活化輔助t細(xì)胞的方法以及用于該方法的組合物的制作方法
【專利摘要】本申請(qǐng)公開了活化輔助T細(xì)胞的方法以及用于該方法的組合物。具體地，本申請(qǐng)公開了：用于活化輔助T細(xì)胞的方法，其包括將WT1肽添加至抗原遞呈細(xì)胞以活化該輔助T細(xì)胞的步驟，其中所述的WT1肽能夠與選自HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中的任一個(gè)結(jié)合；在該方法中應(yīng)用的組合物；通過活化輔助T細(xì)胞治療和/或預(yù)防癌癥的方法；在所述治療和/或預(yù)防方法中使用的藥物組合物；等等。
【專利說明】活化輔助T細(xì)胞的方法以及用于該方法的組合物 本申請(qǐng)為申請(qǐng)?zhí)枮?00880006096. 5的分案申請(qǐng)，要求2007年2月27日的優(yōu)先權(quán)。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于活化輔助T細(xì)胞的方法，包括將WTl肽添加至抗原遞呈細(xì)胞，并由 此活化輔助T細(xì)胞，其中所述WTl肽具有結(jié)合HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和 HLA-DPB1*0501分子中任一個(gè)的能力，以及用于其的組合物，用于通過活化輔助T細(xì)胞治療 和/預(yù)防癌癥的藥物組合物等等。

【背景技術(shù)】
[0002] WTl基因（維耳姆斯瘤1基因（Wilms'tumorlgene))被認(rèn)為是導(dǎo)致維耳姆斯瘤（其 為兒童腎癌）的基因（非專利文獻(xiàn)1和2)。WTl是具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。最初，WTl基 因被認(rèn)為是腫瘤抑制基因。然而，隨后的研究（非專利文獻(xiàn)3、4、5和6)顯示W(wǎng)Tl基因在造 血腫瘤和實(shí)體癌中起著癌基因的作用。
[0003] 已顯示可通過用WTl肽體外刺激外周血單核細(xì)胞而誘導(dǎo)WTl肽特異性T淋巴細(xì)胞 (CTL)，并且此類CTL損傷內(nèi)源表達(dá)WTl的癌細(xì)胞，諸如造血腫瘤細(xì)胞和實(shí)體癌細(xì)胞。該CTL 識(shí)別復(fù)合物的形式的WTl肽，在所述復(fù)合物中，該WTl肽與MHC I類分子結(jié)合。因此，此類 WTl肽取決于MHC I類分子亞型而不同（專利文獻(xiàn)1、非專利文獻(xiàn)7、以及專利文獻(xiàn)2、3和 4)。
[0004] 存在對(duì)癌抗原特異的輔助T細(xì)胞對(duì)有效誘導(dǎo)CTL是很重要的（非專利文獻(xiàn)8)。通 過識(shí)別MHC II類分子和抗原遞呈細(xì)胞上的抗原肽的復(fù)合物誘導(dǎo)和活化輔助T細(xì)胞。活化 的輔助T細(xì)胞產(chǎn)生諸如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6或干擾素的細(xì)胞因子以幫助B細(xì)胞的生長、 分化或成熟?；罨妮o助T細(xì)胞還具有促進(jìn)其它T細(xì)胞亞類（例如，Tc和TD細(xì)胞）的生 長、分化或成熟的功能。因此，活化的輔助T細(xì)胞具有通過促進(jìn)B細(xì)胞或T細(xì)胞的生長或活 化從而活化免疫系統(tǒng)的功能。因此，在癌免疫治療中通過MHC II類結(jié)合的抗原肽（輔助 肽）提高輔助T細(xì)胞的功能以增加癌疫苗的效果被認(rèn)為是有用的（非專利文獻(xiàn)9)。目前， 僅發(fā)現(xiàn)與HLA-DRB1*0401分子結(jié)合的肽（非專利文獻(xiàn)10)、與HLA-DRB1*0405分子結(jié)合的肽 和與HLA-DRB1*1502分子結(jié)合的肽（專利文獻(xiàn)5)是WTl的輔助肽。因此，需要發(fā)現(xiàn)各自與 HLA-DRB1*1501、HLA-DPB1*0901 或 HLA-DPB1*0501 分子結(jié)合的肽。
[0005] 此外，已顯示在輔助肽中，存在能夠與多個(gè)MHC II類分子結(jié)合并誘導(dǎo)輔助T細(xì)胞 的混雜輔助肽（非專利文獻(xiàn)11和12)。然而，非常難以鑒定與三或更多類MHC II類分子結(jié) 合并發(fā)揮足夠功能的混雜輔助肽。 專利文獻(xiàn) 1:W02003/106682 專利文獻(xiàn) 2:W02005/095598 專利文獻(xiàn) 3:W02007/097358 專利文獻(xiàn)4:國際專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/JP2007/074146 專利文獻(xiàn) 5:W02005/045027 非專利文獻(xiàn) l:Daniel A.Haber 等，Cell. 1990Jun29 ;61 (7) :1257-69. 非專利文獻(xiàn) 2:Call KM 等，Cell. 1990Feb9 ;60(3) :509-20. 非專利文獻(xiàn) 3:Menke AL 等，Int Rev Cytol. 1998; 181:151-212.綜述 非專利文獻(xiàn) 4: Yamagami T 等，Blood. 1996AprI ;87 (7) : 2878-84. 非專利文獻(xiàn) 5: Inoue K 等，Blood. 1998Aprl5 ;91 (8) : 2969-76. 非專利文獻(xiàn) 6: Tsuboi A 等，Leuk Res. 1999May;23 (5) :499-505. 非專利文獻(xiàn) 7: Oka Y 等，Immunogenetics. 2000Feb ;51 (2) : 99-107. 非專利文獻(xiàn) 8: Gao FG 等，Cancer Res. 2002Novl5;62 (22) :6438-41. 非專利文獻(xiàn) 9:Zeng G, J Immunother. 2001May ；24 (3) : 195-204 非專利文獻(xiàn) 10:Knights AJ等，Cancer Tmmunol Immunother. 2002Jul ；51(5) :271-81. 非專利文獻(xiàn) 11: Sotiriadou R 等，Br J Cancer. 2001Novl6;85 (10) :1527-34. 非專利文獻(xiàn) 12:Hural JA 等，J Immunol·2002Jull;169(l):557-65·


【發(fā)明內(nèi)容】
發(fā)明解決的問題
[0006] 本發(fā)明所要解決的問題是提供用WTl肽活化輔助T細(xì)胞的方法，其中所述的WTl 肽具有與HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子或HLA-DPB1*0501分子結(jié)合的能力，和 用于其的組合物，以及用于通過活化輔助T細(xì)胞治療和/預(yù)防癌癥的藥物組合物等等。 解決問題的手段
[0007] 考慮到上述情況進(jìn)行深入研究，結(jié)果本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在與HLA_DRB1*0405分子和 HLA_DRB1*1502分子結(jié)合的WTl膚當(dāng)中，具有氨基酸序列Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His 的WTl肽還與HLA-DRB1*1501 分子、HLA-DPB1*0901 分 子和HLA-DPB1*0501分子結(jié)合。因此，本發(fā)明得以完成。
[0008] 本發(fā)明提供了 ： (1) 用于活化輔助T細(xì)胞的方法，包括將WTl肽添加至抗原遞呈細(xì)胞，并且由此活 化輔助T細(xì)胞，其中所述WTl肽具有與HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和 HLA-DPB1*0501分子中任一個(gè)結(jié)合的能力。 (2) 根據(jù)（1)的方法，其中所述WTl肽具有與HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分 子或HLA-DPB1*0501分子中的至少兩個(gè)結(jié)合的能力。 (3) 根據(jù)⑴或⑵的方法，其中所述WTl肽還具有與HLA-DRB1*0405分子和/或 HLA-DRB1*1502分子結(jié)合的能力。 (4) 根據(jù)（1)-(3)任一項(xiàng)的方法，其中所述的WTl肽具有與HLA-DRB1*1501分子、 HLA-DPB1*0901 分子、HLA-DPB1*0501 分子、HLA-DRB1*0405 分子和 HLA-DRB1*1502 分子結(jié) 合的能力。 (5) 根據(jù)（1)-(4)任一項(xiàng)的方法，其中所述的WTl肽是包含氨基酸序列：Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID No: 2)的膚。 (6) 根據(jù)（1)-(5)任一項(xiàng)的方法，其中通過添加 WTl肽、添加包含編碼WTl肽的多核苷 酸的表達(dá)載體或添加包括該表達(dá)載體的細(xì)胞實(shí)現(xiàn)將WTl肽添加到抗原遞呈細(xì)胞。 (7) 用于通過添加 WTl肽至抗原遞呈細(xì)胞從而活化輔助T細(xì)胞的組合物，其包含WTl 肽，其中所述WTl肽具有與HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分 子中任一個(gè)結(jié)合的能力。 (8) 在受試者中治療或預(yù)防癌癥的方法，包括將WTl肽添加至抗原遞呈細(xì)胞，并且由 此活化輔助T細(xì)胞，其中所述WTl肽具有與HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和 HLA-DPB1*0501分子中任一個(gè)結(jié)合的能力。 (9) 用于通過添加 WTl肽至抗原遞呈細(xì)胞來活化輔助T細(xì)胞從而治療或預(yù)防癌癥的藥 物組合物，其包含WTl肽，其中所述WTl肽具有與HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分 子和HLA-DPB1*0501分子中任一個(gè)結(jié)合的能力。 (10) 特異性結(jié)合WTl肽的抗體，其中所述的WTl肽具有與HLA-DRB1*1501分子、 HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一個(gè)結(jié)合的能力。 (11) 在 HLA-DRB1*1501 陽性、HLA-DPB1*0901 陽性和 HLA-DPB1*0501 陽性受試者的任 一中測(cè)定WTl肽的存在或量的方法，其包括： (a) 使抗-WTl抗體與來自所述受試者的樣品反應(yīng)；以及 (b) 測(cè)定與所述樣品中含有的WTl肽特異性結(jié)合的抗-WTl抗體的存在或量。 (12) 治療或預(yù)防癌癥的方法，包括將WTl肽添加至抗原遞呈細(xì)胞，并由此活化輔助T 細(xì)胞，以及將所述活化的輔助T細(xì)胞施與受試者，其中所述WTl肽具有與HLA-DRB1*1501分 子、HLA-DPB1*0901分子或HLA-DPB1*0501分子結(jié)合的能力。 (13) 用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物，包括用WTl肽活化的輔助T細(xì)胞，其中所述 WTl肽具有與HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一個(gè)結(jié) 合的能力。 (14) 在 HLA-DRB1*1501 陽性、HLA-DPB1*0901 陽性和 HLA-DPB1*0501 陽性受試者的任 一中測(cè)定WTl-特異性輔助T細(xì)胞的存在或量的方法，其包括： (a) 使 WTl 肽和 HLA-DRB1*1501 分子、HLA-DPB1*0901 分子或 HLA-DPB1*0501 分子的復(fù) 合物與來自所述受試者的樣品反應(yīng)；以及 (b) 測(cè)定樣品中包含的識(shí)別復(fù)合物的輔助T細(xì)胞的存在或量。 (15) 在 HLA-DRB1*1501 陽性、HLA-DPB1*0901 陽性、HLA-DPB1*0501 陽性、 HLA-DRB1*0405陽性或HLA-DRB1*1502陽性受試者中測(cè)定WTl-特異性輔助T細(xì)胞的存在或 量的方法，其包括： (a) 用WTl肽刺激外周血單核細(xì)胞、侵襲性淋巴細(xì)胞（invasive lymphocyte)、腫瘤細(xì) 胞、腹水中的細(xì)胞、胸水中的細(xì)胞、腦脊髓液中的細(xì)胞、骨髓細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞；以及 (b) 測(cè)定細(xì)胞因子的產(chǎn)生或輔助T細(xì)胞的反應(yīng)， 其中細(xì)胞因子產(chǎn)生或輔助T細(xì)胞反應(yīng)的存在或量的升高表明WTl特異性輔助T細(xì)胞的 存在或量。 本發(fā)明的效果
[0009] 本發(fā)明提供了用WTl肽活化輔助T細(xì)胞的方法，其中所述WTl肽與HLA-DRB1*1501 分子、HLA-DPB1*0901 分子，HLA-DPB1*0501 分子、HLA-DRB1*0405 分子和 HLA-DRB1*1502 分 子結(jié)合，和用于其的組合物，以及用于通過活化輔助T細(xì)胞治療和/或預(yù)防癌癥的藥物組合 物等等。因此，能夠在體內(nèi)和體外活化具有任何此類MHC II類分子的受試者的輔助T細(xì) 胞，治療和預(yù)防癌癥等。由于約90%的日本人均被該五類MHC II類亞類所覆蓋，可在非常 寬范圍的受試者中活化輔助T細(xì)胞以治療和/或預(yù)防癌癥。 附圖簡述：
[0010] 圖1是表示由TA28. 1細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-Y的量的圖。在圖中，縱軸表示IFN-Y 的濃度（pg/ml)。該圖從左邊開始，分別相應(yīng)于"在不存在WTl肽的情況下培養(yǎng)來自 HLA-DRB1*1501陽性受試者的外周血單核細(xì)胞的情況"、"在WTl肽的存在下培養(yǎng)TA28. 1細(xì) 胞的情況（黑色）"、"在不存在WTl肽的情況下培養(yǎng)來自HLA-DRB1*1501陰性受試者的外 周血單核細(xì)胞的情況"、"在WTl肽的存在下培養(yǎng)來自HLA-DRB1*1501陰性受試者的外周血 單核細(xì)胞的情況"。 圖2是表示由TA28. 1細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ、IL-4和IL-10量的圖。在該圖中，縱軸表示 濃度（pg/ml)。從左邊開始，所述圖對(duì)應(yīng)于IFN- γ、IL-4和IL-10的值。 圖3是表示由E15. 2細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ、IL-4和IL-10量的圖。在該圖中，縱軸表示 濃度（pg/ml)。從左邊開始，所述圖對(duì)應(yīng)于IFN- γ、IL-4和IL-10的值。 圖4表示由HLA-DPB1*0501/*0501陽性單核細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和IL-17。在該圖中，橫 軸表示IFN- γ，且縱軸表示IL-17。圖4a表示沒有用WTl肽刺激的細(xì)胞，以及圖4b表示用 WTl肽刺激的細(xì)胞。 圖5是表示TA28. 1細(xì)胞生長的圖。在該圖中，縱軸表示cpm(xl04)。該圖從左邊開始， 分別相應(yīng)于"用沒有加 WTl肽的外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)TA28. 1細(xì)胞的情況"、"用加了 WTl 肽的外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)TA28. 1細(xì)胞的情況（黑色）"、"在抗-MHC I類抗體存在下，用 加了 WTl肽的外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)TA28. 1細(xì)胞的情況"、"在抗-HLA-DR抗體存在下，用加 了 WTl肽的外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)TA28. 1細(xì)胞的情況（陰影）"、"在抗-HLA-DQ抗體存在 下，用加了 WTl肽的外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)TA28. 1細(xì)胞的情況"、"在抗-HLA-DP抗體存在 下，用加了 WTl肽的外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)TA28. 1細(xì)胞的情況"。 圖6是表示E15. 2細(xì)胞生長的圖。在該圖中，縱軸表示cpm(xl04)。該圖從左邊開始， 分別相應(yīng)于"用沒有加 WTl肽的來自HLA-DPB1*0901陽性受試者的外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng) E15. 2細(xì)胞的情況"、"用加了 WTl肽的來自HLA-DPB1*0901陽性受試者的外周血單核細(xì)胞共 培養(yǎng)E15. 2細(xì)胞的情況（黑色）"、"用沒有加 WTl肽的來自HLA-DPB1*0901陰性受試者的 外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)E15. 2細(xì)胞的情況"、"用加了 WTl肽的來自HLA-DPB1*0901陰性受 試者的外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)E15. 2細(xì)胞的情況"。 圖7是表示E15. 2細(xì)胞生長的圖。在該圖中，縱軸表示cpm。該圖從左邊開始，分別相 應(yīng)于"用沒有加 WTl肽的外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)E15. 2細(xì)胞的情況"、"用加了 WTl肽的外 周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)E15. 2細(xì)胞的情況（黑色）"、"在抗-MHC I類抗體存在下，用加了 WTl 肽的外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)E15. 2細(xì)胞的情況"、"在抗-HLA-DR抗體存在下，用加了 WTl肽 的外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)E15. 2細(xì)胞的情況"、"在抗-HLA-DQ抗體存在下，用加了 WTl肽的 外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)E15. 2細(xì)胞的情況"、和"在抗-HLA-DP抗體存在下，用加了 WTl肽的 外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)E15. 2細(xì)胞的情況（陰影）"。 圖8是表示HLA-DPB1*0501/*0501陽性單核細(xì)胞生長的圖。在圖中，縱軸表示cpm。該 圖從左邊開始，分別對(duì)應(yīng)于"沒有用WTl肽刺激的情況"和"用WTl肽刺激的情況"。 圖9表示通過抗HLA-DP抗體抑制HLA-DPB1*0501/*0501陽性單核細(xì)胞的生長。圖中， 縱軸表示cpm。該圖從左邊開始，分別對(duì)應(yīng)于"沒有用WTl肽刺激的情況"、"用來自HIV的 對(duì)照肽刺激的情況"、"用WTl肽刺激的情況"、"在抗HLA-DR抗體的存在下用WTl肽刺激的 情況"、"在抗HLA-DQ抗體的存在下用WTl肽刺激的情況"以及"在抗HLA-DP抗體的存在下 用WTl肽刺激的情況"。 圖10是表示用不同濃度的WTl肽的情況下E15. 2細(xì)胞生長的圖。圖中，縱軸表示 cpm (xlO4)，并且橫軸表示W(wǎng)Tl肽的濃度。 實(shí)施本發(fā)明的最佳模式
[0011] 一方面，本發(fā)明涉及用于活化輔助T細(xì)胞的方法，包括將WTl肽添加至抗原遞呈細(xì) 胞，并由此活化輔助T細(xì)胞，其中所述WTl肽具有結(jié)合HLA-DRBl*1501分子、HLA-DPBl*0901 分子和HLA-DPB1*0501分子中任一個(gè)的能力。在本發(fā)明中，WTl肽是指由SEQIDNo: 1所示 人WTl蛋白的部分氨基酸序列組成的肽；在所述氨基酸序列上具有一至若干個(gè)氨基酸替 換、修飾或缺失、并具有結(jié)合HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501 分子中任一個(gè)的能力的肽；或這樣的肽，其中各種物質(zhì)諸如氨基酸、肽或其類似物可能附著 于該肽的N端和/或C端。所述物質(zhì)例如可以通過活體內(nèi)的酶或通過諸如細(xì)胞內(nèi)加工的過 程而被加工，并且最終所述WTl肽變成可結(jié)合HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和 HLA-DPB1*0501分子中任一個(gè)的形式。所述物質(zhì)可以是調(diào)節(jié)本發(fā)明WTl肽溶解度、或增加其 穩(wěn)定性（抵抗蛋白酶等）的物質(zhì)。備選地，其可以是將本發(fā)明的WTl肽特異性地遞送至例 如特定組織或器官，或增加抗原遞呈細(xì)胞攝入效率的物質(zhì)等。備選地，其可以為限制為與和 抗原遞呈細(xì)胞來源的受試者相同類型的MHC I類分子的WTl肽。
[0012] 本發(fā)明的WTl肽具有結(jié)合HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和 HLA-DPB1*0501分子中任一個(gè)的能力。因此，所述WTl肽可以是具有與HLA-DRB1*1501分 子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中至少兩個(gè)結(jié)合的能力的肽，或具有與 HLA-DRB1*1501分子和/或HLA-DPB1*0901分子和/或HLA-DPB1*0501分子、和除了上述分 子外的HLA II類分子結(jié)合的能力的肽，例如，具有與HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405 分子和/或HLA-DRB1*1502分子結(jié)合的能力的肽；具有與HLA-DPB1*0901分子、 HLA-DRB1*0405分子和/或HLA-DRB1*1502分子結(jié)合的能力的肽；具有與HLA-DPB1*0501 分子、HLA-DRB1*0405分子和/或HLA-DRB1*1502分子結(jié)合的能力的肽；或具有與 HLA-DRB1*1501 分子、HLA-DPB1*0901 分子、HLA-DPB1*0501 分子、HLA-DRB1*0405 分子和 / 或HLA-DRB1*1502分子結(jié)合的能力的肽。由于具有氨基酸序列Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His(SEQ ID No:2)的WTl肽具有與HLA-DRB1*1501 分子、HLA-DPB1*0901 分子、HLA-DPB1*0501 分子、HLA-DRB1*0405 分子和 HLA-DRB1*1502 分 子結(jié)合的能力，具有此類氨基酸序列的WTl肽是優(yōu)選的。一般而言，與MHC II類結(jié)合的肽 由10-25個(gè)氨基酸組成。因此，WTl肽優(yōu)選具有由10-25個(gè)氨基酸組成的氨基酸序列。
[0013] 可通過本領(lǐng)域通用的方法或其變形合成本發(fā)明的WTl肽。此類方法例如描述 于 Peptide Synthesis,Interscience, New York, 1966 ；The Proteins,卷 2,Academic Press Inc. , New York, 1976 ；Peptide-Gosei, Maruzen Co., Ltd.,1975 ；Peptide-Gosei No Kiso To Jikken, Maruzen Co. , Ltd. , 1985 ；和 Iyakuhin No Kaihatsu(Zoku),卷 14,Peptide-Gosei, Hirokawa-Book store, 1991。
[0014] 還可基于編碼WTl肽的核苷酸序列信息應(yīng)用基因工程技術(shù)制備本發(fā)明的WTl肽。 此類基因工程技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
[0015] 抗原遞呈細(xì)胞是指諸如樹狀細(xì)胞的、能將WTl肽與MHC II類分子一起遞呈給輔助 T細(xì)胞等的細(xì)胞。因此，抗原遞呈細(xì)胞來源的受試者必須具有與所加入的WTl肽結(jié)合的MHC Π 類亞類相同的 MHC II 類亞類（例如，HLA-DRB1*1501、HLA-DPB1*0901、HLA-DPB1*0501、 HLA-DRB1*0405 或 HLA-DRB1*1502)。
[0016] 一般而言，輔助T細(xì)胞通過所述T細(xì)胞表面的TCR-⑶3復(fù)合物通過抗原遞呈細(xì)胞 表面上MHC II類分子識(shí)別抗原肽，并且通過抗原遞呈細(xì)胞表面的整聯(lián)蛋白配體刺激T細(xì)胞 表面的整聯(lián)蛋白而被活化。在本發(fā)明中，輔助T細(xì)胞的活化不僅包括輔助T細(xì)胞的活化，還 包括輔助T細(xì)胞的誘導(dǎo)與生長。如上所述,經(jīng)活化的輔助T細(xì)胞具有通過增加 B細(xì)胞或T 細(xì)胞的誘導(dǎo)、生長或活化而活化免疫系統(tǒng)的功能。因此，本發(fā)明用于活化輔助T細(xì)胞的方法 可用作癌癥等治療中的輔助治療。備選地，應(yīng)用本發(fā)明的方法體外活化的輔助T細(xì)胞可以 用于治療或預(yù)防癌癥等，或可用作用于其的輔助治療?？赏ㄟ^測(cè)量細(xì)胞因子諸如干擾素和 白介素等的產(chǎn)量和分泌量而確定輔助T細(xì)胞的活化。
[0017] 可直接通過添加 WTl肽、或間接通過添加包含編碼WTl肽的多核苷酸的表達(dá)載體、 或添加包含該表達(dá)載體的細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)將WTl肽添加至抗原遞呈細(xì)胞?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人 員的公知方法制備包含編碼WTl肽的多核苷酸的表達(dá)載體和包含該表達(dá)載體的細(xì)胞。
[0018] 在另一方面，本發(fā)明涉及用于通過將WTl肽添加至抗原遞呈細(xì)胞而活化輔 助T細(xì)胞的組合物，其包括WTl肽，其中所述的WTl肽具有結(jié)合HLA-DRB1*1501分子、 HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一個(gè)的能力。當(dāng)將本發(fā)明的組合物施與 HLA-DRB1*1501、HLA-DPB1*0901或HLA-DPB1*0501陽性受試者時(shí)，該受試者的免疫系統(tǒng)通 過受試者的輔助T細(xì)胞的活化而被活化。在許多癌癥和腫瘤中WTl基因都以高水平表達(dá)， 所述癌癥和腫瘤包括造血腫瘤，諸如白血病、骨髓增生異常綜合征、多發(fā)性骨髓瘤或惡性淋 巴瘤；以及實(shí)體癌，諸如胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、胚細(xì)胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列 腺癌、子宮癌、宮頸癌或卵巢癌。因此，本發(fā)明的組合物可以用作治療或預(yù)防癌癥的輔助治 療。備選地，應(yīng)用本發(fā)明的組合物活化的輔助T細(xì)胞例如可用作癌癥治療中的佐藥。
[0019] 如上所述，本發(fā)明的WTl肽可以是具有與HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分 子和HLA-DPB1*0501分子中至少兩個(gè)結(jié)合的能力的肽，或具有與HLA-DRB1*1501分子和/ 或HLA-DPB1*0901分子和/或HLA-DPB1*0501分子、和其他MHC II類分子結(jié)合的能力的肽。 因此，只要抗原遞呈細(xì)胞來源的受試者對(duì)于本發(fā)明的WTl肽能與其結(jié)合的MHC II類亞類是 陽性的，即可以得到本發(fā)明組合物活化輔助T細(xì)胞的效果。
[0020] 除了 WTl肽外，本發(fā)明的組合物還可以包含例如載體、賦形齊IJ、添加劑等。因?yàn)楸?發(fā)明組合物中包含的WT1肽活化對(duì)該WT1肽特異的輔助T細(xì)胞，因此該組合物可以包含MHC I類限制性WTl肽，或其可與該肽一起使用。
[0021] 可依據(jù)諸如輔助T細(xì)胞的期望活化、抗原遞呈細(xì)胞的狀態(tài)的條件合適地選擇應(yīng)用 本發(fā)明組合物的方法。此類方法的實(shí)例包括，但不限于真皮內(nèi)施用、皮下施用、肌內(nèi)施用、靜 脈內(nèi)施用、鼻內(nèi)施用和口服施用，以及添加至抗原遞呈細(xì)胞的培養(yǎng)基中?？梢罁?jù)諸如輔助T 細(xì)胞的期望活化、抗原遞呈細(xì)胞的狀態(tài)的條件合適地選擇本發(fā)明組合物中包含的WTl肽的 量、以及本發(fā)明組合物的形式、使用次數(shù)等。
[0022] 在其它方面，本發(fā)明涉及通過將WTl肽添加至抗原遞呈細(xì)胞活化輔助T細(xì)胞的組 合物，其包含包含編碼所述WTl肽的多核苷酸的表達(dá)載體或包含該表達(dá)載體的細(xì)胞，其中 所述的WTl肽具有與HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中 任一個(gè)結(jié)合的能力。包含編碼所述WTl肽的多核苷酸的表達(dá)載體和包含該表達(dá)載體的細(xì)胞 描述如上。
[0023] 另一方面，本發(fā)明涉及包含編碼WTl肽的多核苷酸的表達(dá)載體或包含該表達(dá)載體 的細(xì)胞在制備組合物中的應(yīng)用。
[0024] 在其它方面，本發(fā)明涉及用于通過將WTl肽添加至抗原遞呈細(xì)胞活化輔助T細(xì)胞 的試劑盒，其包含WTl肽，其中所述的WTl肽具有與HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分 子和HLA-DPB1*0501分子中任一個(gè)結(jié)合的能力。優(yōu)選在用于活化輔助T細(xì)胞的方法中使用 該試劑盒。除了所述WTl肽之外，本發(fā)明的試劑盒還可以包含例如獲得抗原遞呈細(xì)胞的工 具、檢測(cè)輔助T細(xì)胞活性的工具等。一般而言，所述試劑盒附有說明書手冊(cè)。通過應(yīng)用本發(fā) 明的試劑盒，可有效地誘導(dǎo)輔助T細(xì)胞。
[0025] 在另一方面，本發(fā)明涉及用于通過將WTl肽添加至抗原遞呈細(xì)胞活化輔助T細(xì)胞 的試劑盒，其包含包含編碼WTl肽的多核苷酸的表達(dá)載體或包含該表達(dá)載體的細(xì)胞，其中 所述的WTl肽具有與HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中 任一個(gè)結(jié)合的能力。
[0026] 在其它方面，本發(fā)明涉及用于在受試者中治療或預(yù)防癌癥的方法，包括將WTl肽 添加至抗原遞呈細(xì)胞，并由此活化輔助T細(xì)胞，其中所述的WTl肽具有與HLA-DRB1*1501分 子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一個(gè)結(jié)合的能力。本發(fā)明的方法是這 樣的方法，其中通過活化輔助T細(xì)胞而活化受試者中的免疫系統(tǒng)，并且治療或預(yù)防了該受 試者的癌癥。可直接通過添加 WTl肽、或間接通過添加包含編碼WTl肽的多核苷酸的表達(dá) 載體、或添加包含該表達(dá)載體的細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)添加 WTl肽至抗原遞呈細(xì)胞。
[0027] 如上所述，輔助T細(xì)胞識(shí)別任何一個(gè)MHC II類分子、尤其是HLA-DRB1*1501分 子、HLA-DPB1*0901分子或HLA-DPB1*0501與WTl肽的復(fù)合物。因此，所述受試者是具有 與WTl肽結(jié)合的MHC II類分子的受試者，例如HLA-DRB1*1501陽性、HLA-DPB1*0901陽性、 或HLA-DPB1*0501陽性受試者。如上所述，本發(fā)明的WTl肽可以是具有與HLA-DRB1*1501 分子、HLA-DPB1*0901分子或HLA-DPB1*0501分子中的至少兩個(gè)結(jié)合的能力的肽，或具有與 HLA-DRB1*1501分子和/或HLA-DPB1*0901分子和/或HLA-DPB1*0501分子、和除了它們外 的MHC II類分子結(jié)合的能力的肽。因此，在這種情況下，能夠在對(duì)于本發(fā)明的WTl肽能結(jié) 合的MHCII類亞類而言陽性的受試者中治療或預(yù)防癌癥。待治療或預(yù)防的癌癥可以是任意 一個(gè)，并且其實(shí)例包括造血腫瘤，諸如白血病、骨髓增生異常綜合征、多發(fā)性骨髓瘤或惡性 淋巴瘤；以及實(shí)體癌，諸如胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、胚細(xì)胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前 列腺癌、子宮癌、宮頸癌或卵巢癌。此外，本發(fā)明的方法可與用MHC I類分子限制性WTl肽 治療或預(yù)防癌癥的方法或用于其的藥物組合物一起應(yīng)用。
[0028] 另一方面，本發(fā)明涉及用于通過將WTl肽添加至抗原遞呈細(xì)胞活化輔助T細(xì)胞 從而在受試者中治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物，其包含WTl肽，其中所述的WTl肽具有與 HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一個(gè)結(jié)合的能力。所 述WTl基因在許多癌癥和腫瘤中以高水平表達(dá)，所述癌癥和腫瘤包括造血腫瘤，諸如白血 病、骨髓增生異常綜合征、多發(fā)性骨髓瘤或惡性淋巴瘤；以及實(shí)體癌，諸如胃癌、結(jié)腸癌、肺 癌、乳腺癌、胚細(xì)胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、宮頸癌或卵巢癌。因此，本 發(fā)明的藥物組合物可用于治療或預(yù)防癌癥。
[0029] 如上所述，本發(fā)明的WTl肽可以是具有與HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分 子或HLA-DPB1*0501分子中的至少兩個(gè)結(jié)合的能力的肽，或具有與HLA-DRB1*1501分子和 /或HLA-DPB1*0901分子和/或HLA-DPB1*0501分子、和除了它們外的MHC II類分子結(jié)合 的能力的肽。因此，只要該抗原遞呈細(xì)胞來源自對(duì)于本發(fā)明的WTl肽能與其結(jié)合的MHC II 類亞類而言陽性的受試者，則本發(fā)明的藥物組合物可用于治療或預(yù)防癌癥。
[0030] 當(dāng)將本發(fā)明的藥物組合物例如施用于HLA-DRB1*1501陽性、HLA-DPB1*0901陽性 或HLA-DPB1*0501陽性受試者時(shí)，可通過該藥物組合物中包含的WTl肽活化輔助T細(xì)胞從 而活化受試者的免疫系統(tǒng)，由此治療或預(yù)防癌癥。因此，本發(fā)明的藥物組合物可與治療或預(yù) 防癌癥的方法或用于其的藥物組合物一起使用。
[0031] 除了作為活性組分的WTl肽之外，本發(fā)明的藥物組合物還可以包含例如載體、賦 形劑等。本發(fā)明藥物組合物中包含的WTl肽與抗原遞呈細(xì)胞表面的MHC II類分子結(jié)合，并 且活化輔助T細(xì)胞。因此，本發(fā)明的藥物組合物還可以包含輔助T細(xì)胞的活化劑、生長因子、 誘導(dǎo)劑等，或可以包含MHC I類限制性WTl肽。
[0032] 可以依據(jù)諸如疾病類型、受試者的狀況或靶部位等條件而適當(dāng)?shù)剡x擇施用本發(fā)明 藥物組合物的方法。此類方法的實(shí)例包括但不限于：真皮內(nèi)施用、皮下施用、肌內(nèi)施用、靜脈 內(nèi)施用、鼻內(nèi)施用和口服施用?？梢砸罁?jù)諸如疾病類型、受試者的狀況或靶部位等條件而適 當(dāng)?shù)剡x擇本發(fā)明藥物組合物中所包含的肽的量、以及本發(fā)明藥物組合物的劑型、施用的次 數(shù)等。肽的單劑量一般為〇· OOOlmg-lOOOmg，優(yōu)選0· OOlmg-lOOOmg。
[0033] 在其它方面，本發(fā)明涉及用于通過將WTl肽添加至抗原遞呈細(xì)胞活化輔助T細(xì) 胞從而在受試者中治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物，其包含包含編碼所述WTl肽的多核苷 酸的表達(dá)載體或包含該表達(dá)載體的細(xì)胞，其中所述的WTl肽具有與HLA-DRB1*1501分子、 HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一個(gè)結(jié)合的能力。
[0034] 在其它方面，本發(fā)明涉及WTl肽、包含編碼所述WTl肽的多核苷酸的表達(dá)載體或包 含該表達(dá)載體的細(xì)胞在制備藥物組合物中的用途。
[0035] 另一方面，本發(fā)明涉及與WTl肽特異性結(jié)合的抗體，其中所述的WTl肽具有與 HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一個(gè)結(jié)合的能力?？?通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的手段或方法制備本發(fā)明的抗體。本發(fā)明的抗體可用于各種癌癥 的診斷、其預(yù)后等。
[0036] 另一方面，本發(fā)明涉及用于確定HLA-DRB1*1501陽性、HLA-DPB1*0901陽性或 HLA-DPB1*0501陽性受試者中WTl肽的存在或量的方法，其包括： (a) 使抗-WTl抗體與來自所述受試者的樣品反應(yīng)；以及 (b) 測(cè)定與所述樣品中含有的WTl肽特異性結(jié)合的抗-WTl抗體的存在或量。例如，可 以通過將抗-WTl抗體與來自HLA-DRB1*1501陽性、HLA-DPB1*0901陽性或HLA-DPB1*0501 陽性受試者的樣品溫育，或?qū)⒃摽?WTl抗體施用于HLA-DRB1*1501陽性、HLA-DPB1*0901陽 性或HLA-DPB1*0501陽性受試者，并確定例如其位置、部位或量從而診斷癌癥或其預(yù)后等。 本發(fā)明的抗-WTl抗體是指可特異性識(shí)別本發(fā)明WTl肽的抗體?？?WTl抗體可以是單克隆 抗體或多克隆抗體?？?WTl抗體可以是經(jīng)標(biāo)記的?？蓱?yīng)用已知的標(biāo)記,諸如突光標(biāo)記或放 射性標(biāo)記用作標(biāo)記。通過標(biāo)記抗體，可以容易且快速地確定WTl肽的存在或量。
[0037] 另一方面，本發(fā)明涉及確定WTl肽的存在或量的試劑盒，其包含作為基本組分的 抗-WTl抗體。
[0038] 此外，在WTl肽的存在或量的確定中，當(dāng)所述WTl肽具有與HLA-DRB1*0405分子和 /或HLA-DRB1*1502分子結(jié)合的能力，可在具有此類MHC II類亞類的受試者中確定WTl肽 的存在或量。
[0039] 另一方面，本發(fā)明涉及治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物，其包含用WTl肽活化 的輔助T細(xì)胞，其中所述的WTl肽具有與HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和 HLA-DPB1*0501分子中任一個(gè)結(jié)合的能力。通過活化的輔助T細(xì)胞誘導(dǎo)、生長或活化B細(xì)胞 或T細(xì)胞而治療或預(yù)防癌癥。因此，本發(fā)明這一方面的藥物組合物可與治療或預(yù)防癌癥的 另一方法或用于其的藥物組合物一起使用。用WTl肽活化輔助T細(xì)胞不僅包括用WTl肽直 接活化，還包括用包含編碼WTl肽的多核苷酸的表達(dá)載體或包含該表達(dá)載體的細(xì)胞間接活 化。
[0040] 除了作為活性組分的經(jīng)活化的輔助T細(xì)胞外，本發(fā)明的藥物組合物還可以包含例 如載體、賦形劑等?？梢砸罁?jù)諸如疾病類型、受試者的狀況或靶部位等條件而適當(dāng)?shù)剡x擇施 用本發(fā)明藥物組合物的方法。此類方法的實(shí)例包括但不限于：真皮內(nèi)施用、皮下施用、肌內(nèi) 施用、靜脈內(nèi)施用、鼻內(nèi)施用和口服施用?？梢砸罁?jù)諸如疾病類型、受試者的狀況或靶部位 等條件而適當(dāng)?shù)剡x擇本發(fā)明藥物組合物中所包含的輔助T細(xì)胞量、以及本發(fā)明藥物組合物 的劑型、施用的次數(shù)等。
[0041] 另一方面，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防癌癥的方法，包括將WTl肽添加至抗原遞 呈細(xì)胞，并由此活化輔助T細(xì)胞，并將該活化的輔助T細(xì)胞施用于受試者，其中所述的WTl 肽具有與HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一個(gè)結(jié)合 的能力。
[0042] 另一方面，本發(fā)明涉及WTl肽在制備包含經(jīng)活化的輔助T細(xì)胞的藥物組合物中的 用途。
[0043] 在其它方面，本發(fā)明涉及在HLA-DRB 1*1501陽性、HLA-DPB 1*0901陽性和 HLA-DPB1*0501陽性受試者的任一中測(cè)定WTl-特異性輔助T細(xì)胞的存在或量的方法，其包 括： (a) 使 WTl 肽和 HLA-DRB1*1501 分子、HLA-DPB1*0901 分子或 HLA-DPB1*0501 分子的復(fù) 合物與來自所述受試者的樣品反應(yīng)；以及 (b) 測(cè)定樣品中包含的識(shí)別復(fù)合物的輔助T細(xì)胞的存在或量。來自受試者的樣品可 以是任何的樣品，只要其可能含有淋巴細(xì)胞。此類樣品的實(shí)例包括體液，諸如血液或淋 巴，以及組織。可應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，諸如生物素-抗生蛋白鏈菌素方法， 制備例如作為四聚體或五聚體的WTl肽和HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子或 HLA-DPB1*0501分子的復(fù)合物。可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法測(cè)量識(shí)別此類復(fù)合物的 輔助T細(xì)胞的存在或量。在本發(fā)明的這一方面，該復(fù)合物可以是經(jīng)標(biāo)記的?？蓱?yīng)用已知的 標(biāo)記，諸如突光標(biāo)記或放射性標(biāo)記用作標(biāo)記。通過標(biāo)記它，可容易或快速地確定輔助T細(xì)胞 的存在或量。本發(fā)明這一方面的方法可用于診斷癌癥或其預(yù)后等。
[0044] 因此，本發(fā)明還提供了用于在HLA-DRB 1*1501陽性、HLA-DPB 1*0901陽性和 HLA-DPB1*0501陽性受試者的任一中確定輔助T細(xì)胞的存在或量的組合物，其包含WTl肽和 HLA-DRB1*1501 分子、HLA-DPB1*0901 分子或 HLA-DPB1*0501 分子的復(fù)合物。
[0045] 此外，本發(fā)明還提供了用于在HLA-DRB 1*1501陽性、HLA-DPB 1*0901陽性或 HLA-DPB1*0501陽性受試者中確定輔助T細(xì)胞的存在或量的試劑盒，其包含WTl肽和 HLA-DRB1*1501 分子、HLA-DPB1*0901 分子或 HLA-DPB1*0501 分子的復(fù)合物。
[0046] 此外，在輔助T細(xì)胞的存在或量的確定中，當(dāng)該WTl肽具有與HLA-DRB1*0405分子 和/或HLA-DRB1*1502結(jié)合的能力時(shí)，能夠在具有此類MHC II類亞類的受試者中確定輔助 T細(xì)胞的存在或量。在這種情況下，應(yīng)用WTl肽與能和該WTl肽結(jié)合的MHC II類分子的復(fù) 合物。
[0047] 在其它方面，本發(fā)明涉及應(yīng)用WTl肽和HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子 或HLA-DPB1*0501分子的復(fù)合物獲得輔助T細(xì)胞的方法，其包括： (a) 使樣品和該復(fù)合物反應(yīng)；以及 (b) 獲得樣品中所含有的識(shí)別該復(fù)合物的輔助T細(xì)胞。該復(fù)合物如上所述。樣品可以是 任何樣品，只要其可能含有淋巴細(xì)胞。此類樣品的實(shí)例包括來自受試者的樣品，諸如血液， 以及細(xì)胞培養(yǎng)物?？蓱?yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，諸如FACS或MACS獲得識(shí)別該復(fù)合 物的輔助T細(xì)胞。本發(fā)明允許培養(yǎng)所獲得的輔助T細(xì)胞并將其用于治療或預(yù)防各種癌癥。
[0048] 因此，本發(fā)明還涉及可通過應(yīng)用WTl肽和HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分 子或HLA-DPB1*0501分子的復(fù)合物獲得輔助T細(xì)胞的方法獲得的輔助T細(xì)胞。
[0049] 此外，本發(fā)明還涉及獲得輔助T細(xì)胞的試劑盒，其包含WTl肽和HLA-DRB 1*1501分 子、HLA-DPB1*0901分子或HLA-DPB1*0501分子的復(fù)合物。
[0050] 此外，在輔助T細(xì)胞的獲得中，當(dāng)該WT1肽具有與HLA-DRB 1*0405分子和/或 HLA-DRB1*1502分子結(jié)合的能力時(shí)，可能獲得識(shí)別此類MHC II類亞類和WTl肽的復(fù)合物的 輔助T細(xì)胞。在這種情況下，應(yīng)用WTl肽和與其結(jié)合的MHC II類分子的復(fù)合物。
[0051] 另一方面，本發(fā)明涉及在HLA-DRB1*1501陽性、HLA-DPB1*0901陽性、 HLA-DPB1*0501陽性、HLA-DRB1*0405陽性或HLA-DRB1*1502陽性受試者中測(cè)定WTl-特異 性輔助T細(xì)胞的存在或量的方法，其包括： (a) 用WTl肽刺激外周血單核細(xì)胞、侵襲性淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、腹水中的細(xì)胞、胸水中 的細(xì)胞、腦脊髓液中的細(xì)胞、骨髓細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞；以及 (b) 測(cè)定細(xì)胞因子的產(chǎn)生或輔助T細(xì)胞的反應(yīng)， 其中細(xì)胞因子產(chǎn)生或輔助T細(xì)胞反應(yīng)的存在或量的升高表明WTl特異性輔助T細(xì)胞的 存在或量。在本發(fā)明該方法中應(yīng)用的諸如外周血單核細(xì)胞、侵襲性淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、腹 水中的細(xì)胞、胸水中的細(xì)胞、腦脊髓液中的細(xì)胞、骨髓細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞的細(xì)胞可以來源自 健康受試者或癌癥患者。通過應(yīng)用來自健康受試者的細(xì)胞，能夠確定該受試者是否患有癌 癥，該受試者是否具有其的易感性等。通過應(yīng)用來自癌癥患者的細(xì)胞，能夠預(yù)測(cè)WTl免疫治 療是否對(duì)該癌癥患者具有效果，等等。用WTl肽刺激細(xì)胞可在體外或體內(nèi)實(shí)施。由于其容 易性，優(yōu)選在體外刺激?？赏ㄟ^已知的方法確定細(xì)胞因子產(chǎn)生或輔助T細(xì)胞反應(yīng)的存在，或 細(xì)胞因子產(chǎn)生或輔助T細(xì)胞反應(yīng)的量。
[0052] 以下實(shí)施例更詳細(xì)地闡明了本發(fā)明，但是不能將其理解為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。 實(shí)施例
[0053] 1.制備抗原遞呈細(xì)胞 從收集自健康供血者（HLA-DRB1*1501陽性、HLA-DPB1*0901陽性或HLA-DPB1*0501陽 性）的外周血中分離外周血單核細(xì)胞（PBMCs)。在1 % AB血清（Nabi, Miami, FL)、X-VIV015 培養(yǎng)基（Cambrex)中以IxlO7細(xì)胞/孔的密度將PBMCs接種于6孔塑料板中，并培養(yǎng)2小 時(shí)。培養(yǎng)后，移除懸浮細(xì)胞，并在 1000IU/ml IL-4(P印ro Tech)、1000IU/ml GM-CSF(P印ro Tech)，I % AB血清和X-VIV015培養(yǎng)基中培養(yǎng)剩下的貼壁細(xì)胞。在第2和第4天，更換培養(yǎng) 基，并加入IL-4和GM-CSF。第6天，將lOOIU/mlTNF- α加入到成熟的抗原遞呈細(xì)胞。
[0054] 2. WTl肽特異性⑶4陽性T細(xì)胞的誘導(dǎo) 應(yīng)用用于分離⑶4陽性T細(xì)胞的RosetteSep(StemCell)從來源自相同供體中的血液 分離⑶4陽性T細(xì)胞。將該⑶4陽性T細(xì)胞（3χ106細(xì)胞）添加至24孔板的每一個(gè)孔。用 加了 2〇μ/πι1 WTl肽（SEQ ID Ν〇:2)的自體抗原遞呈細(xì)胞（3χ105細(xì)胞）刺激它們，并用 25Gy放射輻射。在刺激后次日，加入20IU/ml IL-2。類似地，每隔一周應(yīng)用加了 2〇μ8/πι1 WTl肽的抗原遞呈細(xì)胞刺激經(jīng)刺激的CD4陽性T細(xì)胞。此外，在第二次刺激后，每隔一天將 培養(yǎng)基更換為含有IL-2的培養(yǎng)基。將通過總共3次刺激誘導(dǎo)的CD4陽性T細(xì)胞（分別將 HLA-DRB1*1501和HLA-DPB1*0901陽性T細(xì)胞限定為ΤΑ28. 1細(xì)胞和Ε15. 2細(xì)胞）用于以下 實(shí)驗(yàn)。
[0055] 3. IFN-Y 的測(cè)量 在20 μ g/ml WTl肽的存在下培養(yǎng)TA28. 1細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞24小時(shí)，其中所述的 外周血單核細(xì)胞來自該TA28. 1細(xì)胞來源的受試者。培養(yǎng)后，應(yīng)用EILISA試劑盒量化上清液 中的IFN-Y的量。作為對(duì)照，應(yīng)用了來自HLA-DRB1*1501陰性受試者的外周血單核細(xì)胞。 結(jié)果如圖1所示。其證實(shí)了 TA28. 1細(xì)胞識(shí)別對(duì)HLA-DRB1*1501分子特異的WTl肽，以增加 IFN-Y的產(chǎn)量（SM舌化）。
[0056] 此外，應(yīng)用ELISA試劑盒，證實(shí)了 TA28. 1細(xì)胞和E15. 2細(xì)胞不產(chǎn)生IL-4和IL-10。 結(jié)果如圖2和3所示。其證實(shí)了 TA28. 1細(xì)胞和E15. 2細(xì)胞是Thl細(xì)胞。
[0057] 應(yīng)用HLA-DPB1*0501/*0501陽性單核細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞懸浮于 X-VIV0(1% AB血清），并加入20yg/ml WTl肽、lOyg/ml布雷菲德菌素 A和0. 5yg/ ml⑶28/49d。在5% CO2下在37°C溫育4小時(shí)。作為對(duì)照，應(yīng)用沒有添加 WTl肽溫育 的細(xì)胞。在用緩沖液洗滌后，加入抗-⑶3-perCP抗體和抗-CD4-APC抗體，并將其在4°C 溫育30分鐘。用緩沖液洗滌后，應(yīng)用BD Cytofix/Cytoperm固定細(xì)胞和透化處理（4°C， 20分鐘）。用BDperm/wash緩沖液洗滌后，加入抗-INF- γ -FITC (BD，克隆：B27)和 抗-IL-17-PE(eBioscience，克隆：eBio64DEC17)，并在4°C溫育30分鐘。用緩沖液洗滌后， 用FACSAria分析細(xì)胞。結(jié)果如圖4所示。其證實(shí)了 HLA-DPB1*0501陽性單核細(xì)胞生長，并 產(chǎn)生 IFN-γ 和 IL-17。
[0058] 4.生長測(cè)試 通過[3H]-胸苷摻入方法進(jìn)行生長測(cè)試。在96孔板中共培養(yǎng)TA28. 1細(xì)胞（3xl04細(xì) 胞）和加了 WTl肽并輻射過的外周血單核細(xì)胞（HLA-DRB1*1501陽性；IxlO5細(xì)胞）。共培 養(yǎng)80小時(shí)后，加入37kBq/孔[ 3H]-胸苷（Amersham Biosciences)。再溫育16小時(shí)，并應(yīng) 用β-閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)量。作為計(jì)數(shù)/分鐘（cpm)表示測(cè)量結(jié)果。作為對(duì)照，應(yīng)用沒有加肽 的外周血單核細(xì)胞。此外，為了證實(shí)該活化信號(hào)對(duì)HLA-DRB1*1501分子是特異的，應(yīng)用了 抗-MHC I類抗體、抗-HLA-DR抗體、抗-HLA-DQ抗體和抗-HLA-DP抗體。結(jié)果如圖5所示， 其證實(shí)了 TA28. 1細(xì)胞被通過WTl肽和HLA-DRB1*1501的信號(hào)活化，并生長。其還證實(shí)該生 長對(duì)HLA-DRB1*1501是特異的，因?yàn)槠浔豢?HLA-DR抗體抑制。
[0059] 類似地，應(yīng)用E15. 2細(xì)胞進(jìn)行生長測(cè)試。作為附加對(duì)照，應(yīng)用了來自 HLA-DPB1*0901陰性受試者的外周血單核細(xì)胞。結(jié)果如圖6和7所示。其證實(shí)了 E15. 2細(xì)胞 被通過WTl肽和HLA-DPB1*0901的信號(hào)活化，并生長。其還證實(shí)了該生長對(duì)HLA-DPB1*0901 是特異的，因?yàn)槠浔豢?HLA-DP抗體抑制。
[0060] 此外，還應(yīng)用HLA-DPB1*0501/*0501陽性單核細(xì)胞進(jìn)行生長測(cè)試。作為對(duì)照，還應(yīng) 用了來自HLA-DPB1*0501陰性受試者的外周血單核細(xì)胞。結(jié)果如圖8和9所示。其證實(shí)了 HLA-DPB1*0501/*0501陽性單核細(xì)胞被通過WTl肽和HLA-DPB1*0501的信號(hào)活化，并生長。 其還證實(shí)了該生長對(duì)HLA-DPB1*0501是特異的，因?yàn)槠浔豢?HLA-DP抗體抑制。
[0061] 此外，還用各種濃度的WTl肽進(jìn)行了 E15. 2細(xì)胞的生長測(cè)試。應(yīng)用的WTl肽的濃 度為0.08、0.4、2、10、50、100或15(^8/1111。結(jié)果如圖10所示。其證實(shí)了11'1肽以濃度依 賴的方式使E15. 2細(xì)胞生長。 工業(yè)實(shí)用性
[0062] 本發(fā)明提供了用WTl肽活化輔助T細(xì)胞的方法，其中所述WTl肽具有結(jié)合 HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子或HLA-DPB1*0501分子的能力，并提供了用于其 的組合物，以及提供了用于通過活化輔助T細(xì)胞治療和/或預(yù)防癌癥的藥物組合物等。因 此，本發(fā)明可用于醫(yī)藥等領(lǐng)域，例如，應(yīng)用于開發(fā)和制備用于預(yù)防或治療高水平表達(dá)WTl基 因的各種造血腫瘤和實(shí)體癌的藥物組合物領(lǐng)域。
【權(quán)利要求】
1. 用于活化輔助T細(xì)胞的方法，包括將WTl肽添加至抗原遞呈細(xì)胞，并且由此活化輔助 T細(xì)胞，其中所述WTl肽具有與HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501 分子中任一個(gè)結(jié)合的能力。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述WTl肽具有與HLA-DRB1*1501分子、 HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中的至少兩個(gè)結(jié)合的能力。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述WTl肽還具有與HLA-DRB1*0405分子和/或 HLA-DRB1*1502分子結(jié)合的能力。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中所述的WTl肽具有與HLA-DRB1*1501分子、 HLA-DPB1*0901 分子、HLA-DPB1*0501 分子、HLA-DRB1*0405 分子和 HLA-DRB1*1502 分子結(jié) 合的能力。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中所述的WTl肽是包含氨基酸序列：Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID No: 2)的膚。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中通過添加WTl肽、添加包含編碼WTl肽的多核 苷酸的表達(dá)載體或添加包括該表達(dá)載體的細(xì)胞實(shí)現(xiàn)將WTl肽添加到抗原遞呈細(xì)胞。
7. 用于通過添加WTl肽至抗原遞呈細(xì)胞從而活化輔助T細(xì)胞的組合物，其包含WTl肽， 其中所述WTl肽具有與HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子 中任一個(gè)結(jié)合的能力。
8. 在受試者中治療或預(yù)防癌癥的方法，包括將WTl肽添加至抗原遞呈細(xì)胞，并且由 此活化輔助T細(xì)胞，其中所述WTl肽具有與HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和 HLA-DPB1*0501分子中任一個(gè)結(jié)合的能力。
9. 用于通過添加WTl肽至抗原遞呈細(xì)胞來活化輔助T細(xì)胞從而治療或預(yù)防癌癥的藥物 組合物，其包含WTl肽，其中所述WTl肽具有與HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子 和HLA-DPB1*0501分子中任一個(gè)結(jié)合的能力。
10. 特異性結(jié)合WTl肽的抗體，其中所述的WTl肽具有與HLA-DRB1*1501分子、 HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一個(gè)結(jié)合的能力。
11. 在 HLA-DRB1*1501 陽性、HLA-DPB1*0901 陽性和 HLA-DPB1*0501 陽性受試者的任一 中測(cè)定WTl肽的存在或量的方法，其包括： (a) 使抗-WTl抗體與來自所述受試者的樣品反應(yīng)；以及 (b) 測(cè)定與所述樣品中含有的WTl肽特異性結(jié)合的抗-WTl抗體的存在或量。
12. 治療或預(yù)防癌癥的方法，包括將WTl肽添加至抗原遞呈細(xì)胞，并由此活化輔助T細(xì) 胞，以及將所述活化的輔助T細(xì)胞施用于受試者，其中所述WTl肽具有與HLA-DRB1*1501分 子、HLA-DPB1*0901分子或HLA-DPB1*0501分子結(jié)合的能力。
13. 用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物，包括用WTl肽活化的輔助T細(xì)胞，其中所述 WTl肽具有與HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一個(gè)結(jié) 合的能力。
14. 在 HLA-DRB1*1501 陽性、HLA-DPB1*0901 陽性和 HLA-DPB1*0501 陽性受試者的任一 中測(cè)定WTl-特異性輔助T細(xì)胞的存在或量的方法，其包括： (a)使 WTl 肽和 HLA-DRB1*1501 分子、HLA-DPB1*0901 分子或 HLA-DPB1*0501 分子的復(fù) 合物與來自所述受試者的樣品反應(yīng)；以及 (b)測(cè)定樣品中包含的識(shí)別該復(fù)合物的輔助T細(xì)胞的存在或量。 15?在 HLA-DRB1*1501 陽性、HLA-DPB1*0901 陽性、HLA-DPB1*0501 陽性、HLA-DRB1*0405 陽性或HLA-DRB1*1502陽性受試者中測(cè)定WTl-特異性輔助T細(xì)胞的存在或量的方法，其包 括： (a) 用WTl肽刺激外周血單核細(xì)胞、侵襲性淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、腹水中的細(xì)胞、胸水中 的細(xì)胞、腦脊髓液中的細(xì)胞、骨髓細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞；以及 (b) 測(cè)定細(xì)胞因子的產(chǎn)生或輔助T細(xì)胞的反應(yīng)， 其中細(xì)胞因子產(chǎn)生或輔助T細(xì)胞反應(yīng)的存在或量的升高表明WTl特異性輔助T細(xì)胞的 存在或量。
【文檔編號(hào)】C12N5/0783GK104312974SQ201410573477
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2008年2月27日 優(yōu)先權(quán)日:2007年2月27日
【發(fā)明者】杉山治夫 申請(qǐng)人:株式會(huì)社癌免疫研究所