一種制備外源環(huán)狀rna的方法及定量檢測內(nèi)源環(huán)狀rna的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備外源環(huán)狀RNA的方法及定量檢測內(nèi)源環(huán)狀RNA的方法。本發(fā)明將人工合成的DNA基因進行克隆，增殖，之后轉(zhuǎn)錄DNA基因為線性RNA，將RNA末端修飾后，首尾連接，制備成外源環(huán)狀RNA分子。將外源環(huán)狀RNA分子按特定比例加入總RNA中，作為內(nèi)源環(huán)狀RNA實時定量檢測時的參考基因，首次實現(xiàn)了對內(nèi)源環(huán)狀RNA的實時定量檢測。
【專利說明】一種制備外源環(huán)狀RNA的方法及定量檢測內(nèi)源環(huán)狀RNA的 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種制備外源環(huán)狀RNA的方法及定量檢測 內(nèi)源環(huán)狀RNA的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 生物體內(nèi)大部分的RNA(Ribonucleicacid,核糖核酸）為線性，但有少部分RNA首 尾連接形成環(huán)狀，稱之為環(huán)狀RNA。近年來，環(huán)狀RNA迅速成為RNA世界研究的熱點,這是因 為環(huán)狀RNA被發(fā)現(xiàn)與重要生物學(xué)功能及疾病等密切相關(guān)。另外，高通量測序技術(shù)被應(yīng)用于 檢測環(huán)狀RNA，極大地加快了對環(huán)狀RNA的發(fā)現(xiàn)及對環(huán)狀RNA功能的分析。
[0003] 對于RNA來說，其表達量是一個十分重要的屬性。RNA是否表達以及表達量的多 少，都決定著RNA的生物學(xué)功能。例如，很多疾病的產(chǎn)生就是因為RNA表達量的異常造成的。 要衡量RNA的表達量，就需要一個在各種狀態(tài)下表達量相對恒定的RNA作為參考基因。經(jīng) 過大量的研究發(fā)現(xiàn)，線性肌動蛋白（Actin)等基因的表達量相對恒定，常常作為線性RNA表 達的參考基因。
[0004] 在實現(xiàn)本發(fā)明的過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下問題：
[0005] 已知的恒定表達基因均為線性RNA分子，不能作為環(huán)狀RNA分子的參考基因，使得 不同樣品間的環(huán)狀RNA表達量比較缺乏參考標準，因而缺乏有效的環(huán)狀RNA檢測技術(shù)，極大 地限制了環(huán)狀RNA的研究與應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中缺乏環(huán)狀RNA的參考基因的問題，本發(fā)明實施例提供了一種 制備外源環(huán)狀RNA的方法及定量檢測內(nèi)源環(huán)狀RNA的方法。所述技術(shù)方案如下：
[0007] -方面，本發(fā)明實施例提供了一種制備外源環(huán)狀RNA的方法，所述方法包括：
[0008] 選擇外源線性RNA基因；
[0009] 將所述外源線性RNA基因克隆到原核表達載體中，獲得克隆的外源線性RNA基 因；
[0010] 將所述克隆的外源線性RNA基因在體外轉(zhuǎn)錄，合成外源線性RNA;
[0011] 去除所述外源線性RNA的5'端的三磷酸結(jié)構(gòu)，并在所述外源線性RNA的5'端合 成羥基；
[0012] 對5'端為羥基的所述外源線性RNA進行磷酸化修飾，合成5'端經(jīng)磷酸化修飾的 所述外源線性RNA;
[0013] 將所述5'端經(jīng)磷酸化修飾的外源線性RNA的5'端和3'端連接，合成外源環(huán)狀 RNA；
[0014] 切掉未環(huán)化成功的所述外源線性RNA，得到外源環(huán)狀RNA。
[0015] 具體地，所述外源線性RNA基因?qū)?yīng)的DNA序列如序列表SEQIDNO: 1所示。
[0016] 具體地，采用RNA酶R切掉未環(huán)化成功的所述外源線性RNA。
[0017] 另一方面，本發(fā)明提供了一種定量檢測內(nèi)源環(huán)狀RNA的方法，所述方法包括：
[0018] 采用上述的方法制備外源環(huán)狀RNA;
[0019] 對所述外源環(huán)狀RNA進行質(zhì)量控制；
[0020] 向待檢樣本和對照樣本的總RNA中加入所述外源環(huán)狀RNA，所述總RNA與所述外源 環(huán)狀RNA的質(zhì)量比為2000:1，得到所述外源環(huán)狀RNA與所述總RNA的混合物；
[0021] 利用實時定量PCR方法分別檢測所述外源環(huán)狀RNA與所述總RNA的混合物中的目 標環(huán)狀RNA和所述外源環(huán)狀RNA的含量；
[0022] 以所述外源環(huán)狀RNA作為參考基因確定所述待檢樣本中所述目標環(huán)狀RNA的表達 量。
[0023] 具體地，所述對所述外源環(huán)狀RNA進行質(zhì)量控制包括：
[0024] 利用隨機引物對合成的所述外源環(huán)狀RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，合成外源cDNA;
[0025] 利用第一引物和第二引物分別對所述外源線性cDNA和所述外源環(huán)狀cDNA進行實 時定量PCR擴增，分別獲得CT1值和CT2值，所述第一引物包括如序列表中SEQIDN0:2所 示的第一正向引物和如序列表中SEQIDN0:3所示的第一反向引物，所述第二引物包括如 序列表中SEQIDN0:4所示的第二正向引物和如序列表中SEQIDN0:5所示的第二反向引 物；
[0026] 通過CT1值和CT2值以及公式2[eT2_eTl]x丨〇〇%,計算合成的所述外源環(huán)狀RNA的 環(huán)化比例，并選用環(huán)化比例超過90%的所述外源環(huán)狀RNA。
[0027] 具體地，所述向待檢樣本的總RNA中加入所述外源環(huán)狀RNA，所述總RNA與所述外 源環(huán)狀RNA的質(zhì)量比為2000:1，得到所述外源環(huán)狀RNA與所述總RNA的混合物，包括：
[0028] 提取并純化所述待檢樣本與所述對照樣本的總RNA;
[0029] 測量純化后的所述總RNA的質(zhì)量濃度；
[0030] 根據(jù)所述待檢樣本和所述對照樣本的總RNA的質(zhì)量濃度按照所述總RNA與所述外 源環(huán)狀RNA的質(zhì)量比為2000:1的比例與所述外源環(huán)狀RNA混合，得到所述外源環(huán)狀RNA與 所述總RNA的混合物。
[0031] 進一步地，利用分光光度計測量所述待檢樣本與所述對照樣本的總RNA的質(zhì)量濃 度。
[0032] 具體地，所述利用實時定量PCR方法分別檢測所述外源環(huán)狀RNA與所述總RNA的 混合物中的目標環(huán)狀RNA和所述外源環(huán)狀RNA的含量，包括：
[0033] 利用所述隨機引物對加入了所述外源環(huán)狀RNA的所述總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，得到逆 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，所述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物包括目標環(huán)狀cDNA和所述外源環(huán)狀cDNA;
[0034] 利用第三引物分別對所述待測樣本與所述對照樣本的所述目標環(huán)狀cDNA進行定 量PCR檢測，擴增后分別獲得CT3值和CT4值，利用所述第二引物分別對所述待測樣本與所 述對照樣本的所述外源環(huán)狀cDNA進行定量PCR檢測，擴增后分別獲得CT5值和CT6值；
[0035] 所述第三引物與所述第二引物的擴增產(chǎn)物均跨越了環(huán)狀RNA的環(huán)化結(jié)點。
[0036] 進一步地，根據(jù)公式eT6_eT5_ eT4]x1〇〇%,計算所述待檢樣本中所述目標環(huán) 狀RNA的比例。
[0037] 進一步地，所述實時定量PCR的擴增程序為：95°C20秒；95°C3秒，60°C20秒，共 40個循環(huán)。
[0038] 本發(fā)明實施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是：本發(fā)明實施例提供了一種制備 外源環(huán)狀RNA的方法，其獲得的外源環(huán)狀RNA可作為內(nèi)源環(huán)狀RNA的參考基因，解決了內(nèi)源 環(huán)狀RNA由于缺乏參考基因而無法進行實時定量PCR檢測的缺陷，有助于環(huán)狀RNA的研究 與應(yīng)用。本發(fā)明實施例提供的定量檢測內(nèi)源環(huán)狀RNA的方法，將制備的外源環(huán)狀RNA加入 待檢樣本與對照樣本的總RNA中，并與待檢樣本與對照樣本的總RNA-同進行擴增與檢測。 因而，外源環(huán)狀RNA實質(zhì)上已經(jīng)等同于了穩(wěn)定表達的內(nèi)源環(huán)狀RNA，可以作為不同樣本間檢 測內(nèi)源環(huán)狀RNA表達量的參考基因，解決了沒有內(nèi)源環(huán)狀RNA參照基因的難題，從而實現(xiàn)了 對內(nèi)源環(huán)狀RNA表達量檢測的目的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0039] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使 用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他 的附圖。
[0040] 圖1是本發(fā)明實施例一提供的制備外源環(huán)狀RNA的方法流程圖；
[0041] 圖2是本發(fā)明實施例二提供的制備外源環(huán)狀RNA的方法流程圖。

【具體實施方式】
[0042] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施方式作進一 步地詳細描述。
[0043] 實施例一
[0044] 本發(fā)明實施例提供了一種制備外源環(huán)狀RNA的方法，如圖1所示，該方法包括：
[0045] 步驟101 :選擇外源線性RNA基因；
[0046] 步驟102 :將外源線性RNA基因克隆到原核表達載體中，獲得克隆的外源線性RNA 基因；
[0047] 步驟103 :將克隆的外源線性RNA基因在體外逆轉(zhuǎn)錄，合成外源線性RNA;
[0048] 步驟104 :去除外源線性RNA的5'端的三磷酸結(jié)構(gòu)，并在外源線性RNA的5'端合 成羥基；
[0049] 步驟105 :對5'端為羥基的外源線性RNA進行磷酸化修飾，合成5'端經(jīng)磷酸化修 飾的外源線性RNA;
[0050] 步驟106 :將5'端經(jīng)磷酸化修飾的外源線性RNA的5'端和3'端連接，合成外源 環(huán)狀RNA;
[0051] 步驟107 :切掉未環(huán)化成功的所述外源線性RNA，得到外源環(huán)狀RNA;
[0052] 步驟108 :純化外源環(huán)狀RNA。
[0053] 具體地，本發(fā)明實施例提供的待檢樣本為萊茵衣藻，且該萊茵衣藻的品系為 CC503 (購自于衣藻資源中心，網(wǎng)址為：http://chlamycollection.org/)。
[0054] 步驟101 :選擇外源線性RNA基因，該外源線性RNA基因?qū)?yīng)的DNA序列如序列表 SEQIDNO: 1所示。上述SEQIDNO: 1及其互補鏈由生工生物工程（上海）股份有限公司 合成。通過NCBI的BLAST程序檢索，沒有發(fā)現(xiàn)生物中存在外源線性RNA基因的同源性高的 基因。選擇的外源線性RNA基因的長度不超過lOOObp。在外源線性RNA基因的5'端和3' 端分別添加了ctcgag和aagctt序列，該ctcgag和aagctt序列分別為限制性內(nèi)切酶Xhol 和Hindlll的酶切位點，便于將外源線性RNA基因克隆進入原核表達載體，在外源線性RNA 基因的5'端連接的taatacgactcactata序列為17轉(zhuǎn)錄酶的啟動子序列，其余序列為可轉(zhuǎn) 錄的序列，且在taatacgactcactata序列之后連接有g(shù)gg序列，ggg序列能夠增加17轉(zhuǎn)錄 酶的轉(zhuǎn)錄效率。
[0055] 步驟102 :將外源線性RNA基因克隆到原核表達載體中，獲得克隆的外源線性RNA 基因，包括：
[0056] 所選用的克隆載體為pBluescriptIISK(+)(該克隆載體從長沙贏潤生物技術(shù) 有限公司購買，貨號為VKS0288)，采用內(nèi)切酶XhoI(購買自NEB公司，貨號為R0146)和內(nèi) 切酶HindIII(購買自NEB公司，貨號為R0104)對pBluescriptllSK(+)載體進行雙酶 切。具體地，在20iil的反應(yīng)體系中，包含有l(wèi)OiigpBluescriptIISK(+)載體、20U的內(nèi) 切酶HindIII、20U的內(nèi)切酶Xhol和2X的NEBuffer2. 1(由NEB公司提供）。將上述反 應(yīng)體系混合均勻，經(jīng)短暫離心，于37°C保溫1小時后，經(jīng)80°C20分鐘將酶滅活，并獲得線 性pBluescriptIISK(+)載體，該線性pBluescriptIISK(+)載體的濃度為 10/20 = 0. 5yg/y1 〇
[0057] 將外源線性RNA基因的DNA序列（如序列表SEQIDNO: 1所示）及其互補鏈用無 菌水溶解后，分別配制成濃度為〇. 5yg/yl的溶液，按體積比1 :1混合均勻，于PCR儀中依 次經(jīng)歷94°C10分鐘；65°C10分鐘；37°C10分鐘，形成外源雙鏈DNA基因。
[0058] 在20ii1的反應(yīng)體系中包括線性的pBluescriptIISK(+)載體10ii1、外源雙鏈 DNA基因liil、400U的T4DNA連接酶（購買自NEB公司，貨號為M0202)和1XT4DNA連接酶 緩沖液（隨T4DNA連接酶一起購買自NEB公司），16°C溫育過夜后，65°C10分鐘，T4DNA連 接酶經(jīng)熱失活，獲得含有外源線性RNA基因的pBluescriptIISK(+)質(zhì)粒載體。
[0059] 利用熱激法將含有外源線性RNA基因的pBluescriptIISK(+)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化進 入大腸桿菌，具體方法如下：取50yl感受態(tài)細胞（由北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)， 目錄號為⑶501)在冰浴中自然解凍，加入含有外源線性RNA基因的pBluescriptIISK(+) 質(zhì)粒載體，輕輕混勻，在冰浴上孵育30分鐘，42°C熱激30秒，快速轉(zhuǎn)移至冰浴中冰浴3分 鐘，該過程中不要搖動離心管，然后加入300yl不含抗生素的無菌LB液體培養(yǎng)基（LB液 體培養(yǎng)基成份：牛肉膏0. 5g，蛋白胨1. 0g，氯化鈉0. 5g，蒸餾水100mL，pH7. 2?7. 5)，于 37°C200轉(zhuǎn)/分鐘，復(fù)蘇1小時，取復(fù)蘇后的菌液200 均勻涂布于含氨芐青霉素抗性的 LB固體培養(yǎng)基（LB固體培養(yǎng)基包括：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L和瓊 脂粉15g/L)上，待菌液完全吸收后倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中，暗培養(yǎng)過夜。挑取LB固體培 養(yǎng)基上長出來的單克隆至5ml含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，經(jīng)37°C200轉(zhuǎn)/分鐘，搖 菌擴增繁殖6-8小時，制備成感受態(tài)細胞。
[0060] 利用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的快速質(zhì)粒小提試劑盒（貨號為DP105) 從上述感受態(tài)細胞中，提取并純化含有外源線性RNA基因的pBluescriptIISK(+)質(zhì)粒 載體的DNA，提取與純化的方法按照隨試劑盒提供的說明書進行。利用分光光度計（美國 Quawell公司生產(chǎn)，型號為Q5000)中的雙鏈DNA程序，檢測純化后的pBluescriptIISK(+)質(zhì)粒的質(zhì)量濃度。利用外源線性RNA基因的PCR引物從純化后的pBluescriptIISK(+) 質(zhì)粒上擴增外源線性RNA基因。具體地，20iU的擴增體系包括：純化后的pBluescriptII SK(+)質(zhì)粒50ng、10illQ5高保真擴增混合物（購自于NEB公司，貨號為M0492)和10iiM 的外源線性RNA基因的PCR引物（該PCR引物為正向引物與反向引物的等摩爾比混合物）。 擴增程序如下：98°C30秒；98°C8秒，56°C20秒，72°C20秒，共30個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物利用 乙醇沉淀進行純化，純化產(chǎn)物溶解于10U1無酶水中，獲得外源線性RNA基因的PCR產(chǎn)物， 利用Q5000(美國Quawell公司生產(chǎn)，型號為Q5000)中的雙褳DNA定量程序?qū)CR產(chǎn)物進 行定量檢測，檢測結(jié)果表明：本次擴增獲得的外源線性RNA基因的PCR產(chǎn)物濃度為560ng/ U1。將外源線性RNA基因的PCR產(chǎn)物送至武漢擎科生物技術(shù)有限公司測序，確認克隆的外 源線性RNA基因的正確性，從而獲得帶有正確克隆的外源線性RNA基因的pBluescriptII SK(+)質(zhì)粒。
[0061] 其中，外源線性RNA基因的PCR引物的正向引物如序列表中SEQIDN0:9所示，夕卜 源線性1^基因的？〇?引物的反向引物如序列表中5￡0 10勵:10所示。序列表中5￡0 10 N0:9中的多聚T序列是為了在轉(zhuǎn)錄時獲得多聚A，用于模擬生物RNA的多聚A尾巴，具有多 聚A尾巴的RNA可以被Poly⑴弓丨物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。同時，多聚A尾巴也可用于純化RNA。
[0062] 步驟103 :將克隆的外源線性RNA基因在體外轉(zhuǎn)錄，合成外源線性RNA，包括：
[0063] 采用I7RNA快速高效合成試劑盒（購自于NEB公司，貨號為E2050)轉(zhuǎn)錄合成外源 線性RNA。該試劑盒中的成份包括：無酶水、含有NTP的緩沖液混合物和I7RNA聚合酶混合 物，該反應(yīng)體系中包括：1Ug上述外源線性RNA基因的PCR產(chǎn)物、lOiil含有NTP的緩沖液 混合物和2 I7RNA聚合酶混合物，加水補足20 混合均勻，并短暫離心，經(jīng)37°C保溫2 小時后，加入30ill無酶水和2illDNase1(購自于NEB公司，貨號為M0303)，混合均勻后， 經(jīng)37°C保溫15分鐘，去除DNA模板。再利用DynabeadsmRNA純化試劑盒（由ABI公司生 產(chǎn)，貨號為61006)進行純化，并用50ill無酶水溶解純化產(chǎn)物，獲得純化的外源線性RNA。
[0064] 步驟104 :去除外源線性RNA的5'端的三磷酸結(jié)構(gòu)，并在外源線性RNA的5'端合 成羥基。因體外合成的外源線性RNA的5'端為三磷酸結(jié)構(gòu)，使得外源線性RNA的5'端無 法與3'端連接形成環(huán)狀，所以必須去除該5'端的三磷酸結(jié)構(gòu)，再在5'端加上單磷酸結(jié)構(gòu)， 這樣外源線性RNA的首尾才能相連成環(huán)狀，具體步驟包括：
[0065] 采用小牛腸堿性磷酸酶（購自于NEB公司，貨號為M0290)去除外源線性RNA的5' 端的三磷酸結(jié)構(gòu)，配制如下反應(yīng)體系：20yg純化的外源線性RNA和7U的小牛腸堿性磷酸 酶，用水補足20yl后混合均勻，經(jīng)短暫離心，于37°C保溫1小時，獲得去除5'端三磷酸結(jié) 構(gòu)的外源線性RNA。利用DynabeadsmRNA純化試劑盒（由ABI公司生產(chǎn)，貨號為61006)純 化去除了 5'端三磷酸結(jié)構(gòu)的外源線性RNA，得到5'端為羥基的外源線性RNA。
[0066] 步驟105 :對5'端為羥基的外源線性RNA進行磷酸化修飾，合成5'端磷酸化修飾 的外源線性RNA，包括：
[0067] 利用T4PNK激酶（由NEB公司，貨號為M0201)修飾該5'端為羥基的外源線性 RNA。隨酶一起提供的有10XT4PNK激酶緩沖液。在50iU的反應(yīng)體系中，包含如下成份： 1XT4PNK激酶緩沖液、ImMATP、10UT4PNK激酶、以及上述獲得的5'端為羥基的外源線性 RNA，用水補足50ill并混合均勻，經(jīng)短暫離心，于37 °C保溫30分鐘。利用DynabeadsmRNA 純化試劑盒（由ABI公司生產(chǎn)，貨號為61006)進行純化，操作方法按該試劑盒的說明書進 行，獲得5'端磷酸化修飾的外源線性RNA。
[0068] 步驟106 :將5'端磷酸化修飾的外源線性RNA的5'端和3'端連接，合成外源環(huán) 狀RNA,包括：
[0069] 利用T4RNA連接酶I(NEB公司生產(chǎn)，貨號為M0204)對該5'端磷酸化修飾的外源線 性RNA的5'端與3'端進行連接。隨該T4RNA連接酶I一起提供的成份還包括：10XT4RNA 連接酶反應(yīng)緩沖液、10mMATP和PEG8000。在2〇111的反體系中包含如下成份：1\了41?隱 連接酶反應(yīng)緩沖液、l〇U/yl的T4RNA連接酶1ill、10U/ill的RNA酶抑制劑0. 5ill、濃度 為10%的PEG8000、20-50iiM的ATP和上述獲得的5'端磷酸化修飾的外源線性RNA，用水 補足20iU并混合均勻，經(jīng)短暫離心，于PCR儀中于16°C過夜，經(jīng)95°C2分鐘終止反應(yīng)，得 到外源環(huán)狀RNA。
[0070] 純化外源環(huán)狀RNA，具體地，向得到的含有外源環(huán)狀RNA的混合物中加入以下成 份：5M的醋酸銨（Ambion公司生產(chǎn)，貨號為AM9071) 10iil、濃度為100%的乙醇200iil和 水80iil，混合均勻，經(jīng)短暫離心，置于-80°C冰箱（海爾公司生產(chǎn)，型號為DW-86L626)中放 置30分鐘；取出后經(jīng)14000rpm4°C離心25分鐘，用移液器的槍頭小心吸去上層清液，向沉 淀中加入300iU濃度為70%的乙醇，用于清洗沉淀，再經(jīng)14000rpm4°C離心5分鐘后吸去 上層清液，于室溫下，空氣中干燥10分鐘，用于去除殘留的乙醇，再用10Ul無酶水溶解沉 淀，獲得純化的外源環(huán)狀RNA。
[0071] 步驟107 :利用RNA酶R切掉未環(huán)化成功的外源線性RNA，得到外源環(huán)狀RNA，具體 步驟包括：
[0072] 在獲得的純化的外源環(huán)狀RNA中，還有部分未環(huán)化成功的外源線性RNA，利用RNA 酶R(由Epicentre公司生產(chǎn)，貨號為RNR07250)切掉未環(huán)化成功的外源線性RNA。隨該RNA 酶R-起提供的還有10XRNA酶R反應(yīng)緩沖液，向獲得的純化的外源環(huán)狀RNA中加入2ill 10XRNA酶R反應(yīng)緩沖液、1ill20U/ill的RNA酶R和水7ill并混合均勻，經(jīng)短暫離心后 于40°C保溫1小時，獲得去除了外源線狀RNA的外源環(huán)狀RNA。
[0073] 步驟108 :純化去除了外源線狀RNA的外源環(huán)狀RNA，包括：
[0074] 向獲得的去除了外源線狀RNA的外源環(huán)狀RNA中加入以下成份：5M的醋酸銨 (Ambion公司生產(chǎn)，貨號為AM9071) 10ill、濃度為100%的乙醇200ill和水80ill并混合均 勻，經(jīng)短暫離心，置于_80°C冰箱（海爾公司生產(chǎn)，型號為DW-86L626)中放置30分鐘，取出 后經(jīng)14000rpm4°C離心25分鐘，用移液器的槍頭小心吸去上層清液，向沉淀中加入300yl 濃度為70%的乙醇，用于清洗沉淀，再經(jīng)14000rpm4°C離心5分鐘后吸去上層清液，于室溫 下，空氣中干燥10分鐘，用于去除殘留的乙醇，用50yl無酶水溶解沉淀，獲得純化的外源 環(huán)狀RNA。
[0075] 本發(fā)明實施例提供的制備外源環(huán)狀RNA的方法，為了確定內(nèi)源環(huán)狀RNA的表達量 人工合成外源環(huán)狀RNA作為參考基因，按比例加入總RNA中，以模擬體內(nèi)穩(wěn)定表達的內(nèi)源環(huán) 狀RNA。在本發(fā)明實施例提供的人工合成外源環(huán)狀RNA中，首先，所設(shè)計的外源環(huán)狀RNA與 外源線性RNA在體內(nèi)應(yīng)該沒有相同序列以及同源性高的序列，因為加入總RNA后，是無法將 外源RNA與內(nèi)源RNA區(qū)分開的，若二者存在重疊，將與"參考基因恒定表達"這一實時定量 基本假設(shè)矛盾，直接影響后期定量的準確性。此外，外源基因長度也不能太長，否則影響環(huán) 化效率?？紤]到合成的RNA量較大，且需要經(jīng)常使用，本發(fā)明實施例將RNA對應(yīng)的DNA序列 轉(zhuǎn)入質(zhì)粒中，質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，隨著大腸桿菌增殖而增殖質(zhì)粒，同時，增加了相應(yīng)的DNA 的量，從而靈活獲得大量DNA序列。再通過體外轉(zhuǎn)錄，將質(zhì)粒DNA變?yōu)镽NA。為此，在DNA前 端設(shè)計了體外轉(zhuǎn)錄啟動子序列。轉(zhuǎn)錄成的RNA需要純化，為了實現(xiàn)這一目的，又在DNA的未 端設(shè)計了寡聚T，轉(zhuǎn)錄后形成寡聚A尾巴，寡聚A可用于純化RNA。合成的外源RNA是線狀， 需要環(huán)化后才能成為環(huán)狀RNA。由于合成時的RNA的5'端為三磷酸基團，而連接時，需要的 是單磷酸基團，為此，去掉了外源RNA的三磷酸基團后，再加上單磷酸基團這一步，從而合 成能夠環(huán)化成環(huán)的前體RNA的狀態(tài)，最終將該RNA的首尾連接，閉合成環(huán)，制備成為外源環(huán) 狀RNA分子。將制備的外源環(huán)狀RNA加入待檢樣本的總RNA中，并與待檢樣本的總RNA- 同進行擴增，因而，可以作為內(nèi)源環(huán)狀RNA的參考基因，用于衡量內(nèi)源環(huán)狀RNA的表達量，從 而用于內(nèi)源環(huán)狀RNA定量檢測。
[0076] 實施例二
[0077] 本發(fā)明實施例提供了一種定量檢測環(huán)狀RNA的方法，如圖2所示，該方法包括：
[0078] 步驟100 :采用本發(fā)明實施例一提供的方法制備外源環(huán)狀RNA。
[0079] 步驟200 :對外源環(huán)狀RNA進行質(zhì)量控制。
[0080] 步驟300 :向待檢樣本與對照樣本的總RNA中加入外源環(huán)狀RNA，總RNA與外源環(huán) 狀RNA的質(zhì)量比為2000:1，得到外源環(huán)狀RNA與總RNA的混合物。
[0081] 步驟400 :利用實時定量PCR方法分別檢測外源環(huán)狀RNA與總RNA的混合物中的 目標環(huán)狀RNA和外源環(huán)狀RNA的含量。
[0082] 步驟500 :以外源環(huán)狀RNA為參考基因，確定待檢樣本中的目標環(huán)狀RNA的相對表 達量。
[0083] 其中，本發(fā)明實施例提供的待測樣本是在實時定量PCR檢測中需要檢測表達變化 的樣本，對照樣本是實時定量PCR檢測待測樣本中基因表達變化時的參照樣本。
[0084] 在前期研究中，利用高通量測序的方式發(fā)現(xiàn)在萊茵衣藻中一個表達量較高的環(huán)狀 RNA，命名為環(huán)狀cRNA006,CRNA006的線性序列如序列表中SEQIDN0:8所示，將線性的CRNA006的5'端與3'端首尾相連，便形成了環(huán)狀CRNA006。通過高通量測序等技術(shù)分析表 明：與正常生長條件（對照樣本：生長溫度為25°C)比較，萊茵衣藻在低溫生長條件下（待 測樣本：生長溫度為5°C，且待測樣本與對照樣本的其他條件均相同），環(huán)狀CRNA006的表達 量下降了 2倍以上，表明CRNA006是一個低溫響應(yīng)的環(huán)狀RNA分子，可能具有耐冷的生物學(xué) 功能，值得進一步研究，因而，需要進一步確認其表達變化趨勢。本實施例利用所制備的外 源環(huán)狀RNA為參考基因，驗證了CRNA006在低溫條件下的下調(diào)表達趨勢。
[0085] 步驟200 :對外源環(huán)狀RNA進行質(zhì)量控制，包括：
[0086] 1、利用隨機引物對合成的外源環(huán)狀RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，合成外源cDNA，具體地，利用 分光光度計（美國Quawell公司生產(chǎn)，型號為Q5000)中RNA定量程序，測定并獲得純化的 外源環(huán)狀RNA的質(zhì)量濃度，本實施例提供的外源環(huán)狀RNA的質(zhì)量濃度為355ng/iil。
[0087] 取獲得純化的外源環(huán)狀RNA0. 5iig，與下列成分混合：5ill濃度為1iiM的6堿 基隨機逆轉(zhuǎn)錄引物（由生工生物工程（上海）股份有限公司合成）、2ul濃度為10mM的 dNTP、20U的逆轉(zhuǎn)錄酶（美國Invitrigen公司生產(chǎn)，貨號為18064-014)、5iil濃度為lOOmM 的DL-二硫蘇糖醇（DL-Dithiothreitol，DTT，隨逆轉(zhuǎn)錄酶一起由美國Invitrigen公司提 供）和10li1 5X逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液（隨逆轉(zhuǎn)錄酶一起由美國Invitrigen公司提供），用 水補足50yl混勻后，經(jīng)42°C保溫2小時，75°C保溫15分鐘，使酶失活，合成外源cDNA。
[0088] 2、利用第一引物和第二引物分別對外源線性cDNA和外源環(huán)狀cDNA進行實時定量 PCR擴增，并分別獲得CT1值和CT2值，第一引物包括如序列表中SEQIDN0:2所示的第一 正向引物和如序列表中SEQIDN0:3所示的第一反向引物，所述第二引物包括如序列表中 SEQIDN0:4所示的第二正向引物和如序列表中SEQIDN0:5所示的第二反向引物；其中， 第一引物的擴增產(chǎn)物不跨越外源環(huán)狀RNA的環(huán)化連接點，使得該第一引物既可擴增外源線 性cDNA，又可擴增外源環(huán)狀cDNA;第二引物或其擴增產(chǎn)物均跨越外源環(huán)狀RNA的環(huán)化連接 點，使得該第二引物只能擴增外源環(huán)狀cDNA。實時定量PCR包括兩類擴增，一類利用第一 引物擴增，另一類利用第二引物擴增，兩類擴增平行進行，除引物不同外，其他所有其它反 應(yīng)成份與條件均相同。具體擴增過程如下：取2ill上述外源cDNA、3ill濃度為1iiM的第 一引物、10111定量？〇?混合物（由！'〇7〇13〇公司生產(chǎn)，貨號為0?5-201)和0.411150倍的 R0X熒光校正染料（由Toyobo公司隨QPS-201 -起提供）混合均勻后，經(jīng)短暫離心，在ABI StepOne實時定量PCR儀中按如下擴增程序進行實時定量PCR擴增：95°C20秒；95°C3秒， 60°C20秒，后二步（95°C3秒，60°C20秒）共40個循環(huán)，在每一次循環(huán)的最后一步收集熒 光信號，該熒光信號的強弱用于衡量表達量的多少。
[0089] 3、通過CT1值和CT2值以及公式

【權(quán)利要求】
1. 一種制備外源環(huán)狀RNA的方法，其特征在于，所述方法包括： 選擇外源線性RNA基因； 將所述外源線性RNA基因克隆到原核表達載體中，獲得克隆的外源線性RNA基因； 將所述克隆的外源線性RNA基因在體外轉(zhuǎn)錄，合成外源線性RNA ; 去除所述外源線性RNA的5'端的三磷酸結(jié)構(gòu)，并在所述外源線性RNA的5'端合成羥 基； 對5'端為羥基的所述外源線性RNA進行磷酸化修飾，合成5'端經(jīng)磷酸化修飾的所述 外源線性RNA ; 將所述5'端經(jīng)磷酸化修飾的外源線性RNA的5'端和3'端連接，合成外源環(huán)狀RNA ; 切掉未環(huán)化成功的所述外源線性RNA，得到外源環(huán)狀RNA。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源線性RNA基因?qū)?yīng)的DNA序列如 序列表SEQ ID NO: 1所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，采用RNA酶R切掉未環(huán)化成功的所述外源 線性RNA。
4. 一種定量檢測內(nèi)源環(huán)狀RNA的方法，其特征在于，所述方法包括： 采用如權(quán)利要求1-3任一項所述的方法制備外源環(huán)狀RNA ; 對所述外源環(huán)狀RNA進行質(zhì)量控制； 向待檢樣本和對照樣本的總RNA中加入所述外源環(huán)狀RNA，所述總RNA與所述外源環(huán)狀 RNA的質(zhì)量比為2000:1，得到所述外源環(huán)狀RNA與所述總RNA的混合物； 利用實時定量PCR方法分別檢測所述外源環(huán)狀RNA與所述總RNA的混合物中的目標環(huán) 狀RNA和所述外源環(huán)狀RNA的含量； 以所述外源環(huán)狀RNA為參考基因，確定所述待檢樣本中所述目標環(huán)狀RNA的表達量。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述對所述外源環(huán)狀RNA進行質(zhì)量控制包 括： 利用隨機引物對合成的所述外源環(huán)狀RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，合成外源cDNA ; 利用第一引物和第二引物分別對所述外源線性cDNA和所述外源環(huán)狀cDNA進行實時定 量PCR擴增，分別獲得CTl值和CT2值，所述第一引物包括如序列表中SEQ ID NO: 2所示的 第一正向引物和如序列表中SEQ ID N0:3所示的第一反向引物，所述第二引物包括如序列 表中SEQ ID N0:4所示的第二正向引物和如序列表中SEQ ID N0:5所示的第二反向引物； 通過CtI值和CT2值以及公式( H] X丨〇〇%,計算合成的所述外源環(huán)狀RNA的環(huán)化 比例，并選用環(huán)化比例超過90%的所述外源環(huán)狀RNA。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，向所述待檢樣本和所述對照樣本的所述 總RNA中加入所述外源環(huán)狀RNA，所述總RNA與所述外源環(huán)狀RNA的質(zhì)量比為2000:1，得到 所述外源環(huán)狀RNA與所述總RNA的混合物，包括： 提取并純化所述待檢樣本與所述對照樣本的總RNA ; 測量純化后的所述總RNA的質(zhì)量濃度； 根據(jù)所述待檢樣本和所述對照樣本的總RNA的質(zhì)量濃度按照所述總RNA與所述外源環(huán) 狀RNA的質(zhì)量比為2000:1的比例與所述外源環(huán)狀RNA混合，得到所述外源環(huán)狀RNA與所述 總RNA的混合物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，利用分光光度計測量所述待檢樣本與所 述對照樣本的總RNA的質(zhì)量濃度。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述利用實時定量PCR方法分別檢測所 述外源環(huán)狀RNA與所述總RNA的混合物中的目標環(huán)狀RNA和所述外源環(huán)狀RNA的含量，包 括： 利用所述隨機引物對加入了所述外源環(huán)狀RNA的所述總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，得到逆轉(zhuǎn)錄 產(chǎn)物，所述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物包括目標環(huán)狀cDNA和所述外源環(huán)狀cDNA ; 利用第三引物分別對所述待測樣本與所述對照樣本的所述目標環(huán)狀cDNA進行定量 PCR檢測，擴增后分別獲得CT3值和CT4值，利用所述第二引物分別對所述待測樣本與所述 對照樣本的所述外源環(huán)狀cDNA進行定量PCR檢測，擴增后分別獲得CT5值和CT6值； 所述第三引物與所述第二引物的擴增產(chǎn)物均跨越了環(huán)狀RNA的環(huán)化結(jié)點。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，根據(jù)公式2[eT3+〇r6_eT5_eT4]x 1〇〇%，計算 所述待檢樣本中的所述目標環(huán)狀RNA的相對表達量。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述實時定量PCR的擴增程序為： 95°C 20 秒；95°C 3 秒，60°C 20 秒，共 40 個循環(huán)。
【文檔編號】C12N15/10GK104328112SQ201410604749
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月31日
【發(fā)明者】彭海, 李利利, 陳利紅, 高利芬, 張繼, 方治偉, 章偉雄, 盧龍, 李甜甜, 周俊飛 申請人:江漢大學(xué)