本發(fā)明涉及真菌發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種富產(chǎn)γ-氨基丁酸的乳酸菌型豆豉的制作方法。

背景技術(shù)：

豆豉是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵豆制品，由于其豐富的營養(yǎng)和獨(dú)特的風(fēng)味深受廣大消費(fèi)者的喜愛；特別是在南方，既可以做菜肴，又可以作為調(diào)味品被廣泛食用。由于豆豉制備過程中的微生物發(fā)酵作用，不僅使得豆豉含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，還在豆豉中形成了豐富的多肽，氨基酸，寡糖，單糖等物質(zhì)，使豆豉更容易被人體吸收，促進(jìn)消化，適合于腸胃吸收障礙的人群、消化能力減退的老人和消化不良的兒童食用。

由于地域差異，制作豆豉所利用的微生物也不盡相同，主要有曲霉型豆豉，如湖南瀏陽豆豉；細(xì)菌型豆豉，如利用納豆芽孢桿菌生產(chǎn)的日本納豆；毛霉型豆豉，如重慶的永川豆豉；根霉型豆豉，如印尼的天培。

傳統(tǒng)的豆豉制作工藝是：黃豆→浸泡→蒸煮→瀝干冷卻→接種→室溫制曲→洗曲、添加輔料→后酵→豆豉→干燥→成品。上述工藝主要是在自然條件下發(fā)酵，使得豆豉制曲時間較長，而且豆豉的生產(chǎn)還受到季節(jié)的限制，大部分豆豉都在氣溫較高的夏季制作，并不能常年生產(chǎn)，因此嚴(yán)重影響了企業(yè)廠房的利用及豆豉的市場供求和生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大，增加了生產(chǎn)成本。

為改善上述問題，利于生產(chǎn)推廣，研究人員從菌種的改良，優(yōu)化工藝方面著手。但是，該工藝普遍采取單菌種制曲來生產(chǎn)豆豉，參與發(fā)酵的微生物較少，分泌的酶種類不全，使得豆豉成品的風(fēng)味不及傳統(tǒng)發(fā)酵的豆豉。例如：

申請公布號為CN103621913A的中國發(fā)明專利申請文獻(xiàn)公開了一種快速高效發(fā)酵保健豆豉的生產(chǎn)工藝，該生產(chǎn)工藝包括以下步驟：將大豆浸泡后混合麩皮，于121℃滅菌30分鐘；熟料冷卻至40℃左右接種三角瓶種曲，30℃培養(yǎng)至熟料表面行成白色即得豆豉曲；將豆豉曲加入10％的鹽水，使豆豉醅的含水量達(dá)到80％～100％，于50℃進(jìn)行高溫發(fā)酵七天后豆豉醅即已成熟；將豆豉醅加入90℃以上熱水保溫2～4小時后過濾得粗醬油，剩余固體為淋油豆豉；將發(fā)酵好的納豆芽胞桿菌液(2000IU/mL以上)按0.1-1％比例加入淋油豆豉中，得基礎(chǔ)豆豉；在基礎(chǔ)豆豉中加入米酒、辣椒、花椒等不同的香辛料，即可得獲得花樣豆豉。

與傳統(tǒng)工藝相比，上述工藝雜菌污染少、發(fā)酵周期短、產(chǎn)品含鹽量低，含納豆激酶穩(wěn)定；并且一次發(fā)酵，生產(chǎn)出醬油和豆豉不僅營養(yǎng)豐富，且花樣繁多，適合大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)；但是風(fēng)味單一不及傳統(tǒng)發(fā)酵的豆豉。

此外，目前工業(yè)生產(chǎn)推廣的豆豉大多僅能滿足消費(fèi)者的常規(guī)口感要求，對于保健型豆豉的生產(chǎn)推廣較少；其中，γ-氨基丁酸(GABA)作為現(xiàn)今食品中的保健因子，具有降血壓，抗心律失調(diào)，調(diào)節(jié)激素分泌等作用；隨著生活水平不斷提高，人們對于保健型食品越來越重視，尤其是對能夠適于“三高”人群食用的一些食品，更是深受歡迎。

因此，有必要進(jìn)一步改善現(xiàn)有的生產(chǎn)工藝，提供一種豆豉風(fēng)味更佳豐富、生產(chǎn)周期更短，更適合大規(guī)模推廣，而且能夠生產(chǎn)具有一定保健功能的豆豉的制作工藝。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種富產(chǎn)γ-氨基丁酸的乳酸菌型豆豉的制作方法，該工藝不僅能夠縮短發(fā)酵周期、降低生產(chǎn)成本，還能夠在制備過程中顯著提高成曲的蛋白酶活力和發(fā)酵產(chǎn)生的氨基態(tài)氮含量，并產(chǎn)生大量γ-氨基丁酸保健因子，從而改善豆豉的風(fēng)味，提高豆豉的營養(yǎng)性。

蛋白酶活力作為制曲完成的指標(biāo)，主要為發(fā)酵過程中分解大分子蛋白類物質(zhì)提供準(zhǔn)備，氨基態(tài)氮含量是發(fā)酵完成的指標(biāo)，發(fā)酵過程是一系列的生化反應(yīng)，如美拉德反應(yīng)等，與豆豉的風(fēng)味和營養(yǎng)相關(guān)。

一種富產(chǎn)γ-氨基丁酸的乳酸菌型豆豉的制作方法，包括：將黃豆依次清洗、浸泡、瀝干、蒸煮后，接種菌粉進(jìn)行制曲和發(fā)酵，獲得豆豉；在制曲前，接種的菌粉為米曲霉和黑曲霉的混合菌粉，兩者的質(zhì)量比為1.5～4:1；在制曲后，接種含有植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC NO.3782的菌液，再進(jìn)行發(fā)酵。

該植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC NO.3782已于2010年由劉佩從傳統(tǒng)泡菜中分離得到，鑒定為植物乳桿菌，并命名為(Lactobacillus plantarum)lp15-2-1，并保藏于中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏時間為2010年4月27日，保藏號為CGMCC NO.3782。該菌株的分離、純化及鑒定方法已在中國專利文獻(xiàn)201010251108,.X中公開。本發(fā)明不涉及該菌種的保藏。

進(jìn)一步地，所述米曲霉為滬釀3.042，所述黑曲霉為As 3.350。

米曲霉作為釀造動力微生物，其產(chǎn)酶豐富，能夠產(chǎn)生如蛋白酶、肽酶、淀粉酶、纖維素酶等，這些酶系對豆豉制作發(fā)揮著不同作用，其中蛋白酶是關(guān)鍵酶。米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的能力較強(qiáng)，產(chǎn)酸性蛋白酶的能力相對較弱；而豆豉的發(fā)酵過程是在中性和偏酸性的環(huán)境中完成的，需要酸性蛋白酶。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黑曲霉的添加不僅不會影響豆豉的發(fā)酵，還可以彌補(bǔ)米曲霉的缺點(diǎn)，為整個豆豉曲提供酸性蛋白酶。其中，米曲霉和黑曲霉的配比為4:1時，制曲所產(chǎn)的蛋白酶活力最高。

實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC NO.3782的添加還能夠進(jìn)一步促進(jìn)豆豉發(fā)酵產(chǎn)生的氨基態(tài)氮含量，從而使豆豉中γ-氨基丁酸的含量進(jìn)一步提高。

作為優(yōu)選，以黃豆的質(zhì)量計，所述菌粉的接種量為1～1.5％。

作為優(yōu)選，以制曲后豆豉曲的質(zhì)量計，所述菌液的接種量為1～2mL/kg，菌液中所述植物乳桿菌的濃度為10⁷cfu/mL。

作為優(yōu)選，所述浸泡的溫度為25～35℃，時間為3～5h。

作為優(yōu)選，所述蒸煮的溫度為120～125℃，時間為15～25min。

霉菌的生長溫度不宜過低，不利于微生物的生長及代謝；溫度不宜過高，容易產(chǎn)生“燒曲”現(xiàn)象，不利于微生物生長，且易使酶失活。

霉菌生長需要一定量的水分，適宜的濕度能使原料保持較高的水分，并使微生物處于平衡狀態(tài)，這樣有利于霉菌的生長，增加產(chǎn)酶量；但是，濕度過大，易使培養(yǎng)箱內(nèi)水分過高，可能妨礙霉菌與外界環(huán)境的物質(zhì)交換，不利于微生物的生長，使酶活力下降。

故，作為優(yōu)選，所述制曲的條件為：溫度為30～35℃，相對濕度為75～80％，時間為36～60h。更優(yōu)選，所述溫度為30℃，相對濕度為75％，時間為48h。

豆豉發(fā)酵過程中，需要添加一定的食鹽，這不僅有利于最終成品的風(fēng)味品質(zhì)，而且還與微生物生長有很大關(guān)系。高鹽能夠抑制微生物的生長以及蛋白酶活力，阻礙了蛋白質(zhì)分解，從而氨基態(tài)氮含量下降，所以控制含鹽量對于豆豉成品品質(zhì)至關(guān)重要。

作為優(yōu)選，制曲后，添加食鹽和水，再進(jìn)行發(fā)酵；其中，食鹽的添加量為40～60g/kg。更優(yōu)選，食鹽的添加量為50g/kg。

豆豉發(fā)酵前期是大豆中的蛋白質(zhì)在微生物分泌的酶的催化下發(fā)生的水解反應(yīng)，所以必須有水參加。當(dāng)含水量太低，不利于蛋白質(zhì)水解成氨基態(tài)氮，保持較高的水分有利于蛋白質(zhì)的分解；但是水分過高，豆豉呈現(xiàn)醬狀或者糊狀，不能夠保持豆豉原有的固態(tài)顆粒。因此，控制含水量在一定范圍內(nèi)有利于豆豉發(fā)酵。

作為優(yōu)選，所述水的添加量為400～600mL/kg。更優(yōu)選，水的添加量為500mL/kg。

在豆豉發(fā)酵過程中，大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)在酶的催化下產(chǎn)生小分子的氨基態(tài)氮，溫度過低不利于酶的催化反應(yīng)，過高易使酶失活。

相對濕度與豆豉中的含水量相關(guān)，只有在合適的濕度下，豆豉和微生物才能保持較合適的水分，從而有利于豆豉發(fā)酵；濕度過低，豆豉內(nèi)的水分會蒸發(fā)出來，這樣不利于微生物的生長以及蛋白質(zhì)水解成氨基態(tài)氮；濕度過高，豆豉含水量高，豆豉表面被大量水分包圍，不利于內(nèi)外界物質(zhì)的交換。另外，發(fā)酵時間會影響豆豉成品的品質(zhì)，比如風(fēng)味和口感。

作為優(yōu)選，所述發(fā)酵的條件為：溫度為35～40℃，相對濕度為60～70％，時間為10～15d。更優(yōu)選，溫度為37℃，相對濕度為65％，時間為14d。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明方法采用米曲霉和黑曲霉的混合菌粉進(jìn)行制曲，加入植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC NO.3782菌液進(jìn)行發(fā)酵，并配合適宜地制曲和發(fā)酵工藝，顯著提高成曲蛋白酶活力、發(fā)酵產(chǎn)生的氨基態(tài)氮含量以及γ-氨基丁酸含量，獲得了品質(zhì)和風(fēng)味更佳且更健康的豆豉成品。

(2)本發(fā)明方法制備工藝簡單，大大縮短了發(fā)酵周期，降低了生產(chǎn)成本。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中不同米曲霉與黑曲霉菌粉配比對豆豉制曲蛋白酶活力的影響。

圖2為實(shí)施例1中不同菌粉接種量對豆豉制曲蛋白酶活力的影響。

圖3為實(shí)施例1中不同制曲溫度對豆豉制曲蛋白酶活力的影響。

圖4為實(shí)施例1中不同制曲濕度對豆豉制曲蛋白酶活力的影響。

圖5為實(shí)施例1中不同制曲時間對豆豉制曲蛋白酶活力的影響。

圖6為實(shí)施例2中比較兩種豆豉發(fā)酵產(chǎn)氨基態(tài)氮的情況。

圖7為實(shí)施例2中γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖。

圖8為實(shí)施例2中γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

圖9為實(shí)施例2中乳酸菌型豆豉中γ-氨基丁酸液相色譜圖。

具體實(shí)施方式

下列實(shí)施例中涉及的各指標(biāo)測定方法如下：

1、蛋白酶活力的測定：GB/T 23527-2009；

2、氨基態(tài)氮含量的測定：

(1)樣品的制備：稱取5g左右樣品，放入200mL燒杯中，加入50mL蒸餾水，用勻漿機(jī)打碎均勻，轉(zhuǎn)入離心管中，在3500r/min的條件下離心15min，將上清液移入100mL容量瓶中，再加10mL蒸餾水于離心管沉淀中，再次離心，上清液倒入容量瓶中，此操作反復(fù)3次，最后用蒸餾水定容至100mL，混勻。

(2)樣品的測定：吸取10mL樣品液于200mL燒杯中，加入60mL蒸餾水，開動磁力攪拌器，用0.05mol/L的NaOH溶液滴定酸度計pH至8.2，加入10mL甲醛溶液混勻，再用0.05mol/L的NaOH滴定至9.2，記下pH從8.2到9.2消耗的NaOH體積V₁；空白實(shí)驗(yàn)只需要將樣品換成10mL蒸餾水，記下消耗的NaOH體積V_2.。

氨基態(tài)氮含量：

3、γ-氨基丁酸(GABA)的測定

(1)試劑

0.2％KH2PO4：0.2g溶于100mL超純水中，用0.45μm過濾，收集濾液。

樣品溶液的制備：準(zhǔn)確稱取0.05-0.25g粉碎試樣，用水定容至100mL，經(jīng)超聲溶解過后，用0.22μm濾膜過濾，收集濾液作為樣品溶液。

0.4mol/L硼酸緩沖液：準(zhǔn)確稱取2.47g硼酸，加入約80mL水，用氫氧化鈉調(diào)pH至10.2，用水定容至100mL，用0.45μm過濾，收集濾液。

衍生試劑的制備：稱取0.01g鄰苯二甲醛(OPA)，用2.5mL乙腈溶解，加20μLβ-巰基乙醇，超聲溶解。

(2)柱前衍生化

精密吸取50uL樣品溶液及50μL衍生試劑，400uL硼酸緩沖液混合反應(yīng)約2min后，加入500μL 0.2％KH₂PO₄終止反應(yīng)，30秒后立即進(jìn)樣，進(jìn)樣量為20μL。

(3)色譜條件

流動相

A相：稱取8.0g結(jié)晶乙酸鈉，用水溶解定容至1000mL；然后加入220μL三乙胺，攪拌并滴加5％的醋酸調(diào)pH至7.20+0.02；最后加入5mL四氫呋喃，混合后過濾備用。

B相：稱取8.0g結(jié)晶乙酸鈉，用水溶解定容至1000mL；然后滴加2％的醋酸調(diào)pH至7.20±0.02；再按乙酸鈉溶液：乙腈：甲醇＝1:2:2(體積比)混合過濾后備用。

梯度洗脫表

柱溫：40℃；流速：1.0mL/min；檢測波長：338nm

(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取0.1gγ-氨基丁酸，用水溶解后定容至100mL，即為1.0mg/mL，用0.45μm過濾，收集濾液進(jìn)行稀釋，分別準(zhǔn)確吸取0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.9mg/mL濃度標(biāo)準(zhǔn)液，按上述方法進(jìn)行色譜分析，以峰面積—標(biāo)準(zhǔn)液濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程，線性相關(guān)系數(shù)R為0.99以上。

(5)試樣測定

稱取10g豆豉，放入200mL燒杯中，加入50mL蒸餾水，用勻漿機(jī)打碎均勻，轉(zhuǎn)入離心管中，在3500r/min的條件下離心15min，將上清液移入100mL容量瓶中，再加10mL蒸餾水于離心管沉淀中，再次離心，上清液倒入容量瓶中，此操作反復(fù)3次，最后用蒸餾水定容至100mL，混勻；吸取5mL樣品溶液，加入5mL 0.1mol/L三氯乙酸，渦旋2min，然后在40℃水浴中提取1h，取1mL；離心分離(12000r/min、5min)，取上清液50μL，吸取硼酸緩沖液400μL，OPA衍生劑50μL，混合反應(yīng)1min后加入500μL 0.2％KH₂PO₄終止反應(yīng)，用0.22μm濾膜過濾，30秒后立即進(jìn)樣，進(jìn)樣量為20μL，記錄色譜峰的保留時間和峰面積，試樣與標(biāo)準(zhǔn)溶液的衍生化處理至進(jìn)樣時間應(yīng)保持一致。根據(jù)色譜峰的峰面積，以外標(biāo)法計算相應(yīng)的γ-氨基丁酸的濃度。

4、下列實(shí)施例的米曲霉為滬釀3.042，所述黑曲霉為As 3.350，植物乳桿菌為(Lactobacillus plantarum)CGMCC NO.3782。

實(shí)施例1

以蛋白酶活力為指標(biāo)，對菌粉配比、接種量、制曲溫度、相對濕度和制曲時間等因素進(jìn)行評估。

1、菌粉配比：挑選飽滿的原料大豆100g，用清水洗干凈，然后加入300mL，30℃的水浸泡4h，瀝干后，接入1g菌粉(接種量1.0％，w/w)，其中米曲霉和菌粉配比設(shè)置為5:0、4:1、3:2、2:3，在溫度為30℃、相對濕度75％的條件下，制曲60h后，測定蛋白酶活力。

由圖1可知，當(dāng)米曲霉和黑曲霉菌粉的配比為4:1時，制曲所產(chǎn)的蛋白酶活力最高。

2、接種量：挑選飽滿的原料大豆100g，用清水洗干凈，然后加入300mL，30℃的水浸泡4h，瀝干后，接入菌粉，其中米曲霉和黑曲霉菌粉配比為4:1，接種量設(shè)置(w/w)為2.0％、1.5％、1.0％、0.5％，在溫度為30℃、相對濕度75％的條件下，制曲60h后，測定蛋白酶活力。

由圖2可知，隨著接種量的增加，蛋白酶活力逐漸增加，在接種量為1.5％達(dá)到最大，但當(dāng)接種量進(jìn)一步增加時，蛋白酶活力卻反而下降，可能是因?yàn)榻臃N量太大，微生物生長過多，產(chǎn)生的溫度要高于其最適生長溫度，以及受于可被利用的營養(yǎng)物質(zhì)的限制。所以，確定1.5％的接種量為最佳接種量。

3、制曲溫度：挑選飽滿的原料大豆100g，用清水洗干凈，然后加入300mL，30℃的水浸泡4h，瀝干后，接入菌粉(接種量為1.5％，w/w)，其中米曲霉和黑曲霉菌粉配比為4:1，在溫度設(shè)置為25℃、30℃、35℃、37℃、40℃，相對濕度75％的條件下，制曲60h后，測定蛋白酶活力。

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度逐漸升高，豆豉曲蛋白酶活力逐漸升高，在35℃時酶活達(dá)到最大，但隨著溫度進(jìn)一步增加，酶活力急劇下降。

4、制曲相對濕度：挑選飽滿的原料大豆100g，用清水洗干凈，然后加入300mL，30℃的水浸泡4h，瀝干后，接入菌粉(接種量為1.5％，w/w)，其中米曲霉和黑曲霉菌粉配比為4:1，在溫度為30℃、相對濕度設(shè)置為65％、70％、75％、80％和85％的條件下，制曲60h后，測定蛋白酶活力。

從圖4可以看出，隨著相對濕度的增加，蛋白酶活力先增加后又下降，在相對濕度為75％的酶活達(dá)到最大。

5、制曲時間：挑選飽滿的原料大豆100g，用清水洗干凈，然后加入300mL，30℃的水浸泡4h，瀝干后，接入菌粉(接種量為1.5％，w/w)，其中米曲霉和黑曲霉菌粉配比為4:1，在溫度為30℃、相對濕度設(shè)置為75％的條件下，分別制曲12h、24h、36h、48h、60h和72h后，取樣測定蛋白酶活力。

由圖5可知，隨著制曲時間的延長，蛋白酶活力呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，在48h時達(dá)到最大。在48h之前，微生物在生長，從而酶活也逐漸增加；在48h時，霉菌生長得旺盛，產(chǎn)酶能力也達(dá)到最大，酶活也相應(yīng)提高，而在48h后，可能受到可利用的營養(yǎng)物質(zhì)的限制以及菌種產(chǎn)酶能力衰退的緣故，蛋白酶活力逐漸下降。

實(shí)施例2

通過實(shí)施例1的研究，獲得最佳的豆豉制曲工藝。

具體步驟如下：

(1)取1kg飽滿的黃豆顆粒，用清水清洗直至干凈，加入3L的30℃溫水浸泡4h后，瀝干水分，放入121℃高壓蒸煮鍋內(nèi)蒸煮20min，冷卻至室溫，獲得煮熟的黃豆顆粒；

(2)向煮熟的黃豆顆粒中接入15g混合菌粉，其中米曲霉和黑曲霉菌粉的質(zhì)量比為4:1，混合均勻，放入培養(yǎng)箱中制曲48h，溫度為30℃，相對濕度為75％；

(3)制曲完成過后，添加食鹽和無菌水，以質(zhì)量計，每1kg的豆豉曲接種1mL含10⁷cfu/mL植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC NO.3782的菌液，并加入50g食鹽和500mL的無菌水，將溫度調(diào)到37℃，相對濕度調(diào)為65％，發(fā)酵12天，得到成品豆豉。

制曲完成后，蛋白酶活力最高可以達(dá)到1158u/g；發(fā)酵完成后，氨基態(tài)氮含量達(dá)到2.33g/100g，γ-氨基丁酸含量達(dá)到38mg/kg；成品豆豉呈黑褐色顆粒狀，有濃濃的豆香味，口感柔軟，有一定的咸味。

對比例1

一種豆豉的制作方法，具體步驟如下：

(1)取1kg飽滿的黃豆顆粒，用清水清洗直至干凈，加入3L的30℃溫水浸泡4h后，瀝干水分，放入121℃高壓蒸煮鍋內(nèi)蒸煮20min，冷卻至室溫，獲得煮熟的黃豆顆粒；

(2)向煮熟的黃豆顆粒中接入15g混合菌粉，其中米曲霉和黑曲霉菌粉的質(zhì)量比為4:1，混合均勻，放入培養(yǎng)箱中制曲48h，溫度為30℃，相對濕度為75％；

(3)制曲完成過后，添加食鹽和無菌水，以質(zhì)量計，每1kg的豆豉曲加入50g食鹽和500mL的無菌水，將溫度調(diào)到37℃，相對濕度調(diào)為65％，發(fā)酵12天，得到成品豆豉。

將實(shí)施例2和對比例1獲得的豆豉進(jìn)行氨基態(tài)氮含量的比較，結(jié)果如圖6所示。