一種2’-脫氧-5-氟尿苷的微生物合成方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種2’-脫氧-5-氟尿苷的微生物合成方法，所述的方法為：以2’-脫氧核糖-1-磷酸二環(huán)己胺鹽和5-氟尿嘧啶為底物，以產(chǎn)嘧啶核苷磷酸化酶的菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為催化劑，以pH值為6.5～8.5的磷酸緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)，在45～65℃條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，獲得2’-脫氧-5-氟尿苷；本發(fā)明方法2’-脫氧-5-氟尿苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了79.36％，一步酶促合成，條件溫和，反應(yīng)時(shí)間短，并且避免了底物脫氧核糖供體來(lái)源不足、價(jià)格昂貴的問(wèn)題；應(yīng)用全細(xì)胞進(jìn)行催化，無(wú)需進(jìn)行酶的分離純化，反應(yīng)結(jié)束后菌體回收方便，有利于工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)。
【專利說(shuō)明】-種2' -脫氧-5-氟尿苷的微生物合成方法 (一）

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種2' -脫氧-5-氟尿苷的合成方法，特別涉及一種2' -脫氧-5-氟 尿苷的微生物合成方法。 (二）

【背景技術(shù)】
[0002] 5-氟尿嘧啶首次合成于1957年，目前仍用于治療多種惡性腫瘤，但是其自身毒性 較大、擴(kuò)散能力較弱和抗藥性限制了 5-氟尿嘧啶的使用。2'-脫氧-5-氟尿苷為其前體藥 物，具有低細(xì)胞毒性和易于在體內(nèi)被吸收的優(yōu)點(diǎn)，它通過(guò)抑制胸腺嘧啶脫氧核苷酸合成酶， 阻斷尿嘧啶脫氧核苷酸轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶核苷酸，影響DNA的合成，從而起到抗病毒復(fù)制和 抗腫瘤的作用。
[0003] 曹萌萌等報(bào)道了化學(xué)法合成2' -脫氧-5-氟尿苷的改進(jìn)工藝，以氟尿嘧啶為起始 原料，經(jīng)硅醚化、縮合、溴化、氫化和皂化等工藝（如圖1所示），最后得總收率為34. 31 %。 采用該合成路線收率較低，且需使用有毒化學(xué)試劑，對(duì)環(huán)境及人身均有不利影響，不符合現(xiàn) 在倡導(dǎo)的綠色友好化學(xué)的主題。
[0004] 朱仁發(fā)等報(bào)道了以5-氟尿嘧啶核苷為原料，經(jīng)丙酰溴?；宕?' -溴 代-3'，5' -0-二丙?；?5-氟尿嘧啶核苷，然后氫化得產(chǎn)物2' -脫氧2'，5' -0-二丙酰 基-5-氟尿嘧啶核苷，最后經(jīng)皂化合成2'-脫氧-5-氟尿苷，總收率為72. 0%，其合成流程 如圖2所示。采用該合成方法能獲得較高的產(chǎn)物收率，但以5-氟尿苷作為原料，生產(chǎn)成本 高，反應(yīng)中使用的H2也具有一定的危險(xiǎn)性，回收中間產(chǎn)物用于下一步反應(yīng)也需大量使用有 機(jī)溶劑，同樣會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。
[0005] 而周長(zhǎng)林等曾報(bào)道利用產(chǎn)核苷磷酸化酶的游離大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，研 究中發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加 l.〇mg/L底物脫氧尿苷可以使菌體核苷磷酸化酶的活力提高 11. 0%，而加入另一種底物5-FU時(shí)細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制。以脫氧尿苷和5-氟尿嘧啶為原料 合成2' -脫氧_5_氟尿苷，廣物2' -脫氧_5_氟尿苷的轉(zhuǎn)化率可達(dá)50%，濃度約為9mmol/ L〇
[0006]

【權(quán)利要求】
1. 一種2'-脫氧-5-氟尿苷的微生物合成方法，其特征在于所述的方法為：以2'-脫 氧核糖-1-磷酸二環(huán)己胺鹽和5-氟尿嘧啶為底物，以產(chǎn)嘧啶核苷磷酸化酶的菌株經(jīng)發(fā)酵培 養(yǎng)獲得的濕菌體為催化劑，以pH值為6. 5?8. 5的磷酸緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)，在45?65 °C條 件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液分離純化，獲得2' -脫氧-5-氟尿苷；所述催化 劑是將產(chǎn)嘧啶核苷磷酸化酶的菌株經(jīng)種子培養(yǎng)后接種至含誘導(dǎo)劑的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā) 酵培養(yǎng)獲得的，所述誘導(dǎo)劑為腺苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷或胞嘧啶。
2. 如權(quán)利要求1所述2'-脫氧-5-氟尿苷的微生物合成方法，其特征在于所述2'-脫 氧核糖-1-磷酸二環(huán)己胺鹽的初始濃度為20?40mmol/L緩沖液，所述5-氟尿嘧啶的初始 濃度為20?120mmol/L緩沖液，所述催化劑的用量以濕菌體質(zhì)量計(jì)為100?120g/L緩沖 液。
3. 如權(quán)利要求1所述2'-脫氧-5-氟尿苷的微生物合成方法，其特征在于所述產(chǎn)核苷 磷酸化酶的菌株為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus)CCTCC AB205442。
4. 如權(quán)利要求1所述2'-脫氧-5-氟尿苷的微生物合成方法，其特征在于所述誘導(dǎo)劑 的添加終濃度為5?25mmol/L發(fā)酵培養(yǎng)基。
5. 如權(quán)利要求1所述2' -脫氧-5-氟尿苷的微生物合成方法，其特征在于所述誘導(dǎo)劑 為腺苷、尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷。
6. 如權(quán)利要求1?5之一所述2'-脫氧-5-氟尿苷的微生物合成方法，其特征在于所 述催化劑按如下步驟制備： (1) 斜面培養(yǎng) 將產(chǎn)嘧啶核苷磷酸化酶的菌株接種至LB斜面培養(yǎng)基，在35°C培養(yǎng)24h，獲得斜面菌體； 所述每升斜面培養(yǎng)基的組成為：l〇g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化鈉，15g瓊脂，加蒸餾水 至 lL，pH 為 7.0 ; (2) 種子培養(yǎng) 挑取斜面菌體接種至種子培養(yǎng)基，在35°C、180rpm條件下培養(yǎng)16h，獲得種子液；所述 每升種子培養(yǎng)基的組成為：l〇g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化鈉，加蒸餾水至1L，pH為 7. 0 ； (3) 發(fā)酵培養(yǎng) 將種子液以體積濃度1 %的接種量接種至含終濃度15mmol/L誘導(dǎo)劑的發(fā)酵培養(yǎng)基，在 35°C、180rpm條件下發(fā)酵培養(yǎng)24h，離心，收集沉淀用生理鹽水洗滌3次，即獲得濕菌體；所 述每升發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：l〇g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化鈉，加蒸餾水至1L，pH為 7. 0。
7. 如權(quán)利要求1?5之一所述2' -脫氧-5-氟尿苷的微生物合成方法，其特征在于 所述反應(yīng)液分離純化的方法為：反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液進(jìn)行柱層析，以C18填料作為分離介 質(zhì)，以體積濃度10%甲醇水溶液作為洗脫劑進(jìn)行分離，TLC跟蹤檢測(cè)，收集含目標(biāo)組分的洗 脫液，即為2' -脫氧-5-氟尿苷。
【文檔編號(hào)】C12P19/38GK104293867SQ201410504731
【公開(kāi)日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月27日
【發(fā)明者】易喻, 應(yīng)國(guó)清, 江林林, 王鴻, 梅建鳳, 陳建澍 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)