一種自然殺傷t細(xì)胞活化劑多肽及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及具有活化自然殺傷T細(xì)胞，抑制腫瘤壞死因子釋放酶、具有減輕急性炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體破壞的多肽。其序列為FRQSFQKVLCLRKGS是全新的序列，在體內(nèi)試驗(yàn)中增加內(nèi)毒素休克小鼠的生存率，具有潛在的新藥開(kāi)發(fā)價(jià)值。
【專利說(shuō)明】一種自然殺傷T細(xì)胞活化劑多肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及自然殺傷T細(xì)胞活化劑及其應(yīng)用，具體涉及具有活化自然殺傷T細(xì)胞，治療急性淋巴細(xì)胞性白血病的多肽。
【背景技術(shù)】
[0002]急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)是一種進(jìn)行性惡性疾病，其特征為大量的類似于淋巴母細(xì)胞的未成熟白細(xì)胞。這些細(xì)胞可在血液、骨髓、淋巴結(jié)、脾臟和其它器官中發(fā)現(xiàn)。急性淋巴細(xì)胞性白血病占兒童急性白血病的80%，發(fā)病率高峰在3歲至7歲之間。ALL也可發(fā)生于成年人，占所有成年人白血病的20%。近年來(lái)隨著醫(yī)學(xué)研究的深入，對(duì)急性淋巴細(xì)胞性白血病的認(rèn)識(shí)和治療取得了很大進(jìn)展。生物靶向治療腫瘤是非常有前景的，靶向治療是阻斷腫瘤發(fā)生的某個(gè)過(guò)程，達(dá)到治療腫瘤的目的。
[0003]自然殺傷T (natural killer T cells, NKT)細(xì)胞是一種具有特定標(biāo)志的T細(xì)胞亞群，既表達(dá)T細(xì)胞表面標(biāo)志，如CD3、TCRaB (人類表達(dá)Va24 Vfill，小鼠表達(dá)Val4 Jal8)，又表達(dá)NK細(xì)胞的表面標(biāo)志。NKT細(xì)胞只能識(shí)別由⑶Id分子遞呈的特異性糖脂類分子，而不是由主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex, MHC)遞呈的多肽。NKT細(xì)胞活化后可迅速分泌一系列的細(xì)胞壞死相關(guān)因子，如穿孔素和TNF-α，增強(qiáng)其殺傷腫瘤細(xì)胞的作用；還可通過(guò)激活其他具有殺傷活性的效應(yīng)細(xì)胞，如NK細(xì)胞和CD8 +細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤作用。
[0004]因此，活 化自然殺傷T細(xì)胞，抑制急性淋巴細(xì)胞性白血病發(fā)展，是治療急性淋巴細(xì)胞性白血病的新靶點(diǎn)。但是，尚未有開(kāi)發(fā)成熟的自然殺傷T細(xì)胞活化劑多肽的治療急性淋巴細(xì)胞性白血病的藥物。
[0005]本專利中的自然殺傷T細(xì)胞活化劑多肽已證明在急性淋巴細(xì)胞性白血病中有效，具有在其他腫瘤模型中開(kāi)發(fā)的前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]發(fā)明目的
本發(fā)明提供全新的序列，該序列自然殺傷T細(xì)胞活化劑，對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病具有很好的療效。
[0007]技術(shù)方案
自然殺傷T細(xì)胞活化劑，其特征在于其序列為FRQSFQKVLCLRKGS。
[0008]自然殺傷T細(xì)胞活化劑在制備治療急性淋巴細(xì)胞白血病藥物中的應(yīng)用。
[0009]有益效果
利用固相合成法化學(xué)合成自然殺傷T細(xì)胞活化劑，該多肽具有全新的序列，該多肽可體外活化自然殺傷T細(xì)胞，治療急性淋巴細(xì)胞白血病。在體內(nèi)試驗(yàn)中增加內(nèi)毒素休克小鼠的生存率，具有潛在的新藥開(kāi)發(fā)價(jià)值。【具體實(shí)施方式】
[0010]本發(fā)明涉及多肽由吉爾生化(上海)合成。
[0011]實(shí)施例1
多肽的化學(xué)合成方法
多肽用Fmoc化學(xué)方法合成。合成反應(yīng)從C端向N端進(jìn)行，Rink介質(zhì)(可在AdvancedChemTech公司購(gòu)得)上有自由氨基，順序連接氨基酸。每一步連接過(guò)程中，氨基酸殘基都要活化，活化混合物中有4倍于介質(zhì)上自由氨基的HBTU，HOBt7DIEA和Fmoc-氨基酸。每次氨基酸的連接反應(yīng)之后，都用一個(gè)吡啶/醋酸/N-甲基咪唑(4:1:0.5)的混合物來(lái)封閉未連接的自由氨基，封閉反應(yīng)10 min0每次氨基酸的連接反應(yīng)之后，下一個(gè)氨基酸連接之前，都要把介質(zhì)上的Fmoc-基團(tuán)去掉，去Fmoc-基團(tuán)使用含20%哌啶的二甲基甲酰胺，需15分鐘。最后，當(dāng)所有氨基酸殘基順序連接之后，多肽用98%三氟乙酸從介質(zhì)上切割下來(lái)，切割在室溫下進(jìn)行2小時(shí)。
[0012]應(yīng)用上述化學(xué)條件可合成并獲得多肽，序列為FRQSFQKVLCLRKGS，該序列為全新序列。
[0013]實(shí)施例2 自然殺傷T細(xì)胞活化劑I對(duì)體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活I(lǐng)C50。
[0014]采用MTT比色法。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的U937細(xì)胞，以1.0X 105加入96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h，實(shí)驗(yàn)孔、陽(yáng)性藥物對(duì)照孔分別加入不同濃度的實(shí)驗(yàn)藥物自然殺傷T細(xì)胞活化劑I和陽(yáng)性對(duì)照藥物長(zhǎng)春新堿；空白組加入相同體積的溶劑。每孔設(shè)五個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h，分別在Oh、2h、8h、14h、20h、24h、36h、，48h 每孔加入 MTT，作用 4h 后，加入 DMSO，孵育 30min，在酶標(biāo)儀620nm處測(cè)定吸光度A值，按公式腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1_實(shí)驗(yàn)組吸光值/對(duì)照組吸光值)X 100%。計(jì)算出實(shí)驗(yàn)藥物的IC50為5.77 μ M0
[0015]實(shí)施例3
用內(nèi)毒素休克模型檢測(cè)自然殺傷T細(xì)胞活化劑I的體內(nèi)活力
在建立內(nèi)毒素休克模型之前，我們首先測(cè)定了 LPS(E.coli 0111:B4，sigma公司購(gòu)買(mǎi))小白鼠的LD50為50 μg每只小鼠，在實(shí)驗(yàn)中我們采用了 100 μg每只小鼠，這樣，對(duì)照組的小鼠可全部死亡。在我們前面的科研工作中，發(fā)現(xiàn)Regas印in2 (另外一條多肽抑制劑，已公開(kāi))可提高C57BL/6小鼠在內(nèi)毒素休克過(guò)程中的生存率。為了在我們的小白鼠上建立內(nèi)毒素休克模型，我們用Regas印in2做了一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組小鼠注射100 μg LPS，而Regasepin2實(shí)驗(yàn)組的小鼠在注射LPS 5分鐘之后,每只小鼠再注射0.7 mg的多肽。通過(guò)制作Kaplan-Meier生存曲線發(fā)現(xiàn)Regasepin2可有效的保護(hù)注射了 100 Pg的小鼠,提高了生存率。成功地在小白鼠上建立內(nèi)毒素休克模型之后，用該模型檢測(cè)自然殺傷T細(xì)胞活化劑I的體內(nèi)活力。對(duì)照組小鼠(12只)注射100 Pg LPS，而自然殺傷T細(xì)胞活化劑I組小鼠(12只)在注射LPS 5 min后，每只小鼠注射0.7 mg自然殺傷T細(xì)胞活化劑I。用Kaplan-Meier生存曲線分析，自然殺傷T細(xì)胞活化劑I可有效地保護(hù)小白鼠，提高內(nèi)毒素休克小鼠的生存率。
[0016]實(shí)施例4
整合素阻斷劑多肽1、多肽II和多肽III對(duì)黑色素瘤B16F10 C57BL/6黑鼠移植腫瘤生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)取生長(zhǎng)旺盛期的瘤組織在無(wú)菌條件下碾磨，制備成I X 17個(gè)/ml細(xì)胞懸液，以0.1 ml接種于小鼠右側(cè)腋部皮下。小鼠移植瘤用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤直徑，待腫瘤生長(zhǎng)至100-200mm3后動(dòng)物隨機(jī)分組。使用測(cè)量瘤徑的方法，動(dòng)態(tài)觀察整合素阻斷劑多肽對(duì)受試動(dòng)物腫瘤的抑制效果。腫瘤直徑的測(cè)量次數(shù)為每2天I次，每次測(cè)量同時(shí)還需稱量鼠重。實(shí)驗(yàn)組左側(cè)腋部皮下注射多肽，陰性組同時(shí)給等量生理鹽水，給藥14 d，其中環(huán)磷酰胺隔天皮下給藥一次，紫杉醇組每3天皮下給藥一次，多肽低劑量一天給藥兩次組一天給兩次，其它各組一天給藥一次。治療14 d后,小鼠處死,手術(shù)剝?nèi)×鰤K稱重。腫瘤體積(tumor volume，TV)的計(jì)算公式為:
TV = l/2XaXb2
其中a、b分別表示長(zhǎng)寬。
[0017]根據(jù)測(cè)量的結(jié)果計(jì)算出相對(duì)腫瘤體積(relative tumor volume, RTV),計(jì)算公式為:RTV = Vt/V0O其中Vtl為分籠給藥時(shí)(即(Ici)測(cè)量所得腫瘤體積，Vt為每一次測(cè)量時(shí)的腫瘤體積?？鼓[瘤活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)為相對(duì)腫瘤增殖率T/C (%)，計(jì)算公式如下:
【權(quán)利要求】
1.自然殺傷T細(xì)胞活化劑1，其特征在于其序列為FRQSFQKVLCLRKGS。
2.一種藥物組合物，其特征在于其包含如權(quán)利要求1所述多肽與一種以上藥學(xué)上可接受的賦形劑、填充劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑、或穩(wěn)定劑。
3.如權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其特征在于，所述組合物為注射劑。
4.如權(quán)利要求1所述的劑多肽，其特征在于有效劑量為10mg/kg。
5.如權(quán)利要求1所述的自然殺傷T細(xì)胞活化劑I在制備、治療急性淋巴細(xì)胞性白血病藥物中的 應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K38/10GK104031126SQ201410295889
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月27日
【發(fā)明者】羅瑞雪 申請(qǐng)人:蘇州普羅達(dá)生物科技有限公司