一種鑒別微孢子蟲裂殖增殖期和孢子增殖期的雙色熒光標(biāo)記方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和熒光顯微技術(shù)，具體涉及一種鑒別微孢子蟲裂殖增殖期和孢子增殖期的雙色熒光標(biāo)記方法。
【背景技術(shù)】
[0002]家蠶微孢子蟲(Nosema bombycis)是引起蠶業(yè)疫病家蠶微粒子病的專性細(xì)胞內(nèi)寄生真核生物。家蠶微孢子蟲大小為2?5μπι，其生活史可分為3個(gè)階段:感染期、裂殖增殖期、孢子增殖期。感染期為生活史中的胞外期，該時(shí)期家蠶微孢子蟲為成熟孢子，在光鏡下具很強(qiáng)折光性，適宜條件下可通過彈出極管注入孢原質(zhì)或細(xì)胞內(nèi)吞等方式感染宿主細(xì)胞。裂殖增殖期的家蠶微孢子蟲未形成孢壁，不含有幾丁質(zhì)成分，孢子增殖期和感染期的微孢子蟲具有由幾丁質(zhì)和蛋白組成的孢壁。微孢子蟲的感染常常通過光學(xué)顯微鏡觀察感染期的成熟孢子進(jìn)行診斷(Cali et al.2011)，相差顯微鏡或微分干涉顯微鏡觀察成熟孢子時(shí)其折光性很強(qiáng)。研究者們采用了多種方式以易于微孢子蟲觀察，包括采用傳統(tǒng)的染色劑如姬姆薩、革蘭氏和革蘭氏變色酸處理對(duì)固定涂片進(jìn)行制樣(van Gool et al.1993 ；Moura etal.1997 ； Strano et al.1976)，通過 Calcofluor White M2R 等焚光染料處理(Sak etal.2011； Schwartz et al.1992)，或者使用一些特殊的染色方法如格莫瑞六亞甲基四胺銀(GMS)染色、海登海因氏鐵蘇木精染色、萋一尼氏染色(Gray et al.1969 ； Strano etal.1976)或per1dic acid-Schiff (PAS)染色等。但是，這些技術(shù)大多僅能便于成熟微孢子蟲的觀察，不能區(qū)分微孢子蟲增殖的不同時(shí)期。由于正在發(fā)育過程中的微孢子蟲體積太小而且位于宿主細(xì)胞內(nèi)，特別是裂殖增殖期的微孢子蟲，很難通過顯微鏡觀察，因此大多數(shù)微孢子蟲的結(jié)構(gòu)和發(fā)育階段都是在掃描電子顯微鏡(TEM)或者透射電子顯微鏡(SEM)的幫助下，結(jié)合免疫膠體金標(biāo)記及電腦斷層攝影術(shù)進(jìn)行研究的。由于已報(bào)道的常規(guī)的分辨不同增殖時(shí)期的微孢子蟲依賴電子顯微鏡且對(duì)技術(shù)要求較高，處理過程繁冗耗時(shí)，應(yīng)用具有極大的局限性。因此，急需建立一種簡(jiǎn)便、有效的微孢子蟲裂殖增殖期和孢子增殖期的標(biāo)記方法，以促進(jìn)微孢子蟲生活史和功能基因組學(xué)研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種鑒別微孢子蟲裂殖增殖期和孢子增殖期的雙色熒光標(biāo)記方法，該方法操作簡(jiǎn)單，使用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡即可實(shí)現(xiàn)，打破了對(duì)電子顯微鏡的依賴。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0005]—種鑒別微孢子蟲裂殖增殖期和孢子增殖期的雙色熒光標(biāo)記方法，包括如下步驟:
[0006](I)將經(jīng)封閉處理的組織切片或細(xì)胞采用β-Tubulin抗體通過間接免疫熒光法標(biāo)記裂殖增殖期的微孢子蟲；
[0007](2)然后將組織切片或細(xì)胞用熒光增白劑染幾丁質(zhì)的方法標(biāo)記孢子增殖期的微孢子蟲；
[0008](3)用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡對(duì)樣品進(jìn)行觀察。
[0009]經(jīng)封閉處理的組織切片或細(xì)胞可采用現(xiàn)有方法制得，其中封閉處理的細(xì)胞由以下方法制得:先將感染微孢子蟲的宿主細(xì)胞固定于載玻片上；然后將固定后的細(xì)胞采用Triton X-100溶液浸浴細(xì)胞，透化15?30min;再將透化后的細(xì)胞采用細(xì)胞封閉液進(jìn)行封閉即可。
[0010]本發(fā)明中，固定的方法為將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01?0.1 %的多聚賴氨酸溶液涂抹在載玻片上，風(fēng)干后得到多聚賴氨酸處理后的載玻片備用;然后將感染微孢子蟲的組織切片或細(xì)胞滴加到涂有多聚賴氨酸處理的載玻片上，靜置5min;吸除多余液體，滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液覆蓋細(xì)胞固定15min，吸除固定細(xì)胞的多余液體，滴加0.0lmol/L PBS溶液浸浴細(xì)胞，清洗2次，每次3min。
[0011]本發(fā)明中，所述透化為用體積分?jǐn)?shù)為0.1?2%的Triton X-100溶液透化，優(yōu)選為用體積分?jǐn)?shù)為2%的Triton X-100溶液透化。
[0012]本發(fā)明中，所述封閉為滴加封閉液覆蓋細(xì)胞，18?37°C處理Ih;所述的封閉液為0.05% (V/V)Tween 20,2% (V/V)Triton X-100,0.05% (W/V)BSA和 10% (V/V)山羊血清的PBS溶液。
[0013]本發(fā)明中，所述采用β-Tubulin抗體通過間接免疫熒光法標(biāo)記裂殖增殖期的微孢子蟲的方法為將封閉細(xì)胞用含0.05%(￥八)1^的11 20的PBS溶液清洗后，將以封閉液與β-Tubulin的抗體按體積比為1:200稀釋的一抗工作液浸浴細(xì)胞，18?37°C孵育Ih;吸除一抗工作液液，用含0.05%(V/V)TWeen 20的PBS溶液清洗后，再用以封閉液與Alexa Fluor 594標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG按體積比為1:2000稀釋的二抗工作液浸浴細(xì)胞，常溫孵育lh;吸除二抗工作液，再用含0.05%(V/V)TWeen 20的PBS溶液清洗。
[0014]本發(fā)明中，熒光增白劑染幾丁質(zhì)的方法標(biāo)記孢子增殖期的微孢子蟲的方法如下:滴加0.1yg/mL Calcofluor White M2R染色液覆蓋細(xì)胞，18?37°C孵育1min;吸除染色液，用含0.05%(V/V)TWeen 20的PBS溶液清洗后滴加抗熒光淬滅封片劑即可。
[0015]本發(fā)明所述微孢子優(yōu)選為家蠶微孢子蟲，所述宿主優(yōu)選為家蠶。
[0016]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明公開了一種鑒別微孢子蟲裂殖增殖期和孢子增殖期的雙色熒光標(biāo)記方法，以家蠶微孢子蟲為例，該方法操作簡(jiǎn)便，識(shí)別便利，適用于其他種屬微孢子蟲的研究;突破了現(xiàn)有技術(shù)只能通過制備超薄切片通過透射電子顯微鏡觀察以區(qū)分不同增殖時(shí)期微孢子蟲的限制，大大降低科研成本、技術(shù)要求和平臺(tái)要求;并且本發(fā)明的方法，可采用多色熒光標(biāo)記，以鑒定微孢子蟲蛋白的表達(dá)時(shí)期及其在微孢子蟲不同增殖時(shí)期的亞細(xì)胞定位情況；亦可應(yīng)用于組織切片中各時(shí)期微孢子蟲的免疫熒光標(biāo)記，具有很好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0017]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖:
[0018]圖1為裂殖增殖期和孢子增殖期家蠶微孢子蟲熒光標(biāo)記圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0020]實(shí)施例1
[0021]—種鑒別家蠶微孢子蟲裂殖增殖期和孢子增殖期的雙色熒光標(biāo)記方法，包括如下步驟:
[0022](I)感染家蠶微孢子蟲的昆蟲細(xì)胞固定:取50yL為0.1 % (W/V，g/ml)的多聚賴氨酸溶液在載玻片上涂抹Icm的圓形區(qū)域，風(fēng)干后得到多聚賴氨酸處理后的載玻片備用;然后吸取感染家蠶微孢子蟲的家蠶細(xì)胞滴加到涂有多聚賴氨酸處理的載玻片上，靜置5min;吸除多余液體，滴加為4 %(W/V, g/ml)的多聚甲醛溶液覆蓋昆蟲細(xì)胞固定15min，吸除固定昆蟲細(xì)胞的多余液體，滴加0.01mol/L PBS溶液浸浴細(xì)胞，清洗2次，每次3min;
[0023](2)透化:吸除液體后滴加體積分?jǐn)?shù)為2%的Triton X_100溶液浸浴細(xì)胞，透化15?30min;吸除透化多余液體，PBS溶液浸浴細(xì)胞清洗3次，每次3min;
[0024](3)封閉:吸除液體后滴加封閉液覆蓋細(xì)胞，18?37°C處理lh，期間觀察樣品3次，以補(bǔ)足封閉液避免細(xì)胞干燥;所述的封閉液為0.05%(￥八)1^的11 20,2%(V/V)Triton X-100，0.05%(￥/^4/1111)85厶和10%(￥/^)山羊血清的?85溶液；
[0025](4)間接免疫熒光法標(biāo)記裂殖增殖期的家蠶微孢子蟲:吸除封閉液，清洗液浸浴細(xì)胞清洗2次，每次2min，所述清洗液為含0.05 % (V/V)Tween 20的I3BS溶液;然后采用封閉液將β-Tubulin的抗體按體積比為1:200稀釋制備一抗工作液，然后滴加一抗工作液浸浴細(xì)胞，18?37°C孵育Ih ;吸除一抗工作液液，滴加清洗液清洗3次，每次5min;采用封閉液將Alexa Fluor 594標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG按體積比為1:2000稀釋制備二抗工作液，再滴加二抗工作液浸浴細(xì)胞，常溫