一種臨床用間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種臨床用間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，本發(fā)明制備方法在胳帶采集前對產(chǎn)婦進(jìn)行篩選，以符合條件的健康足月產(chǎn)婦志愿者作為采集目標(biāo)，之后進(jìn)行分離擴(kuò)增進(jìn)行規(guī)模化培養(yǎng)直至第三代，進(jìn)行冷凍保存，對分離過程及冷凍過程的的中間品進(jìn)行一系列質(zhì)量檢測，冷凍后細(xì)胞復(fù)蘇洗滌待用，活率無明顯降低。本發(fā)明擬從原料采集開始直至細(xì)胞制備完成的全過程進(jìn)行臨床級、統(tǒng)一、系統(tǒng)監(jiān)控，以實(shí)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品o
【專利說明】-種臨床用間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種臨床用間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 干細(xì)胞（Stem Cells, SC)是一類具有自我復(fù)制能力（self-renewing)的多潛能細(xì) 胞，是原始且未特化的細(xì)胞。在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞，具有再生各種組 織器官和人體的潛在功能。干細(xì)胞存在所有多細(xì)胞組織里，能經(jīng)由有絲分裂與分化來分裂 成多種的特化細(xì)胞，而且可以利用自我更新來提供更多干細(xì)胞。干細(xì)胞的來源有很多，包括 臍帶、臍帶血與骨髓。
[0003] 嬰兒出生后遺留在胎盤和臍帶中的血是干細(xì)胞的重要來源。臍帶血中的造血干細(xì) 胞可以用來治療多種血液系統(tǒng)疾病和免疫系統(tǒng)疾病，包括血液系統(tǒng)惡性腫瘤（如：急性白 血病、慢性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓異常增殖綜合癥和淋巴瘤等）、血紅蛋白?。ㄈ纾汉?洋性貧血）、骨髓造血功能衰竭（如：再生障礙性貧血）、先天性代謝性疾病、先天性免疫缺 陷疾患、自身免疫性疾患、某些實(shí)體腫瘤（如：小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、卵巢癌和進(jìn)行性 肌營養(yǎng)不良等）。自1988年臍血干細(xì)胞就用來治療根達(dá)綜合癥、亨達(dá)綜合癥、和拉綜合癥 和急性淋巴細(xì)胞性白血病等許多兒童疾病。截至2011年，臍帶血不僅已能有效地治療幾十 種難治性疾病和多種不治之癥，而且它所能治療的疾病種類還在不斷地增加。自體儲存的 臍帶血一旦需要使用時(shí)，不需配型，細(xì)胞活性強(qiáng)，無免疫排斥的危險(xiǎn)，移植成活率高，治愈率 高，醫(yī)療費(fèi)用低。
[0004] 在人臍帶中有一類具有干細(xì)胞特征的細(xì)胞群體，被稱為人間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs)。 人間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我更新和多向分化的潛能，在不同誘導(dǎo)條件下可分化為三胚層細(xì) 胞，如骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等。此外，還表達(dá)IL6、G-CSF和SCF 等多種造血細(xì)胞生長所需要的因子，能夠維持長期培養(yǎng)的造血祖細(xì)胞增殖，顯示MSC具有 支持造血和促進(jìn)造血恢復(fù)的作用。同時(shí)研究表明MSC具有免疫調(diào)節(jié)作用，在體外能夠抑制T 淋巴細(xì)胞增殖，體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MSCs移植可以抑制異體免疫反應(yīng)，減輕移植相關(guān)的排斥 反應(yīng)，并延長異體移植物的存活時(shí)間。最近的臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MSCs聯(lián)合造血干細(xì)胞移植可以 減輕GVHD并降低移植失敗率。MSC的多向分化能力和免疫調(diào)節(jié)能力決定了其在細(xì)胞治療、 組織工程等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0005] 目前常規(guī)培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞多用動物血清，如雞、豬、牛等，其中胎牛血清因獲取 量大、污染輕而被廣泛應(yīng)用。但近年隨著人畜共患病發(fā)病率的增加，以異種血清培養(yǎng)的組織 向臨床應(yīng)用的安全性受到質(zhì)疑，因此自體血清培養(yǎng)越來越受到重視。
[0006] 中國發(fā)明專利ZL200610067537. 5公開了一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其 步驟包括諸如：將人臍帶去除殘留血液，剪碎，用膠原酶消化；再加入胰酶消化；消化液用 篩網(wǎng)過濾，去除未消化組織；將過濾后的消化液用磷酸緩沖液稀釋；離心；以及將細(xì)胞接種 于培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)等。
[0007] 中國發(fā)明專利申請200910194915. X公開了一種臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞及其制備方 法，分離并獲取了具有成骨分化潛能的UCB-MSCs細(xì)胞亞群的干細(xì)胞。其技術(shù)手段主要涉及 將來自臍血的間充質(zhì)干細(xì)胞的單細(xì)胞懸液和熒光標(biāo)記的CD105單克隆抗體混合后，通過流 式細(xì)胞儀分選得到⑶105陽性（⑶105+)的臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞。該干細(xì)胞接種于醫(yī)學(xué)上 可接受的生物可降解材料，形成了骨移植物。
[0008] 但目前公開的各類間充質(zhì)干細(xì)胞制備方法雖均能獲得間充質(zhì)干細(xì)胞，但都不符合 臨床應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明擬從原料采集開始直至細(xì)胞制備完成的全過程進(jìn)行臨床級、統(tǒng)一、 系統(tǒng)監(jiān)控，以實(shí)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 針對現(xiàn)有技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供一種臨床用間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，本發(fā)明制 備方法在臍帶采集前對產(chǎn)婦進(jìn)行篩選，以符合條件的健康足月產(chǎn)婦志愿者作為采集目標(biāo)， 之后進(jìn)行分離擴(kuò)增進(jìn)行規(guī)?；囵B(yǎng)直至第三代，進(jìn)行冷凍保存，對分離過程及冷凍過程的 的中間品進(jìn)行一系列質(zhì)量檢測，冷凍后細(xì)胞復(fù)蘇洗滌待用，活率無明顯降低。
[0010] 本發(fā)明提供一種臨床用間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，所述制備方法包括如下步驟：
[0011] 步驟一、臍帶篩選與保存：篩選、采集健康足月產(chǎn)婦志愿者臍帶，置于臍帶保存液 中4°C冷藏，并于24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行分離處理；
[0012] 步驟二、臍帶分離：將臍帶轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，生理鹽水清洗；去除兩端結(jié)扎部位， 剝除臍靜脈和兩條臍動脈；展平，撕下華通氏膠，去除羊膜；將撕下的華通氏膠置于離心管 中剪碎至1?4mm3小塊；
[0013] 步驟三、間充質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)：將剪碎的華通氏膠轉(zhuǎn)至裝有完全培養(yǎng)基的透氣蓋 培養(yǎng)瓶中，在37°c、5% CO2、飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)；細(xì)胞密度達(dá)約lg/T75瓶，第5天首次換 液，此后每3天換液一次，至第14天左右；細(xì)胞融合度達(dá)80%以上時(shí)，用胰蛋白酶消化傳 代，用原培養(yǎng)上清終止；
[0014] 步驟四、傳代培養(yǎng)：傳代時(shí)，傳代細(xì)胞接種密度約為6000個(gè)/cm2 ;3天后，細(xì)胞密 度達(dá)80%以上，再次傳代；傳至第三代，細(xì)胞數(shù)約為3?5 X 109,收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)和活率，按 2 X IOVml/管進(jìn)行冷凍保存；將細(xì)胞上清進(jìn)行無菌檢測、支原體檢測，取I X IO7細(xì)胞做細(xì)胞 表面標(biāo)志檢測；
[0015] 步驟五、間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志、分化檢測：按照ISCT間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)檢測陽 性指標(biāo)以及陰性指標(biāo)；對第三代細(xì)胞進(jìn)行分化實(shí)驗(yàn)檢測干細(xì)胞分化能力，分別向成脂、成 骨、成軟骨三個(gè)方向分化，進(jìn)行油紅0染色、茜素紅染色和阿爾新藍(lán)染色鑒定；間充質(zhì)干細(xì) 胞表面標(biāo)志、分化檢測后，冷凍保存；
[0016] 所述陽性指標(biāo)如⑶90、⑶105、⑶73等；所述陰性指標(biāo)如⑶79-a、⑶14、⑶34、⑶45、 HLA-DR ；
[0017] 步驟六、臨床用間干細(xì)胞使用：取冷凍細(xì)胞，復(fù)蘇后用生理鹽水洗滌兩遍，統(tǒng)計(jì)細(xì) 胞數(shù)和細(xì)胞活率，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果按臨床需要將細(xì)胞和復(fù)方電解質(zhì)溶液混勻待用；并留樣進(jìn) 行內(nèi)毒素和細(xì)菌檢測。
[0018] 優(yōu)選地，步驟一中，所述臍帶保存液為無血清培養(yǎng)基，不含抗生素；可維持臍帶細(xì) 胞活性長達(dá)24?48小時(shí)，避免了臨床應(yīng)用時(shí)的抗生素過敏問題。
[0019] 優(yōu)選地，步驟一中，所述篩選的檢測項(xiàng)目包括攜帶病毒、遺傳家族史等；所述病毒 如乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等；
[0020] 優(yōu)選地，步驟三中，所述胰蛋白酶的濃度為0. 05%，由0. 25%成品胰酶稀釋5倍； 用于細(xì)胞消化過程，低濃度消化保持細(xì)胞活性和干細(xì)胞干性；所述百分比為質(zhì)量體積比。
[0021] 優(yōu)選地，步驟三中，所述完全培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和血清替代物以及谷氨酰胺配 比而成，血清替代物比例10% ;谷氨酰胺比例0.02mmol/ml ;用于細(xì)胞分離、擴(kuò)增培養(yǎng)以及 冷凍保護(hù)過程，避免不明動物源蛋白進(jìn)入人體引起的潛在風(fēng)險(xiǎn)；所述百分比為質(zhì)量體積比。
[0022] 優(yōu)選地，步驟四中，所述無菌檢測包括用血培養(yǎng)儀進(jìn)行細(xì)菌和真菌檢測；所述支原 體檢測包括用PCR法進(jìn)行支原體檢測。
[0023] 優(yōu)選地，步驟四中，所述冷凍保存所用細(xì)胞冷凍保護(hù)液由完全培養(yǎng)基和二甲基亞 砜（DMSO)配制而成，其中二甲基亞砜（DMSO)終濃度10%;用于保護(hù)冷凍細(xì)胞的活性；所述 百分比為質(zhì)量體積比。
[0024] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：
[0025] 1、全過程全面質(zhì)量監(jiān)控，從臍帶采集前的篩選開始直至細(xì)胞制備成成品中間品及 終產(chǎn)品的質(zhì)量全部受控；
[0026] 2、無血清培養(yǎng)基，不使用抗生素，避免異源蛋白及抗生素可能引起的疾病或過敏 風(fēng)險(xiǎn)；
[0027] 3、規(guī)模化培養(yǎng)，保證細(xì)胞均一性和有效性；
[0028] 4、低濃度胰酶消化，保持細(xì)胞的活性及干細(xì)胞的干性；
[0029] 5、干細(xì)胞表面標(biāo)志檢測的陽性指標(biāo)表達(dá)率99%以上，陰性指標(biāo)2%以下。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù) 人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明 的保護(hù)范圍。
[0031] 實(shí)施例1
[0032] 本實(shí)施例提供一種臨床用間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，具體包括如下步驟：
[0033] 步驟一、臍帶篩選與保存：篩選、采集健康足月產(chǎn)婦志愿者臍帶，置于臍帶保存液 中4°C冷藏，并于24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行分離處理；所述臍帶保存液為無血清培養(yǎng)基，不含抗生素； 所述篩選的檢測項(xiàng)目包括攜帶病毒、遺傳家族史等；所述病毒如乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等；
[0034] 同時(shí)采集一管母血留作復(fù)檢，復(fù)檢項(xiàng)目為乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等病毒免疫學(xué)檢 測及基因檢測。
[0035] 步驟二、臍帶分離：將臍帶轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，生理鹽水清洗；去除兩端結(jié)扎部位， 剝除臍靜脈和兩條臍動脈；展平，撕下華通氏膠，去除羊膜；將撕下的華通氏膠置于離心管 中剪碎至1?4mm 3小塊；臍帶分離過程中的清洗液上清進(jìn)行無菌檢測，用血培養(yǎng)儀進(jìn)行細(xì) 菌和真菌檢測，用PCR法進(jìn)行支原體檢測。
[0036] 步驟三、間充質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)：將剪碎的華通氏膠轉(zhuǎn)至裝有完全培養(yǎng)基的透氣蓋 培養(yǎng)瓶中，在37°C、5% CO2、飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)；細(xì)胞密度達(dá)約lg/T75瓶，第5天首次換 液，此后每3天換液一次，至第14天左右；細(xì)胞融合度達(dá)80 %以上時(shí)，用胰蛋白酶消化傳 代，用原培養(yǎng)上清終止；所述胰蛋白酶的濃度為0. 05%，由0. 25%成品胰酶稀釋5倍；用于 細(xì)胞消化過程，低濃度消化保持細(xì)胞活性和干細(xì)胞干性；所述完全培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和 血清替代物以及谷氨酰胺配比而成，血清替代物比例10% ;谷氨酰胺比例〇.〇2mmol/ml。
[0037] 步驟四、傳代培養(yǎng)：傳代細(xì)胞接種密度約為6000個(gè)/cm2 ;3天后，細(xì)胞密度達(dá)80% 以上，再次傳代；傳至第三代，細(xì)胞數(shù)約為3?5X 109,收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)和活率，按2X IO7/ ml/管進(jìn)行冷凍保存；將細(xì)胞上清進(jìn)行無菌檢測、支原體檢測；所述無菌檢測包括用血培養(yǎng) 儀進(jìn)行細(xì)菌和真菌檢測；所述支原體檢測包括用PCR法進(jìn)行支原體檢測。
[0038] 步驟五、間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志、分化檢測：取IX IO7的細(xì)胞進(jìn)行干細(xì)胞表面標(biāo)志 檢測，按照ISCT間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)檢測⑶90、⑶105、⑶73三個(gè)陽性指標(biāo)以及⑶79-aXD14、 CD34、CD45、HLA-DR五個(gè)陰性指標(biāo)；對第三代細(xì)胞進(jìn)行分化實(shí)驗(yàn)檢測干細(xì)胞分化能力，分別 向成脂、成骨、成軟骨三個(gè)方向分化，進(jìn)行油紅〇染色、茜素紅染色和阿爾新藍(lán)染色鑒定；間 充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志、分化檢測后，冷凍保存。
[0039]

【權(quán)利要求】
1. 一種臨床用間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步驟： 步驟一、臍帶篩選與保存：篩選、采集健康足月產(chǎn)婦志愿者臍帶，置于臍帶保存液中 4°C冷藏，并于24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行分離處理； 步驟二、臍帶分離：將臍帶轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，生理鹽水清洗；去除兩端結(jié)扎部位，剝除 臍靜脈和兩條臍動脈；展平，撕下華通氏膠，去除羊膜；將撕下的華通氏膠置于離心管中剪 碎至1?4mm3小塊； 步驟三、間充質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)：將剪碎的華通氏膠轉(zhuǎn)至裝有完全培養(yǎng)基的透氣蓋培養(yǎng) 瓶中，在37°C、5% CO2、飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)；細(xì)胞密度達(dá)約lg/T75瓶，第5天首次換液，此 后每3天換液一次，至第14天左右；細(xì)胞融合度達(dá)80%以上時(shí)，用胰蛋白酶消化傳代，用原 培養(yǎng)上清終止； 步驟四、傳代培養(yǎng)：傳代時(shí)，傳代細(xì)胞接種密度約為6000個(gè)/cm2 ;3天后，細(xì)胞密度 達(dá)80%以上，再次傳代；傳至第三代，細(xì)胞數(shù)約為3?5X 109,收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)和活率，按 2 X IOVml/管進(jìn)行冷凍保存；將細(xì)胞上清進(jìn)行無菌檢測、支原體檢測，取I X IO7細(xì)胞做細(xì)胞 表面標(biāo)志檢測； 步驟五、間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志、分化檢測：按照ISCT間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)檢測陽性指 標(biāo)以及陰性指標(biāo)；對第三代細(xì)胞進(jìn)行分化實(shí)驗(yàn)檢測干細(xì)胞分化能力，分別向成脂、成骨、成 軟骨三個(gè)方向分化，進(jìn)行油紅〇染色、茜素紅染色和阿爾新藍(lán)染色鑒定；間充質(zhì)干細(xì)胞表面 標(biāo)志、分化檢測后，冷凍保存； 步驟六、臨床用間干細(xì)胞使用：取冷凍細(xì)胞，復(fù)蘇后用生理鹽水洗滌兩遍，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù) 和細(xì)胞活率，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果按臨床需要將細(xì)胞和復(fù)方電解質(zhì)溶液混勻待用；并留樣進(jìn)行內(nèi) 毒素和細(xì)菌檢測。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的臨床用間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，步驟一中，所 述臍帶保存液為無血清培養(yǎng)基，不含抗生素。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的臨床用間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，步驟一中，所 述篩選的檢測項(xiàng)目包括攜帶病毒或遺傳家族史。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的臨床用間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，步驟三中，所 述胰蛋白酶的濃度為〇. 05%，由0. 25%成品胰酶稀釋5倍。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的臨床用間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，步驟三中， 所述完全培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和血清替代物以及谷氨酰胺配比而成，血清替代物比例為 10% ;谷氨酰胺比例0. 02mmol/ml。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的臨床用間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，步驟四中，所 述無菌檢測包括用血培養(yǎng)儀進(jìn)行細(xì)菌和真菌檢測；所述支原體檢測包括用PCR法進(jìn)行支原 體檢測。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的臨床用間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，步驟四中，所 述冷凍保存所用細(xì)胞冷凍保護(hù)液由完全培養(yǎng)基和二甲基亞砜配制而成，其中二甲基亞砜終 濃度10%。
【文檔編號】C12N5/0775GK104212764SQ201410487187
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月22日
【發(fā)明者】董成友, 朱兵銳, 江曄, 謝天 申請人:上海華顏干細(xì)胞科技有限公司