高產(chǎn)吲哚-3-乙酸的重組細(xì)胞及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了高產(chǎn)吲哚-3-乙酸的重組細(xì)胞及其構(gòu)建方法。采用本申請(qǐng)的重組細(xì)胞的構(gòu)建方法構(gòu)建的重組解淀粉芽孢桿菌菌株SQR9-E和重組枯草芽孢桿菌菌株168-E均能夠表達(dá)出吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A、吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B和吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C這三種蛋白質(zhì)。重組菌株SQR9-E和168-E中吲哚-3-乙酸的產(chǎn)量均高于每株菌株的對(duì)照。本發(fā)明的高產(chǎn)吲哚-3-乙酸的重組細(xì)胞及其構(gòu)建方法可以有效提高重組菌株中吲哚-3-乙酸的產(chǎn)量，可廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域。
【專利說(shuō)明】高產(chǎn)吲哚-3-乙酸的重組細(xì)胞及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】中高產(chǎn)吲哚-3-乙酸的重組細(xì)胞及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 卩引哚-3-乙酸（Indole-3-acetic acid,簡(jiǎn)稱IAA)是一類含有一個(gè)不飽和芳香族 環(huán)和一個(gè)乙酸側(cè)鏈的內(nèi)源激素，屬吲哚類化合物，又名茁長(zhǎng)素、生長(zhǎng)素、異生長(zhǎng)素?，F(xiàn)已證 實(shí)，吲哚-3-乙酸存在于細(xì)菌、真菌、藻類和許多高等植物中。在高等植物中，它主要存在 于生長(zhǎng)旺盛的部位，如胚芽鞘、根尖、受精后的子房和幼嫩的種子等。雖然在植物體內(nèi)含量 甚微，但參與了許多生理生化過(guò)程的調(diào)節(jié)與控制，具有十分廣泛的生理作用。從細(xì)胞水平 看，它可以影響細(xì)胞的伸長(zhǎng)、分裂和分化；從器官水平看，它可以影響營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官 的生長(zhǎng)、成熟和衰老。吲哚-3-乙酸的基本作用在于調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)，不僅能促進(jìn)生長(zhǎng)，而 且具有抑制生長(zhǎng)和器官建成的作用。吲哚-3-乙酸在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域具有廣泛的用途，它能 促進(jìn)植物生根，提高農(nóng)作物產(chǎn)量；用于木本和草本植物的扦插（插枝）生根，以加速根的形 成和提高植株生根的百分率。
[0003] 微生物具有體積小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)繁殖快、代謝旺盛等特征，如能得到高效合成 口引哚-3-乙酸的微生物，將為吲哚-3-乙酸的生產(chǎn)提供新的途徑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何利用微生物生物合成吲哚-3-乙酸。
[0005] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了一種重組細(xì)胞的構(gòu)建方法。
[0006] 本發(fā)明所提供的重組細(xì)胞的構(gòu)建方法，包括向受體細(xì)胞中導(dǎo)入用于生物合成吲 哚-3-乙酸的DNA得到產(chǎn)吲哚-3-乙酸的重組細(xì)胞；所述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA 編碼吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A、吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B和吲哚-3-乙酸合成相關(guān) 蛋白C這三種蛋白質(zhì)；
[0007] 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A為下述Al)或A2)的蛋白質(zhì)：
[0008] Al)氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示的蛋白質(zhì)；
[0009] A2)在Al)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè) 氨基酸殘基得到的具有相同功能的由Al)衍生的蛋白質(zhì)；
[0010] 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B為下述BI)或B2)的蛋白質(zhì)：
[0011] BI)氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示的蛋白質(zhì)；
[0012] B2)在BI)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè) 氨基酸殘基得到的具有相同功能的由BI)衍生的蛋白質(zhì)；
[0013] 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C為下述Cl)或C2)的蛋白質(zhì)：
[0014] Cl)氨基酸序列如SEQ ID No. 5所示的蛋白質(zhì)；
[0015] C2)在Cl)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè) 氨基酸殘基得到的具有相同功能的由Cl)衍生的蛋白質(zhì)；
[0016] 所述受體細(xì)胞為微生物細(xì)胞、非人動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。
[0017] 所述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA，由吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1、吲 哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3連接而成；所述吲哚-3-乙酸 合成相關(guān)基因1編碼所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A ;所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因 2編碼所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B ;所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3編碼所述吲 哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C。
[0018] 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1為如下All)或A12)或A13)所示的核酸分子：
[0019] All)其編碼序列是SEQ ID No. 1的第1-1164位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分 子；
[0020] A12)與All)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼所述吲 哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A的cDNA分子或基因組DNA分子；
[0021] A13)在嚴(yán)格條件下與All)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述吲哚-3-乙酸合成 相關(guān)蛋白A的cDNA分子或基因組DNA分子；
[0022] 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2為如下B11)或B12)或B13)所示的核酸分子：
[0023] BI 1)其編碼序列是SEQ ID No. 1的第1165-2586位核苷酸所示的DNA分子或cDNA 分子；
[0024] B12)與B11)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼所述吲 哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B的cDNA分子或基因組DNA分子；
[0025] B13)在嚴(yán)格條件下與B11)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述吲哚-3-乙酸合成 相關(guān)蛋白B的cDNA分子或基因組DNA分子；
[0026] 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3為如下C11)或C12)或C13)所示的核酸分子：
[0027] Cl 1)其編碼序列是SEQ ID No. 1的第2587-4074位核苷酸所示的DNA分子或cDNA 分子；
[0028] C12)與C11)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼所述吲 哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C的cDNA分子或基因組DNA分子；
[0029] C13)在嚴(yán)格條件下與C11)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述吲哚-3-乙酸合成 相關(guān)蛋白C的cDNA分子或基因組DNA分子。
[0030] 所述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA為如下Dl)或D2)或D3)所示的核酸分 子：
[0031] Dl)核苷酸序列是SEQ ID No. 1的DNA分子或cDNA分子；
[0032] D2)與Dl)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼所述的吲 哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A、所述的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B和所述的吲哚-3-乙酸合 成相關(guān)蛋白C這三種蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子；
[0033] D3)在嚴(yán)格條件下與Dl)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述的吲哚-3-乙酸合 成相關(guān)蛋白A、所述的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B和所述的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C 這三種蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子。
[0034] 上述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采 用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法，對(duì)本發(fā)明的用于生物合成吲哚-3-乙酸的 DNA的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過(guò)人工修飾的，與本發(fā)明分離得到的用于生物合成吲 哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列具有75%或者更高同一性且編碼所述吲哚-3-乙酸合成相 關(guān)蛋白A、所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B和所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C這三種蛋 白質(zhì)，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。
[0035] 這里使用的術(shù)語(yǔ)"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本 發(fā)明的SEQ ID No. 1具有75%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一 性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多 個(gè)序列之間的同一性可以用百分比（％)表示，其可以用來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。
[0036] 上述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA，所述嚴(yán)格條件是在2 X SSC，0. 1% SDS的 溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0. 5 X SSC，0. 1 % SDS的溶液中，在68°C 下雜交并洗膜2次，每次15min。
[0037] 上述75%或75%以上同一性，可為80%、85%、90%或95%以上的同一性。
[0038] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了一種重組細(xì)胞的構(gòu)建方法。
[0039] 本發(fā)明所提供的重組細(xì)胞的構(gòu)建方法，包括對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行SI)、S2)和S3)的改 造得到高產(chǎn)吲哚-3-乙酸的重組細(xì)胞的步驟：
[0040] SI)向所述受體細(xì)胞中導(dǎo)入所述的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1 ;
[0041] S2)向所述受體細(xì)胞中導(dǎo)入所述的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2 ;
[0042] S3)向所述受體細(xì)胞中導(dǎo)入所述的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3。
[0043] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方 法，對(duì)本發(fā)明的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1或吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2或吲哚-3-乙 酸合成相關(guān)基因3的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過(guò)人工修飾的，與本發(fā)明分離得到的 吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1的核苷酸序列具有75%或者更高同一性且編碼所述的吲 哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A，或與吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2的核苷酸序列具有75%或 者更高同一性且編碼所述的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B，或與吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基 因3的核苷酸序列具有75%或者更高同一性且編碼所述的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C， 均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。
[0044] 這里使用的術(shù)語(yǔ)"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本發(fā) 明的SEQ ID No. 1的第1-1164位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75%或更高，或 85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列；與本發(fā)明的SEQID No. 1 的第1165-2586位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75 %或更高，或85 %或更高，或 90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列；與本發(fā)明的SEQ ID No. 1的第2587-4074 位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或 95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī) 軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比（％)表示，其可以用來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)序列之 間的同一'I"生。
[0045] 所述嚴(yán)格條件是在2XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次，每次 5min，又于0. 5 X SSC，0. 1 % SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次，每次15min。
[0046] 上述75%或75%以上同一性，可為80%、85%、90%或95%以上的同一性。
[0047] 上文中，所述微生物可為細(xì)菌。所述細(xì)菌可為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì) 菌。所述革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌可為芽孢桿菌屬細(xì)菌。所述革蘭氏陰性細(xì)菌可為埃希氏菌屬細(xì) 菌。進(jìn)一步所述芽孢桿菌屬細(xì)菌為解淀粉芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌。所述埃希氏菌屬細(xì)菌 可為大腸桿菌（Escherichia coli)。所述解淀粉芽孢桿菌可為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens) SQR9、枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis) 168 和所述大腸桿菌 (Escherichia coli)可為大腸桿菌（Escherichia coli)BL21〇
[0048] 由上述重組細(xì)胞的構(gòu)建方法構(gòu)建的重組細(xì)胞也屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0049] 上述重組細(xì)胞的構(gòu)建方法和上述重組細(xì)胞在生物合成吲哚-3-乙酸中的應(yīng)用也 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0050] 所述應(yīng)用中，所述重組細(xì)胞以色氨酸為底物生產(chǎn)吲哚-3-乙酸。
[0051] 實(shí)驗(yàn)證明，采用本申請(qǐng)的重組細(xì)胞的構(gòu)建方法構(gòu)建的重組解淀粉芽孢桿菌菌 株SQR9-E和重組枯草芽孢桿菌菌株168-E均能夠表達(dá)吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A、吲 哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B和吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C這三種蛋白質(zhì)。SQR9-E菌株的 吲哚-3-乙酸的產(chǎn)量是其受體菌株SQR9菌株的4. 2倍，是空載體對(duì)照菌株SQR9-CK菌株的 4倍（SQR9-E菌株的吲哚-3-乙酸產(chǎn)量為42±2. 41mg/L發(fā)酵液，SQR9菌株的吲哚-3-乙 酸產(chǎn)量為9. 8 ± I. 31mg/L發(fā)酵液，SQR9-CK菌株的吲哚-3-乙酸產(chǎn)量為10. 5 ± I. 08mg/L發(fā) 酵液）；168-E菌株的吲哚-3-乙酸的產(chǎn)量是其受體菌株168菌株的10倍，是空載體對(duì)照 菌株168-CK菌株的10倍（168-E菌株的吲哚-3-乙酸產(chǎn)量為22±2. 32mg/L發(fā)酵液，168 菌株的吲哚-3-乙酸產(chǎn)量為2. 2±0. 30mg/L發(fā)酵液，168-CK菌株的吲哚-3-乙酸產(chǎn)量為 2. 2±0. 26mg/L發(fā)酵液）。本發(fā)明的高產(chǎn)吲哚-3-乙酸的重組細(xì)胞及其構(gòu)建方法可以有效 提高重組菌株中吲哚-3-乙酸的產(chǎn)量，可廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0052] 圖1為重組載體pUBC19-P43-E示意圖。
[0053] 圖2為重組菌株蛋白差異分析的變性聚丙烯酰胺凝膠。泳道1和泳道8為蛋白分 子量標(biāo)準(zhǔn)15-170KDa的Ladder，泳道2為168-CK菌株蛋白條帶，泳道3為168-E菌株蛋白 條帶，泳道4為BL21-CK菌株蛋白條帶，泳道5為BL21-E菌株蛋白條帶，泳道6為SQR9-CK 菌株蛋白條帶，泳道7為SQR9-E菌株蛋白條帶。

【具體實(shí)施方式】
[0054] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0055] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0056] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0057] 下述實(shí)施例中的解淀粉芽抱桿菌 SQR9 (Bacillus amyloliquefaciens SQR9) (Xu Z，Shao J，Li B，Yan X，Shen Q，Zhang R. 2013. Contribution of Baci llomycin D in Bacillus amyloliquefaciens SQR9 to Antifungal Activity and Biofilm Formation. Appl. Environ. Microbiol. 79:808 - 815.)公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃 研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。解淀粉 芽抱桿菌 SQR9(Bacillus amyloliquefaciens SQR9)在下文中簡(jiǎn)稱 SQR9。
[0058] 下述實(shí)施例中的枯草芽抱桿菌168 (Bacillus subtilis 168) (Kunst F,Ogasawara N,Moszer I,etal.1997.The complete genome sequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis. Nature 390:249 - 256.)公眾可從中國(guó)農(nóng) 業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用， 不可作為其它用途使用?？莶菅挎邨U菌168(Bacillus subtilis 168)在下文中簡(jiǎn)稱168。
[0059] 下述實(shí)施例中的 pUBC19 (Zhang X-Z，Cui Z-L，Hong Q, Li S-P. 2005. High-Level Expression and Secretion of Methyl Parathion Hydrolase in Bacillus subtilis WB800.Appl. Environ. Microbiol. 71:4101 - 4103.)公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與 農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使 用。
[0060] 實(shí)施例1、生物合成吲哚-3-乙酸
[0061] 一、高產(chǎn)吲哚-3-乙酸的重組菌體細(xì)胞的制備
[0062] 高產(chǎn)吲哚-3-乙酸的重組菌體細(xì)胞的構(gòu)建方法，包括向受體細(xì)胞中導(dǎo)入用于生物 合成吲哚-3-乙酸的DNA，得到產(chǎn)吲哚-3-乙酸的重組菌體細(xì)胞的步驟。其中，用于生物合 成吲哚-3-乙酸的DNA，由吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1、吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和 吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3連接而成；用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列 為序列表中SEQ ID No. 1。具體方法如下：
[0063] 將pUBC19載體的BamHI和PstI識(shí)別位點(diǎn)間的序列替換為SEQ ID No. 2所示的 P43啟動(dòng)子的核苷酸序列保持其它序列不變，得到重組載體pUBC19-P43。
[0064] 將重組載體PUBC19-P43的KpnI和PstI識(shí)別位點(diǎn)間的序列替換為SEQ ID No. 1 所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列，保持其它序列不變，得到重組載體 PUBC19-P43-E (圖1)。pUBC19-P43-E可表達(dá)SEQ ID No. 3所示的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋 白A、SEQ ID No. 4所示的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B和SEQ ID No. 5所示的吲哚-3-乙 酸合成相關(guān)蛋白C這三種蛋白質(zhì)。SEQ ID No. 1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA 編碼SEQ ID No. 3所示的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A、SEQ ID No. 4所示的吲哚-3-乙酸 合成相關(guān)蛋白B和SEQ ID No. 5所示的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C這三種蛋白質(zhì)。SEQ ID No. 1中，第1-1164位為吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A的編碼序列，第1165-2586位為 吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B的編碼序列，第2587-4074位為吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白 C的編碼序列。
[0065] 采用化學(xué)方法將PUBC19-P43-E導(dǎo)入解淀粉芽孢桿菌SQR9菌株中，得到含有SEQ ID No. 1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重組菌株，將該菌株命名 為重組解淀粉芽孢桿菌SQR9-E(下文中簡(jiǎn)稱SQR9-E菌株）；將pUBC19-P43-E導(dǎo)入枯草芽 孢桿菌168菌株中，得到含有SEQ ID No. 1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核 苷酸序列的重組菌株，將該菌株命名為重組枯草芽孢桿菌168-E (下文中簡(jiǎn)稱168-E菌株）； 將PUBC19-P43-E導(dǎo)入大腸桿菌BL21菌株中，得到含有SEQ ID No. 1所示的用于生物合成吲 哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重組菌株，將該菌株命名為重組大腸桿菌BL21-E (下文 中簡(jiǎn)稱BL21-E菌株）；將pUBC19-P43導(dǎo)入解淀粉芽孢桿菌SQR9菌株中，得到不含有SEQ ID No. 1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重組菌株，將該菌株命名為 重組解淀粉芽孢桿菌SQR9-CK (下文中簡(jiǎn)稱SQR9-CK菌株），該菌株是SQR9-E的空載體對(duì)照 菌株；將PUBC19-P43導(dǎo)入枯草芽孢桿菌168菌株中，得到不含有SEQ ID No. 1所示的用于生 物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重組菌株，將該菌株命名為重組枯草芽孢桿菌 168-CK (下文中簡(jiǎn)稱168-CK菌株），該菌株是168-E的空載體對(duì)照菌株；將pUBC19-P43導(dǎo)入 大腸桿菌BL21菌株中，得到不含有SEQ ID No. 1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA 的核苷酸序列的重組菌株，將該菌株命名為重組大腸桿菌BL21-CK(下文中簡(jiǎn)稱BL21-CK菌 株），該菌株是BL21-CK的空載體對(duì)照菌株。
[0066] 二、用于生物合成吲哚-3-乙酸的成套蛋白質(zhì)的提取及分析
[0067] 1、不同處理的菌體細(xì)胞收集
[0068] 將步驟一的 BL21-CK、BL21-E、168-CK、168-E、SQR9-CK 和 SQR-E 菌株分別接種于含 有3mL液體LB培養(yǎng)基的試管（卡那霉素的濃度為20 μ g/mL)中，過(guò)夜培養(yǎng)作為種子液，分 別得到BL21-CK、BL21-E、168-CK、168-E、SQR9-CK和SQR-E菌株的種子液。將上述種子液 分別以1 %體積比的接種量接種于IOOmL含3mM色氨酸的Landy培養(yǎng)基（在Landy培養(yǎng)基 中加入色氨酸，使色氨酸的含量為3mM得到的液體即為含3mM色氨酸的Landy培養(yǎng)基）中 (Landy M, Warren GH, RosenmanM SB, Colio LG. 1948. Bacillomycin:an antibiotic from Bacillus subtilis active against pathogenic Fungi. Exp. Biol. Med. 67:539-541.), 22°C，90rpm避光培養(yǎng)72小時(shí)后在4°C，8000g離心收集菌體，分別得到BL21-CK、BL21-E、 168-CK、168-E、SQR9-CK 和 SQR-E 菌株的菌體。
[0069] 2、用于生物合成吲哚-3-乙酸的成套蛋白質(zhì)的提取
[0070] 將收集到的菌體用0· 2M pH 6. 8磷酸緩沖液洗滌，4°C，8000g離心IOmin收集菌 體，共進(jìn)行上述操作三次。將收集到的菌體采用B-PER?: Bacteria Protein Extraction Reagent (Thermo Scientific)試劑盒提取菌體蛋白。具體流程如下：離心沉淀的菌體用IOmL B-PER Reagent重懸，并且加入2 μ L 100mg/mL溶菌酶；其中BL21-CK和BL21-E菌體置于 室溫反應(yīng)l〇_15min，得到BL21-CK菌體裂解液和BL21-E菌體裂解液；SQR9-CK、SQR9-E、 168-CK和168-E菌株置于室溫反應(yīng)45min，得到SQR9-CK菌體裂解液、SQR9-E菌體裂解液、 168-CK菌體裂解液和168-E菌體裂解液，將各裂解液15000g離心5min，所獲上清液即為 菌株的蛋白粗提液，獲得BL21-CK蛋白粗提液、BL21-E蛋白粗提液、SQR9-CK蛋白粗提液、 SQR9-E蛋白粗提液、168-CK蛋白粗提液和168-E蛋白粗提液。將各菌株的蛋白粗提液置 于-70°C冰箱中保存。
[0071] 3、BCA法測(cè)定蛋白總量
[0072] 蛋白定量采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司），具體 流程如下：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的數(shù)量，將試劑A (BCA堿性溶液）和試劑B (硫酸銅溶液）以 50:1(￥八）的比例混合配制此六工作液；將0、1、2、4、6、8、1(^1^的標(biāo)準(zhǔn)85六蛋白溶液（11^/ mL)分別加入96孔板的不同孔中，并加 CldH2O使得每孔的體積為10 μ L，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè) 復(fù)孔。分別取10 μ L稀釋的待測(cè)蛋白樣品加入96孔板的不同孔中，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。 向BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測(cè)樣品孔中每孔分別加入200 μ L配置好的BCA工作液，充分混勻 后于37 C反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后將96孔板冷卻至室溫，米用酶標(biāo)僅測(cè)定各樣品的吸光度 OD562。以BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度值作為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn) 曲線，計(jì)算各樣品的蛋白質(zhì)含量。
[0073] 4、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)
[0074] SDS-PAGE凝膠制備：先灌制濃度為10 %的分離膠，濃度為10 %的分離膠包含 5. 3mL30 % Acr/Bis(29:l)貯存液、4. OmL 下層緩沖液、0· 8mL 10 % APS、0. 008mL TEMED 和6. 7mL去離子水，分離膠灌好后置于37°C凝固30min ;待分離膠凝固后灌制濃度為5% 的濃縮膠，濃度為5 %的濃縮膠包含0. 75mL 30 % Acr/Bis (29:1)貯存液、I. 25mL上層緩 沖液、0. 015mL 10% APS、0. 005mL TEMED和3. OmL去離子水，濃縮膠灌好后置于室溫凝結(jié) 15_20min〇
[0075] 在電泳槽內(nèi)加入新鮮配置的IX電極緩沖液。根據(jù)待測(cè)蛋白濃度取適量的待測(cè)蛋 白樣品，加入10 μ L樣品緩沖液混合均勻，然后去離子水補(bǔ)齊至30 μ L，各個(gè)樣品的蛋白質(zhì) 質(zhì)量濃度均相同，將樣品進(jìn)行沸水浴5min，HOOOrpm離心5min后上樣，每個(gè)泳道的上樣體 積均相同。首先采用80V的電壓使樣品先從濃縮膠遷移至分離膠，隨后采用100V的電壓使 得樣品跑至分離膠底部。
[0076] 凝膠的染色及脫色：電泳結(jié)束后，將凝膠從玻璃板上輕輕撥下，放入已加入適量固 定液的干凈玻璃皿內(nèi)，固定30min，固定結(jié)束后倒出固定液加入適量考馬氏亮藍(lán)R-250染色 液，震蕩染色I(xiàn)h,然后倒出染色液加入脫色液進(jìn)行震蕩脫色,每隔IOmin更換脫色液，重復(fù) 脫色洗脫四次，之后加脫色液連續(xù)脫色4-8h，期間更換脫色液3-4次，脫色完全后進(jìn)行掃描 拍照。
[0077] 卩引哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A的分子量為43KDa，吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B的 分子量為53KDa和卩引哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C的分子量為54KDa，圖2中顯不含有用于 生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重組菌株BL21-E、SQR9-E和168-E均能夠 表達(dá)出吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A、吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B和吲哚-3-乙酸合成 相關(guān)蛋白C。相對(duì)于不含有用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重組菌株， 含有用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重組菌株BL21-E、SQR9-E和168-E 表達(dá)出的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A、吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B和吲哚-3-乙酸合 成相關(guān)蛋白C的含量均明顯增多，168-E菌株蛋白條帶中在約43KDa處明顯比168-CK菌株 增強(qiáng)，而由于菌株在55KDa大小的蛋白很多，只能推測(cè)168-E菌株與168-CK菌株相比能更 多的表達(dá)55KDa左右的蛋白；與BL21-CK菌株相比，在菌株BL21-E蛋白條帶中能清晰分辨 出在43KDa、54KDa和53KDa大小處條帶增強(qiáng)；在SQR9-E菌株蛋白條帶中可清晰分辨出在 43KDa、54KDa和53KDa大小處條帶比SQR9-CK菌株蛋白條帶增強(qiáng)。
[0078] 三、吲哚-3-乙酸產(chǎn)量檢測(cè)
[0079] 將SQR9菌株、SQR9-E菌株、SQR9-CK菌株、168菌株、168-E菌株和168-CK菌株分 別接種于含有3mL液體LB培養(yǎng)基的試管（卡那霉素的濃度為20 μ g/mL)中，過(guò)夜培養(yǎng)作為 種子液，分別得到SQR9菌株、SQR9-E菌株、SQR9-CK菌株、168菌株、168-E菌株和168-CK菌 株的種子液。將上述種子液分別以1 %體積比的接種量接種于IOOmL含3mM色氨酸的Landy 培養(yǎng)基（在Landy培養(yǎng)基中加入色氨酸，使色氨酸的含量為3mM得到的液體即為含3mM色 氨酸的Landy培養(yǎng)基）中，SQR9菌株、SQR9-E菌株和SQR9-CK菌株的接種量以菌體含量計(jì) 相同，168菌株、168-E菌株和168-CK菌株的接種量以菌體含量計(jì)相同。在22°C，90rpm避 光培養(yǎng)72小時(shí)，分別得到SQR9-E菌株、SQR9-CK菌株、168-E菌株和168-CK菌株的發(fā)酵液。 實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，每次重復(fù)每個(gè)菌株均接入10個(gè)裝有IOOmL含3mM色氨酸的Landy培養(yǎng)基 的容積為500mL三角瓶在上述條件下進(jìn)行發(fā)酵。
[0080] 分別將各菌株的IOOmL發(fā)酵液在4°C，8000rpm離心IOmin去除菌體細(xì)胞，收集 SQR9菌株、SQR9-E菌株、SQR9-CK菌株、168菌株、168-E菌株和168-CK菌株的上清液。將 各菌株的上清液分別倒入不同的無(wú)菌三角瓶中，用2M HCl溶液調(diào)節(jié)各菌株的上清液pH值 至2. 0,然后加入與上述三角瓶中等體積的乙酸乙酯萃取三次，萃取結(jié)束后8000rpm，4°C離 心lOmin，將各菌株的乙酸乙酯相37°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)獲得旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的樣品。將各菌株的旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)后的樣品分別用ImL甲醇溶解，過(guò)0.22 μ m濾膜，放入-20°C冰箱保存。甲醇溶解的樣 品采用HPLC進(jìn)行定量分析，HPLC的分析條件為：采用AgilentTC-C18色譜柱，柱溫25°C，流 動(dòng)相為A(甲醇）和B(0. 1%乙酸）的體積比為60 :40,進(jìn)樣量為IOyL,流速為0. 4mL/min， 紫外吸收波長(zhǎng)為220nm。HPLC分析中，以吲哚-3-乙酸（Sigma，CAS N0:87-51-4)為標(biāo)準(zhǔn) 品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間定性和采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法（外標(biāo)法）進(jìn)行定量分析。
[0081] 試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)采用SPSS 12. 0 (SPSS Inc.，USA)統(tǒng)計(jì)軟件的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)處理統(tǒng) 計(jì)。
[0082] 不同菌株的吲哚-3-乙酸產(chǎn)量如表1，結(jié)果表明含有用于生物合成吲哚-3-乙酸 的DNA的核苷酸序列的重組菌株SQR9-E和168-E中吲哚-3-乙酸的產(chǎn)量均高于每株相應(yīng) 的受體菌株和空載體對(duì)照菌株。SQR9-E菌株的吲哚-3-乙酸產(chǎn)量是SQR9菌株的4. 2倍， 是SQR9-CK菌株的4倍（SQR9-E菌株的吲哚-3-乙酸產(chǎn)量為42±2. 41mg/L發(fā)酵液，SQR9 菌株的吲哚-3-乙酸產(chǎn)量為9.8±1.31mg/L發(fā)酵液，SQR9-CK菌株的吲哚-3-乙酸產(chǎn)量 為10. 5±1.08mg/L發(fā)酵液）；168-E菌株合成吲哚-3-乙酸的產(chǎn)量是168菌株的10倍， 是168-CK菌株的10倍（168-E菌株的吲哚-3-乙酸產(chǎn)量為22±2. 32mg/L發(fā)酵液，168 菌株的吲哚-3-乙酸產(chǎn)量為2. 2±0. 30mg/L發(fā)酵液，168-CK菌株的吲哚-3-乙酸產(chǎn)量為 2.2±0.2611^/1發(fā)酵液）。
[0083] 表1、各菌株的吲哚-3-乙酸產(chǎn)量
[0084]

【權(quán)利要求】
1. 重組細(xì)胞的構(gòu)建方法，包括向受體細(xì)胞中導(dǎo)入用于制備吲哚-3-乙酸的DNA得到高 產(chǎn)吲哚-3-乙酸的重組細(xì)胞；所述用于制備吲哚-3-乙酸的DNA編碼吲哚-3-乙酸合成相 關(guān)蛋白A、吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B和吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C這三種蛋白質(zhì)； 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A為下述A1)或A2)的蛋白質(zhì)： A1)氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示的蛋白質(zhì)； A2)在A1)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基 酸殘基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白質(zhì)； 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B為下述B1)或B2)的蛋白質(zhì)： B1)氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示的蛋白質(zhì)； B2)在B1)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基 酸殘基得到的具有相同功能的由B1)衍生的蛋白質(zhì)； 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C為下述C1)或C2)的蛋白質(zhì)： C1)氣基酸序列如SEQ ID No. 5所不的蛋白質(zhì)； C2)在C1)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基 酸殘基得到的具有相同功能的由C1)衍生的蛋白質(zhì)； 所述受體細(xì)胞為微生物細(xì)胞、非人動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述用于制備吲哚-3-乙酸的DNA，由吲 哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1、吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3 連接而成；所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1編碼權(quán)利要求1所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān) 蛋白A ;所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2編碼權(quán)利要求1所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白 B ;所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3編碼權(quán)利要求1所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1為 如下All)或A12)或A13)所示的核酸分子： All)其編碼序列是SEQ ID No. 1的第1-1164位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子； A12)與All)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼所述吲哚-3-乙 酸合成相關(guān)蛋白A的cDNA分子或基因組DNA分子； A13)在嚴(yán)格條件下與All)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān) 蛋白A的cDNA分子或基因組DNA分子； 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2為如下B11)或B12)或B13)所示的核酸分子： B11)其編碼序列是SEQ ID No. 1的第1165-2586位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分 子； B12)與B11)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼所述吲哚-3-乙 酸合成相關(guān)蛋白B的cDNA分子或基因組DNA分子； B13)在嚴(yán)格條件下與B11)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān) 蛋白B的cDNA分子或基因組DNA分子； 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3為如下C11)或C12)或C13)所示的核酸分子： C11)其編碼序列是SEQ ID No. 1的第2587-4074位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分 子； C12)與C11)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼所述吲哚-3-乙 酸合成相關(guān)蛋白C的cDNA分子或基因組DNA分子； C13)在嚴(yán)格條件下與C11)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān) 蛋白C的cDNA分子或基因組DNA分子。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述用于制備吲哚-3-乙酸的 DNA為如下D1)或D2)或D3)所示的核酸分子： D1)核苷酸序列是SEQ ID No. 1的DNA分子或cDNA分子； D2)與D1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼權(quán)利要求1所述的 吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A、權(quán)利要求1所述的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B和權(quán)利要求 1所述的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C這三種蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子； D3)在嚴(yán)格條件下與D1)限定的核苷酸序列雜交，且編碼權(quán)利要求1所述的吲哚-3-乙 酸合成相關(guān)蛋白A、權(quán)利要求1所述的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B和權(quán)利要求1所述的吲 哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C這三種蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子。
5. 重組細(xì)胞的構(gòu)建方法，包括對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行SI)、S2)和S3)的改造得到產(chǎn)吲 哚-3-乙酸的重組細(xì)胞的步驟： 51) 向所述受體細(xì)胞中導(dǎo)入權(quán)利要求2或3所述的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1 ; 52) 向所述受體細(xì)胞中導(dǎo)入權(quán)利要求2或3所述的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2 ; 53) 向所述受體細(xì)胞中導(dǎo)入權(quán)利要求2或3所述的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：所述微生物細(xì)胞為細(xì)菌。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：所述細(xì)菌為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌或革蘭氏陰 性細(xì)菌。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：所述革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌為芽孢桿菌屬細(xì)菌； 進(jìn)一步所述芽孢桿菌屬細(xì)菌為解淀粉芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌；所述革蘭氏陰性細(xì)菌為埃 希氏菌屬細(xì)菌；進(jìn)一步所述埃希氏菌屬細(xì)菌為大腸桿菌。
9. 由權(quán)利要求1至8中任一所述的方法構(gòu)建的重組細(xì)胞。
10. 權(quán)利要求1至8中任一所述的方法在制備吲哚-3-乙酸中的應(yīng)用，或權(quán)利要求9所 述的重組細(xì)胞在制備吲哚-3-乙酸中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104388369SQ201410675072
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月21日
【發(fā)明者】張瑞福, 邵佳慧, 張楠 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所