一種羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的制備方法，包括以下步驟：（1）以羅非魚為原料，粉碎，加水，水溫調(diào)節(jié)至50-60℃，加入木瓜蛋白酶和Alcalase中的一種或兩種，酶解至水解度為15-22%，滅酶，離心后，取上清液，得酶解液；（2）將酶解液過截留分子量為1-10kDa超濾膜，取濾過液；（3）將濾過液通過已預(yù)先固載好鋅離子的IMAC分離柱，然后用pH值為7.0-7.5的純凈水沖洗2-3個柱體積，再用pH值為4.0-4.5的純凈水進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；（4）將洗脫液經(jīng)真空干燥和冷凍濃縮，得抗氧化鋅元素結(jié)合肽。該方法較為簡便，產(chǎn)品安全，可應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。
【專利說明】一種羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于功能性肽【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的制備 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 功能性肽是指對生物機(jī)體的生命活動有益或具有特定生理作用的肽類化合物，其 對保健食品及生化藥物的開發(fā)具有極其重要的作用。其中，礦物元素結(jié)合肽即促礦物元素 吸收肽，是一種具有螯合礦物離子能力的功能性肽，其可在pH值呈中性至微堿性的動物小 腸下端，能與礦物離子，如鋅離子等結(jié)合，阻止礦物離子與磷酸根產(chǎn)生沉淀，使小腸內(nèi)可溶 性的礦物離子濃度增加，并借助小肽的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收特點(diǎn)和機(jī)制以螯合物整體的形式通過小腸 被主動吸收，從而促進(jìn)這些必需礦物離子的吸收和利用，可預(yù)防因礦物質(zhì)缺乏而引起的各 種疾病。此外，由于礦物元素結(jié)合肽可與金屬離子螯合，能抑制以金屬離子為輔酶或輔基的 脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并減少由金屬離子產(chǎn)生的活性氧，因此其可能具有一定的抗氧化活性。
[0003] 近年來，以食源性蛋白為原料采用酶解法制備抗氧化肽已取得了很大的進(jìn)展，獲 得了較多具有高抗氧化活性的肽段。但目前關(guān)于制備兼具抗氧化與促礦物元素吸收的雙效 功能性肽的方法尚未見報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的制備方法，該制備方法 制備獲得的羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽具有促進(jìn)鋅離子吸收的生物活性，是一種兼具抗氧 化與促鋅離子吸收的雙效功能性肽。
[0005] 本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：一種羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合 肽的制備方法，包括以下步驟： (1) 控制酶解：以羅非魚為原料，粉碎，加水，水溫調(diào)節(jié)至50_60°C，加入木瓜蛋白酶和 Alcalase中的一種或兩種，酶解至水解度為15-22%，滅酶，離心后，取上清液，得酶解液； (2) 超濾分離：將酶解液采用截留分子量為1-10 kDa的超濾膜過濾，取濾過液； (3) 固定化金屬離子親和層析：將濾過液通過已預(yù)先固載好鋅離子的IMAC分離柱，然 后用pH值為7. 0-7. 5的純凈水沖洗2-3個柱體積，再用pH值為4. 0-4. 5的純凈水進(jìn)行洗 脫，收集洗脫液； (4) 真空濃縮、冷凍干燥：將洗脫液經(jīng)真空干燥和冷凍濃縮，得抗氧化鋅元素結(jié)合肽。
[0006] 本發(fā)明的原理是：本發(fā)明先將羅非魚酶解再經(jīng)超濾后得具有抗氧化活性的酶解產(chǎn) 物，然后采用IMAC分離柱從酶解產(chǎn)物中把具有鋅離子結(jié)合能力的組分分離出來，即為抗氧 化鋅元素結(jié)合肽。經(jīng)過鑒定，羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的主成分結(jié)構(gòu)為二肽結(jié)構(gòu)，具體結(jié) 構(gòu)為 Lys-Leu 或 Lys_IIe〇
[0007] 其中固定化金屬離子親和層析，即IMAC，是利用蛋白質(zhì)、肽等表面暴露的一些氨基 酸殘基和載體之上的金屬離子的親和力的不同來進(jìn)行分離純化的技術(shù)，具有配基簡單、吸 附量大、分離條件溫和、通用性強(qiáng)等特點(diǎn)，適用于某些蛋白質(zhì)、肽、氨基酸與酶的分離純化。
[0008] 在上述羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的制備方法中： 步驟（1)中水的用量為羅非魚原料總重量的2-3倍。
[0009] 步驟（1)中滅酶時的溫度為85-95°C，滅酶時間為10-20min。
[0010] 步驟（1)中離心時離心機(jī)轉(zhuǎn)速為4000-8000r/min，離心時間為15_30min。
[0011] 其中步驟（1)中水解度的測定方法：水解度（%) =酶解液中游離氨基態(tài)氮含量/原 料總氮含量X100,式中：酶解液中游離氨基態(tài)氮含量采用甲醛電位滴定法測定；原料總氮 含量采用半微量凱氏定氮法測定。
[0012] 步驟（2)中將酶解液先過截留分子量為3-10 kDa的超濾膜，再采用截留分子量為 lkDa的超濾膜過濾，取濾過液；或?qū)⒚附庖褐苯硬捎媒亓舴肿恿繛閘kDa的超濾膜過濾，除 去未酶解的蛋白，獲得所需的小分子肽類。
[0013] 步驟（3)中預(yù)先固載好鋅離子的IMAC分離柱的制備過程如下：選取層析柱，先用 0. 05-0. 2mol · Γ1的ZnCl2或ZnS04溶液沖洗0. 5-2個柱體積，以實(shí)現(xiàn)鋅離子在柱子上的固 載，再用純凈水沖洗5-10個柱體積，去除未結(jié)合的鋅離子，即制備獲得預(yù)先固載好鋅離子 的IMAC分離柱。
[0014] 本發(fā)明所述的層析柱優(yōu)選為GE公司生產(chǎn)的HiPr印IMAC FF 16/10預(yù)裝柱。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)： (1) 本發(fā)明方法制備的羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽具有與天然抗氧化劑谷胱甘肽相似 的抗氧化性，安全無毒，在抗氧化保健方面具有優(yōu)越性； (2) 本發(fā)明方法制備的羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽具有促進(jìn)鋅離子吸收的生物活性， 是一種兼具抗氧化與促鋅離子吸收的新型雙效功能性肽； (3) 本發(fā)明方法制備的羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的制備工藝較為簡便，產(chǎn)品安全，可 應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1為實(shí)施例1-4中獲得的羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的IMAC分離純化圖； 圖2為實(shí)施例1-4中獲得的羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的總離子流圖； 圖3實(shí)施例1-4中獲得的羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的一級質(zhì)譜圖； 圖4實(shí)施例1-4中獲得的羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的二級質(zhì)譜圖； 圖5為實(shí)施例1中羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的DPPH自由基清除率； 圖6為實(shí)施例1中羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的0H自由基清除率。

【具體實(shí)施方式】
[0017] 以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0018] 第一部分羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的制備方法 實(shí)施例1 本實(shí)施例提供的羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的制備方法，包括以下步驟： (1)以羅非魚為原料，取肉絞碎，按照1: 2的料水重量比加水，水溫調(diào)節(jié)至50°C，加入木 瓜蛋白酶，酶解至水解度為15%，85°C滅酶20min，再以轉(zhuǎn)速為4000r/min離心30min，取上清 液，得酶解液； (2) 將酶解液過截留分子量為1 kDa的超濾膜，取濾過液； (3) 將超濾液通過已預(yù)先固載好鋅離子的IMAC分離柱，然后用pH值調(diào)節(jié)為7. 2的純 凈水沖洗2個柱體積，再用pH值調(diào)節(jié)為4. 0的純凈水進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，其中預(yù)先固載 好鋅離子的IMAC分離柱的制備過程如下：選取層析柱，先用0. 05-0. 2mol · Γ1的ZnCl2或 ZnS04溶液沖洗0. 5-2個柱體積，以實(shí)現(xiàn)鋅離子在柱子上的固載，再用純凈水沖洗5-10個柱 體積，去除未結(jié)合的鋅離子，即制備獲得預(yù)先固載好鋅離子的IMAC分離柱，采用的層析柱 為GE公司生產(chǎn)的HiPr印IMAC FF 16/10預(yù)裝柱； (4) 真空濃縮經(jīng)IMAC分離后的洗脫液，冷凍干燥得抗氧化鋅元素結(jié)合肽，獲得的羅非 魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的IMAC分離純化圖如圖1中所示，從圖1中可以看出，圖中第1個 高峰是用pH值為7. 0-7. 5的純凈水沖洗2-3個柱體積后出現(xiàn)的峰，這個峰代表的組分是不 能與鋅離子結(jié)合的肽，因此被洗脫下來，這部分是不要的，能結(jié)合鋅離子的肽此時被吸附在 柱子上，其在酸性條件下可以被洗脫下來，因此用pH值為4. 0-4. 5的純凈水進(jìn)行洗脫，收集 到的洗脫液則為鋅元素結(jié)合肽，為圖中第2峰。
[0019] 羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的肽序結(jié)構(gòu)測定采用電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜分析 (ESI-MS/MS, Bruker Daltonics Inc.，Billerica, MA)。樣品以流動注射方式注入電噴 霧（ESI)質(zhì)譜，采用正離子掃描模式，霧化氣和干燥氣為高純氮?dú)?，氣體流速為6L/min，氣 體壓力為1. 5Bar，掃描范圍為質(zhì)/核比50-1000 (m/z)，噴霧電壓3. 5kV。MS/MS肽序列分 析借助 BioTools (Version3. 0，Bruker Daltonics Data Analysis 3. 3)軟件并結(jié)合手動 計(jì)算。具體結(jié)果如圖2-4中所示。經(jīng)過鑒定，羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的主成分結(jié)構(gòu)為 二肽結(jié)構(gòu)，具體結(jié)構(gòu)為Lys-Leu或Lys-IIe。
[0020] 實(shí)施例2 本實(shí)施例提供的羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的制備方法，包括以下步驟： (1) 以羅非魚為原料，取肉絞碎，按照1:3的料水重量比加水，水溫調(diào)節(jié)至55°C，加入 Alcalase，酶解至水解度為17%，90°C滅酶15min，再以轉(zhuǎn)速為6000r/min離心25min，取上清 液，得酶解液； (2) 將酶解液先過截留分子量為5 kDa的超濾膜，以除去未酶解的蛋白，再過截留分子 量為lkDa的超濾膜，獲得小分子肽，取濾過液； (3) 將超濾液通過已預(yù)先固載好鋅離子的IMAC分離柱，然后用pH值調(diào)節(jié)為7. 3的純凈 水沖洗2個柱體積，再用pH值調(diào)節(jié)為4. 2的純凈水進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，預(yù)先固載好鋅離 子的IMAC分離柱的制備過程等同實(shí)施例1 ; (4) 真空濃縮經(jīng)IMAC分離后的洗脫液吧，冷凍干燥得抗氧化鋅元素結(jié)合肽，該抗氧化 鋅元素結(jié)合肽的IMAC分離純化圖如圖1中所示。羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的肽序結(jié)構(gòu) 同實(shí)施例1。
[0021] 實(shí)施例3 本實(shí)施例提供的羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的制備方法，包括以下步驟： (1)以羅非魚為原料，取肉絞碎，按照1:2的料水重量比加水，水溫調(diào)節(jié)至52°C，加入木 瓜蛋白酶與Alcalase( 1:1，w/w)，酶解至水解度為18%，95°C滅酶10min，再以轉(zhuǎn)速為7000r/ min離心20min，取上清液，得酶解液； (2) 將酶解液過截留分子量為3 kDa的超濾膜，以除去未酶解的蛋白，再過截留分子量 為lkDa的超濾膜，獲得小分子肽，取濾過液； (3) 將超濾液通過已預(yù)先固載好鋅離子的IMAC分離柱，然后用pH值調(diào)節(jié)為7. 5的純凈 水沖洗2個柱體積，再用pH值調(diào)節(jié)為4. 0的純凈水進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，預(yù)先固載好鋅離 子的IMAC分離柱的制備過程等同實(shí)施例1 ; (4) 真空濃縮經(jīng)IMAC分離后的洗脫液，冷凍干燥得抗氧化鋅元素結(jié)合肽，該抗氧化鋅 元素結(jié)合肽的IMAC分離純化圖如圖1中所示。羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的肽序結(jié)構(gòu)同 實(shí)施例1。
[0022] 實(shí)施例4 本實(shí)施例提供的羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的制備方法，包括以下步驟： (1) 以羅非魚為原料，取肉絞碎，按照1:3的料水重量比加水，水溫調(diào)節(jié)至53°C，加入木 瓜蛋白酶與Alcalase( 1:2, w/w)，酶解至水解度為20%，90°C滅酶15min，再以轉(zhuǎn)速為8000r/ min離心15min，取上清液，得酶解液； (2) 將酶解液過截留分子量為10kDa的超濾膜，以除去未酶解的蛋白，再過截留分子量 為lkDa的超濾膜，獲得小分子肽，取濾過液； (3) 將超濾液通過已預(yù)先固載好鋅離子的IMAC分離柱，然后用pH值調(diào)節(jié)為7. 4的純凈 水沖洗2個柱體積，再用pH值調(diào)節(jié)為4. 1的純凈水進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，預(yù)先固載好鋅離 子的IMAC分離柱的制備過程等同實(shí)施例1 ; (4) 真空濃縮經(jīng)IMAC分離后的超濾液洗脫液，冷凍干燥得抗氧化鋅元素結(jié)合肽，該抗 氧化鋅元素結(jié)合肽的IMAC分離純化圖如圖1中所示。羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的肽序 結(jié)構(gòu)同實(shí)施例1。
[0023] 第二部分羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的抗氧化性測試 抗氧化性的測定方法： 2. 1 DPPH自由基清除率的測定方法：取2mL樣液(實(shí)施例1中獲得的抗氧化鋅元素結(jié) 合肽，樣品用純凈水溶解，下同）加入〇. 15mM DPPH (95%乙醇溶解），混勻后于室溫下避光 反應(yīng)30 min，在517 nm處測得其吸光值A(chǔ)i，空白為2 mL 95%乙醇溶液代替DPPH溶液，力口 入2 mL樣液混勻，在517nm處測得其吸光值A(chǔ)j，對照組為2 mL DPPH溶液加入2 mL 95%乙 醇，在517 nm處測得其吸光值A(chǔ)0。對樣品溶液做梯度稀釋，測定不同濃度下的自由基清除 率，經(jīng)線性回歸后計(jì)算出自由基清除率為50%時的濃度，即IC 5(I值。清除率按以下公式進(jìn)行 計(jì)算：清除率（％) = [1-%4) / AJ X 100%，式中人為對照組吸光值夂為樣品組吸光值； Aj-為空白組吸光值，羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的DPPH自由基清除率結(jié)果見圖5,用公認(rèn) 的抗氧化劑谷胱甘肽做對照，DPPH自由基半清除率IC 5(I值越低表明其抗氧化性越好，從圖5 中可以看出，本發(fā)明中的抗氧化鋅元素結(jié)合肽的抗氧化性與抗氧化劑谷胱甘肽的抗氧化性 兩者沒有顯著性差異，具有相似的活性。
[0024] 2. 2 0H自由基清除率的測定方法：取0. 6 mL 5mmol/L鄰二氮菲的無水乙醇溶液， 先加入 0· 4mL 0· 15 mol/L 的磷酸鹽緩沖液（pH 7. 40)和 0· 6mL 0· 75 mmol/L 的 FeS04,再 加入2mL樣品液混勻后，最后加入0. 4mL 0. 1% (V/V)的H202搖勻，37°C下水浴60 min后 在536 nm處測定得吸光值為A樣品；以去離子水代替樣品和H202溶液重復(fù)上述操作，在536 nm處測得其吸光值為A未損傷；以去離子水代替樣品液來重復(fù)以上操作，在536 nm處測得 吸光度A損傷。對樣品溶液做梯度稀釋，測定不同濃度下的自由基清除率，經(jīng)線性回歸后計(jì) 算出自由基清除率為50%時的蛋白濃度，即IC5Q值。清除率按如下公式進(jìn)行計(jì)算：清除率 (%)= (A樣品-A損傷V( A未損傷-A損傷）X100%，式中：A樣品為樣品組的吸光值；A損傷為損傷管 的吸光值;A#i^為未損傷管的吸光值。羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的OH自由基清除率結(jié) 果見圖6,用公認(rèn)的抗氧化劑谷胱甘肽做對照，OH自由基半清除率IC 5(I值越低表明其抗氧化 性越好，從圖6中可以看出，本發(fā)明中的抗氧化鋅元素結(jié)合肽的抗氧化性與抗氧化劑谷胱 甘肽的抗氧化性兩者沒有顯著性差異，具有相似的活性。
[0025] 本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知 識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修 改、替換或變更，均落在本發(fā)明權(quán)利保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 控制酶解：以羅非魚為原料，粉碎，加水，水溫調(diào)節(jié)至50-60°C，加入木瓜蛋白酶和 Alcalase中的一種或兩種，酶解至水解度為15-22%，滅酶，離心后，取上清液，得酶解液； (2) 超濾分離：將酶解液采用截留分子量為1-10 kDa的超濾膜過濾，取濾過液； (3) 固定化金屬離子親和層析：將濾過液通過已預(yù)先固載好鋅離子的IMAC分離柱，然 后用pH值為7. 0-7. 5的純凈水沖洗2-3個柱體積，再用pH值為4. 0-4. 5的純凈水進(jìn)行洗 脫，收集洗脫液； (4) 真空濃縮、冷凍干燥：將洗脫液經(jīng)真空干燥和冷凍濃縮，得抗氧化鋅元素結(jié)合肽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的制備方法，其特征在于：步驟 (1)中水的用量為羅非魚原料總重量的2-3倍。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的制備方法，其特征在于：步驟 (1)中滅酶時的溫度為85-95°C，滅酶時間為10_20min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的制備方法，其特征在于：步驟 (1) 中離心時離心機(jī)轉(zhuǎn)速為4000-8000r/min，離心時間為15_30min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的制備方法，其特征在于：步驟 (2) 中將酶解液先過截留分子量為3-10 kDa的超濾膜，再采用截留分子量為lkDa的超濾膜 過濾，取濾過液；或?qū)⒚附庖褐苯硬捎媒亓舴肿恿繛閘kDa的超濾膜過濾。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的制備方法，其特征在 于：步驟（3)中預(yù)先固載好鋅離子的IMAC分離柱的制備過程如下：選取層析柱，先用 0. 05-0. 2mol · Γ1的ZnCl2或ZnS04溶液沖洗0. 5-2個柱體積，以實(shí)現(xiàn)鋅離子在柱子上的固 載，再用純凈水沖洗5-10個柱體積，去除未結(jié)合的鋅離子，即制備獲得預(yù)先固載好鋅離子 的IMAC分離柱。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的羅非魚抗氧化鋅元素結(jié)合肽的制備方法，其特征在于：所述 的層析柱為GE公司生產(chǎn)的HiPr印IMAC FF 16/10預(yù)裝柱。
【文檔編號】C12P21/06GK104195207SQ201410476725
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月17日
【發(fā)明者】胡曉, 李來好, 楊賢慶, 陳勝軍, 吳燕燕, 郝淑賢, 林婉玲, 馬海霞 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所