一種誘導(dǎo)培養(yǎng)基及誘導(dǎo)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生成胰島素分泌細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種誘導(dǎo)培養(yǎng)基，包括溶劑DMEM-高糖培養(yǎng)基、血小板、全反式維甲酸、激活素A、胰高血糖素樣肽I、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、β細(xì)胞素、胰島素樣生長(zhǎng)因子、煙酰胺、多肽、五肽胃泌素和巰基乙醇；采用物理震蕩、膠原酶和胰酶雙重消化法，從人脂肪組織中高效分離脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；并將這些脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)增殖傳代，然后使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成為胰島素分泌細(xì)胞，能使40%以上的脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞。
【專利說(shuō)明】一種誘導(dǎo)培養(yǎng)基及誘導(dǎo)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生成胰島素分泌細(xì)胞的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)培養(yǎng)基，具體地說(shuō)，涉及一種誘導(dǎo)培養(yǎng)基及誘導(dǎo)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生成胰島素分泌細(xì)胞的方法，屬于醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]我國(guó)目前糖尿病的患病率已超過12%。全世界有約2億人患有輕重程度不等的糖尿病。糖尿病的發(fā)病機(jī)制主要是由于胰島分泌細(xì)胞的損傷、功能障礙或機(jī)體免疫功能異常而導(dǎo)致胰島素的分泌絕對(duì)或相對(duì)不足，從而使血糖升高，進(jìn)而引起全身各臟器損傷，出現(xiàn)各種并發(fā)癥。臨床治療通常是采用皮下注射胰島素的方法來(lái)降低血糖，而對(duì)于I型及部分II型糖尿病的患者來(lái)說(shuō)，這種治療方法效果并不理想，因?yàn)槠湟资共∪藢?duì)胰島素產(chǎn)生依賴性和耐藥性，且難以阻止糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生及發(fā)展。胰島移植雖然可以解決根本問題，但并不能避免免疫排斥反應(yīng)，而且供源缺乏不易實(shí)施。因此，取自患者自體的干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化成胰島素分泌細(xì)胞才是治療糖尿病最為理想和有效的治療方法，它既可以修復(fù)體內(nèi)損傷的胰島素分泌細(xì)胞，又可以避免疫排斥反應(yīng)和相關(guān)并發(fā)癥，達(dá)到治療糖尿病的效果，近些年來(lái)其已成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的重點(diǎn)。因此研發(fā)新的胰島素分泌細(xì)胞的來(lái)源也就成為了問題的關(guān)鍵所在。
[0003]根據(jù)干細(xì)胞發(fā)育階段的不同，可將其分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞具有全能性，它能夠分化為體內(nèi)幾乎所有的組織和器官，早在2000年Reubinoft等就用胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化出造血細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及心肌細(xì)胞等多種細(xì)胞。但是胚胎干細(xì)胞因來(lái)源有限，且無(wú)法避免倫理學(xué)、法律、道德等問題，同時(shí)有報(bào)道稱胚胎干細(xì)胞具有致瘤性，因此胚胎干細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用受到了限制。近年來(lái)許多研究表明成體干細(xì)胞也保持著向多種組織細(xì)胞分化的潛能，如間充質(zhì)干細(xì)胞可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)元等，成體干細(xì)胞來(lái)源豐富，是目前研究的重點(diǎn)。近年來(lái)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的研究取得了一些突破性的進(jìn)展，已有多項(xiàng)研究表明其能分化為心肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。因其來(lái)源充足，而且可以變廢為寶，故有著良好的應(yīng)用前景。
如申請(qǐng)?zhí)枮?00980117365.X (以下稱對(duì)比文件)， 申請(qǐng)人:為SMT.G.R.多斯及SMT.K M瑪塔腎病研究所及研究中心，名稱為用于治療糖尿病的源自人脂肪組織的胰島素生產(chǎn)性間充質(zhì)干細(xì)胞的專利，公開了一種用于從人脂肪組織中分離和分化胰島素生產(chǎn)性間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其包括以下步驟:a)將脂肪組織切成碎末，b)向上述組織中加入I型膠原酶，c)將由上獲得的內(nèi)含物置于培養(yǎng)器里的搖動(dòng)器上，d)將步驟c獲得的全部?jī)?nèi)含物離心，e)將離心后得到的上清液和沉淀物分別在含有“無(wú)異種材料的”增殖培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中在37°C和CO2氣氛中培養(yǎng)約10天，所述增殖培養(yǎng)基由高葡萄糖DMEM(Dulbeccos改進(jìn)的Eagles培養(yǎng)基)、人白蛋白、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、(FGF)、丙酮酸鈉緩沖劑、抗生素和抗真菌劑組成，f)更新培養(yǎng)基但不進(jìn)行連續(xù)傳代，g)在9-10天結(jié)束時(shí)通過胰酶消化收集上述細(xì)胞，h)檢查所收集細(xì)胞的活力、無(wú)菌性、細(xì)胞計(jì)數(shù)以及CD45陰性、CD90/CD73陽(yáng)性細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析，i)使用分化培養(yǎng)基使所有細(xì)胞分化成胰島素表達(dá)細(xì)胞，所述分化培養(yǎng)基由DMEM-高葡萄糖、DMEM F12、煙酰胺、活化素A、Exendin 4、五肽胃泌素、HGF、h)B27、N2、血清添加物、抗生素和抗真菌劑組成，j)在至少3天后，使用常規(guī)技術(shù)分離步驟(i)的細(xì)胞，而后進(jìn)行Pax-6、Isl-U Ipf-l/pdx-l、C-肽、胰島素的測(cè)量、無(wú)菌性和活力測(cè)定。
[0004]在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下不足:應(yīng)用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)生成胰島素分泌細(xì)胞，因?yàn)殚g充質(zhì)干細(xì)胞屬異體細(xì)胞，有一定的抗原性，輸給糖尿病病人后可能會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，且間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)的生存期較短，誘導(dǎo)胰島素分泌細(xì)胞的效率也不理想。
[0005]申請(qǐng)?zhí)枮?00980117365.X的發(fā)明技術(shù)采用單一膠原酶消化法分離人脂肪間充干細(xì)胞。其誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞所用誘導(dǎo)因子包括煙酰胺、活化素A、Exendin 4、五肽胃泌素、HGF，其所獲干細(xì)胞數(shù)量較低，誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞產(chǎn)生的陽(yáng)性細(xì)胞率較低，誘導(dǎo)效果不理想。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對(duì)以上不足，提供一種誘導(dǎo)培養(yǎng)基，克服現(xiàn)有培養(yǎng)基在誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞中誘導(dǎo)效果不理想的缺陷。采用本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，可以更有效地誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞。
[0007]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種分離人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞方法，克服了現(xiàn)有分離方法細(xì)胞產(chǎn)率低的不足，本發(fā)明采用物理震蕩，加膠原酶和胰酶雙重消化法，可從人脂肪組織中高效分離脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞產(chǎn)率可達(dá)3.0*106干細(xì)胞/ml脂肪組織。
[0008]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種誘導(dǎo)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生成胰島素分泌細(xì)胞的方法，誘導(dǎo)分化的效果更好，能使40%以上的脂肪干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞。
[0009]為了解決以上問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:一種誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括溶劑DMEM-高糖培養(yǎng)基(DMEM-high glucose)和以下成份:
血小板溶液、全反式維甲酸(All-Trans Retinoic Acid)、激活素A (Activin A)、胰高血糖素樣肽I (GLP-1，Glucagon-like peptide I)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF，F(xiàn)ibroblast growth factor)、β 細(xì)胞素(β-cellulin)、膜島素樣生長(zhǎng)因子(Insulin-likegrowth factor (IGFl))、煙酰胺(Nicotinamide)、多肽(Exendin 4)、五肽胃泌素(Pentagastrin)和疏基乙醇(β -mercaptoethanol)。
[0010]—種優(yōu)化方案，所述血小板的濃度為5-10%;
全反式維甲酸(All-Trans Retinoic Acid)的濃度為 0.5-1.0MM ；
激活素 A (Activin A)的濃度為 10-30ng/ml ；
胰高血糖素樣肽 I (GLP-1, Glucagon-like peptide I)的濃度為 200-600ng/ml ; 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF, Fibroblast growth factor)的濃度為10_50ng/ml ； β 細(xì)胞素(β-cellulin)的濃度為 10_50ng/ml ；
胰島素樣生長(zhǎng)因子(Insulin-like growth factor (IGFl))的濃度為 10_40ng/ml ; 煙酰胺(Nicotinamide)的濃度為 0.5-1.0mg/ml ；
多肽(Exendin 4)的濃度為 0.5-2.0Pg/ml ；
五肽胃泌素(Pentagastrin)的濃度為 5.0-30.0ng/ml ； 疏基乙醇(β -mercaptoethanol)的濃度為 0.1-0.2mM。
[0011 ] 進(jìn)一步地，所述血小板的濃度為5% ；
全反式維甲酸(All-Trans Retinoic Acid)的濃度為IMM ；
激活素A (Activin A)的濃度為10ng/ml ；
胰高血糖素樣肽 I (GLP-1, Glucagon-like peptide I)的濃度為 200ng/ml ;
成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF, Fibroblast growth factor)的濃度為10ng/ml ； β細(xì)胞素(β-cellulin)的濃度為10ng/ml ；
胰島素樣生長(zhǎng)因子(Insulin-like growth factor (IGFl))的濃度為 10ng/ml ; 煙酰胺(Nicotinamide)的濃度為lmg/ml ；
多肽(Exendin 4)的濃度為 0.5Pg/ml ；
五肽胃泌素(Pentagastrin)的濃度為10ng/ml ；
巰基乙醇(β -mercaptoethanol)的濃度為0.1mM。米用該誘導(dǎo)培養(yǎng)基，能使40%以上的脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞。
[0012]基于以上誘導(dǎo)培養(yǎng)基，一種誘導(dǎo)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生成胰島素分泌細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法為:
采用物理震蕩、膠原酶和胰酶雙重消化法，從人脂肪組織中高效分離脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；并將這些脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)增殖傳代，然后使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成為胰島素分泌細(xì)胞。
[0013]一種優(yōu)化方案，所述方法包括人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)步驟:
(1)采集糖尿病患者脂肪組織，移入離心管中，加入濃度0.25%胰蛋白酶和濃度0.1%膠原酶的混合液；
(2)應(yīng)用旋渦振蕩器，將以上脂肪組織懸液以1500rpm，震蕩60秒鐘；
(3)在37°C恒溫?fù)u床中振蕩消化60分鐘，將所得下層液體移入含完全培養(yǎng)基的離心管中終止消化，完全培養(yǎng)基包括濃度10%胎牛血清與高糖DMEM培養(yǎng)基；
(4)在剩余脂肪中再次加入濃度0.25%胰蛋白酶和濃度0.1 %膠原酶的混合液，重復(fù)步驟(3)繼續(xù)消化60分鐘，重復(fù)I次，將經(jīng)消化的脂肪懸液離心，去除懸浮上清，得沉淀的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；
(5)在沉淀的脂肪干細(xì)胞中加入含濃度10%胎牛血清和高糖DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，移入第一 T75培養(yǎng)瓶中，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱孵育，48h后半量換液2次，其后每3_5天換液一次去除未貼壁的細(xì)胞；
(6)當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞占滿80%培養(yǎng)瓶底面積時(shí)，用濃度0.25%胰酶加0.04% EDTA消化傳代，濃度0.25%胰酶和0.04% EDTA的體積比為1:1，使人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞得以增殖傳代。
[0014]采用以上分離人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞方法，細(xì)胞產(chǎn)率可達(dá)3.0*106干細(xì)胞/ml脂肪組織。
[0015]進(jìn)一步地，所述方法包括人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞誘導(dǎo)步驟:
(I)取第3-4代處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，置于尖底離心管中，離心，棄上清，得沉淀脂肪干細(xì)胞并重懸于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，將所得脂肪干細(xì)胞的細(xì)胞密度調(diào)整為5xl05個(gè)細(xì)胞/ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基； (2)將所得人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞懸液接種到第二T75培養(yǎng)瓶中；
(3)將第二T75培養(yǎng)瓶置于CO2孵育箱中，37°C培養(yǎng)；
(4)每隔3-4天更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基I次，連續(xù)培養(yǎng)14天；
(5)棄掉第二T75培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)誘導(dǎo)培養(yǎng)基上清，然后用PBS將貼壁細(xì)胞洗一次，棄上清； 加入0.25%胰蛋白酶置37°C消化5-10分鐘；
當(dāng)貼壁細(xì)胞與培養(yǎng)瓶表面脫離后，加入PBS稀釋；將細(xì)胞收集于尖底離心管中；
離心；棄上清得到誘導(dǎo)的胰島素分泌細(xì)胞。
[0016]以上方法能使40%以上的脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞。
[0017]進(jìn)一步地，所述步驟(I)、步驟(4)混合液中濃度0.25%胰蛋白酶和濃度0.1%膠原酶的體積比為1:1。
[0018]本發(fā)明采用以上技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn):應(yīng)用胰蛋白酶和膠原酶雙重消化法對(duì)脂肪組織進(jìn)行消化，外加物理震蕩方法，可獲得高達(dá)每毫升脂肪3xl06的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞量；采用DMEM高糖培養(yǎng)基，以5%的人血小板溶液提供細(xì)胞生長(zhǎng)因子的來(lái)源。以IuM的全反式維甲酸為主導(dǎo)的多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子組成的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生成胰島素分泌細(xì)胞，能使40%以上的脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞。
[0019]從人脂肪組織中分離脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，并在體外培養(yǎng)誘導(dǎo)為能分泌胰島素的細(xì)胞。該發(fā)明在于探索出一套能誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向分泌胰島素的細(xì)胞分化的培養(yǎng)條件和所需生長(zhǎng)因子。采集糖尿病人自體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)的胰島素分泌細(xì)胞用于病人自體不產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，也不涉及倫理問題。
[0020]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說(shuō)明。

【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明不限于以下列舉的特定例子。
[0022]實(shí)施例1，一種誘導(dǎo)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生成胰島素分泌細(xì)胞的方法，包括以下步驟:
人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)
(1)采集糖尿病患者脂肪組織100ml，用眼科剪盡量剪破脂肪組織中肉眼可見的細(xì)小血管，沖洗血液后剪碎脂肪組織，移入離心管中，加入濃度0.25%胰蛋白酶和濃度0.1%膠原酶的混合液，混合液中濃度0.25%胰蛋白酶和濃度0.1 %膠原酶的體積比為1: 1，混合液的用量為脂肪組織的體積的兩倍；
(2)應(yīng)用旋渦振蕩器，將以上脂肪組織懸液以1500rpm，震蕩60秒鐘；
(3)在37°C恒溫?fù)u床中振蕩消化I小時(shí)，液面分為三層，上層為黃色油狀脂肪細(xì)胞層，中層為脂肪組織層，下層為含單個(gè)核細(xì)胞的液體，將下層液體吸出后移入含完全培養(yǎng)基的離心管中終止消化，完全培養(yǎng)基包括濃度10%胎牛血清與高糖DMEM ；
(4)在剩余脂肪，即步驟(2)中所得上層+中層的脂肪細(xì)胞中再次加入濃度0.25%胰蛋白酶和濃度0.1 %膠原酶的混合液，混合液中濃度0.25%胰蛋白酶和濃度0.1 %膠原酶的體積比為1:1;
混合液的用量為脂肪組織的體積的兩倍，重復(fù)步驟(2)繼續(xù)消化，重復(fù)I次，將經(jīng)消化的液體1500rpm離心lOmin，去除懸浮的脂肪細(xì)胞和脂滴，去上清，得沉淀的脂肪干細(xì)胞；
(5)在沉淀的脂肪干細(xì)胞中加入含濃度10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，移入第一 T75培養(yǎng)瓶中，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱孵育，48h后連續(xù)半量換液2次，其后每3_5天換液一次去除未貼壁的細(xì)胞；
當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞占滿80%培養(yǎng)瓶底面積時(shí)，用濃度0.25%胰酶加0.04% EDTA消化傳代，濃度0.25%胰酶和0.04% EDTA的體積比為1: 1，得到含人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)物，約3.0*106干細(xì)胞/ml脂肪組織。
[0023]人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定:
應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志以對(duì)其進(jìn)行鑒定，取第3-4代穩(wěn)定增殖細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使用0.25%胰蛋白酶消化收集，16個(gè)細(xì)胞懸浮在10ul含1%血清白蛋白的PBS中，依次加入下列鼠抗人單克隆抗體:FITC-CD13，F(xiàn)ITC-CD29，F(xiàn)ITC-CD34，F(xiàn)ITC-CD44，F(xiàn)ITC-CD73，PE-CD90，PE-CD105 和 FITC-HLA-DR，在 4°C 標(biāo)記 20min，PBS 洗 I 次，使用FACS Caliper流式細(xì)胞儀檢測(cè),分析確定是人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0024]以上標(biāo)志鑒定步驟是驗(yàn)證性的，即用來(lái)驗(yàn)證按照人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)步驟是可行的，以后只要按照分離、培養(yǎng)步驟進(jìn)行即可，可以不再進(jìn)行。
[0025]人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞誘導(dǎo):
(I)在超凈工作臺(tái)內(nèi)，取經(jīng)過流式細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)志鑒定的第3-4代處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，置于尖底離心管中，離心300g，10分鐘，棄上清，得沉淀脂肪干細(xì)胞細(xì)胞，將所得沉淀脂肪干細(xì)胞重懸于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，將所得脂肪干細(xì)胞的細(xì)胞密度調(diào)整為5x10s個(gè)細(xì)胞/ml。
[0026](2)用1ml吸管，將所得人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞懸液1ml接種到第二 T75培養(yǎng)瓶中；
(3)在第二T75培養(yǎng)瓶右側(cè)面上用記號(hào)筆標(biāo)明脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞份號(hào)和誘導(dǎo)培養(yǎng)日期，將培養(yǎng)瓶置于CO2孵育箱中，37°C培養(yǎng)；
(4)誘導(dǎo)培養(yǎng)到第3-4天，如果細(xì)胞生長(zhǎng)快，培養(yǎng)基顏色變黃，則更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基；
(5)把第二T75培養(yǎng)瓶中已經(jīng)變黃的培養(yǎng)基吸出棄入廢液缸中，再用一支新的1ml移液管在培養(yǎng)瓶中加入1ml/瓶的新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基；
(6)蓋好換過液的第二T75培養(yǎng)瓶瓶蓋，用記號(hào)筆在第二 T75培養(yǎng)瓶上標(biāo)明換液日期，把第二 T75培養(yǎng)瓶放回原來(lái)的CO2孵育箱繼續(xù)培養(yǎng)；
(7)每3-4天換液一次，培養(yǎng)10-14天；
(8)將盛有誘導(dǎo)的胰島素分泌細(xì)胞的第二T75培養(yǎng)瓶置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，棄掉誘導(dǎo)培養(yǎng)基上清，然后用5ml PBS將貼壁細(xì)胞洗一次，棄上清；加入0.25%胰蛋白酶置37°C消化5-10分鐘；倒置顯微鏡下觀察到貼壁細(xì)胞與培養(yǎng)瓶表面脫離后，加入1ml PBS稀釋；并用1ml吸管將細(xì)胞收集于50ml尖底離心管中；每4瓶T75培養(yǎng)瓶的細(xì)胞合并于I支50ml尖底離心管中；以300g離心10分鐘；棄上清得到誘導(dǎo)的胰島素分泌細(xì)胞。將誘導(dǎo)產(chǎn)生的胰島素分泌細(xì)胞凍存于液氮中，日后可用于糖尿病病人的回輸治療。
[0027]誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有以下成分:
DMEM-高糖培養(yǎng)基(DMEM-high glucose)；
濃度5-10%的血小板溶液； 濃度 0.5-1.0uM 的全反式維甲酸(All-Trans Retinoic Acid)；
濃度 10-30ng/ml 的激活素 A (Activin A)；
濃度 200_600ng/ml 的胰高血糖素樣肽 I (GLP-1, Glucagon-like peptide I);
濃度 10_50ng/ml 的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF, Fibroblast growth factor)；
濃度 10-50ng/ml 的 β 細(xì)胞素(β -cellulin)；
濃度 10_40ng/ml 的膜島素樣生長(zhǎng)因子(Insulin-like growth factor (IGFl))；
濃度 0.5-1.0mg/ml 的煙酰胺(Nicotinamide)；
濃度 0.5-2.0Pg/ml 的多肽(Exendin 4)；
濃度 5.0-30.0ng/ml 的五肽胃泌素(Pentagastrin)；
濃度 0.1-0.2mM 的疏基乙醇(β -mercaptoethanol)；
經(jīng)試驗(yàn)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用以下成分及配比的情況下，脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞的效果為最佳:
血小板的濃度為5% ；
全反式維甲酸(All-Trans Retinoic Acid)的濃度為IMM ；
激活素A (Activin A)的濃度為10ng/ml ；
胰高血糖素樣肽 I (GLP-1, Glucagon-like peptide I)的濃度為 200ng/ml ;
成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF, Fibroblast growth factor)的濃度為10ng/ml ； β細(xì)胞素(β-cellulin)的濃度為10ng/ml ；
胰島素樣生長(zhǎng)因子(Insulin-like growth factor (IGFl))的濃度為 10ng/ml ; 煙酰胺(Nicotinamide)的濃度為lmg/ml ；
多肽(Exendin 4)的濃度為 0.5Pg/ml ；
五肽胃泌素(Pentagastrin)的濃度為10ng/ml ；
疏基乙醇(β -mercaptoethanol)的濃度為 0.1mM。
[0028]在誘導(dǎo)人脂肪干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的過程中，傳統(tǒng)的培養(yǎng)基沒有誘導(dǎo)分化的作用；采用200980117365.X的培養(yǎng)基，則誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞產(chǎn)生的陽(yáng)性細(xì)胞率較低。采用以上誘導(dǎo)培養(yǎng)基，能使40%以上的脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞，應(yīng)用這些細(xì)胞，將提高對(duì)糖尿病患者的治療效果。
以上成分均為市場(chǎng)上有售的現(xiàn)有產(chǎn)品。
[0029]試驗(yàn):采用雙硫腙(DTZ)染色對(duì)步驟2誘導(dǎo)所得胰島素分泌細(xì)胞進(jìn)行鑒定:將50mg DTZ溶于5ml 二甲基亞砜中，混勻，過濾除菌，得DTZ染色液，備用；在細(xì)胞誘導(dǎo)10天后進(jìn)行DTZ染色，染色時(shí)，取Iml誘導(dǎo)的細(xì)胞加到12孔培養(yǎng)板中，加入1ul DTZ染色液，于37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20分鐘，吸取染色孔內(nèi)的少許細(xì)胞，PBS洗滌2次，顯微鏡下觀察、拍照，胰島素分泌細(xì)胞呈棕色。
[0030]如圖1所示，對(duì)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，14天后，所誘導(dǎo)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分化形成β細(xì)胞小簇，并具有胰島素分泌能力。圖la，培養(yǎng)第四代的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。圖lb，培養(yǎng)第四代的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)14天誘導(dǎo)，所誘導(dǎo)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分化形成β細(xì)胞小簇。
[0031]如圖2所示，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胰島素陽(yáng)性細(xì)胞百分率:取誘導(dǎo)第14天的細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，離心，棄上清，用lOOulPBS重懸細(xì)胞，分別加入lOulFITC標(biāo)記的抗胰島素抗體、C肽(C-P印tide)、Glut-1和PDX-1抗體(美國(guó)e-B1science公司生產(chǎn))，室溫下避光孵育30分鐘，流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)15個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞率達(dá)40%。
[0032]可以看出，胰島素(Insulin)，C肽(C-P印tide)，Glut-1 和 PDX-1
呈陽(yáng)性。代表β細(xì)胞小簇具有胰島素分泌功能。該誘導(dǎo)產(chǎn)生的胰島素分泌細(xì)胞可用于臨床糖尿病人的治療。
[0033]以上所述為本發(fā)明最佳實(shí)施方式的舉例，其中未詳細(xì)述及的部分均為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的公知常識(shí)。本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求的內(nèi)容為準(zhǔn)，任何基于本發(fā)明的技術(shù)啟示而進(jìn)行的等效變換，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括溶劑DMEM-高糖培養(yǎng)基(DMEM-high glucose)和: 血小板、全反式維甲酸(All-Trans Retinoic Acid)、激活素A (Activin A)、胰高血糖素樣肽 I (GLP-1，Glucagon-like peptide I)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF，F(xiàn)ibroblastgrowth factor)、β 細(xì)胞素(β-cellulin)、膜島素樣生長(zhǎng)因子(Insulin-like growthfactor (IGFl))、煙酸胺(Ni cot inamide)、多妝(Exendin 4)、五妝胃泌素(Pentagastrin)和疏基乙醇(β -mercaptoethanol)0
2.如權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中:血小板的濃度為5-10% ； 全反式維甲酸(All-Trans Retinoic Acid)的濃度為0.5-1.0剛; 激活素 A (Activin A)的濃度為 10-30ng/ml ； 胰高血糖素樣肽 I (GLP-1, Glucagon-like peptide I)的濃度為 200_600ng/ml ; 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF，F(xiàn)ibroblast growth factor)的濃度為10_50ng/ml ； β 細(xì)胞素(β-cellulin)的濃度為 10_50ng/ml ； 胰島素樣生長(zhǎng)因子(Insulin-like growth factor (IGFl))的濃度為 10_40ng/ml ； 煙酰胺(Nicotinamide)的濃度為 0.5-1.0mg/ml ； 多肽(Exendin 4)的濃度為 0.5-2.0gg/ml ； 五肽胃泌素(Pentagastrin)的濃度為 5.0-30.0ng/ml ； 疏基乙醇(β -mercaptoethanol)的濃度為 0.1-0.2mM。
3.如權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于: 所述血小板的濃度為5% ； 全反式維甲酸(All-Trans Retinoic Acid)的濃度為?μΜ ; 激活素A (Activin A)的濃度為lOng/ml ； 胰高血糖素樣肽 I (GLP-1, Glucagon-like peptide I)的濃度為 200ng/ml ; 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF，F(xiàn)ibroblast growth factor)的濃度為10ng/ml ； β細(xì)胞素(β-cellulin)的濃度為10ng/ml ； 胰島素樣生長(zhǎng)因子(Insulin-like growth factor (IGFl))的濃度為 10ng/ml ； 煙酰胺(Nicotinamide)的濃度為lmg/ml ； 多肽(Exendin 4)的濃度為 0.5gg/ml ； 五肽胃泌素(Pentagastrin)的濃度為10ng/ml ； 疏基乙醇(β -mercaptoethanol)的濃度為 0.1mM。
4.一種誘導(dǎo)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生成胰島素分泌細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法為: 釆用物理震蕩、膠原酶和胰酶雙重消化法，從人脂肪組織中高效分離脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；并將這些脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)增殖傳代，然后使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成為胰島素分泌細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)步驟: (I)釆集糖尿病患者脂肪組織，移入離心管中，加入濃度0.25%胰蛋白酶和濃度0.1%膠原酶的混合液； (2)應(yīng)用旋渦振蕩器，將以上脂肪組織懸液以1500rpm，震蕩60秒鐘； (3)在37°C恒溫?fù)u床中振蕩消化60分鐘，將所得下層液體移入含完全培養(yǎng)基的離心管中終止消化，完全培養(yǎng)基包括濃度10%胎牛血清與高糖DMEM培養(yǎng)基； (4)在剩余脂肪中再次加入濃度0.25%胰蛋白酶和濃度0.1 %膠原酶的混合液，重復(fù)步驟(3)繼續(xù)消化60分鐘，重復(fù)I次，將經(jīng)消化的脂肪懸液離心，去除懸浮上清，得沉淀的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞； (5)在沉淀的脂肪干細(xì)胞中加入含濃度10%胎牛血清和高糖DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，移入第一 T75培養(yǎng)瓶中，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱孵育，48h后半量換液2次，其后每3_5天換液一次去除未貼壁的細(xì)胞； (6)當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞占滿80%培養(yǎng)瓶底面積時(shí)，用濃度0.25%胰酶加0.04% EDTA消化傳代，濃度0.25%胰酶和0.04% EDTA的體積比為1:1，使人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞得以增殖傳代。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞誘導(dǎo)步驟: (1)取第3-4代處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，置于尖底離心管中，離心，棄上清，得沉淀脂肪干細(xì)胞并重懸于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，將所得脂肪干細(xì)胞的細(xì)胞密度調(diào)整為5xl05個(gè)細(xì)胞/ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基； (2)將所得人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞懸液接種到第二T75培養(yǎng)瓶中； (3)將第二T75培養(yǎng)瓶置于CO2孵育箱中，37°C培養(yǎng)； (4)每隔3-4天更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基I次，連續(xù)培養(yǎng)14天； (5)棄掉第二T75培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)誘導(dǎo)培養(yǎng)基上清，然后用PBS將貼壁細(xì)胞洗一次，棄上清； 加入0.25%胰蛋白酶置37°C消化5-10分鐘； 當(dāng)貼壁細(xì)胞與培養(yǎng)瓶表面脫離后，加入PBS稀釋；將細(xì)胞收集于尖底離心管中； 離心；棄上清得到誘導(dǎo)的胰島素分泌細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)、步驟(4)混合液中濃度0.25%胰蛋白酶和濃度0.1%膠原酶的體積比為1:1。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK104263697SQ201410475810
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月18日
【發(fā)明者】胡振波 申請(qǐng)人:胡振波