犬新孢子蟲(chóng)的分離方法和體外培養(yǎng)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種犬新孢子蟲(chóng)的分離方法和體外培養(yǎng)方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的犬新孢子蟲(chóng)的分離方法通過(guò)這樣的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：取一定體積濃度為10kU/ml的青霉素和10mg/ml的鏈霉素的雙抗，應(yīng)用一次性注射器無(wú)菌采集犬新孢子蟲(chóng)感染的動(dòng)物腦組織，該犬新孢子蟲(chóng)感染的動(dòng)物腦組織體積為該雙抗體積的兩倍，將該雙抗加入到采集的該犬新孢子蟲(chóng)感染的動(dòng)物腦組織；采用不同規(guī)格的一次性注射器按照針頭直徑縮小的順序反復(fù)吸吹。本發(fā)明具有簡(jiǎn)便、快捷、省時(shí)、增殖時(shí)間短、實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】犬新孢子蟲(chóng)的分離方法和體外培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種犬新孢子蟲(chóng)的分離方法和體外培養(yǎng)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]犬新孢子蟲(chóng)(Neospora caninum)為專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)，隸屬于原生動(dòng)物門(mén)(Protozoa)、頂復(fù)亞門(mén)(Apicomplexa)、孢子蟲(chóng)綱(Sporozoa)、新孢子蟲(chóng)亞綱(Neosporidia)、新孢子蟲(chóng)屬(Neospora)。1988年,Dubey等人首次從一只下肢癱瘓的犬體內(nèi)分離到該蟲(chóng)體，并且將其命名為犬新孢子蟲(chóng)。犬新孢子蟲(chóng)的終末宿主是犬，牛、羊、豬、馬、兔等多種哺乳動(dòng)物都可以作為中間宿主，它的寄生部位是中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腦、肝、肌肉及其它內(nèi)臟組織。新孢子蟲(chóng)病(Neosporiasis)是由犬新孢子蟲(chóng)寄生于犬、牛、羊等多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)而引起的一種原蟲(chóng)病，該病主要引起母畜流產(chǎn)、死胎或新生兒運(yùn)動(dòng)障礙和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，給畜牧業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。國(guó)內(nèi)對(duì)犬新孢子蟲(chóng)的研究尚屬起步階段，尚缺少自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的犬新孢子蟲(chóng)體分離、體外增殖等技術(shù)方法。
[0003]原有方法(Yamane et al.1997)中報(bào)道的犬新孢子蟲(chóng)的分離方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn):無(wú)菌采集新鮮死亡的胎兒腦組織，稱量10克放入研缽中，加入胰蛋白酶使終濃度為0.5%，37°C孵育20min，添加適量液氮迅速研磨，得到勻漿液經(jīng)細(xì)胞濾器過(guò)濾后離心，并懸浮于添加抗生素等雙抗的無(wú)菌PBS中，最后將含有蟲(chóng)體的混懸液接種于含有10%胎牛血清培養(yǎng)基的單層Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞系)上，每24h更換培養(yǎng)液，直至觀察到犬新孢子蟲(chóng)速殖子。這一分離方法繁瑣復(fù)雜，極易污染，研磨組織飛濺的液氮容易傷害操作人員，胰蛋白酶也會(huì)影響組織中分離的蟲(chóng)體和培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，分離效率較低，失敗率高。
[0004]體外培養(yǎng)犬新孢子蟲(chóng)常用細(xì)胞為Vero細(xì)胞系等傳代細(xì)胞,原有方法(Davison etal.1999)中報(bào)道的體外培養(yǎng)犬新孢子蟲(chóng)的方法，以Ve1傳代細(xì)胞系培養(yǎng)犬新孢子蟲(chóng)速殖子為例，將復(fù)蘇的Ve1細(xì)胞接種到含8%犢牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，當(dāng)Vero細(xì)胞長(zhǎng)成單層后接種14個(gè)左右蟲(chóng)體，每隔12小時(shí)更換培養(yǎng)液，應(yīng)用倒置顯微鏡觀察犬新孢子蟲(chóng)速殖子增殖情況，接種4-5日后蟲(chóng)體增殖達(dá)到高峰期。Vero細(xì)胞的傳代培養(yǎng)程序繁瑣，而且犬新孢子蟲(chóng)在Vero細(xì)胞系中培養(yǎng)生長(zhǎng)和增殖緩慢，尤其凍存蟲(chóng)體復(fù)蘇、接種Vero細(xì)胞其復(fù)蘇和增殖時(shí)間較長(zhǎng)，極大限制了急需蟲(chóng)體試驗(yàn)的研究進(jìn)展。
[0005]專(zhuān)利“一種新的犬新孢子蟲(chóng)速殖子的體外培養(yǎng)和染色方法”采用MCF-7乳腺細(xì)胞為宿主細(xì)胞，采用RPM-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，采用倒置顯微鏡觀察胞外新孢子蟲(chóng)速殖子的數(shù)目，從第2天開(kāi)始緩慢增長(zhǎng)，第3天開(kāi)始迅速增長(zhǎng)，在第4天達(dá)到高峰。該方法依舊存在增殖時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題。
[0006]目前，尚沒(méi)有應(yīng)用原代人胚腎細(xì)胞-293細(xì)胞體外增殖培養(yǎng)犬新孢子蟲(chóng)的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明是鑒于現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題而做出的，本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)便、快捷、實(shí)用性強(qiáng)的犬新孢子蟲(chóng)的分離方法。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的犬新孢子蟲(chóng)的分離方法通過(guò)這樣的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):取一定體積濃度為10kU/ml的青霉素和10mg/ml的鏈霉素的雙抗,應(yīng)用一次性注射器無(wú)菌采集犬新孢子蟲(chóng)感染的動(dòng)物腦組織，該犬新孢子蟲(chóng)感染的動(dòng)物腦組織體積為該雙抗體積的兩倍以上,將該雙抗加入到采集的該犬新孢子蟲(chóng)感染的動(dòng)物腦組織；
[0009]采用不同規(guī)格的一次性注射器按照針頭直徑縮小的順序反復(fù)吸吹。
[0010]本發(fā)明所述的犬新孢子蟲(chóng)的分離方法，其特征在于，所述吸吹步驟中，反復(fù)吸吹至少10次以上。
[0011]本發(fā)明所述的犬新孢子蟲(chóng)的分離方法，其特征在于，所述一次性注射器，針頭直徑的大小不小于27G。
[0012]本發(fā)明所述的犬新孢子蟲(chóng)的分離方法，其特征在于，所述一次性注射器，選自12G針頭、20G針頭、27G針頭中任意一種以上的針頭。
[0013]本發(fā)明所述的犬新孢子蟲(chóng)的分離方法，其特征在于，還包括:將經(jīng)過(guò)處理的所述犬新孢子蟲(chóng)感染動(dòng)物腦組織接種到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Vero細(xì)胞中培養(yǎng)。
[0014]本發(fā)明所述的犬新孢子蟲(chóng)的分離方法，其特征在于，所述培養(yǎng)采用DMEM完全培養(yǎng)液。
[0015]本發(fā)明所述的犬新孢子蟲(chóng)的分離方法，其特征在于，所述培養(yǎng)液含有I %雙抗和8%犢牛血清。
[0016]本發(fā)明所述的犬新孢子蟲(chóng)的分離方法，其特征在于，所述培養(yǎng)液每隔24小時(shí)更換一次。
[0017]為了實(shí)現(xiàn)上述的另一目的，本發(fā)明的犬新孢子蟲(chóng)的體外培養(yǎng)方法通過(guò)這樣的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):采用含8%犢牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)原代人胚腎細(xì)胞-293細(xì)胞；當(dāng)原代人胚腎細(xì)胞-293細(xì)胞長(zhǎng)成單層細(xì)胞后，向每瓶原代人胚腎細(xì)胞-293細(xì)胞中接種13個(gè)通過(guò)本發(fā)明分離得到的犬新孢子蟲(chóng)速殖子(或犬新孢子蟲(chóng)其他分離株)，每隔12小時(shí)更換培養(yǎng)液；以及采用倒置顯微鏡觀察犬新孢子蟲(chóng)速殖子增殖情況，培養(yǎng)36小時(shí)即可觀察到蟲(chóng)體增殖達(dá)到高峰期，培養(yǎng)48小時(shí)后90%以上原代人胚腎細(xì)胞-293細(xì)胞漲破崩解，培養(yǎng)液中幾乎全部為犬新孢子蟲(chóng)速殖子。
[0018]本發(fā)明的犬新孢子蟲(chóng)的體外培養(yǎng)方法的技術(shù)方案，接種到原代人胚腎細(xì)胞-293細(xì)胞中蟲(chóng)體的數(shù)量?jī)H為接種到Vero細(xì)胞中的蟲(chóng)體的數(shù)量的1/10，培養(yǎng)36小時(shí)蟲(chóng)體即可達(dá)到高峰期，培養(yǎng)48小時(shí)蟲(chóng)體即可達(dá)到最高值，僅為采用Ve1細(xì)胞所用增殖時(shí)間的1/2。另外Vero細(xì)胞是貼壁性強(qiáng)的細(xì)胞系，傳代培養(yǎng)需要胰蛋白酶消化等步驟，操作繁瑣復(fù)雜；而原代人胚腎細(xì)胞-293細(xì)胞貼壁性弱，傳代培養(yǎng)時(shí)采用移液器槍頭吹打即可脫壁，不需要胰蛋白酶消化等復(fù)雜步驟，因此，采用原代人胚腎細(xì)胞-293培養(yǎng)犬新孢子蟲(chóng)速殖子具有省時(shí)省力、簡(jiǎn)便、快捷、實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
[0019]有益效果:
[0020]本發(fā)明的犬新孢子蟲(chóng)的分離和體外培養(yǎng)方法具有簡(jiǎn)便、快捷、省時(shí)、增殖時(shí)間短、實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021]為更清楚地說(shuō)明本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，下面對(duì)【具體實(shí)施方式】部分的描述中使用到的附圖作簡(jiǎn)單說(shuō)明。
[0022]附圖標(biāo)記說(shuō)明如下:
[0023]圖1為本發(fā)明的第一實(shí)施例分離得到的犬新孢子蟲(chóng)的顯微圖；
[0024]圖2為本發(fā)明的第二實(shí)施例分離得到的犬新孢子蟲(chóng)的顯微圖；
[0025]圖3為本發(fā)明的第三實(shí)施例中采用的原代人胚腎細(xì)胞-293細(xì)胞的顯微圖；
[0026]圖4為本發(fā)明的第三實(shí)施例中培養(yǎng)36h時(shí)犬新孢子蟲(chóng)速殖子的顯微圖；
[0027]圖5為本發(fā)明的第三實(shí)施例中培養(yǎng)48h時(shí)犬新孢子蟲(chóng)速殖子的顯微圖。

【具體實(shí)施方式】
[0028]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面，結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體的實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0029]第一實(shí)施例
[0030]取1.5mL離心管一支，向其中加入體積濃度為10kU/ml青霉素和10mg/ml鏈霉素的雙抗0.5mL。應(yīng)用消毒的剪刀、鑷子、骨鋸、手術(shù)刀等工具剪除犬新孢子蟲(chóng)感染的瀕死期或死亡時(shí)間為6小時(shí)內(nèi)的犢牛腦部皮膚，無(wú)菌條件下撬開(kāi)腦殼，采用12G針頭的一次性注射器無(wú)菌采集腦組織lmL，加入到該1.5mL離心管，反復(fù)吸吹10次左右，然后采用20G針頭的一次性注射器和27G針頭的一次性注射器分別依次反復(fù)吸吹各10次。將經(jīng)過(guò)處理的犬新孢子蟲(chóng)感染的牛源腦組織全部接種到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ve1細(xì)胞中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含1%雙抗和8%犢牛血清的DMEM(Hyclone公司產(chǎn)品)，每隔24小時(shí)更換一次培養(yǎng)液。
[0031]采用倒置顯微鏡觀察，直到觀察到犬新孢子蟲(chóng)。收集含犬新孢子蟲(chóng)分離株的Vero細(xì)胞，2000r/min離心5分鐘，取沉淀物過(guò)27G針頭，去掉牛源腦組織和Vero細(xì)胞，過(guò)濾液以10000r/min離心5分鐘,沉淀即為分離的犬新孢子蟲(chóng),如圖1所示。
[0032]第二實(shí)施例
[0033]取1.5mL離心管一支，向其中加入體積濃度為10kU/ml青霉素和10mg/ml鏈霉素的雙抗0.5mL。應(yīng)用消毒的剪刀、鑷子、手術(shù)刀等工具剪除犬新孢子蟲(chóng)感染的瀕死期或死亡時(shí)間為6小時(shí)內(nèi)的鼠(沙鼠、Balb/c鼠、小白鼠)腦部皮膚，無(wú)菌條件下撬開(kāi)腦殼，采用12G針頭的一次性注射器無(wú)菌采集腦組織lmL，加入到該1.5mL離心管，反復(fù)吸吹10次以上，然后采用20G針頭的一次性注射器和27G針頭的一次性注射器分別依次反復(fù)吸吹各10次。將經(jīng)過(guò)處理的犬新孢子蟲(chóng)感染的鼠源腦組織全部接種到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ve1細(xì)胞中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含1%雙抗和8%犢牛血清的DMEM(Hyclone公司產(chǎn)品)，每隔24小時(shí)更換一次培養(yǎng)液。
[0034]采用倒置顯微鏡觀察，直到觀察到犬新孢子蟲(chóng)。收集含犬新孢子蟲(chóng)分離株的Vero細(xì)胞，2000r/min離心5分鐘，取沉淀物過(guò)27G針頭，去掉牛源腦組織和Vero細(xì)胞，過(guò)濾液以10000r/min離心5分鐘,沉淀即為分離的犬新孢子蟲(chóng),如圖2所示。
[0035]第三實(shí)施例
[0036]采用DMEM培養(yǎng)液(Hyclone公司產(chǎn)品，含I %雙抗和8%犢牛血清)于37°C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)如圖3所示的原代人胚腎細(xì)胞-293細(xì)胞。當(dāng)原代人胚腎細(xì)胞-293細(xì)胞長(zhǎng)成單層細(xì)胞后，向每瓶原代人胚腎細(xì)胞-293細(xì)胞中接種13個(gè)第一實(shí)施例得到的犬新孢子蟲(chóng)速殖子，每隔12h更換一次培養(yǎng)液。采用倒置顯微鏡觀察犬新孢子蟲(chóng)速殖子增殖情況。如圖4所示，培養(yǎng)36小時(shí)即可觀察到蟲(chóng)體增殖達(dá)到高峰期。如圖5所示，培養(yǎng)48h后90%以上原代人胚腎細(xì)胞-293細(xì)胞漲破崩解，培養(yǎng)液中幾乎全部為犬新孢子蟲(chóng)速殖子。
[0037]本發(fā)明的犬新孢子蟲(chóng)的分離和體外培養(yǎng)方法具有簡(jiǎn)便、快捷、省時(shí)、增殖時(shí)間短、實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
[0038]以如上所述的實(shí)施例僅用于具體說(shuō)明本發(fā)明的精神，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，當(dāng)然可根據(jù)本說(shuō)明書(shū)中所公開(kāi)的技術(shù)內(nèi)容，通過(guò)變更、置換或變型的方式輕易做出其它的實(shí)施方式，這些其它的實(shí)施方式都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種犬新孢子蟲(chóng)的分離方法，其特征在于，包括以下步驟: 取一定體積濃度為10kU/ml的青霉素和10mg/ml的鏈霉素的雙抗,應(yīng)用一次性注射器無(wú)菌采集犬新孢子蟲(chóng)感染的動(dòng)物腦組織，該犬新孢子蟲(chóng)感染的動(dòng)物腦組織體積為該雙抗體積的兩倍以上，將該雙抗加入到采集的該犬新孢子蟲(chóng)感染的動(dòng)物腦組織； 采用不同規(guī)格的一次性注射器按照針頭直徑縮小的順序反復(fù)吸吹。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的犬新孢子蟲(chóng)的分離方法，其特征在于，所述吸吹步驟中，反復(fù)吸吹至少10次以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的犬新孢子蟲(chóng)的分離方法，其特征在于，所述一次性注射器，針頭直徑的大小不小于27G。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的犬新孢子蟲(chóng)的分離方法，其特征在于，所述一次性注射器，選自12G針頭、20G針頭、27G針頭中任意一種以上的針頭。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的犬新孢子蟲(chóng)的分離方法，其特征在于，還包括:將經(jīng)過(guò)處理的所述犬新孢子蟲(chóng)感染動(dòng)物腦組織接種到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Vero細(xì)胞中培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的犬新孢子蟲(chóng)的分離方法，其特征在于，所述培養(yǎng)采用DMEM完全培養(yǎng)液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的犬新孢子蟲(chóng)的分離方法，其特征在于，所述培養(yǎng)液含有I%雙抗和8%犢牛血清。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7中所述的犬新孢子蟲(chóng)的分離方法，其特征在于，所述培養(yǎng)液每隔24小時(shí)更換一次。
9.一種犬新孢子蟲(chóng)的體外培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟: 采用含8%犢牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)原代人胚腎細(xì)胞-293細(xì)胞； 當(dāng)原代人胚腎細(xì)胞-293細(xì)胞長(zhǎng)成單層細(xì)胞后，向每瓶原代人胚腎細(xì)胞-293細(xì)胞中接種13個(gè)根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的分離方法得到的犬新孢子蟲(chóng)速殖子，每隔12小時(shí)更換培養(yǎng)液；以及 采用倒置顯微鏡觀察犬新孢子蟲(chóng)速殖子增殖情況。
【文檔編號(hào)】C12N1/10GK104312922SQ201410550101
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月15日
【發(fā)明者】賈立軍, 張守發(fā), 魯承 申請(qǐng)人:延邊大學(xué)