)入靶生物分子后，可通過(guò)使用 下列3個(gè)高選擇性反應(yīng)之一而用探針標(biāo)記疊氮化物：Staudinger連接、Cu(I)催化的疊氮 化物-炔經(jīng)環(huán)加成作用或張力提高的（strain-promoted) [3+2]環(huán)加成作用。Agard等人J Am Chem Soc.2004Nov 24 ; 126 (46):15046-7。
[0007] 生物正交化學(xué)報(bào)道分子之前已用于通過(guò)摻入核苷似類物而標(biāo)記核酸。因此，可 使用生物正交標(biāo)記例如Staudinger連接、疊氮化物和炔經(jīng)的Cu(I)-催化的[3+2]環(huán)加 成作用（"點(diǎn)擊化學(xué)"）或"無(wú)銅"點(diǎn)擊化學(xué)（其獨(dú)立地由Barry Sharpless和Carolyn Bertozzi 描述）脈沖標(biāo)記 DNA。Sharpless 等人 Angew Chem Int Ed Engl. 2002Mar 15; 41 (6) : 1053-7 (通過(guò)引用完全合并入本文）；Meldal 等人 J. Org. Chem. 2002,67, 3057 (通 過(guò)引用完全合并入本文）；八8&1(1等人14111〇161113〇(3.20041^〇￥24;126(46):15046-7(通 過(guò)引用完全合并入本文）；美國(guó)專利7, 122, 703 ;美國(guó)申請(qǐng)案2003000516671。點(diǎn)擊化學(xué) 和Staudinger連接適合于通過(guò)直接檢測(cè)核苷酸摻入來(lái)測(cè)量細(xì)胞增殖。參見(jiàn)Salic等人， Methods and Compositions for Labeling Nucleic Acids，美國(guó)申請(qǐng)案 20070207476 和 20070099222(于2006年10月27日提交）（通過(guò)引用完全合并入本文）。
[0008] 術(shù)語(yǔ)"點(diǎn)擊化學(xué)（click chemistry) "是指在銅（I)催化劑存在的情況下進(jìn)行的 [3+2]環(huán)加成反應(yīng)。銅（I)催化劑可由銅（I)離子或銅（I)螯合部分組成。銅（I)螯合部分 可以是"其特征在于存在2個(gè)或更多個(gè)可參與銅（I)離子配合物（含有多于一個(gè)的配位鍵） 的形成的極性基團(tuán)的任何實(shí)體"。Salic等人，美國(guó)專利申請(qǐng)案20070207476 (同上）。銅（I) 螯合劑在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，包括但不限于新亞銅試劑（neocuproine)和浴銅靈二磺酸鹽 (bathocuproine disulphonate)。Salic 等人，美國(guó)專利申請(qǐng) 20070207476 和 Sharpless 等 人，美國(guó)申請(qǐng)案2003000516671。
[0009] [3+2]環(huán)加反應(yīng)也稱為1，3偶極環(huán)加成，其可在1，3-偶極子與親偶極試劑 (dipolarophile)之間發(fā)生。1，3-偶極子與親偶極試劑的實(shí)例在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。例如， 1，3-偶極子可以是疊氮化物，親偶極試劑可以是炔烴。
[0010] 用于脈沖標(biāo)記DNA的點(diǎn)擊化學(xué)技術(shù)包括用含有反應(yīng)性不飽和基團(tuán)的第一核苷類 似物處理細(xì)胞以便將第一核苷類似物摻入新合成的DNA中。然后，將細(xì)胞與包含第二反應(yīng) 性不飽和基團(tuán)的連接至標(biāo)記物的試劑接觸，以便在第一與第二反應(yīng)性不飽和基團(tuán)之間發(fā)生 [3+2]環(huán)加成作用。
[0011] 用于脈沖標(biāo)記DNA的[3+2]環(huán)加成反應(yīng)的下列描述僅作為例子提供并且無(wú)意限定 本發(fā)明的范圍。
[0012] 作為使用點(diǎn)擊化學(xué)脈沖標(biāo)記DNA的一個(gè)實(shí)例，用有效量的炔烴修飾的核苷類似物 例如乙炔基-脫氧尿嘧啶（EdU)處理細(xì)胞，進(jìn)行指定的時(shí)間，以便將EdU摻入新合成的DNA。 在用EdU進(jìn)行脈沖標(biāo)記后，固定細(xì)胞、透化細(xì)胞，然后在銅（I)催化劑存在的情況下，將細(xì)胞 與染料標(biāo)記的疊氮化物反應(yīng)。通過(guò)[3+2]環(huán)加成反應(yīng)在染料與摻入的核苷類似物之間形成 共價(jià)鍵，然后染料標(biāo)記可使用標(biāo)準(zhǔn)方法（包括但不限于流式細(xì)胞術(shù)、熒光顯微術(shù)、成像、多 孔板測(cè)定或高內(nèi)涵篩選）來(lái)測(cè)量。
[0013] 在使用點(diǎn)擊化學(xué)脈沖標(biāo)記DNA的第二實(shí)例中，用有效量的疊氮化物修飾的核苷類 似物例如5-疊氮基-2' -脫氧尿嘧啶（AzdU)處理細(xì)胞，進(jìn)行指定的時(shí)間以便將AzdU摻入 新合成的DNA。在用AzdU進(jìn)行該脈沖標(biāo)記后，固定細(xì)胞,透化細(xì)胞,然后在銅（I)催化劑存 在的情況下將細(xì)胞與染料標(biāo)記的炔烴反應(yīng)。作為疊氮化物與炔烴部分之間的[3+2]環(huán)加成 反應(yīng)的結(jié)果，形成共價(jià)鍵。然后染料標(biāo)記可使用標(biāo)準(zhǔn)方法（包括但不限于流式細(xì)胞術(shù)、熒光 顯微術(shù)、成像、多孔板測(cè)定或高內(nèi)涵篩選）來(lái)測(cè)量。
[0014] 點(diǎn)擊化學(xué)的一個(gè)備選方法（已由Bertozzi等人描述）是"無(wú)銅"點(diǎn)擊化學(xué)反 應(yīng)，其利用緊張的（strained) [3+2]環(huán)加成反應(yīng)而不使用銅⑴催化劑。Bertozzi等 人，Compositions and methods for modification of biomolecules,美國(guó)專利申請(qǐng)案 20060110782 (2005年10月31日提交）（通過(guò)引用全部合并入本文中）。
[0015] 例如，可首先用有效量的疊氮化物修飾的核苷類似物例如AzdU處理細(xì)胞，進(jìn)行指 定的時(shí)間，以便將疊氮化物修飾的核苷類似物摻入新合成的DNA。在該AzdU的脈沖后，用有 效量的具有反應(yīng)性環(huán)炔部分的化合物或分子處理細(xì)胞以便在疊氮化物與環(huán)炔部分之間發(fā) 生緊張的[3+2]環(huán)加成反應(yīng)?？尚揎棴h(huán)炔以進(jìn)一步包含染料標(biāo)記，所述染料標(biāo)記則可使用 標(biāo)準(zhǔn)方法（包括但不限于流式細(xì)胞術(shù)、熒光顯微術(shù)、成像、多孔板測(cè)定或高內(nèi)涵篩選）來(lái)測(cè) 量?？捎糜诰o張的[3+2]環(huán)加成反應(yīng)以脈沖標(biāo)記DNA的環(huán)炔包括但不限于環(huán)辛炔、二氟環(huán) 辛炔、雜環(huán)炔（heterocycloalkyne)、二氯環(huán)辛炔、二溴環(huán)辛炔或二碘環(huán)辛炔。
[0016] 可將本領(lǐng)域內(nèi)已知的其他化學(xué)試劑用于脈沖標(biāo)記DNA。例如，可將Bertozzi等人 描述的疊氮化物-膦化學(xué)試劑（也稱為Staudinger連接）用于檢測(cè)疊氮化物修飾的核苷類 似物例如AzdU至新合成的DNA的慘入。參見(jiàn)Bertozzi等人，Chemoselective ligation， 美國(guó)專利申請(qǐng)20070037964 (2006年9月19日提交）（通過(guò)引用完全合并入本文）。首先 將細(xì)胞與有效量的疊氮化物修飾的核苷類似物例如AzdU接觸，進(jìn)行指定的時(shí)間。然后，將 細(xì)胞與經(jīng)工程改造的膦部分反應(yīng)。經(jīng)工程改造的膦部分的一個(gè)實(shí)例是2-二苯基膦-苯甲 酸甲酯。當(dāng)將疊氮化物-膦化學(xué)試劑用于脈沖標(biāo)記DNA時(shí)，經(jīng)工程改造的膦部分還包含染 料標(biāo)記。在疊氮化物與膦部分之間的反應(yīng)發(fā)生后，可使用標(biāo)準(zhǔn)方法，包括但不限于流式細(xì)胞 術(shù)、熒光顯微術(shù)、成像、多孔板測(cè)定或高內(nèi)涵篩選來(lái)測(cè)量染料標(biāo)記。
[0017] 在一些實(shí)驗(yàn)中，期望用2種不同的核苷類似物脈沖標(biāo)記DNA以便可建立基線增殖 速率。目前本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法，包括上述方法，需要在加入第二脈沖標(biāo)記物之前，從培養(yǎng) 基或生物體除去核苷類似物的第一脈沖標(biāo)記。該清洗要求導(dǎo)入了影響DNA合成的定量的假 象。因此，在本領(lǐng)域中需要用于雙脈沖標(biāo)記DNA而無(wú)中間清洗步驟的方法。
[0018] 發(fā)明概述
[0019] 本發(fā)明提供了使用2種或更多種核苷類似物來(lái)脈沖標(biāo)記核酸以測(cè)量細(xì)胞核酸合 成的基線和變化的方法。
[0020] 在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于測(cè)量細(xì)胞核酸合成的變化的方法，其中所述方法 包括：
[0021] a)將樣品與有效量的第一核苷或核苷酸類似物一起溫育以形成第一溫育樣品 (primary incubated sample)；
[0022] b)將第一溫育樣品與至少一種第二核苷或核苷酸類似物一起溫育以形成第二溫 育樣品(secondary incubated sample)；
[0023] c)將第二溫育樣品與第一標(biāo)記試劑和至少一種第二標(biāo)記試劑一起溫育以形成標(biāo) 記的樣品；
[0024] d)檢測(cè)標(biāo)記的樣品，其中測(cè)量第一和至少一種第二核苷或核苷酸類似物的摻入水 平，
[0025] 其中將至少一種第二核苷或核苷酸類似物的摻入水平相對(duì)于第一核苷或核苷酸 類似物的摻入水平的差異測(cè)量為細(xì)胞核酸合成的變化，
[0026] 前提是第一核苷或核苷酸或至少一種第二核苷或核苷酸包含生物正交功能部分 (bioorthogonal functional moiety)〇
[0027] 在其他實(shí)施方案中提供了用于測(cè)量細(xì)胞RNA合成的變化的方法，用于測(cè)量細(xì)胞 DNA合成的變化的方法和用于就對(duì)細(xì)胞增殖或基因表達(dá)的影響篩選化合物的方法。
[0028] 在某些方面，第一和/或第二核苷類似物包含生物正交功能部分，其中所述功能 部分可經(jīng)歷[3+2]環(huán)加成反應(yīng)或Staudinger連接。在一個(gè)情況下,生物正交功能部分包含 疊氮基、炔基或膦部分。在特定的方面，核苷類似物是乙炔基-脫氧尿嘧啶（EdU)或5-疊 氮基-2' -脫氧尿嘧啶（AzdU)。至少第一或第二核苷類似物包含生物正交功能部分。
[0029] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一或第二核苷類似物包含鹵素部分，其可以是溴、氯或 碘。在一個(gè)方面核苷類似物是BrdU。
[0030] 還提供了第一和至少一種第二標(biāo)記試劑，其中標(biāo)記試劑共價(jià)或非共價(jià)地鍵合至摻 入的核苷類似物。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一標(biāo)記試劑和第二標(biāo)記試劑是包含生物正交功能 部分的標(biāo)記物或抗體。在一個(gè)方面，標(biāo)記物是熒光染料。在另一個(gè)方面，抗體是抗BrdU抗 體。
[0031] 在某些方面，生物正交功能部分是疊氮化物，其中標(biāo)記試劑是羅丹明-疊氮化物、 Alexa Fluor? 350-疊氮化物、Alexa Fluor? 488-疊氮化物、Alexa Fluor? 555-疊 氮化物、Alexa Fluor? 568-疊氮化物、Alexa 568-疊氮化物、Alexa Fluor? 594-疊氮化物、Alexa Fluor? 633-疊氮化物、Alexa Fluor? 647-疊氮化物、 Pacific Blue?疊氮化物、Cascade Blue?疊氮化物、熒光素-疊氮化物、花菁-疊氮化物 (cyanine-azide)和四甲基羅丹明（TMR)-疊氮化物。
[0032] 在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，檢測(cè)第一核苷類似物和至少一種競(jìng)爭(zhēng)性核苷類似物 的摻入還可包括使用流式細(xì)胞術(shù)、熒光顯微術(shù)、成像、高內(nèi)涵篩選或多孔板測(cè)定。
[0033] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)用下列來(lái)測(cè)量細(xì)胞增殖：用有效量的第一核苷 類似物處理細(xì)胞；用有效量的至少一種第二核苷類似物處理細(xì)胞；檢測(cè)第一核苷類似物的 摻入；以及檢測(cè)至少一種競(jìng)爭(zhēng)性核苷類似物的摻入。
[0034] 在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，在用核苷類似物的第一脈沖標(biāo)記處理細(xì)胞后，應(yīng)用 特殊的處理或測(cè)試過(guò)程。此類測(cè)試處理或測(cè)試化合物可引起期望的細(xì)胞增殖的改變，如在 通過(guò)向培養(yǎng)基系統(tǒng)中或向被測(cè)試的動(dòng)物加入藥物來(lái)篩選癌癥治療藥物的情況下一樣。該處 理可與來(lái)自第二核苷類似物的脈沖（例如，BrdU的加入）同時(shí)或在此之前進(jìn)行，而在處理 過(guò)程中無(wú)除去或清除（在動(dòng)物的情況下）第一核苷類似物的間斷。
[0035] 在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，在選自但不限于下列的細(xì)胞上進(jìn)行測(cè)量細(xì)胞增殖的 方法Jurkat細(xì)胞、M0LT4細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、C0S7細(xì)胞、CH0K1細(xì)胞、A549細(xì)胞、3T3細(xì)胞、 佛波醇刺激的外周血淋巴細(xì)胞、U266、H929、L1210、K562、EL4、SK-BR3、HL60、MCF7、A431 和 BT-474。
[0036] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于測(cè)量細(xì)胞核酸合成的變化的試劑盒，其中試劑 盒包括：第一核苷或核苷酸類似物；至少一種第二核苷或核苷酸類似物，其中至少第一類 似物或所述至少一種第二核苷或核苷酸類似物包含生物正交功能部分；第一標(biāo)記試劑；和 第二標(biāo)記試劑。另外的試劑盒組分包括緩沖劑、檢測(cè)劑和使用試劑盒組分測(cè)量細(xì)胞核酸合 成的變化的說(shuō)明書(shū)。
[0037] 附圖概述
[0038] 圖1提供了顯示用EdU(K) μ M)的第一脈沖標(biāo)記和BrdU(K) μ M)的第二脈沖標(biāo)記 處理的細(xì)胞群體的圖，如利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的。圖被分為4個(gè)象限，第一象限（Ql)位于 左上角，第二象限（Q2)位于右上角，第三象限（Q3)位于左下角，以及第四象限（Q4)位于右 下角。象限Q3(左下）中的細(xì)胞群體對(duì)于EdU(第一脈沖）和BrdU(第二脈沖）都是陰性 的。象限Q2(右上）中的細(xì)胞群體對(duì)于EdU(第一脈沖）和BrdU(第二脈沖）都是陽(yáng)性的。
[0039] 圖2提供了顯示用EdU(IOyM)的第一脈沖標(biāo)記和BrdU(IOyM)的第二脈沖標(biāo) 記處理的細(xì)胞群體的一系列圖（如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的）。第一個(gè)圖（左）被分成四 個(gè)象限，第一象限（Ql)位于左上角，第二象限（Q2)位于右上角，第三象限（Q3)位于左下 角，以及第四象限（Q4)位于右下角。象限Q3(左下）中的細(xì)胞群體對(duì)于EdU(第一脈沖） 和BrdU(第二脈沖）都是陰性的。象限Q2(右上）中的細(xì)胞群體對(duì)于EdU(第一脈沖）和 BrdU(第二脈沖）都是陽(yáng)性的。中間的圖是EdU對(duì)DNA細(xì)胞周期的圖。使用的P4>P1的門(mén) 控證實(shí)一些EdU陽(yáng)性細(xì)胞是BrdU陰性的。此類細(xì)胞是在BrdU-摻入（第二脈沖）之前在 只摻入EdU的最初30分鐘的脈沖（第一脈沖）過(guò)程中已通過(guò)細(xì)胞周期的合成期的細(xì)胞。
[0040] 圖3A提供了顯示用EdU(K) μ M)的第一脈沖標(biāo)記和BrdU(K) μ M)的第二脈沖標(biāo) 記處理的細(xì)胞群體的一系列圖（如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的）。第一個(gè)圖（左）被分成四 個(gè)象限，第一象限（Ql)位于左上角，第二象限（Q2)位于右上角，第三象限（Q3)位于左下 角，以及第四象限（Q4)位于右下角。象限Q3(左下）中的細(xì)胞群體對(duì)于EdU(第一脈沖） 和BrdU(第二脈沖）都是陰性的。象限Q2(右上）中的細(xì)胞群體對(duì)于EdU(第一脈沖）和 BrdU(第二脈沖）都是陽(yáng)性的。中間的圖是EdU對(duì)DNA細(xì)胞周期的圖，門(mén)控P5>P1。中間的 圖顯示BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的亞群（其是EdU陰性的），該亞群是在30分鐘的只摻入EdU的第一 脈沖后進(jìn)入細(xì)胞周期的DNA合成期的細(xì)胞群體。圖3B提供了顯示用20 μ M濃度的EdU和 10 μ M濃度的BrdU的同時(shí)脈沖處理的細(xì)胞群體的圖（如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的）。該圖被 分成四個(gè)象限，第一象限（Ql)位于左上角，第二象限（Q2)位于右上角，第三象限（Q3)位于 左下角，以及第四象限（Q4)位于右下角。象限Q3(左下）中的細(xì)胞群體對(duì)于EdU和BrdU 都是陰性的。象限Q2(右上）中的細(xì)胞群體對(duì)于EdU和BrdU都是陽(yáng)性的。該圖顯示只檢 測(cè)到來(lái)自BrdU的陽(yáng)性信號(hào)并且未檢測(cè)到來(lái)自EdU的信號(hào)，從而證明BrdU優(yōu)先于EdU被摻 入。
[0041] 圖4提供了顯示用EdU(IOyM)的第一脈沖標(biāo)記和BrdU(IOyM)的第二脈沖標(biāo) 記處理的細(xì)胞群體的一系列圖（如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的）。第一個(gè)圖（左）被分成四 個(gè)象限，第一象限（Ql)位于左上角，第二象限（Q2)位于右上角，第三象限（Q3)位于左下 角，以及第四象限（Q4)位于右下角。象限Q3(左下）中的細(xì)胞群體對(duì)于EdU(第一脈沖） 和BrdU(第二脈沖）都是陰性的。象限Q2(右上）中的細(xì)胞群體對(duì)于EdU(第一脈沖）和 BrdU(第二脈沖）都是陽(yáng)性的。Q4象限是在第一脈沖中被EdU標(biāo)記但在第二脈沖中未被 BrdU的標(biāo)記的細(xì)胞，因?yàn)樗鼈円堰M(jìn)入G2/M并且不再合成DNA。Ql象限亞群是在第一脈沖 中未被EdU標(biāo)記但在第二脈沖中正好進(jìn)入DNA合成期并且被BrdU標(biāo)記的細(xì)胞。中間的圖 是EdU對(duì)細(xì)胞周期的圖。在中間和左邊的圖中，進(jìn)入或已通過(guò)細(xì)胞周期的DNA合成期的亞 群只顯示單個(gè)標(biāo)記。
[0042] 圖5提供了一系列圖，其顯示當(dāng)用EdU和BrdU同時(shí)處理細(xì)胞時(shí)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù) 只檢測(cè)到用BrdU標(biāo)記的DNA群體。左邊的第一個(gè)圖顯示EdU對(duì)只用EdU的單脈沖標(biāo)記處 理的DNA細(xì)胞周期的圖。第二個(gè)圖顯示BrdU對(duì)只用BrdU的單脈沖標(biāo)記處理的DNA細(xì)胞周 期的圖。第三和第四個(gè)圖顯示熒光核苷酸標(biāo)記對(duì)用EdU和BrdU同時(shí)處理的DNA細(xì)胞周期 的雙參數(shù)圖。只有BrdU被摻入用EdU和BrdU同時(shí)處理的細(xì)胞，如第三和第四個(gè)圖中所顯 示的。
[0043] 圖6提供了核苷類似物至DNA內(nèi)的摻入的描述。在圖的左側(cè)，EdU被摻入DNA雙 螺旋中。當(dāng)將EdU摻入DNA時(shí)，類似物是可容易地接近的，從而可使用Alexa Fluor?疊氮 化物進(jìn)行標(biāo)記而無(wú)需變性步驟。圖的右側(cè)顯示，變性是摻入的BrdU的標(biāo)準(zhǔn)的基于抗體的標(biāo) 記所必需的。
[0044] 圖7提供了標(biāo)記為A至C的一系列結(jié)果圖，其顯示用EdU (20 μ M)的第一脈沖標(biāo)記 和BrdU(K) μ Μ)的第二脈沖標(biāo)記處理的細(xì)胞群體（Ramos B淋巴細(xì)胞）（如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù) 檢測(cè)的）。
[0045] 圖8提供了標(biāo)記為A至C的一系列結(jié)果圖，其顯示用EdU(20 μ Μ)的第一脈沖標(biāo)記 和BrdU(K) μ Μ)的第二脈沖標(biāo)記處理的細(xì)胞群體（來(lái)自慢性髓性白血病細(xì)胞的Κ562人成 淋巴細(xì)胞）（如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的）。
[0046] 圖9-1至9-3提供了標(biāo)記為A至I的一系列結(jié)果圖，其顯示細(xì)胞群體（TF-Ia人成 紅細(xì)胞）。圖A至G顯示用EdU (20 μ M)的第一脈沖標(biāo)記和BrdU (10 μ M)的第二脈沖標(biāo)記 (使用改變的脈沖時(shí)間）處理的細(xì)胞群體（如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的）。圖H和I顯示只 用一個(gè)脈沖處理的細(xì)胞群體，圖H顯示只有EdU(20 μ M)的脈沖標(biāo)記的結(jié)果，圖I顯示只用 BrdU(K) μ M)的脈沖標(biāo)記的結(jié)果，如利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的。
[0047] 圖10提供了標(biāo)記為A至F的一系列結(jié)果圖，其顯示用EdU (20 μ Μ)的第一脈沖標(biāo) 記和BrdU(K) μ Μ)的第二脈沖標(biāo)記處理的細(xì)胞群體（ΤΗΡ-1單核細(xì)胞）（如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù) 檢測(cè)的）。
[0048] 圖11顯示在7個(gè)不同的處理?xiàng)l件下，為EdU和BrdU共陽(yáng)性（Q2)、EdU和BrdU共 陰性（Q3)、BrdU陽(yáng)性且EdU陰性（Ql)以及BrdU陰性且EdU陽(yáng)性（Q4)的細(xì)胞（Jurkat T 細(xì)胞淋巴細(xì)胞）的百分比。
[0049] 圖12-1和12-2提供了標(biāo)記為A至J的一系列結(jié)果圖，其顯示用EdU(20μΜ)的第 一脈沖標(biāo)記和BrdU(K) μ Μ)的第二脈沖標(biāo)記處理的細(xì)胞群體（Jurkat T-細(xì)胞淋巴細(xì)胞） (如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的）。
[0050] 發(fā)明詳述
[0051] 引言：
[0052] 在本文中我們描述了通過(guò)摻入生物正交核苷或核苷酸類似物（以便可雙標(biāo)記新 合成的細(xì)胞核酸而無(wú)需中斷性的清洗步驟）來(lái)測(cè)量細(xì)胞核酸合成的方法。此類類似物包 括但不限于鹵代的（例如BrdU)、疊氮基修飾的類似物，炔烴修飾的類似物或膦修飾的類似 物。然后通過(guò)測(cè)量熒光信號(hào)來(lái)檢測(cè)此類類似物的摻入，其中標(biāo)記物因類似物和標(biāo)記物的官 能團(tuán)或通過(guò)抗體而選擇性地連接至核酸類似物。對(duì)核苷（或核苷酸）類似物的定時(shí)暴露 (其具有將該類似物摻入活躍合成的細(xì)胞核酸的潛能）被定義為脈沖。脈沖可以測(cè)量基線 增殖、基線基因表達(dá)或?qū)μ囟ㄌ幚淼捻憫?yīng)。
[0053] 我們已發(fā)現(xiàn)，加入另外的使用不同核苷類似物（其被選擇性標(biāo)記）的脈沖，提供了 測(cè)量基線增殖和隨后的增殖變化而不會(huì)引入將類似物清洗或清除出被測(cè)量的細(xì)胞或系統(tǒng) 的假象的機(jī)制。還預(yù)期可進(jìn)行第三脈沖，例如，但不限于測(cè)量藥物對(duì)細(xì)胞增殖或基因表達(dá)的 相互作用的能力?？赏ㄟ^(guò)核酸的第一脈沖標(biāo)記記錄基線合成速率。無(wú)需除去第一脈沖的中 斷，可開(kāi)始第二脈沖。通常，除去第一脈沖標(biāo)記而導(dǎo)致的對(duì)細(xì)胞的中斷改變細(xì)胞增殖的速 率并且使得評(píng)估細(xì)胞增殖的變化變得困難。此外，無(wú)清洗步驟使得所述方法與高通量篩選 (HTS)相容。用于脈沖標(biāo)記核酸而不使用放射性核苷的兩個(gè)相容的方法產(chǎn)生了非常強(qiáng)大的 工具，該工具在一個(gè)情況下可用于評(píng)估離體或體內(nèi)癌癥治療。
[0054] 部分地基于這樣的概念來(lái)預(yù)測(cè)新型雙標(biāo)記方法，所述概念是：在加入第二類似物 之前來(lái)自第一脈沖的類似物被完全摻入，或第二類似物是第一類似物的競(jìng)爭(zhēng)者，以便第二 類似物被選擇性地?fù)饺胄律怂峋酆衔?。不希望受理論束縛，已顯示，在類似物EdU和BrdU 的情況下，在EdU的存在下，BrdU被選擇性地?fù)饺搿⒁?jiàn)，實(shí)施例3。
[0055] 定義：
[0056] 在詳細(xì)地描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于特定的組合物或方法步驟，因?yàn)?其可發(fā)生變化。應(yīng)當(dāng)指出，如在本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)中使用的，除非上下文另外明確 地指出，否則單數(shù)形式"a"、"an"和"the"包括復(fù)數(shù)所指物。因此，例如，"a fluorescent pH sensitive dye"包括許多染料，"a cell"包括許多細(xì)胞等。
[0057] 除非另外定義，否則本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 技術(shù)人員通常理解的意義相同的意義。還應(yīng)理解，當(dāng)描述連接至另一個(gè)化合物的化學(xué)部分 或分子時(shí)，為了綴合的目的，這些部分以基（radical)的形式存在。為了本文中描述的本發(fā) 明的目的，定義下列術(shù)語(yǔ)。
[0058] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"炔烴反應(yīng)性"是指與核苷類似物上的炔烴修飾的基團(tuán)選 擇性反應(yīng)以在炔烴修飾的基團(tuán)與炔烴反應(yīng)性基團(tuán)之間形成共價(jià)化學(xué)鍵的化學(xué)部分。炔烴反 應(yīng)性基團(tuán)的實(shí)例包括疊氮化物。"炔烴反應(yīng)性"還可指包含與炔烴基團(tuán)選擇性反應(yīng)的化學(xué)部 分的分子。
[0059] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"疊氮化物反應(yīng)性"是指與另一個(gè)分子上的疊氮基修飾的 基團(tuán)選擇性反應(yīng)以在疊氮基修飾的基團(tuán)與疊氮化物反應(yīng)性基團(tuán)之間形成共價(jià)化學(xué)鍵的化 學(xué)部分。疊氮化物反應(yīng)性基團(tuán)的實(shí)例包括炔烴和膦（例如三芳基膦）。"疊氮化物反應(yīng)性" 還可指包含與疊氮基選擇性反應(yīng)的化學(xué)部分的分子。
[0060] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"疊氮化物選擇性膦染料"是指化合物、分子或試劑，所 述化合物、分子或試劑包含具有染料標(biāo)記的工程改造的膦部分以便當(dāng)與疊氮化物反應(yīng)時(shí)， 在工程改造的膦部分與疊氮化物之間產(chǎn)生共價(jià)鍵。術(shù)語(yǔ)"工程改造的膦部分"是指包含 膦和親電子部分的部分。工程改造的膦部分的一個(gè)實(shí)例是2-二苯基膦基-苯甲酸甲酯 (2-diphenylphosphanyl-benzoic acid methyl ester)。其他工程改造的勝部分在本領(lǐng)域 內(nèi)是已知的。參見(jiàn)，例如，Bertozzi等人，美國(guó)專利申請(qǐng)案20070037964。
[0061] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"生物正交化學(xué)報(bào)道分子"或"生物正交標(biāo)記試劑"是指 包含化學(xué)柄（chemical handle)的可檢測(cè)標(biāo)記物，所述化學(xué)柄在摻入核酸后與存在的核苷 類似物選擇性地反應(yīng)，從而形成共價(jià)鍵。
[0062] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞"在本發(fā)明的體內(nèi)應(yīng)用的背景中意欲包括任何屬或 種的真核和原核細(xì)胞，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞尤為吸引人。"細(xì)胞"還意欲包括正常細(xì)胞和患病 細(xì)胞，例如癌細(xì)胞。
[0063] 術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞增殖"和"細(xì)胞的增殖"在本文中可互換地使用并且指通過(guò)單個(gè)細(xì)胞分 裂成子細(xì)胞而進(jìn)行的細(xì)胞群體的擴(kuò)增，或指單個(gè)細(xì)胞至子細(xì)胞的分裂。
[0064] 術(shù)語(yǔ)"化學(xué)柄"或"生物正交部分"，如本文中所使用的，是指特定的官能團(tuán)，例如 疊氮化物、炔烴、活化的炔烴、亞磷酸鹽/酯、膦等?；瘜W(xué)柄與下面定義的生物學(xué)反應(yīng)性基團(tuán) 的區(qū)別在于化學(xué)柄是這樣的部分，所述部分在天然發(fā)生的生物分子中是罕見(jiàn)的并且對(duì)于生 物分子（例如，天然細(xì)胞成分）是化學(xué)惰性的，但當(dāng)與疊氮化物-或炔烴-反應(yīng)性基團(tuán)反應(yīng) 時(shí)，反應(yīng)可在生物學(xué)相關(guān)條件（例如，細(xì)胞培養(yǎng)條件，例如在不存在過(guò)熱或嚴(yán)苛的反應(yīng)物的 情況下）有效地發(fā)生。
[0065] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"點(diǎn)擊化學(xué)"是指摻入的核苷類似物（核苷酸類似物）或 標(biāo)記試劑上的第一反應(yīng)性不飽和基團(tuán)與存在于標(biāo)記試劑或核苷類似物（核苷酸類似物） 上的第二反應(yīng)性不飽和基團(tuán)之間的[3+2]環(huán)加成反應(yīng)的銅催化形式。該點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)由 Sharpless 等人（Sharpless 等人，Angew Chem，Int. Ed. Engl.，2002,41:1596-1599)描述。
[0066] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"競(jìng)爭(zhēng)性核苷類似物"是指當(dāng)與第一核苷類似物同時(shí)加 入細(xì)胞或生物體中時(shí)，產(chǎn)生優(yōu)先用競(jìng)爭(zhēng)性核苷類似物而非第一核苷類似物標(biāo)記的細(xì)胞群體 的核苷類似物。例如，當(dāng)在雙脈沖實(shí)驗(yàn)中將BrdU(競(jìng)爭(zhēng)性核苷類似物）和EdU(第一核苷 類似物）同時(shí)加入細(xì)胞中時(shí)，只有BrdU(該對(duì)核苷類似物中的競(jìng)爭(zhēng)性核苷類似物）被摻入 DNA (參見(jiàn)，例如，圖5和實(shí)驗(yàn)例3)。
[0067] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"銅（I)催化劑"是指催化摻入的核苷類似物（核苷酸類 似物）或標(biāo)記試劑上的第一反應(yīng)性不飽和基團(tuán)與存在于標(biāo)記試劑或核苷類似物（核苷酸類 似物）上的第二反應(yīng)性不飽和基團(tuán)之間的[3+2]環(huán)加成反應(yīng)的化合物、分子或試劑。術(shù)語(yǔ) "銅（I)催化劑"包括外源性銅（I)以及銅螯合部分。術(shù)語(yǔ)"銅螯合部分"是指特征在于存 在2個(gè)或更多個(gè)可參與銅（I)離子配合物的形成的極性基團(tuán)的任何化合物、分子或試劑。 [0068] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"無(wú)銅點(diǎn)擊化學(xué)"是指可在生理?xiàng)l件下進(jìn)行的張力提高的 [3+2]環(huán)加成反應(yīng)，如由Bertozzi等人美國(guó)申請(qǐng)20060110782 ;Baskin等人PNAS 20070ct 23 ; 104 (43) : 16793-7 ;Agard 等人 J Am Chem Soc. 2004Nov 24 ; 126 (46) : 15046-7 所描述 的。通過(guò)使用包含緊張的環(huán)炔部分的第一分子（通常為標(biāo)記物）和包含疊氮化物部分的第 二分子（通常為核苷類似物）來(lái)完成反應(yīng)。第二分子上的疊氮化物部分在催化劑不存在的 情況下與第一分子上的緊張的環(huán)炔部分反應(yīng)，從而形成包含融合的疊氮化物/環(huán)炔環(huán)的終 綴合產(chǎn)物。
[0069] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"可檢測(cè)的響應(yīng)"是指可通過(guò)觀察或通過(guò)儀器直接或間接 地檢測(cè)的信號(hào)的發(fā)生或其變化。通常，可檢測(cè)的響應(yīng)是導(dǎo)致波長(zhǎng)分布模式的變化，或吸光度 或熒光的強(qiáng)度的變化，或光散射、熒光壽命、熒光偏振的變化，或上述參數(shù)的組合的光學(xué)響 應(yīng)。
[0070] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"染料"是指發(fā)射光以產(chǎn)生可觀察的可檢測(cè)信號(hào)的化合 物。
[0071] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"染料標(biāo)記的疊氮化物"和"疊氮化物-染料分子"是 指也用染料標(biāo)記的具有反應(yīng)性疊氮化物基團(tuán)的化合物或分子。實(shí)例包括但不限于：羅 丹明-疊氮化物、Alexa Fluor? 350-疊氮化物（Molecular ProbesTM/Invitrogen?， Carlsbad，CA)，Alexa Fluor? 488-疊氣化物（Molecular ProbesTM/InvitrogenTM， Carlsbad，CA), Alexa Fluor? 555-疊氮化物（Molecular ProbesTM/InvitrogenTM， Carlsbad，CA)、Alexa Fluor? 568-疊氣化物（Molecular ProbesTM/InvitrogenTM， Carlsbad，CA)、Alexa Fluor? 568-疊氮化物（Molecular ProbesTM/InvitrogenTM， Carlsbad，CA)、Alexa Fluor? 594-疊氣化物，Alexa FlllOr? 633-疊氣化物（Molecular ProbesTM/InvitrogenTM，Carlsbad，CA)、Alexa Fluor? 647-疊氣化物（Molecular ProbesTM/Invitrogen?，Carlsbad，CA), Cascade' Blue? 疊氣化物（Molecular Probes?/ Invitrogen?，Carlsbad，CA)、熒光素-疊氮化物、香豆素-疊氮化物、BODIPY-疊氮化物、花 菁-疊氮化物或四甲基羅丹明（TMR)-疊氮化物。
[0072] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"染料標(biāo)記的環(huán)炔"是指已被進(jìn)一步修飾從而包含染料標(biāo) 記的環(huán)炔。術(shù)語(yǔ)"環(huán)炔"是指可用于緊張的[3+2]環(huán)加成反應(yīng)以脈沖標(biāo)記DNA的化合物或 分子。在本說(shuō)明書(shū)中，環(huán)炔的實(shí)例包括但不限于：環(huán)辛炔、二氟環(huán)辛炔、雜環(huán)炔、二氮環(huán)辛炔、 二溴環(huán)辛炔或二碘環(huán)辛炔。
[0073] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"染料標(biāo)記的炔烴"是指已被進(jìn)一步修飾從而包含染料標(biāo) 記的炔烴。
[0074] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"雙標(biāo)記"是指其中用產(chǎn)生可區(qū)別的信號(hào)的兩種可檢測(cè)試 劑標(biāo)記核酸聚合物的標(biāo)記過(guò)程。由這樣的標(biāo)記過(guò)程產(chǎn)生的核酸聚合物稱為雙標(biāo)記的。
[0075] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"有效量"是指在細(xì)胞、組織或生物體中引發(fā)相關(guān)響應(yīng)的 物質(zhì)、化合物、分子、試劑或組合物的量。例如，在細(xì)胞與核苷類似物接觸的情況下，有效量 是摻入細(xì)胞的DNA中的核苷的量。
[0076] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"熒光團(tuán)"或"產(chǎn)生熒光的（fluorogenic)"是指在結(jié)合 目的生物化合物或分析物后顯示熒光的變化的組合物。本發(fā)明的優(yōu)選熒光團(tuán)包括在水性 介質(zhì)中具有高量子產(chǎn)量的熒光染料。示例性熒光團(tuán)，特別地，包括咕噸（xanthene)、吲哚、 borapolyazaindacene、呋喃和苯并呋喃、花菁。本發(fā)明的突光團(tuán)可被取代以改變突光團(tuán)的 溶解度、光譜性質(zhì)或物理性質(zhì)。
[0077] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記或標(biāo)記物"是指當(dāng)本發(fā)明的標(biāo)記試劑的部分用于本 方法時(shí)保持其天然性質(zhì)（例如光譜性質(zhì)、構(gòu)象和活性）的化學(xué)部分或蛋白質(zhì)。示例性報(bào)道 分子可以是可直接檢測(cè)的（熒光團(tuán)）或可間接檢測(cè)的（半抗原或酶）。此類報(bào)道分子包括 但不限于可使用輻射計(jì)數(shù)裝置測(cè)量的放射性報(bào)道分子；可目測(cè)觀察的或使用分光光度計(jì)測(cè) 量的色素、染料或其他色原（chromogen);可使用自旋標(biāo)記分析儀測(cè)量的自旋標(biāo)記物；和熒 光部分，其中通過(guò)激發(fā)合適的分子加合物產(chǎn)生輸出信號(hào)，并且其可通過(guò)用可被染料吸收的 光激發(fā)來(lái)顯現(xiàn)或可以例如使用標(biāo)準(zhǔn)熒光計(jì)或成像系統(tǒng)來(lái)測(cè)量。報(bào)道分子可以是發(fā)光物質(zhì)例 如磷光體或熒光發(fā)生素（fluorogen);生物發(fā)光物質(zhì)；化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，其中通過(guò)化學(xué)修飾信 號(hào)化合物來(lái)產(chǎn)生輸出信號(hào)；含有金屬的物質(zhì)；或酶，其中存在信號(hào)的酶依賴性二次產(chǎn)生，例 如從無(wú)色底物形成有色產(chǎn)物。報(bào)道分子還可以以化學(xué)或生物化學(xué)或惰性粒子的形式存在， 包括但不限于膠體金、微球體（microsphere)、量子點(diǎn)或無(wú)機(jī)晶體例如納米晶體或磷光體 (參見(jiàn)，例如，Beverloo,等人，Anal. Biochem. 203,326-34(1992))。術(shù)語(yǔ)報(bào)道分子還可指 "標(biāo)簽"或半抗原，所述標(biāo)簽或半抗原可選擇性結(jié)合標(biāo)記的分子以便標(biāo)記的分子，當(dāng)隨后加 入時(shí)，用于產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。例如，可使用生物素、亞氨基生物素或脫硫生物素作為標(biāo)簽， 然后使用辣根過(guò)氧化物酶（HRP)的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白綴合物來(lái)結(jié)合標(biāo)簽， 然后使用生色底物（例如，四甲基聯(lián)苯胺）或產(chǎn)生熒光的底物例如Amplex Red或Amplex Gold(Molecular Probes, Inc.)來(lái)檢測(cè)HRP的存在。以相似的方式，標(biāo)簽可以是半抗原或 抗原（例如，地高辛），并且酶促標(biāo)記的、熒光標(biāo)記的或放射性標(biāo)記的抗體可用于結(jié)合標(biāo)簽。 大量的報(bào)道分子對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的，并且包括但不限于顆粒、熒光染料、半 抗原、酶和它們的生色底物、產(chǎn)生熒光的底物和化學(xué)發(fā)光底物，以及Richard P. Haugland的 MOLECULAR PROBES HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS，第 10版， (2005)(其內(nèi)容通過(guò)引用合并入本文）和其他公開(kāi)來(lái)源中描述的其他報(bào)道分子。如本文中 所使用的，報(bào)道分子不是氨基酸。
[0078] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記試劑"是指用于標(biāo)記和檢測(cè)摻入的核苷酸類似物的 試劑。在一個(gè)情況下，標(biāo)記試劑包含標(biāo)記物和化學(xué)柄。在另一個(gè)情況下，標(biāo)記試劑包含抗體 和標(biāo)記物，其中抗體結(jié)合核苷類似物。
[0079] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"核苷類似物"和"核苷酸類似物"可互換地使用，并且是 指在結(jié)構(gòu)上與摻入新合成的核酸中的天然核苷或核苷酸相似的分子或化合物。在核苷的情 況下，當(dāng)在細(xì)胞內(nèi)時(shí)，它們被磷酸化成核苷酸，然后被摻入新生核酸聚合物。核苷酸因它們 的電荷而難以穿過(guò)細(xì)胞膜并且比核苷更不穩(wěn)定，從而它們的使用通常需要用于轉(zhuǎn)染的額外 步驟和試劑，以將核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)脂雙層。以與天然核苷酸相似的方式將所述核苷類似物 摻入核酸（DNA或RNA)，其中矯正聚合酶（correct polymerase)將類似物識(shí)別為天然核苷 酸并且在合成中不存在中斷。此類類似物包括最終用于檢測(cè)的許多不同部分，例如鹵代類 似物（溴、氯、碘等）和包含生物正交部分例如疊氮基、炔烴或膦的類似物。
[0080] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"反應(yīng)性基團(tuán)"是指能夠與另一個(gè)化學(xué)基團(tuán)反應(yīng)從而形成 共價(jià)鍵，即在合適的反應(yīng)條件下是共價(jià)反應(yīng)性的基團(tuán)，其通常代表另一種物質(zhì)的附著點(diǎn)。如 本文中所使用的，反應(yīng)性基團(tuán)是指通常在生物系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的、在正常生物學(xué)條件下反應(yīng)的 化學(xué)部分，此類反應(yīng)性基團(tuán)在本文中不同于上文中定義的化學(xué)柄或生物正交功能部分例如 本發(fā)明的疊氮基和活化的炔烴部分。如本文中所提及的，反應(yīng)性基團(tuán)是能夠與不同化合物 上的官能團(tuán)起化學(xué)反應(yīng)以形成共價(jià)鍵的部分，例如羧酸或琥珀酰亞胺酯。反應(yīng)性基團(tuán)通常 包括親核試劑、親電試劑和光激活基團(tuán)。
[0081] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"Staudinger連接"是指由Saxon和Bertozzi (E. Saxon和 C. Bertozzi，Science，2000,287:2007-2010)開(kāi)發(fā)的化學(xué)反應(yīng)，該反應(yīng)是經(jīng)典 Staudinger 反應(yīng)的改進(jìn)。經(jīng)典Staudinger反應(yīng)是其中疊氮化物與膦或亞磷酸鹽/酯的組合產(chǎn)生氮 雜葉立德（aza-ylide)中間產(chǎn)物的化學(xué)反應(yīng)，該中間產(chǎn)物在水解后產(chǎn)生膦氧化物和胺。 Staudinger反應(yīng)是將疊氮化物還原成胺的溫和方法；并且三苯基膦通常用作還原劑。在 Staudinger連接中，將親電講（electrophilic trap)(通常甲酯）適當(dāng)?shù)刂糜谌蓟?芳基上（通常為磷原子的鄰位）并且與疊氮化物反應(yīng)，從而產(chǎn)生氮雜-葉立德中間產(chǎn)物， 該中間產(chǎn)物在水性介質(zhì)中重排以產(chǎn)生具有酰胺基和膦氧化物功能的化合物。Staudinger 連接之所以如此命名是因?yàn)槠鋵蓚€(gè)起始分子連接在一起（附著/共價(jià)連接），而在經(jīng)典 Staudinger反應(yīng)中，兩個(gè)產(chǎn)物在水解后未共價(jià)連接。
[0082] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"受試化合物"和"受試處理"是指在請(qǐng)求保護(hù)的方法中 就其對(duì)細(xì)胞增殖或細(xì)胞周期的影響對(duì)其進(jìn)行測(cè)試的任何物質(zhì)、化合物、分子、試劑、組合物 或處理。此類"受試化合物"和"受試處理"對(duì)細(xì)胞增殖的影響不受結(jié)果限制，即，它們可增 力口、減少或不影響細(xì)胞增殖或細(xì)胞周期。
[0083] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"反應(yīng)性伴侶（reactive partner) "是指與另一個(gè)反應(yīng)性 伴侶例如本發(fā)明的核苷類似物和報(bào)道分子特異性反應(yīng)的分子或分子部分。
[0084] 雙標(biāo)記試劑：
[0085] 一般地，為了易于理解本發(fā)明，首先詳細(xì)地描述用于通過(guò)核苷或核苷酸類似物的 摻入而雙標(biāo)記核酸的成分，然后描述雙標(biāo)記方法。之后描述一些實(shí)施方案，其中將此類雙標(biāo) 記的核酸用于測(cè)量細(xì)胞增殖。然后公開(kāi)示例性方法。
[0086] 在進(jìn)一步描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于描述的特定實(shí)施方案，因?yàn)槠洚?dāng) 然可以變化。還應(yīng)理解，本文中使用的術(shù)語(yǔ)只是用于描述特定的實(shí)施方案而不意欲限定本 發(fā)明，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍只受所附權(quán)利要求書(shū)的限定。
[0087] 我們?cè)诒疚闹忻枋隽擞糜诰蛯?duì)新生細(xì)胞核酸合成的作用篩選受試化合物的方法， 其中將兩種顏色標(biāo)記用于測(cè)量與處理后的合成相比較的基線核酸合成。該方法使用被"飼 喂"給細(xì)胞并且摻入生長(zhǎng)的核酸聚合物的核苷類似物，其中至少一個(gè)核苷類似物包含生物 正交功能部分。
[0088] 在特定的實(shí)施方案中，提供了就對(duì)細(xì)胞增殖的作用而篩選受試化合物的方法。在 本文中，我們描述了用于雙標(biāo)記的方法，其中測(cè)量基線增殖以比較體內(nèi)或離體處理細(xì)胞后 增殖的變化。這可通過(guò)使用鹵代類似物（例如BrdU)或含有化學(xué)柄的核苷類似物與含有化 學(xué)柄的核苷類似物（其可使用本發(fā)明的標(biāo)記試劑來(lái)選擇性標(biāo)記）的組合來(lái)完成。本發(fā)明使 用至少一種含有化學(xué)柄（在本文中也稱為生物正交功能部分）的核苷（或核苷酸）類似物。
[0089] 類似地，還可將該雙標(biāo)記法用于測(cè)量響應(yīng)施用的處理的細(xì)胞基因表達(dá)（RNA合 成）。在該情況下，核酸類似物包含核糖，并且是RNA核苷或核苷酸類似物。
[0090] 該雙標(biāo)記法的有利方面是，其在施用核苷類似物的第二脈沖之前不需要從培養(yǎng)基 或動(dòng)物中除去核苷類似物的第一脈沖。對(duì)于第二標(biāo)記的另外脈沖，該'無(wú)清洗'處理的顯著 有利方面是，可使用第一脈沖核苷類似物，然后施用特定的處理或測(cè)試過(guò)程（其可引起細(xì) 胞增殖或基因表達(dá)的期望的改變）來(lái)進(jìn)行基線細(xì)胞增殖或基因表達(dá)的測(cè)量。例如，在通過(guò) 向培養(yǎng)基系統(tǒng)或向測(cè)試的動(dòng)物加入藥物而篩選癌癥治療藥物的情況下。該處理可以與來(lái)自 第二核苷類似物的脈沖同時(shí)進(jìn)行或在其之前進(jìn)行，而無(wú)用于除去第一類似物的處理過(guò)程的 中斷。在測(cè)試結(jié)束時(shí)，制備細(xì)胞以檢測(cè)標(biāo)記核酸的兩個(gè)脈沖。
[0091] 在一個(gè)特定的方面，包含生物正交功能部分的核苷類似物用于第一脈沖，然后使 用鹵代核苷類似物進(jìn)行第二脈沖。在另一個(gè)方面，包含第一生物正交功能部分的核苷類似 物用于第一脈沖，然后使用包含第二生物正交功能部分的核苷類似物進(jìn)行第二脈沖。使用 本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法檢測(cè)此類摻入的類似物。對(duì)于鹵代核苷類似物，使用選擇性識(shí)別特定 鹵素部分的抗體，所述抗體包含標(biāo)記物或通過(guò)包含標(biāo)記物的二抗來(lái)檢測(cè)。使用包含互補(bǔ) (complimentary)生物正交功能部分和標(biāo)記物的試劑（其導(dǎo)致標(biāo)記試劑與核苷類似物的共 價(jià)連接）檢測(cè)包含生物正交功能部分的核苷類似物。
[0092] 用于測(cè)量細(xì)胞增殖的該雙標(biāo)記法與已知的方法顯著不同，因?yàn)?)在兩個(gè)脈沖之 間不需要清洗處理和2)利用兩種顏色、第一和第二標(biāo)記物、熒光測(cè)量進(jìn)行檢測(cè)的兩個(gè)脈沖 標(biāo)記條件的相容性，其中一個(gè)核苷類似物包含生物正交功能部分。優(yōu)選，選擇第一和第二標(biāo) 記物以使它們產(chǎn)生可區(qū)別的可檢測(cè)的信號(hào)，換句話說(shuō)，可以以相同或不同的波長(zhǎng)激發(fā)標(biāo)記 物，但發(fā)射的波長(zhǎng)不同。
[0093] 在一個(gè)特定方面，當(dāng)使用兩種胸苷類似物時(shí)，在加入BrdU時(shí)，不必將第一脈沖核 苷5-乙炔基2' -脫氧尿苷（在本文中也稱為乙炔基尿嘧啶或EdU)從測(cè)試系統(tǒng)（細(xì)胞或動(dòng) 物）中除去，因?yàn)楫?dāng)BrdU存在時(shí)，EdU顯示不摻入核酸。該重要特征和之前未公開(kāi)的核苷 類似物的特征允許不間斷觀察基線細(xì)胞增殖測(cè)量和之后由施用特定處理而導(dǎo)致的細(xì)胞增 殖的改變的狀態(tài)。
[0094] 核苷和核苷酸類似物：
[0095] 核苷和核苷酸類似物都可用于測(cè)量新生核酸合成的本方法。核苷通常用于其中向 細(xì)胞培養(yǎng)物中加入或給動(dòng)物施用類似物的實(shí)驗(yàn)，因?yàn)楹塑疹愃莆镆子诒换罴?xì)胞吸收，其中 它們被磷酸化成核苷酸，然后摻入生長(zhǎng)的核酸聚合物。相反地，核苷酸不穩(wěn)定并且在摻入細(xì) 胞之前或之后易于被酶切割，其通常比核苷更不穩(wěn)定。此外，由于來(lái)自磷酸基團(tuán)的額外的電 荷，核苷酸不易被轉(zhuǎn)運(yùn)入活細(xì)胞，并且通常需要轉(zhuǎn)染步驟來(lái)獲得充足的穿過(guò)細(xì)胞膜的核苷 酸的濃度。這對(duì)于其中應(yīng)當(dāng)使細(xì)胞干擾保持至最低程度以正確地解釋結(jié)果的體內(nèi)或離體/ 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)是不理想的。因?yàn)檫@些原因，下列公開(kāi)內(nèi)容通常提及核苷作為加入至細(xì)胞或動(dòng)物 的類似物，然而這決不意欲是限定性的，其中核苷酸同樣重要。
[0096] 核苷類似物可以是4種DNA堿基（腺嘌呤（A)、胞嘧啶（C)、鳥(niǎo)嘌呤（G)或胸腺嘧 啶（T))中的任一種或4種RNA堿基（腺嘌呤（A)、胞嘧啶（C)、鳥(niǎo)嘌呤（G)或尿嘧啶（U)) 中的任一種的類似物，并且包括它們的三磷酸形式和亞磷酰胺形式，其中利用存在于細(xì)胞 中的聚合酶將此類類似物摻入新合成的核酸。將核苷修飾為類似物，其中它們包含最終用 于檢測(cè)該核苷和在核苷類似物存在的情況下合成所得的新生核酸聚合物的部分。
[0097] 在一個(gè)實(shí)施方案中，核苷類似物是鹵代類似物，包括但不限于溴、氯和碘部分。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，核苷類似物包含化學(xué)柄或生物正交功能部分，包括但不限于疊氮基、炔 烴和膦部分。鹵代類似物在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，例如BrdU、IdU、CldU和BrUTP，并且可購(gòu) 自許多提供商（Sigma，Saint Louis, MO ；Millipore, Billerica, MA ；Anaspec, San Jose, CA ;Invitrogen, Carlsbad, CA)。類似地用于檢測(cè)此類類似物的抗體也可商購(gòu)獲得（Dako, Carpinteria, CA ;BD Bioscience, San Diego, CA ;EMD Biosciences, Madison, WI) 〇
[0098] 包含適用于本文中描述的方法的生物正交功能部分的核苷類似物包括本文中定 義的任何核苷類似物，所述類似物包含可進(jìn)行[3+2]環(huán)加成或Staudinger連接的反應(yīng)性生 物正交部分或化學(xué)柄。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)性生物正交部分可由核苷的堿基攜帶。攜 帶反應(yīng)性生物正交部分的堿基可以是嘌呤（例如，腺嘌呤或鳥(niǎo)嘌呤）或嘧啶（例如，胞嘧 啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶）。在某些實(shí)施方案中，堿基是尿嘧啶；在一些此類實(shí)施方案中，尿嘧 啶在5-位置上攜帶反應(yīng)性生物正交部分。在某些實(shí)施方案中，堿基是腺嘌呤；在一些此類 實(shí)施方案，腺嘌呤攜帶反應(yīng)性生物正交部分。在某些實(shí)施方案，生物正交部分間接地連接至 堿基，而在其他實(shí)施方案中，生物正交部分直接共價(jià)地連接至堿基。可用于本文中描述的 方法的核苷類似物的非限定性實(shí)例包括乙炔基尿嘧啶或EdU和5-疊氮基-2' -脫氧尿嘧 啶（在本文中也稱為疊氮基尿嘧啶或AzdU)以及它們的三磷酸形式和亞磷酰胺形式?？苫?本上如C. -S. Yu和F. Oberdorfer，Synlett，2000,1:86-88中所述合成EdU ;并且可使用與 P. Sunthankar 等人，Anal. Biochem.，1998, 258:195-201 中描述的合成疊氮基-dUMP 的方法 類似的方法合成 AzdU。EdU 還可從 Berry and Associates，Inc. (Dexter，MI)商購(gòu)獲得。
[0099] 在某些實(shí)施方案中，反應(yīng)性生物正交部分由核苷的糖（核糖和脫氧核糖）攜帶。在 某些實(shí)施方案中，將生物正交部分間接連接至糖，然而在其他實(shí)施方案中，將生物正交部分 直接且共價(jià)地連接至糖。在某些實(shí)施方案中，反應(yīng)性生物正交部分連接至核苷的磷酸部分。 攜帶反應(yīng)性生物正交部分的糖可共價(jià)連接至嘌呤（例如，腺嘌呤或鳥(niǎo)嘌呤）或嘧啶（例如， 胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶）。在某些實(shí)施方案中，堿基是尿嘧啶，然而在其他實(shí)施方案中， 堿基是腺嘌呤?？捎糜诒疚闹忻枋龅姆椒ǖ暮塑疹愃莆锏姆窍薅ㄐ詫?shí)例包括EdU、AzdU或 鏈終止雙脫氧化合物例如AZT ;3' -疊氮基-2'，3' -雙脫氧腺苷、3' -疊氮基-3' -脫氧胸苷 (AZT)、5' -疊氮基-5' -脫氧胸苷、5- (1-乙炔基）-2' -O-甲基尿苷、5- (1-丙炔基）-2' -脫 氧尿苷、5-(塊丙基氧基）-2' -脫氧尿苷、8-疊氮基-2' -脫氧腺苷、3' -疊氮基-2'，3' -雙 脫氧腺苷。
[0100] 反應(yīng)性生物正交部分或化學(xué)柄可以是1，3-偶極子例如腈氧化物、疊氮化物、重氮 甲燒、硝酮或腈亞胺（nitrile imine)。在某些實(shí)施方案中，1,3-偶極子是疊氮化物。備選 地，反應(yīng)性生物正交功能部分可以是親偶極物（dipolarophile)例如烯經(jīng)（例如，乙烯基、 丙烯基等）或炔烴（例如，乙炔基、丙炔基等）。在某些實(shí)施方案中，親偶極物是炔烴例如乙 塊基。
[0101] 上述的這些生物正交功能部分是非天然、非擾亂性生物正交化學(xué)部分，其具有可 通過(guò)高選擇性反應(yīng)進(jìn)行修飾的獨(dú)特的化學(xué)功能性。特別地使用標(biāo)記試劑標(biāo)記此類摻入的核 苷，所述標(biāo)記試劑包含在細(xì)胞環(huán)鏡存在的情況下與核苷選擇性地形成共價(jià)鍵的化學(xué)柄。
[0102] 標(biāo)記試劑：
[0103] 試劑 A
[0104] 在特定的實(shí)施方案中，標(biāo)記試劑是一抗，其可被綴合至標(biāo)記物或可被共價(jià)連接至 標(biāo)記物的二抗結(jié)合，其中一抗結(jié)合摻入的核苷。在一個(gè)方面，其為抗BrdU抗體。在另一個(gè) 方面，抗體是抗IdU或抗CldU抗體。然而，還預(yù)期可選擇性結(jié)合摻入的核苷類似物的其他 抗體。
[0105] 試劑 B
[0106] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記試劑包含標(biāo)記物和化學(xué)柄?；瘜W(xué)柄，如上文定義的，是 選擇性地與功能部分反應(yīng)以形成共價(jià)鍵的生物正交功能部分。
[0107] 標(biāo)記或標(biāo)記物
[0108] 如上文已提及的，標(biāo)記物的作用是在標(biāo)記后使得能夠顯現(xiàn)或檢測(cè)核酸聚合物，例 如，細(xì)胞中的DNA。優(yōu)選，選擇標(biāo)記物（或可檢測(cè)的試劑或部分）以便其產(chǎn)生可測(cè)量的并且 其強(qiáng)度與標(biāo)記的核酸聚合物（例如被分析的樣品中的標(biāo)記的核酸聚合物）的量相關(guān)的（例 如，成比例的）信號(hào)。
[0109] 用于本文描述的方法和組合物中的標(biāo)記試劑的標(biāo)記物是在大于280nm的波長(zhǎng) 上展示最大吸收，并且當(dāng)共價(jià)連接至修飾的核苷例如（僅以舉例的方式），疊氮化物和炔 烴或膦時(shí)保持其光譜性質(zhì)的任何化學(xué)部分（有機(jī)的或無(wú)機(jī)的）。用于本文中描述的方法 和組合物中的標(biāo)記試劑的熒光團(tuán)包括但不限于：芘（包括美國(guó)專利5, 132, 432中公開(kāi)的 任何相應(yīng)的衍生化合物）、蒽、萘、吖啶、二苯乙烯、吲哚或苯并吲哚、噁唑或苯并噁唑、噻 唑或苯并噻唑、4-氨基-7-硝基苯-2-氧雜-1，3-二唑（NBD)、花菁（包括美國(guó)系列案 09/968, 401和09/969, 853中的任何相應(yīng)化合物）、羰花青（包括美國(guó)系列案09/557, 275 ; 09/969, 853 和 09/968, 401 ;美國(guó)專利 4, 981，977 ;5, 268, 486 ;5, 569, 587 ;5, 569, 766 ; 5, 486, 616 ；5, 627, 027 ；5, 808, 044 ；5, 877, 310 ；6, 002, 003 ；6, 004, 536 ；6, 008, 373 ； 6, 043, 025 ;6, 127, 134 ;6, 130, 094 ;6, 133, 445 ;和公開(kāi)案 WO 02/26891，WO 97/40104, WO 99/51702, TO 01/21624 ;EP 1065250A1 中的任何相應(yīng)化合物）、喹諾酮（carbostyryl)、 口卜啉、水楊酸、氨基苯甲酸鹽/酯、奧（azulene)、二萘嵌苯（perylene)、批陡、喹啉、 borapolyazaindacene (包括美國(guó)專利 4, 774, 339 ;5, 187, 288 ;5, 248, 782 ;5, 274, 113 和 5,433,896中公開(kāi)的任何相應(yīng)化合物）、咕噸（包括美國(guó)專利6, 162,931 ;6, 130, 101 ; 6, 229, 055 ;6, 339, 392 ;5, 451，343和美國(guó)系列案09/922, 333中公開(kāi)的任何相應(yīng)化合物）、 噁嗪（包括美國(guó)專利4, 714, 763中公開(kāi)的任何相應(yīng)化合物）或苯并噁嗪、卡巴嗪（包括 美國(guó)專利4, 810, 636中公開(kāi)的任何相應(yīng)化合物）、phenalenone、香豆素（包括美國(guó)專利 5, 696, 157 ;5, 459, 276 ;5, 501，980和5, 830, 912中公開(kāi)的相應(yīng)化合物）、苯并呋喃（包括美 國(guó)專利4, 603, 209和4, 849, 362中公開(kāi)的相應(yīng)化合物）和benzphenalenone (包括美國(guó)專 利4, 812, 409中公開(kāi)的任何相應(yīng)化合物）和其衍生物。如本文中所使用的，噁嗪包括試鹵 靈（resorufin)(包括5, 242, 805中公開(kāi)的任何相應(yīng)化合物）、氨基噁嗪酮、二氨基噁嗪和它 們的苯并取代類似物。
[0110] 用于本文中公開(kāi)的方法和組合物中的標(biāo)記試劑的咕噸型熒光團(tuán)包括但不限于熒 光素、對(duì)甲氨基酚（包括美國(guó)專利5, 227, 487和5, 442, 045中公開(kāi)的任何相應(yīng)化合物）或 羅丹明（包括美國(guó)專利5, 798, 276 ;5, 846, 737 ;美國(guó)系列案09/129, 015中的任何相應(yīng)化 合物）。如本文中所使用的，熒光素包括苯并或二苯并熒光素、半萘并熒光素或萘并熒光 素。類似地，如本文中所使用的，對(duì)甲氨基酚包括seminaphthorhodafluor(包括美國(guó)專利 4, 945, 171中公開(kāi)的任何相應(yīng)化合物）。在某些實(shí)施方案中，熒光團(tuán)是通過(guò)在咕噸的9-位 置上的單個(gè)共價(jià)鍵結(jié)合的咕噸。在其他實(shí)施方案中，咕噸包括在9-位置上連接的3H-咕 噸-6-醇-3-酮的衍生物、在9-位置上連接的6-氨基-3H-咕噸-3-酮的衍生物或在9-位 置上連接的6-氨基-3H-咕噸-3-亞胺的衍生物。
[0111] 在某些實(shí)施方案中，用于本文中描述的方法和組合物中的標(biāo)記試劑的熒光 團(tuán)包括咕噸（對(duì)甲氨基酚、羅丹明、熒光素和其衍生物）香豆素、花菁、芘、噁嗪和 borapolyazaindacene。在其他實(shí)施方案中，此類突光團(tuán)是磺化咕噸、氟化咕噸、磺化香豆 素、氟化香豆素和磺化花菁。還包括以商業(yè)名稱銷售并且通常稱為Alexa Fluor、DyLight、 Cy Dyes、B0DIPY、Oregon Green、Pacific Blue、IRDyes、FAM、FITC 和 ROX 的染料。
[0112] 用于標(biāo)記試劑的連接的熒光團(tuán)的選擇將決定修飾的核酸的吸收和熒光發(fā)射性質(zhì)。 可用于檢測(cè)修飾的核酸的熒光團(tuán)標(biāo)記物的物理性質(zhì)包括但不限于光譜特性（吸收、發(fā)射和 斯托克司頻移）、熒光強(qiáng)度、壽命、偏振和光漂白速率或其組合。所有這些物理性質(zhì)可用于 將一種熒光團(tuán)與另一種熒光團(tuán)相區(qū)別，從而允許多重分析。在某些實(shí)施方案，熒光團(tuán)在大于 480nm的波長(zhǎng)上具有最大吸收。在其他實(shí)施方案，熒光團(tuán)在488nm至514nm處或其附近（特 別適合于通過(guò)氬離子激光器激發(fā)源的輸出來(lái)激發(fā)）或546nm附近（特別適合于通過(guò)水銀燈 來(lái)激發(fā)）吸收。在其他實(shí)施方案中，熒光團(tuán)可在NIR(近紅外區(qū)）發(fā)射以用于組織或完整生 物體的應(yīng)用。熒光標(biāo)記試劑的其他期望的性質(zhì)可包括細(xì)胞滲透性和低毒性，例如，如果將在 細(xì)胞或生物體（例如，活動(dòng)物）中進(jìn)行核酸聚合物的標(biāo)記。
[0113] 在某些實(shí)施方案中，標(biāo)記試劑包括串聯(lián)染料（tandem dye)或FRET染料對(duì)。這對(duì) 于獲得一組在相同波長(zhǎng)下激發(fā)但具有不同發(fā)射光譜的標(biāo)記試劑特別有用。兩種染料，當(dāng)它 們十分靠近時(shí)（通常共價(jià)連接），用作FRET對(duì)，這樣可使來(lái)自激發(fā)的第一染料（供體）的能 量轉(zhuǎn)移至第二染料（受體），然后第二染料以更長(zhǎng)的波長(zhǎng)發(fā)射能量（與只激發(fā)第一染料而可 能產(chǎn)生的波長(zhǎng)相比）。特別有用的組合是美國(guó)專利7169939 ;6849745 ;5945526 ;5863727 ; 5800996和6967250中公開(kāi)的FRET染料對(duì)。
[0114] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記試劑包含突光納米晶體。
[0115] 對(duì)于各雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，必須基于使用的儀器選擇匹配的標(biāo)記試劑組以便可在正確的 波長(zhǎng)上適當(dāng)?shù)丶ぐl(fā)和測(cè)量染料以區(qū)別基線核酸合成與因處理而導(dǎo)致的隨后的核酸合成的 變化。匹配的熒光標(biāo)記染料對(duì)通常產(chǎn)生在光譜上可區(qū)別的信號(hào)。例如，在一些實(shí)施方案，匹 配對(duì)中的熒光染料不會(huì)顯著地吸收相同光譜范圍內(nèi)的光（即，它們展示不同的最大吸收波 長(zhǎng)）并且可使用兩個(gè)不同的波長(zhǎng)來(lái)激發(fā)（例如，相繼地激發(fā)）。備選地，匹配對(duì)中的熒光染料 可發(fā)射不同光譜范圍內(nèi)的光（即，它們?cè)诩ぐl(fā)后產(chǎn)生雙色熒光）。成對(duì)的熒光標(biāo)記物在本領(lǐng) 域內(nèi)是已知的（參見(jiàn)，例如，R.P.Haugland，"Molecular Probes:Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,同上）。
[0116] 特定的標(biāo)記物組的選擇將取決于待進(jìn)行的標(biāo)記的目的并且將由幾個(gè)因素決定，例 如標(biāo)記方法的容易程度和成本、期望的樣品標(biāo)記的質(zhì)量、可檢測(cè)部分對(duì)細(xì)胞或生物的作用、 檢測(cè)系統(tǒng)的性質(zhì)、由可檢測(cè)部分產(chǎn)生的信號(hào)的性質(zhì)和強(qiáng)度等。在特定情況下，一個(gè)標(biāo)記物被 選擇用于試劑A，第二標(biāo)記物被選擇用于試劑B。
[0117] 方法：
[0118] 將上述雙標(biāo)記成分用于本方法以通過(guò)細(xì)胞核酸的雙脈沖標(biāo)記測(cè)量細(xì)胞新生核酸 的合成。用核苷類似物進(jìn)行的核酸的第一脈沖標(biāo)記允許確定核酸合成的基線速率。然后用 另外的第二核苷類似物進(jìn)行的核酸的脈沖標(biāo)記允許測(cè)量核酸合成的任何變化。該方法在脈 沖標(biāo)記之間不需要可能引入假象的中間清洗步驟?？蓪⒑怂岷铣蓽y(cè)量為細(xì)胞增殖（在DNA 的情況下）或基因表達(dá)（在RNA的情況下）。此外，該方法可用于就其對(duì)細(xì)胞增殖或基因表 達(dá)的作用篩選化合物（通過(guò)在用第二核苷類似物處理的同時(shí)或在此之前用受試化合物處 理細(xì)胞或生物體）。
[0119] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于測(cè)量細(xì)胞核酸合成的變化的方法，其中所 述方法包括：
[0120] a)將樣品與有效量的第一核苷或核苷酸類似物一起溫育以形成第一溫育樣品；
[0121] b)將第一溫育樣品與至少一種第二核苷或核苷酸類似物一起溫育以形成第二溫 育樣品；
[0122] c)將第二溫育樣品與第一標(biāo)記試劑和至少一種第二標(biāo)記試劑一起溫育以形成標(biāo) 記的樣品；
[0123] d)檢測(cè)標(biāo)記的樣品，其中測(cè)量第一和至少一種第二核苷或核苷酸類似物的摻入水 平，
[0124] 其中將所述至少一種第二核苷或核苷酸類似物的摻入水平相對(duì)于第一核苷或核 苷酸類似物的摻入水平的差異測(cè)量為細(xì)胞核酸合成的變化，
[0125] 前提是第一核苷或核苷酸或至少一種第二核苷或核苷酸包含生物正交功能部分。
[0126] 因此，在一個(gè)方面，提供了用于測(cè)量可被測(cè)量為細(xì)胞增殖的細(xì)胞DNA合成的變化 的方法。在另一個(gè)方面，提供了用于測(cè)量可被測(cè)量為基因表達(dá)的細(xì)胞RNA合成的變化的方 法。
[0127] 在本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了就受試化合物對(duì)細(xì)胞增殖的作用篩選所 述化合物的方法。該方法可包括在用特定化合物治療疾病的過(guò)程中測(cè)量患者的細(xì)胞增殖變 化。
[0128] 可從患者取出癌細(xì)胞并且培養(yǎng)于培養(yǎng)物中。可用第一脈沖確定基線DNA合成速 率，然后加入藥物和第二核苷類似物，并測(cè)定DNA合成速率的變化，所述變化在癌細(xì)胞的藥 物抗性/敏感性的情況下可容易地測(cè)定。通過(guò)加上不改變細(xì)胞增殖狀態(tài)的準(zhǔn)確的基線合成 測(cè)量，可極大地改進(jìn)對(duì)在細(xì)胞周期的不同位置刺激或阻斷DNA合成的化合物的篩選。
[0129] 例如，可從患者中取出乳腺癌細(xì)胞并且培養(yǎng)于培養(yǎng)物中?？赏ㄟ^(guò)加入EdU的第一 脈沖來(lái)確定基線細(xì)胞增殖速率。然后，用化療藥物例如他莫昔芬處理細(xì)胞，用BrdU的第二 脈沖標(biāo)記處理細(xì)胞。然后通過(guò)比較EdU與BrdU的摻入來(lái)測(cè)量響應(yīng)他莫西芬的細(xì)胞增殖速 率?？稍谌橄侔┗颊叩闹委熯^(guò)程中重復(fù)該過(guò)程以確?；颊叩陌┘?xì)胞保持對(duì)選擇的化療劑 (在該情況下，他莫西芬）的響應(yīng)。在本實(shí)例中，臨床醫(yī)生期望在用化療藥物治療之后細(xì)胞 增殖減少。一旦乳腺癌患者的細(xì)胞中DNA的雙脈沖標(biāo)記顯示，在用特定的藥物治療后細(xì)胞 增殖無(wú)變化，那么臨床醫(yī)生可重新評(píng)估患者是可受益于使用該藥物的持續(xù)治療還是應(yīng)當(dāng)轉(zhuǎn) 向不同的化療劑。
[0130] 本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，本方法可適合于就化合物在許多疾病中對(duì)細(xì)胞增殖的作用 來(lái)篩選化合物。例如但無(wú)意限定本發(fā)明的范圍，下列是其進(jìn)展受改變至正常細(xì)胞增殖水平 影響的疾?。喝橄侔?、白血病、結(jié)腸癌、前列腺癌等（參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利6, 646,008(于 2000年2月22日提交））；神經(jīng)疾病，包括神經(jīng)退行性疾病例如亨廷頓?。℉untington's disease)(Curtis 等人，Increased Cell Proliferation and Neurogenesis in the Adult Human Huntington's disease brain，100(15)PNAS 9023-9027(2003 年 7 月 22 日））或 HIV 相關(guān)癡呆（Okamoto 等人，HIV/gpl20Decreases Adult Neural Progenitor Cell Proliferation via Checkpoint Kinase-Mediated Cell-Cycle Withdrawal and Gl Airest，I Cell Stem Cell 230-236(2007年8月16日））；和其他增生疾病包括銀屑病、皮 脂溢、濕疹、良性前列腺增生、先天性腎上腺增生、子宮內(nèi)膜增生、鱗狀細(xì)胞增生、皮脂腺增 生、克羅恩氏病、癌、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和淋巴瘤（參見(jiàn)美國(guó)專利7, 256, 034 (于2004年1月 5日提交））。
[0131] 在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于鑒定新型化合物的方法，所述化合物可稱 為"受試化合物"，其對(duì)細(xì)胞增殖具有期望的作用。取決于應(yīng)用，該期望的作用可以是刺激、 抑制或不影響細(xì)胞增殖。
[0132] 在鑒定受試化合物對(duì)細(xì)胞增殖是否具有作用的篩選方法中，已提出可就潛在有用 的藥劑的存在測(cè)定從天然來(lái)源例如植物、動(dòng)物或甚至來(lái)源例如海洋、森林或土壤樣品分離 的化合物。應(yīng)理解，待篩選的受試化合物還可來(lái)源于化學(xué)組合物或人造化合物。受試化合物 還可包括蛋白質(zhì)和肽，例如通過(guò)重組DNA技術(shù)或通過(guò)其他技術(shù)（包括肽合成）產(chǎn)生的蛋白 質(zhì)和肽。受試化合物還可以是抗體，包括多克隆和單克隆抗體。受試化合物還可包括天然發(fā) 生的化合物的片段或部分，或只有作為已知化合物的活性組合才可被發(fā)現(xiàn)（否則化合物失 活）。受試化合物還可包括核酸，包括但不限于：DNA ;核糖核酸（RNA);小干擾RNA (siRNA); 和單鏈核酸，更特別地，經(jīng)設(shè)計(jì)形成體內(nèi)三鏈體的單鏈核酸。
[0133] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明可用于在用已知影響細(xì)胞增殖的化合物處理后測(cè)量細(xì) 胞增殖。參見(jiàn)，例如，Nicholas R.Cozzarelli，The Mechanism of Action of Inhibitors of DNA Synthesis,46ANN. REV. BI0CHEM. 641-648(1977)〇
[0134] 在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，給生物體施用受試化合物?？蓪?duì)其施用所請(qǐng)求保護(hù) 的方法的生物體包括但不限于：人、小鼠、大鼠、馬、牛、綿羊、兔、狗或貓。
[0135] 可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法給生物體施用受試化合物和核苷類似物。 此類施用包括口服施用（例如，含有受試化合物和/或核苷類似物的丸劑、食物或液體的攝 入）或通過(guò)皮下、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用（例如，通過(guò)注射或局部給藥）。還可胃腸外、脊柱內(nèi) 或腦內(nèi)施用受試化合物。
[0136] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了測(cè)量細(xì)胞中而非生物體中的細(xì)胞增殖的方法。 可向在其中培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入核苷類似物。類似地，如果方法包括就受試化合物 對(duì)細(xì)胞增殖的作用而篩選受試化合物，那么可向在其中培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入受試化合 物。
[0137] 受試化合物對(duì)細(xì)胞增殖的作用的上述論述也預(yù)期涉及它們對(duì)基因表達(dá)的作用，其 中測(cè)量RNA合成的變化。
[0138] 在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，通過(guò)用有效量的EdU處理細(xì)胞，然后用有效量的 BrdU處理細(xì)胞來(lái)測(cè)量細(xì)胞中的細(xì)胞增殖。使用點(diǎn)擊化學(xué)試劑包括硫酸銅（CuSO4)和染料標(biāo) 記的疊氮化物（例如 Alexa Flu〇r@ 488-疊氮化物（Molecular ProbesTM/Invitrogen?， Carlsbad,CA))來(lái)檢測(cè)EdU脈沖標(biāo)記。使用標(biāo)準(zhǔn)的基于抗體的方法檢測(cè)BrdU脈沖標(biāo)記。參 見(jiàn)，例如，Jonathon Pines 等人，Assays for CDK Activity and DNA Replication in the Cell Cycle，CURRENT PROTOCOLS IN CELL BI0L0GY(Juan S. Bonifacino 等人 eds·，John Wiley&Sons，Inc. 2003) (1998)。然后使用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量?jī)煞N標(biāo)記物。
[0139] 在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可將該雙脈沖標(biāo)記法用于評(píng)估離體或體內(nèi)癌癥療 法?？蓮幕颊呷〕霭┘?xì)胞，并培養(yǎng)于培養(yǎng)物中。可使用第一脈沖確定基線DNA合成速率，然 后加入藥物和第二核苷類似物，并測(cè)定DNA合成速率的變化。不改變細(xì)胞增殖狀態(tài)的準(zhǔn)確 基線合成測(cè)量將極大地改進(jìn)篩選刺激或阻斷DNA合成的化合物的方法。
[0140] 在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量細(xì)胞增殖的方法?？蓪⒃撾p脈 沖標(biāo)記法用于評(píng)估對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。例如，可通過(guò)下列測(cè)量在用受試化合物處理后 神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞增殖速率的改變：將神經(jīng)細(xì)胞與核苷類似物的第一脈沖接觸；用受試化合 物進(jìn)行處理；在使用受試化合物進(jìn)行處理的同時(shí)或在此之后將神經(jīng)細(xì)胞與競(jìng)爭(zhēng)性核苷類似 物接觸；檢測(cè)第一核苷類似物的摻入和檢測(cè)競(jìng)爭(zhēng)性核苷類似物的摻入。因此，該雙脈沖標(biāo)記 法可用于鑒定刺激或抑制神經(jīng)細(xì)胞增殖的化合物。
[0141] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用這樣的方法就化合物對(duì)細(xì)胞增殖的作用篩選所 述化合物，所述方法包括步驟：用第一核苷類似物處理細(xì)胞；用受試化合物處理細(xì)胞；在使 用受試化合物處理細(xì)胞的同時(shí)或在此之后用至少一種競(jìng)爭(zhēng)性核苷類似物處理細(xì)胞；檢測(cè)第 一核苷類似物的摻入；和檢測(cè)第二核苷類似物的摻入。
[0142] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)下列步驟測(cè)量生物體中的細(xì)胞增殖：用第一 核苷類似物處理生物體；用至少一種第二核苷類似物處理生物體；檢測(cè)第一核苷類似物的 摻入；和檢測(cè)第二核苷類似物的摻入。
[0143] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)下列步驟測(cè)量生物體中的細(xì)胞增殖：用第一 核苷類似物處理生物體；用受試化合物處理生物體；在用受試化合物處理細(xì)胞的同時(shí)或在 此之后用至少一種競(jìng)爭(zhēng)性核苷類似物處理生物體；檢測(cè)第一核苷類似物的摻入；和檢測(cè)第 二核苷類似物的摻入。
[0144] 照射（Illumination)
[0145] 本發(fā)明的化合物可以在測(cè)定后或測(cè)定期間的任何時(shí)間用產(chǎn)生可檢測(cè)的光學(xué)響應(yīng) 的波長(zhǎng)的光來(lái)照射，并且利用檢測(cè)光學(xué)響應(yīng)的方法來(lái)觀察。在照射后，例如利用紫色或可見(jiàn) 波長(zhǎng)發(fā)射燈、弧光燈、激光器或甚至陽(yáng)光或普通室內(nèi)燈照射后，熒光化合物展示強(qiáng)烈的可見(jiàn) 吸收以及熒光發(fā)射。選擇的用于照射本發(fā)明的熒光化合物的設(shè)備包括但不限于手提式紫外 燈、水銀燈、氙氣燈、氬激光器、激光二極管和YAG激光器。任選地將這些照射源整合入激光 掃描器、流式細(xì)胞儀、熒光微板讀取器、標(biāo)準(zhǔn)或小型熒光計(jì)或色譜檢測(cè)器。該熒光發(fā)射任選 地通過(guò)目視觀察或通過(guò)使用任何下列裝置來(lái)檢測(cè)：CCD照相機(jī)、攝像機(jī)、照相膠片、激光掃 描裝置、熒光計(jì)、光電二極管、量子計(jì)數(shù)器、落射熒光顯微鏡、掃描顯微鏡、流式細(xì)胞儀、熒光 微板讀取器，或通過(guò)用于擴(kuò)增信號(hào)的方法（例如光電倍增管）來(lái)檢測(cè)。在使用流式細(xì)胞儀、 熒光顯微鏡或熒光計(jì)檢查樣品的情況下，任選地將儀器用于通過(guò)可檢測(cè)的不同的光學(xué)性質(zhì) (通常通過(guò)區(qū)別本發(fā)明的第一熒光化合物的熒光響應(yīng)與第二熒光團(tuán)的熒光響應(yīng)）來(lái)區(qū)別和 區(qū)分本發(fā)明的第一脈沖標(biāo)記試劑和第二標(biāo)記試劑。在使用流式細(xì)胞儀檢查樣品的情況下， 樣品的檢查任選地包括使用分選裝置基于熒光響應(yīng)來(lái)分離樣品中的顆粒。
[0146] 本發(fā)明的試劑盒
[0147] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括本發(fā)明的至少一種核苷類似物和標(biāo)記試劑的試 劑盒。試劑盒通常還包括在一個(gè)或多個(gè)方法（所述方法通常用于測(cè)量細(xì)胞核酸合成的變 化）中使用核苷類似物和標(biāo)記試劑的說(shuō)明書(shū)。
[0148] 在例性實(shí)施方案中，試劑盒包括第一核苷或核苷酸類似物，至少一種第二核苷 或核苷酸類似物，其中至少第一類似物或至少一種第二核苷或核苷酸類似物包含生物正交 功能部分，第一標(biāo)記試劑和第二標(biāo)記試劑。另外的試劑盒成分包括緩沖劑、其他檢測(cè)試劑和 標(biāo)準(zhǔn)品。
[0149] 上文已提供了本發(fā)明的詳細(xì)描述，下列實(shí)施例是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明而提供的并 且不應(yīng)當(dāng)解釋為是對(duì)本發(fā)明或權(quán)利要求的范圍的限制。 實(shí)施例
[0150] 下列實(shí)施例描述了本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案。然而，應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用 于舉例說(shuō)明目的并且無(wú)意限定本發(fā)明的范圍。
[0151] 實(shí)施例1
[0152] 按照已知的細(xì)胞活躍生長(zhǎng)所需的條件，通過(guò)提供恰當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)需求來(lái)建立 制備培養(yǎng)細(xì)胞（用于測(cè)量新合成的DNA (細(xì)胞增殖））的標(biāo)準(zhǔn)方法。在本實(shí)施例中，將Jurkat 細(xì)胞培養(yǎng)物以1:4稀釋至2x IO5個(gè)細(xì)胞/ml的密度。在將這些細(xì)胞培養(yǎng)2或3天后，以 20 μ M(適合于摻入正在經(jīng)歷DNA合成的細(xì)胞的DNA中的濃度）加入第一核苷類似物EdU。 在EdU存在的情況下培養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行30分鐘。在30分鐘的生長(zhǎng)后并且在不除去EdU (通過(guò) 在新鮮培養(yǎng)基中清洗細(xì)胞）的情況下，以10 μ M濃度加入適當(dāng)量的競(jìng)爭(zhēng)性核苷類似物BrdU， 然后將細(xì)胞培養(yǎng)30分鐘。然后收獲、清洗細(xì)胞，用70%冰冷的ETOH固定細(xì)胞，并于4°C下 貯存96小時(shí)。然后清洗細(xì)胞，將其在室溫下重懸浮于4M HCL中，進(jìn)行20分鐘。加入磷酸 鹽/檸檬酸緩沖液，將細(xì)胞清洗2次，然后以IxlOVml重懸浮于0. 1 % Tr i ton? X-100/1 % BSA/PBS中。然后，通過(guò)加入基于點(diǎn)擊化學(xué)的試劑進(jìn)行EdU的標(biāo)記，所述試劑包括含有在 Tris-緩沖鹽溶液中的CuSO4和Alexa Fluor? 488-疊氮化物（495nm最大激發(fā)/519nm 最大發(fā)射）（Molecular Probes?/Invitr〇gen?，Carlsbad, CA)的溶液。然后用 0· 1% Trit〇n?X-l〇〇/l%BSA/PBS 清洗細(xì)胞。之后，使用抗 BrdU 抗體 Alexa Fluor? 647 綴 合物（650nm 最大激發(fā)/670nm 最大發(fā)射）（Molecular ProbesTM/InvitrogenTM，Carlsbad， CA)進(jìn)行BrdU的標(biāo)記。為了檢測(cè)DNA含量，加入核酸染料SYTOX?Blue stain(444nm最 大激發(fā) /480nm 最大發(fā)射）（Molecular Probes⑧ /Invitrogen?，Carlsbad，CA)和 RNA 酶 (Invitrogen?，Carlsbad, CA)。利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行3種標(biāo)記的檢測(cè)。為了檢測(cè)EdU標(biāo)記， 使用488nm的激發(fā)，530/30nm的帶通。為了檢測(cè)BrdU標(biāo)記，使用633nm的激發(fā)，660/20nm 的帶通。為了檢測(cè)DNA含量，使用405nm的激發(fā)，450/50nm的帶通。
[0153] 實(shí)施例2
[0154] 按照已知的細(xì)胞活躍生長(zhǎng)所需的條件，通過(guò)提供恰當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)需求來(lái)建立 制備培養(yǎng)細(xì)胞（用于測(cè)量新合成的DNA (細(xì)胞增殖））的標(biāo)準(zhǔn)方法。在本實(shí)施例中，將Jurkat 細(xì)胞培養(yǎng)物以1:4稀釋至2x IO5個(gè)細(xì)胞/ml的密度。在將這些細(xì)胞培養(yǎng)2或3天后，以 20 μ M(適合于摻入正在經(jīng)歷DNA合成的細(xì)胞的DNA中的濃度）加入第一核苷類似物EdU。 在EdU存在的情況下培養(yǎng)細(xì)胞1小時(shí)。在1小時(shí)的生長(zhǎng)后并且在不除去EdU (通過(guò)在新鮮培 養(yǎng)基中清洗細(xì)胞）的情況下，以10 μ M濃度加入適當(dāng)量的競(jìng)爭(zhēng)性核苷類似物BrdU，然后將細(xì) 胞培養(yǎng)30分鐘。然后收獲、清洗細(xì)胞，用70%冰冷的ETOH固定細(xì)胞，并于4°C下貯存96小 時(shí)。然后清洗細(xì)胞，將其在室溫下重懸浮于4M HCL中，進(jìn)行20分鐘。加入磷酸鹽/檸檬酸 緩沖液，將細(xì)胞清洗2次，然后以lx IOVml重懸浮于0. l%Trit〇n? X-100/1% BSA/PBS 中。然后，通過(guò)加入基于點(diǎn)擊化學(xué)的試劑進(jìn)行EdU的標(biāo)記，所述試劑包括含有在TriS-緩沖 鹽溶液中的CuSO4和Alexa Fluor? 488-疊氮化物（495nm最大激發(fā)/519nm最大發(fā)射） (Molecular Probes?/Invitr〇gen?，Carlsbad, CA)的溶液。然后用 0· l%Trit〇n? X-100/1%BSA/PBS清洗細(xì)胞。之后，使用抗BrdU抗體Alexa Fluor? 647綴合物（650nm 最大激發(fā) /670nm 最大發(fā)射）（Molecular ProbesTM/InvitrogenTM，Carlsbad，CA)進(jìn)行 BrdU 的標(biāo)記。為了檢測(cè)DNA含量，加入核酸染料SYT0X? Blue stain(444nm最大激發(fā)/480nm 最大發(fā)射）（Molecular Probes? /Invitrogen?，Carlsbad，CA)和 RNA 酶（Invitrogen?， Carlsbad, CA)。利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行3種標(biāo)記的檢測(cè)。為了檢測(cè)EdU標(biāo)記，使用488nm的 激發(fā)，530/30nm的帶通。為了檢測(cè)BrdU標(biāo)記，使用633nm的激發(fā)，660/20nm的帶通。為了 檢測(cè)DNA含量，使用405nm的激發(fā)，450/50nm的帶通。
[0155] 實(shí)施例1-2的結(jié)果
[0156] 由于在加入核苷類似物的兩個(gè)脈沖之間沒(méi)有進(jìn)行可能導(dǎo)致新合成的DNA的速率 的變化的處理，因此兩種類似物的摻入應(yīng)當(dāng)是相當(dāng)?shù)摹Ｔ趫D中，可看到幾個(gè)細(xì)胞亞群。存在 不包含任一標(biāo)記的細(xì)胞（圖1，Q3象限）。此類細(xì)胞在測(cè)試期間未活躍地復(fù)制它們的DNA。
[0157] 還存在EdU和BrdU標(biāo)記都摻入DNA中的細(xì)胞（圖1，Q2象限）。此類細(xì)胞在兩個(gè) 脈沖和處理的整個(gè)測(cè)試過(guò)程中具有持續(xù)的DNA合成。
[0158] 還存在只具有來(lái)自第一脈沖的標(biāo)記物（EdU)的細(xì)胞群體（圖2和4)。此類細(xì) 胞在利用EdU進(jìn)行標(biāo)記的過(guò)程中處于合成晚期。這可在總DNA對(duì)EdU標(biāo)記的圖上的定位 (mapping)中看到。到加入BrdU的脈沖時(shí)，此類細(xì)胞已停止復(fù)制它們的DNA。
[0159] 還存在只具有來(lái)自第二脈沖的標(biāo)記物的細(xì)胞群體（圖3和4)。此類細(xì)胞在第一脈 沖期間未活躍地復(fù)制它們的DNA，但在第二脈沖期間進(jìn)入DNA合成期。根據(jù)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù) 收集的細(xì)胞群體的圖的模式，可容易地觀察和定量引起合成速率增加或減少的處理。
[0160] 實(shí)施例3
[0161] 在第三實(shí)驗(yàn)中，EdU和BrdU核苷類似物的同時(shí)加入只產(chǎn)生其DNA被BrdU標(biāo)記的 細(xì)胞群體（圖5)。該第三實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在加入第二標(biāo)記物之前無(wú)需清洗除去第一標(biāo)記物。然 后收獲、清洗細(xì)胞，用70%的冰冷ETOH固定細(xì)胞，并于4°C下貯存96小時(shí)。然后清洗細(xì)胞， 將其在室溫下重懸浮于4M HCL中，進(jìn)行20分鐘。加入磷酸鹽/檸檬酸緩沖液，將細(xì)胞清洗 2次，然后以lx IOVml重懸浮于0. 1%1'1^1：011@父-1〇〇/1%85六/^5中。然后，通過(guò)加入 基于點(diǎn)擊化學(xué)的試劑進(jìn)行EdU的標(biāo)記，所述試劑包括含有在Tris-緩沖鹽溶液中的CuSO 4和 Alexa Fluor? 488 綴合物（495nm 最大激發(fā)/519nm 最大發(fā)射）（Molecular Probes?/ Invitrogen?，Carlsbad，CA)的溶液。然后用 0· l%Trit〇n? X-100/1% BSA/PBS 清洗細(xì) 胞。之后，使用抗BrdU抗體Alexa Fluor? 647綴合物（650nm最大激發(fā)/670nm最大發(fā) 射）（Molecular Probes?/Invitrogen?，Carlsbad，CA)進(jìn)行 BrdU 的標(biāo)記。為了檢測(cè) DNA 含量，加入核酸染料SYT0X? Blue stain(444nm最大激發(fā)/480nm最大發(fā)射）（Molecular Probes? /Invitrogen?，Carlsbad, CA)和 RNA 酶（Invitrogen?，Carlsbad, CA)。利用流 式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行3種標(biāo)記的檢測(cè)。為了檢測(cè)EdU標(biāo)記，使用488nm的激發(fā)，530/30nm的帶通。 為了檢測(cè)BrdU標(biāo)記，使用633nm的激發(fā)，660/20nm的帶通。為了檢測(cè)DNA含量，使用405nm 的激發(fā)，450/50nm的帶通。該結(jié)果證明，在兩種核苷類似物存在的情況下，只有BrdU類似物 被摻入DNA，從而確認(rèn)了在加入競(jìng)爭(zhēng)性核苷類似物之前無(wú)需清洗步驟的方法的功效。BrdU 類似物顯示與EdU競(jìng)爭(zhēng)（當(dāng)兩者在核酸合成期間都存在時(shí)）。
[0162] 實(shí)施例4:
[0163] 按照已知的細(xì)胞活躍生長(zhǎng)所需的條件，通過(guò)提供恰當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)需求來(lái)建立 制備培養(yǎng)細(xì)胞（用于測(cè)量新合成的DNA (細(xì)胞增殖））的標(biāo)準(zhǔn)方法。在本實(shí)施例中，將Jurkat 細(xì)胞培養(yǎng)物以1:4稀釋至2x IO5個(gè)細(xì)胞/ml的密度。在將這些細(xì)胞培養(yǎng)2或3天后，以 20 μ M(適合于摻入正在經(jīng)歷DNA合成的細(xì)胞的DNA中的濃度）加入第一核苷類似物EdU。 在EdU存在的情況下培養(yǎng)細(xì)胞1小時(shí)。在1小時(shí)的生長(zhǎng)后并且在不除去EdU (通過(guò)在新鮮培 養(yǎng)基中清洗細(xì)胞）的情況下，以10 μ M濃度加入適當(dāng)量的競(jìng)爭(zhēng)性核苷類似物BrdU，然后將細(xì) 胞培養(yǎng)1小時(shí)。然后收獲、清洗細(xì)胞，用70%的冰冷ETOH固定細(xì)胞，并于4°C下貯存96小 時(shí)。然后清洗細(xì)胞，將其在室溫下重懸浮于4M HCL中，進(jìn)行20分鐘。加入磷酸鹽/檸檬酸 緩沖液，將細(xì)胞清洗2次，然后以lx IOVml重懸浮于0. 1 % TritonX/1 % BSA/PBS中。使用 抗BrdU抗體Alexa Fluor? 647綴合物（650nm最大激發(fā)/670nm最大發(fā)射）（Molecular ProbesTM/Invitrogen TM，Ca;rlsbad，CA)進(jìn)行 BrdU 的標(biāo)記。然后用 0· 1% TritonX/1% BSA/ PBS清洗細(xì)胞。之后，通過(guò)加入基于點(diǎn)擊化學(xué)的試劑進(jìn)行EdU的標(biāo)記，所述試劑包括含有在 Tris-緩沖鹽溶液中的CuSO4和Alexa Fluor? 488-疊氮化物（495nm最大激發(fā)/519nm 最大發(fā)射）（Molecular ProbesTM/InvitrogenTM，Carlsbad，CA)的溶液。為 了檢測(cè) DNA 含 量，加入核酸染料SYTOX? Blue stain(444nm最大激發(fā)/480nm最大發(fā)射）（Molecular ProbesTM/InvitrogenTM，Carlsbad，CA)和 RNA 酶（Invitrogen?，Carlsbad，CA)。利用流式 細(xì)胞術(shù)進(jìn)行3種標(biāo)記的檢測(cè)。為了檢測(cè)EdU標(biāo)記，使用488nm的激發(fā)，530/30nm的帶通。為 了檢測(cè)BrdU標(biāo)記，使用633nm的激發(fā)，660/20nm的帶通。為了檢測(cè)DNA含量，使用405nm的 激發(fā)，450/50nm的帶通。
[0164] 實(shí)施例5
[0165] 按照已知的細(xì)胞活躍生長(zhǎng)所需的條件，通過(guò)提供恰當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)需求來(lái)建立 制備培養(yǎng)細(xì)胞（用于測(cè)量新合成的RNA(基因表達(dá)））的標(biāo)準(zhǔn)方法。在本實(shí)施例中，將HeLa 細(xì)胞培養(yǎng)物在6孔板內(nèi)的蓋玻片上以1:4稀釋至2x IO5個(gè)細(xì)胞的密度。在將這些細(xì)胞培 養(yǎng)2天后，以適合于摻入活躍地轉(zhuǎn)錄信使的細(xì)胞的RNA中的濃度加入第一核苷類似物EU。 在EU存在的情況下培養(yǎng)細(xì)胞1小時(shí)。在1小時(shí)的生長(zhǎng)后并且在不除去EU(通過(guò)在新鮮培 養(yǎng)基中清洗細(xì)胞）的情況下，以10 μ M濃度加入適當(dāng)量的競(jìng)爭(zhēng)性核苷類似物BrU，然后將細(xì) 胞培養(yǎng)30分鐘。然后收獲、清洗細(xì)胞，用3. 7%甲醛/PBS在4°C下固定細(xì)胞30分鐘。然后 用3% BSA/PBS清洗細(xì)胞，在1. 0% Triton? X-100/PBS中進(jìn)行透化，并通過(guò)首先用IMHCl 在4°C下進(jìn)行10分鐘，然后用2M HCl在室溫下進(jìn)行30分鐘來(lái)進(jìn)行變性。然后使用硼酸鹽 緩沖液中和細(xì)胞。然后，通過(guò)加入基于點(diǎn)擊化學(xué)的試劑進(jìn)行EU的標(biāo)記，所述試劑包括含有 在Tris-緩沖鹽溶液中的CuSO 4和Alexa Fluor? 488綴合物（495nm最大激發(fā)/519nm 最大發(fā)射）（Molecular Probes?/Invitrogen?，Carlsbad, CA)的溶液。然后用 1.0% Triton? X-l〇〇/3%BSA/PBS清洗和封閉細(xì)胞。之后，使用抗BrdU抗體和第二檢測(cè)抗體 Alexa Fluor? 647 綴合物（650nm 最大激發(fā)/670nm 最大發(fā)射）（Molecular Pf〇beS?/ Invitrogen?，Carlsbad, CA)進(jìn)行BrU的標(biāo)記。為了檢測(cè)EdU標(biāo)記，使用470/50nm的激發(fā)， 545/75nm的帶通。為了檢測(cè)BrdU標(biāo)記，使用630/50nm的激發(fā)，695/55nm的帶通。使用標(biāo) 準(zhǔn)技術(shù)和適當(dāng)?shù)臑V光片通過(guò)熒光顯微術(shù)進(jìn)行2種標(biāo)記的檢測(cè)。
[0166] 實(shí)施例6
[0167] 按照已知的細(xì)胞活躍生長(zhǎng)所需的條件，通過(guò)提供恰當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)需求來(lái)建立 制備培養(yǎng)細(xì)胞（用于測(cè)量新合成的RNA(基因表達(dá)））的標(biāo)準(zhǔn)方法。在本實(shí)施例中，將HeLa 細(xì)胞培養(yǎng)物在6孔板內(nèi)的蓋玻片上以1:4稀釋至2x IO5個(gè)細(xì)胞的密度。在將這些細(xì)胞培養(yǎng) 2天后，以適合于摻入活躍地轉(zhuǎn)錄信使的細(xì)胞的RNA中的濃度加入第一核苷類似物EU。在 EU存在的情況下培養(yǎng)細(xì)胞1小時(shí)。在1小時(shí)的生長(zhǎng)后并且在不除去EU(通過(guò)在新鮮培養(yǎng)基 中清洗細(xì)胞）的情況下，以10 μ M濃度加入適當(dāng)量的α -鵝膏蕈堿（100 μ g/mL)和適當(dāng)量的 競(jìng)爭(zhēng)性核苷類似物BrU，然后將細(xì)胞培養(yǎng)15分鐘。讓細(xì)胞生長(zhǎng)另外5至30分鐘的時(shí)間。然 后收獲、清洗細(xì)胞，用3. 7%甲醛/PBS在4°C下固定細(xì)胞30分鐘。然后用3% BSA/PBS清洗 細(xì)胞，在1.0%Trit〇n? X-100/PBS中進(jìn)行透化，并通過(guò)首先用IM HCl在4°C下進(jìn)行10分 鐘，然后用2M HCl在室溫下進(jìn)行30分鐘來(lái)進(jìn)行變性。然后使用硼酸鹽緩沖液中和細(xì)胞。然 后，通過(guò)加入基于點(diǎn)擊化學(xué)的試劑進(jìn)行EU的標(biāo)記，所述試劑包括含有在Tris-緩沖鹽溶液 中的CuSO 4和Alexa Fluor? 488綴合物（495nm最大激發(fā)/519nm最大發(fā)射）（Molecular Pr〇beS?/Invitr〇gen TM，Carlsbad，CA)的溶液。然后用 L0%Trit〇n? X_l〇〇/3%BSA/ PBS清洗和封閉細(xì)胞。之后，使用抗BrdU抗體和第二檢測(cè)抗體Alexa Fluor? 647綴合 物（650nm 最大激發(fā)/670nm 最大發(fā)射）（Molecular Probes? /Invitr〇gen?，Carlsbad, CA)進(jìn)行BrU的標(biāo)記。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和適當(dāng)?shù)臑V光片通過(guò)熒光顯微術(shù)進(jìn)行2種標(biāo)記的檢 測(cè)。為了檢測(cè)EdU標(biāo)記，使用470/50nm的激發(fā)，545/75nm的帶通。為了檢測(cè)BrdU標(biāo)記，使 用630/50nm的激發(fā)，695/55nm的帶通。
[0168] 實(shí)施例7
[0169] 按照已知的細(xì)胞活躍生長(zhǎng)所需的條件，通過(guò)提供恰當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)需求來(lái)建立 制備培養(yǎng)細(xì)胞（用于測(cè)量新合成的RNA(基因表達(dá)））的標(biāo)準(zhǔn)方法。在本實(shí)施例中，將HeLa 細(xì)胞培養(yǎng)物以1:4稀釋至2x IO5個(gè)細(xì)胞/ml的密度。在將這些細(xì)胞培養(yǎng)2或3天（達(dá)到 70%匯合）后，用第一核苷類似物EUTP脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染（Iipofect)它們，以將化合物以適合于 摻入活躍地轉(zhuǎn)錄信使的細(xì)胞的RNA中的濃度遞送至細(xì)胞核。在EUTP存在的情況下培養(yǎng)細(xì)胞 15分鐘。在15分鐘的培養(yǎng)后并且在不除去EUTP的情況下，用以適當(dāng)?shù)臐舛燃尤氲母?jìng)爭(zhēng)性 核苷類似物BrUTP脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后讓細(xì)胞再生長(zhǎng)另外15分鐘。然后在收獲前讓細(xì)胞 生長(zhǎng)不同的時(shí)間。然后收獲、清洗細(xì)胞，用3.7%甲醛/PBS在4°C下固定細(xì)胞30分鐘。然 后用3% bsa/pbs清洗細(xì)胞，在i.o%Triton? x-100/pbs中進(jìn)行透化，并通過(guò)首先用IM HCl在4°C下進(jìn)行10分鐘，然后用2M HCl在室溫下進(jìn)行30分鐘來(lái)進(jìn)行變性。然后使用硼酸 鹽緩沖液中和細(xì)胞。然后，通過(guò)加入基于點(diǎn)擊化學(xué)的試劑進(jìn)行EU的標(biāo)記，所述試劑包括含 有在Tris-緩沖鹽溶液中的CuSO 4和Alexa F1UQ1：? 488綴合物（495nm最大激發(fā)/519nm 最大發(fā)射）（Molecular Probes?/Invitrogen?，Carlsbad, CA)的溶液。然后用 1.0% Triton? X-100/3% BSA/PBS清洗和封閉細(xì)胞。之后，使用抗BrdU抗體和第二檢測(cè)抗體 Alexa Fluor? 647 綴合物（650nm 最大激發(fā)/670nm 最大發(fā)射）（Molecular Probes?/ Invitrogen?，Carlsbad, CA)進(jìn)行BrU的標(biāo)記。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和適當(dāng)?shù)臑V光片通過(guò)突光顯 微術(shù)進(jìn)行2種標(biāo)記的檢測(cè)。為了檢測(cè)EdU標(biāo)記，使用470/50nm的激發(fā)，545/75nm的帶通。 為了檢測(cè)BrdU標(biāo)記，使用630/50nm的激發(fā)，695/55nm的帶通。
[0170] 實(shí)施例8
[0171] 按照已知的細(xì)胞活躍生長(zhǎng)所需的條件，通過(guò)提供恰當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)需求來(lái)建立 制備培養(yǎng)細(xì)胞（用于測(cè)量新合成的DNA)的標(biāo)準(zhǔn)方法。在本實(shí)施例中，將HeLa細(xì)胞培養(yǎng)物 在6孔板內(nèi)的蓋玻片上以1:4稀釋至2x105個(gè)細(xì)胞的密度。在將這些細(xì)胞培養(yǎng)2天后，以 10 μ M(適合于摻入正在經(jīng)歷DNA合成的細(xì)胞的DNA中的濃度）加入第一核苷類似物EdU。 在EdU存在的情況下培養(yǎng)細(xì)胞1小時(shí)。在1小時(shí)的生長(zhǎng)后并且在不除去EdU(通過(guò)在新鮮 培養(yǎng)基中清洗細(xì)胞）的情況下，以IOmM加入適當(dāng)量的用于標(biāo)記新合成的DNA的第二核苷 類似物AzdU，和加入改變細(xì)胞增殖速率的藥物，并且培養(yǎng)細(xì)胞另外30分鐘。在第二次溫育 后，以10 μ M濃度加入第三競(jìng)爭(zhēng)性類似物BrdU，和加入改變細(xì)胞增殖速率的第二處理，并且 培養(yǎng)細(xì)胞另外30分鐘。然后收獲、清洗細(xì)胞，用3. 7%甲醛/PBS在4°C下固定細(xì)胞30分 鐘。然后用3% BSA/PBS清洗細(xì)胞，在i.o%Triton? X-100/PBS中進(jìn)行透化，并通過(guò)首 先用IM HCl在4°C下進(jìn)行10分鐘，然后用2M HCl在室溫下進(jìn)行20分鐘來(lái)進(jìn)行變性。然 后使用硼酸鹽緩沖液中和細(xì)胞。然后，通過(guò)下列來(lái)進(jìn)行AzU的標(biāo)記：用3 %的在PBS中的 BSA清洗細(xì)胞2次，并加入基于無(wú)銅點(diǎn)擊化學(xué)的試劑，所述試劑包括含有在Tris-緩沖鹽溶 液中的Alexa Fluor? 488-限制性環(huán)炔（495nm最大激發(fā)/519nm最大發(fā)射）（Molecular Probes?/Invitrogen?，Carlsbad, CA)的溶液。在該反應(yīng)后，通過(guò)加入基于點(diǎn)擊化學(xué)的試 劑進(jìn)行EdU的標(biāo)記，所述試劑包括含有在Tris-緩沖鹽溶液中的CuSO 4和Alexa Fluor? 594 綴合物（590nm 最大激發(fā)/615nm 最大發(fā)射）（Molecular Probes?/Invitr〇gen?， Carlsbad，CA)的溶液。然后用1.0%Trit〇n? X_l〇〇/3%BSA/PBS清洗和封閉細(xì)胞。之 后，使用抗BrdU抗體和第二檢測(cè)抗體Alexa Fluor? 647綴合物（650nm最大激發(fā)/670nm 最大發(fā)射）（Molecular Probes? /Invitrogen?，Carlsbad, CA)進(jìn)行 BrdU 的標(biāo)記。使用 標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過(guò)熒光顯微術(shù)進(jìn)行3種標(biāo)記的檢測(cè)。為了檢測(cè)AzdU標(biāo)記，使用470/50nm的激 發(fā)，545/75nm的帶通。為了檢測(cè)EdU標(biāo)記，使用560/55nm的激發(fā)，645/75nm的帶通。為了 檢測(cè)BrdU標(biāo)記，使用630/50nm的激發(fā)，695/55nm的通帶。
[0172] 實(shí)施例9
[0173] 按照已知的細(xì)胞活躍生長(zhǎng)所需的條件，通過(guò)提供恰當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)需求來(lái)建立 制備培養(yǎng)細(xì)胞（用于測(cè)量新合成的DNA(細(xì)胞增殖））的標(biāo)準(zhǔn)方法。在本實(shí)施例中，將Ramos 人B-淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物以1:4稀釋至2x IO5個(gè)細(xì)胞/ml的密度。在將這些細(xì)胞培養(yǎng)1或2 天后，以20 μ M(適合于摻入正在經(jīng)歷DNA合成的細(xì)胞的DNA中的濃度）加入第一核苷類似 物EdU。在EdU存在的情況下將細(xì)胞培養(yǎng)2小時(shí)。在2小時(shí)的培養(yǎng)后并且在不除去EdU (通 過(guò)在新鮮培養(yǎng)基中清洗細(xì)胞）的情況下，以10 μ M的濃度加入適當(dāng)量的競(jìng)爭(zhēng)性核苷類似物 BrdU，然后培養(yǎng)細(xì)胞2. 5小時(shí)。然后收獲、清洗細(xì)胞，用70%的冰冷ETOH固定細(xì)胞，并于4°C 下貯存96小時(shí)。然后清洗細(xì)胞，將其在室溫下重懸浮于4M HCL中，進(jìn)行20分鐘。加入磷酸 鹽/檸檬酸緩沖液，將細(xì)胞清洗2次，然后以lx IOVml重懸浮于0. 1 % TritonX/1 % BSA/ PBS中。然后，通過(guò)加入基于點(diǎn)擊化學(xué)的試劑進(jìn)行EdU的標(biāo)記，所述試劑包括含有在Tris-緩 沖鹽溶液中的CuSO4和Alexa Fluor? 647-疊氮化物（650nm最大激發(fā)/670nm最大發(fā)射） (Molecular ProbesTM/InvitrogenTM，Carlsbad，CA)的溶液。然后用 0· 1 % TritonX/l % BSA/ PBS清洗細(xì)胞。之后，使用抗BrdU抗體FITC綴合物（494nm最大激發(fā)/518nm最大發(fā)射） (Exalpha Biologicals，Inc.，Maynard California)進(jìn)行BrdU 的標(biāo)記。為 了檢測(cè) DNA含量， 加入核酸染料DAPI (358nm最大激發(fā)/461nm最大發(fā)射）（Molecular ProbesTM/Invitrogen?， Carlsbad, CA)。利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行3種標(biāo)記的檢測(cè)。為了檢測(cè)BrdU標(biāo)記，使用488nm的 激發(fā)，530/30nm的帶通。為了檢測(cè)EdU標(biāo)記，使用633nm的激發(fā)，660/20nm的帶通。為了檢 測(cè)DNA含量，使用355nm的激發(fā)，450/50nm的帶通。
[0174] 圖7提供了標(biāo)記為A至C的一系列結(jié)果圖，其顯示用EdU(20μΜ)的第一脈沖標(biāo)記 和BrdU(K) μ Μ)的第二脈沖標(biāo)記處理的細(xì)胞群體，如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的。圖A被分成 4個(gè)象限，第一象限（Ql)位于左上角，第二象限（Q2)位于右上角，第三象限（Q3)位于左下 角，和第四象限（Q4)位于右下角。象限Q3(左下，淡藍(lán)色）中的細(xì)胞群體對(duì)于EdU(第一脈 沖）和BrdU(第二脈沖）都是陰性的。象限Q2(右上，深藍(lán)色）中的細(xì)胞群體對(duì)于EdU(第 一脈沖）和BrdU (第二脈沖）都是陽(yáng)性的。象限Ql (左上，淡綠色）中的細(xì)胞群體對(duì)于BrdU 是陽(yáng)性的并且對(duì)于EdU是陰性的，BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的亞群（其為EdU陰性的），該亞群是在只 使用EdU的摻入之后進(jìn)入S期的細(xì)胞群體。Q4(右下，紅色）中的細(xì)胞群體對(duì)于EdU是陽(yáng)性 的并且對(duì)于BrdU是陰性的，EdU陽(yáng)性細(xì)胞的亞群（晚S期）（其為BrdU陰性的），該亞群是 在BrdU-摻入前離開(kāi)S期的細(xì)胞群體。圖B是BrdU對(duì)DNA含量的圖，其顯示來(lái)自圖A的相 同顏色的群體。圖C是EdU對(duì)DNA含量的圖，其顯示來(lái)自圖A的相同顏色的群體。
[0175] 實(shí)施例10
[0176] 按照已知的細(xì)胞活躍生長(zhǎng)所需的條件，通過(guò)提供恰當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)需求來(lái)建立 制備培養(yǎng)細(xì)胞（用于測(cè)量新合成的DNA(細(xì)胞增殖））的標(biāo)準(zhǔn)方法。在本實(shí)施例中，將來(lái)自 慢性髓性白血病細(xì)胞培養(yǎng)物的K562人成淋巴細(xì)胞以1:4稀釋至2x IO5個(gè)細(xì)胞/ml的密 度。在將這些細(xì)胞培養(yǎng)1或2天后，以20 μ M(適合于摻入正在經(jīng)歷DNA合成的細(xì)胞的DNA 中的濃度）加入第一核苷類似物EdU。在EdU存在的情況下將細(xì)胞培養(yǎng)2小時(shí)。在2小時(shí) 的培養(yǎng)后并且在不除去EdU (通過(guò)在新鮮培養(yǎng)基中清洗細(xì)胞）的情況下，以10 μ M的濃度加 入適當(dāng)量的競(jìng)爭(zhēng)性核苷類似物BrdU，然后培養(yǎng)細(xì)胞2. 5小時(shí)。然后收獲、清洗細(xì)胞，用70% 的冰冷ETOH固定細(xì)胞，并于4°C下貯存96小時(shí)。然后清洗細(xì)胞，將其在室溫下重懸浮于4M HCL中，進(jìn)行20分鐘。加入磷酸鹽/檸檬酸緩沖液，將細(xì)胞清洗2次，然后以lx IOVml重 懸浮于0. 1 % TritonX/1 % BSA/PBS中。然后，通過(guò)加入基于點(diǎn)擊化學(xué)的試劑進(jìn)行EdU的標(biāo) 記，所述試劑包括含有在Tris-緩沖鹽溶液中的CuSO 4和Alexa Fluor? 647-疊氮化物 (650nm 最大激發(fā)/670nm 最大發(fā)射）（Molecular Probes?/Invitrogen?'Carlsbad，CA)的 溶液。然后用〇. l%TritonX/l%BSA/PBS清洗細(xì)胞。之后，使用抗BrdU抗體FITC綴合物 (494nm 最大激發(fā)/518nm 最大發(fā)身寸）（Exalpha Biologicals, Inc. , Maynard California) 進(jìn)行BrdU的標(biāo)記。為了檢測(cè)DNA含量，加入核酸染料DAPI (358nm最大激發(fā)/461nm最大發(fā) 射）（Molecular Probes?/Invitrogen?，Carlsbad，CA)。利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行 3 種標(biāo)記的 檢測(cè)。為了檢測(cè)BrdU標(biāo)記，使用488nm的激發(fā)，530/30nm的帶通。為了檢測(cè)EdU標(biāo)記，使 用633nm的激發(fā)，660/20nm的帶通。為了檢測(cè)DNA含量，使用355nm的激發(fā)，450/50nm的帶 通。
[0177] 圖8提供了標(biāo)記為A至C的一系列結(jié)果圖，其顯示用EdU(20μΜ)的第一脈沖標(biāo)記 和BrdU(K) μ Μ)的第二脈沖標(biāo)記處理的細(xì)胞群體，如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的。圖A被分成 4個(gè)象限，第一象限（Ql)位于左上角，第二象限（Q2)位于右上角，第三象限（Q3)位于左下 角，和第四象限（Q4)位于右下角。象限Q3(左下，淡藍(lán)色）中的細(xì)胞群體對(duì)于EdU(第一脈 沖）和BrdU(第二脈沖）都是陰性的。象限Q2(右上，深藍(lán)色）中的細(xì)胞群體對(duì)于EdU(第 一脈沖）和BrdU (第二脈沖）都是陽(yáng)性的。象限Ql (左上，淡綠色）中的細(xì)胞群體對(duì)于BrdU 是陽(yáng)性的并且對(duì)于EdU是陰性的，BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的亞群（其為EdU陰性的），該亞群是在只 使用EdU的摻入之后進(jìn)入S期的細(xì)胞群體。Q4(右下，紅色）中的細(xì)胞群體對(duì)于EdU是陽(yáng)性 的并且對(duì)于BrdU是陰性的，EdU陽(yáng)性細(xì)胞的亞群（晚S期）（其為BrdU陰性的），該亞群是 在BrdU-摻入前離開(kāi)S期的細(xì)胞群體。圖B是BrdU對(duì)DNA含量的圖，其顯示來(lái)自圖A的相 同顏色的群體。圖C是EdU對(duì)DNA含量的圖，其顯示來(lái)自圖A的相同顏色的群體。
[0178] 實(shí)施例11
[0179] 按照已知的細(xì)胞活躍生長(zhǎng)所需的條件，通過(guò)提供恰當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)需求來(lái)建立 制備培養(yǎng)細(xì)胞（用于測(cè)量新合成的DNA(細(xì)胞增殖））的標(biāo)準(zhǔn)方法。在本實(shí)施例中，將TF-Ia 人成紅細(xì)胞培養(yǎng)物以1:4稀釋至2x IO5個(gè)細(xì)胞/ml的密度。培養(yǎng)基含有GM-CSF或粒細(xì)胞 巨噬細(xì)胞集落刺激因子以用于生長(zhǎng)。在將這些細(xì)胞培養(yǎng)1或2天后，以20 μ M(適合于摻入 正在經(jīng)歷DNA合成的細(xì)胞的DNA中的濃度）加入第一核苷類似物EdU。在EdU存在的情況 下培養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行表1中所列的時(shí)間。在初始培養(yǎng)之后并且在不除去EdU(通過(guò)在新鮮培養(yǎng) 基中清洗細(xì)胞）的情況下，以10 μ M的濃度加入適當(dāng)量的競(jìng)爭(zhēng)性核苷類似物BrdU，然后培養(yǎng) 細(xì)胞，進(jìn)行表1中所列的時(shí)間。然后收獲、清洗細(xì)胞，用70%的冰冷ETOH固定細(xì)胞，并于4°C 下貯存直至使用。然后清洗細(xì)胞，將其在室溫下重懸浮于4M HCL中，進(jìn)行20分鐘。加入磷 酸鹽/檸檬酸緩沖液，將細(xì)胞清洗2次，然后以lx IOVml重懸浮于0. 1 % TritonX/1 % BSA/ PBS中。然后，通過(guò)加入基于點(diǎn)擊化學(xué)的試劑進(jìn)行EdU的標(biāo)記，所述試劑包括含有在Tris-緩 沖鹽溶液中的CuSOjPAlexa Fluor? 647-疊氮化物（650nm最大激發(fā)/670nm最大發(fā)射） (Molecular ProbesTM/InvitrogenTM，Carlsbad，CA)的溶液。然后用 0· 1 % TritonX/l % BSA/ PBS清洗細(xì)胞。之后，使用抗BrdU抗體FITC綴合物（494nm最大激發(fā)/518nm最大發(fā)射） (Exalpha Biologicals，Inc.，Maynard California)進(jìn)行BrdU 的標(biāo)記。為 了檢測(cè) DNA含量， 加入核酸染料DAPI (358nm最大激發(fā)/461nm最大發(fā)射）（Molecular ProbesTM/Invitrogen?， Carlsbad, CA)。利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行3種標(biāo)記的檢測(cè)。為了檢測(cè)BrdU標(biāo)記，使用488nm的 激發(fā)，530/30nm的帶通。為了檢測(cè)EdU標(biāo)記，使用633nm的激發(fā)，660/20nm的帶通。為了檢 測(cè)DNA含量，使用355nm的激發(fā)，450/50nm的帶通。
[0180] 表 1
[0181]
【權(quán)利要求】
1. 用于測(cè)量細(xì)胞核酸合成的變化的方法： a) 將樣品與有效量的第一核苷或核苷酸類似物一起溫育以形成第一溫育樣品； b) 將第一溫育樣品與至少一種第二核苷或核苷酸類似物一起溫育以形成第二溫育樣 品； c) 將第二溫育樣品與第一標(biāo)記試劑和至少一種第二標(biāo)記試劑一起溫育以形成標(biāo)記的 樣品； d) 檢測(cè)標(biāo)記的樣品，其中測(cè)量所述第一和至少一種第二核苷或核苷酸類似物的摻入水 平， 其中將所述至少一種第二核苷或核苷酸類似物的摻入水平相對(duì)于所述第一核苷或核 苷酸類似物的摻入水平的差異測(cè)量為細(xì)胞核酸合成的變化， 前提是所述第一核苷或核苷酸或所述至少一種第二核苷或核苷酸包含生物正交功能 部分。
2. 用于測(cè)量細(xì)胞DNA合成的變化的方法： a) 將樣品與有效量的第一核苷或核苷酸類似物一起溫育以形成第一溫育樣品； b) 將第一溫育樣品與至少一種第二核苷或核苷酸類似物一起溫育以形成第二溫育樣 品； c) 將第二溫育樣品與第一標(biāo)記試劑和至少一種第二標(biāo)記試劑一起溫育以形成標(biāo)記的 樣品； d) 檢測(cè)標(biāo)記的樣品，其中測(cè)量第一和至少一種第二核苷或核苷酸類似物的摻入水平， 其中將所述至少一種第二核苷或核苷酸類似物的摻入水平相對(duì)于所述第一核苷或核 苷酸類似物的摻入水平的差異測(cè)量為細(xì)胞DNA合成的變化， 前提是所述第一核苷或核苷酸或所述至少一種第二核苷或核苷酸包含生物正交功能 部分。
3. 用于測(cè)量細(xì)胞RNA合成的變化的方法： a) 將樣品與有效量的第一核苷或核苷酸類似物一起溫育以形成第一溫育樣品； b) 將第一溫育樣品與至少一種第二核苷或核苷酸類似物一起溫育以形成第二溫育樣 品； c) 將第二溫育樣品與第一標(biāo)記試劑和至少一種第二標(biāo)記試劑一起溫育以形成標(biāo)記的 樣品； d) 檢測(cè)標(biāo)記的樣品，其中測(cè)量第一和至少一種第二核苷或核苷酸類似物的摻入水平， 其中將所述至少一種第二核苷或核苷酸類似物的摻入水平相對(duì)于所述第一核苷或核 苷酸類似物的摻入水平的差異測(cè)量為細(xì)胞RNA合成的變化， 前提是所述第一核苷或核苷酸或所述至少一種第二核苷或核苷酸包含生物正交功能 部分。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中在用所述至少一種第二核苷或核苷酸類似物進(jìn)行處理的同 時(shí)或在此之前，用受試化合物處理樣品。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中所述第一類似物包含生物正交功能部分。
6. 權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種第二類似物包含生物正交功能部分。
7. 權(quán)利要求1的方法，其中所述第一類似物或所述至少一種第二類似物包含鹵素部 分。
8. 權(quán)利要求1的方法，其中所述生物正交功能部分可經(jīng)歷[3+2]環(huán)加成反應(yīng)。
9. 權(quán)利要求1的方法,其中所述生物正交功能部分可經(jīng)歷Staudinger連接反應(yīng)。
10. 權(quán)利要求1的方法，其中所述生物正交功能部分包含疊氮基、炔烴或膦部分。
11. 權(quán)利要求1的方法，其中第一和第二類似物的至少一種，但非全部，是乙炔基-脫氧 尿嘧啶（EdU)。
12. 權(quán)利要求1的方法，其中第一和第二類似物的至少一種，但非全部，是5-疊氮 基-2' -脫氧尿嘧啶（AzdU)。
13. 權(quán)利要求7的方法，其中鹵素部分是溴、氯或碘。
14. 權(quán)利要求1的方法，其中第一和第二類似物的至少一種，但非全部，是BrdU。
15. 權(quán)利要求1的方法，其中所述第一標(biāo)記試劑和第二標(biāo)記試劑是包含生物正交功能 部分的標(biāo)記物或抗體。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中所述生物正交功能部分可經(jīng)歷[3+2]環(huán)加成反應(yīng)。
17. 權(quán)利要求15的方法，其中所述生物正交功能部分可經(jīng)歷Staudinger連接反應(yīng)。
18. 權(quán)利要求15的方法，其中所述生物正交功能部分是疊氮基、炔烴或膦部分。
19. 權(quán)利要求15的方法，其中所述標(biāo)記物是熒光染料。
20. 權(quán)利要求15的方法，其中所述抗體是抗BrdU抗體。
21. 權(quán)利要求15的方法，其中所述第一標(biāo)記試劑或第二標(biāo)記試劑是染料標(biāo)記的疊氮化 物。
22. 權(quán)利要求21的方法，其中所述染料標(biāo)記的疊氮化物選自： 羅丹明-疊氮化物、Alexa FlUQr? 350-疊氮化物、Alexa Flu〇f? 488-疊氮化物、 Alexa 555-疊氮化物、Alexa Fluor? 568-疊氮化物、Alexa FIuoj*? 568-疊 氮化物、Alexa Fluor? 594-疊氮化物、Alexa F1UQ1：? 633-疊氮化物、Alexa 647-疊氮化物、Alexa Fluol^ 680-疊氮化物、Pacific Blue?疊氮化物、Cascade Blue? 疊氮化物、熒光素-疊氮化物、花菁-疊氮化物、dapoxyl-疊氮化物和四甲基羅丹明 (TMR)-疊氮化物。
23. 權(quán)利要求1的方法，其中以使第一核苷類似物與標(biāo)記試劑之間形成共價(jià)鍵的方式， 將第一標(biāo)記試劑與第二溫育樣品一起溫育。
24. 權(quán)利要求1的方法，其中以使第二核苷類似物與標(biāo)記試劑之間形成共價(jià)鍵的方式， 將第二標(biāo)記試劑與第二溫育樣品一起溫育。
25. 權(quán)利要求1的方法，其中利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)所述第一核苷類似物和所述至少一 種第二核苷類似物的摻入。
26. 權(quán)利要求1的方法，其中利用熒光顯微術(shù)檢測(cè)所述第一核苷類似物和所述至少一 種第二核苷類似物的摻入。
27. 權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)多孔板測(cè)定檢測(cè)所述第一核苷類似物和所述至少一 種第二核苷類似物的摻入。
28. 權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)成像來(lái)檢測(cè)所述第一核苷類似物和所述至少一種第 二核苷類似物的摻入。
29. 權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)高內(nèi)涵篩選來(lái)檢測(cè)所述第一核苷類似物和所述至少 一種第二核苷類似物的摻入。
30. 權(quán)利要求1的方法，其中樣品是生物體或細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞。
31. 就對(duì)細(xì)胞增殖或基因表達(dá)的作用篩選化合物的方法，其包括： a) 將樣品與有效量的第一核苷或核苷酸類似物一起溫育以形成第一溫育樣品； b) 用受試化合物處理第一溫育樣品以形成處理的樣品； c) 在用受試化合物處理第一溫育樣品的同時(shí)或在此之后將處理的樣品與至少一種第 二核苷或核苷酸類似物一起溫育以形成第二溫育樣品； d) 將第二溫育樣品與第一標(biāo)記試劑和至少一種第二標(biāo)記試劑一起溫育以形成標(biāo)記的 樣品； e) 檢測(cè)標(biāo)記的樣品，其中測(cè)量第一和至少一種第二核苷或核苷酸類似物的摻入水平， 其中將所述至少一種第二核苷或核苷酸類似物的摻入水平相對(duì)于所述第一核苷或核 苷酸類似物的摻入水平的差異測(cè)量為篩選的化合物對(duì)細(xì)胞增殖或基因表達(dá)的作用， 前提是所述第一核苷或核苷酸或所述至少一種第二核苷或核苷酸包含生物正交功能 部分。
32. 權(quán)利要求30的方法，其中樣品是生物體或細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞。
33. 用于測(cè)量細(xì)胞核酸合成的變化的試劑盒，其中所述試劑盒包括： a) 第一核苷或核苷酸類似物； b) 至少一種第二核苷或核苷酸類似物，其中至少所述第一類似物或所述至少一種第二 核苷或核苷酸類似物包含生物正交功能部分； c) 第一標(biāo)記試劑；和 d) 第二標(biāo)記試劑。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104263816SQ201410429769
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2009年5月14日 優(yōu)先權(quán)日:2008年5月16日
【發(fā)明者】S·克拉克, J·布拉德福 申請(qǐng)人:生命技術(shù)公司