本發(fā)明屬于食品安全領域，具體涉及一種利用原花青素抑制鐮刀菌產生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒素的方法和應用。

背景技術：
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糧食和水果是人們賴以生存的主要食品來源。近年來隨著物流保鮮技術的提高，糧食和水果得以遠距離的運輸到千家萬戶，然而從采收、運輸、貨架銷售直至消費者的物流過程中，易受到的機械損傷，加上貯藏環(huán)境的高溫、高濕和高二氧化碳，容易滋生病原菌。并且，食品在二次加工過程中，例如蔬菜腌制、水果榨汁，亦容易滋生病原菌。這些病原菌除了導致食品腐敗，還會產生真菌毒素。目前常見的真菌毒素有：黃曲霉毒素、伏馬毒素、玉米赤霉烯酮、單端孢霉烯族、赭曲霉毒素等。它們都能對人體造成嚴重的病理反應，在動物試驗中發(fā)現長期微量毒素的攝入會有致癌、致畸現象。

鐮刀菌屬(Fusarium)是糧食和水果病原真菌中分布廣泛并影響巨大的一類真菌。糧食中常見的有造成水稻惡苗病、馬鈴薯干腐病的串珠鐮孢(F.moniliforme)，引起小麥赤霉病的禾谷鐮孢(F.graminearum)等。而香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)導致，香蕉冠腐病則是由串珠鐮孢(F.moniliforme)、亞粘團串珠鐮孢(F.moniliforme var.subglutinans)半裸鐮孢(Fusarium semitectum)、雙胞鐮孢(F.dimerum)導致的。層出鐮刀菌(F.proliferatum)，由楊桃分離，并被發(fā)現能夠侵染多種作物，該菌具有鐮刀菌屬的典型產毒特征，能夠產生的毒素有：伏馬毒素，單端孢霉烯族毒素，玉米赤霉烯酮等主要的鐮刀菌毒素。其中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)屬于單端孢霉烯族，它對人或動物免疫具有抑制作用，輕者會導致嘔吐現象，重者損害造血系統(tǒng)(Wayne L.Bryden.Mycotoxin contamination of the feed supply chain:Implications for animal productivity and feed security.Animal feed science and technology,2012,173(1-2):134-158)。

為防治病害，越來越多的抑菌劑和殺菌劑被投入使用。例如：丙酸、丙酸鹽、異菌脲、噻菌靈、二氧化硫。尤其是在欠發(fā)達國家或地區(qū)，由于冷鏈物流技術、裝備和條件相對落后，生產商偏向于選用廉價的防腐保鮮藥劑如咪鮮胺、多菌靈，這些殺菌劑存在一定毒性；另一方面，殺菌劑的廣泛使用使得病菌逐漸產生抗藥性，因而人們不得不加大劑量。一個不容忽視的后果是，殺菌不徹底導致真菌抗逆性被激活，促進毒素相關基因表達，毒素生成量進而大幅度提高。此外，逆境脅迫，如：氧化脅迫和酸性環(huán)境也可以促進毒素的產生。因此殺菌劑使用不當不僅不能有效控制病害，而且為食品安全埋下隱患。

近年來，隨著人們對食品安全的關注度越來越高，無論是國內還是國際上，均對毒素有嚴格的限量規(guī)定。在出口貿易方面，真菌毒素的最高限量極其嚴苛，相當大一部分的食品貿易損失是因毒素超標造成，所以如何在防控真菌感染的同時降低真菌毒素的產量，被視為食品產業(yè)的重中之重。當前抑制食品毒素累積的措施有：(1)前期預防，噴灑殺菌抑菌的藥物；(2)中期清除，及時清理壞果病果；和(3)后期化學降解、物理降解或凈化，例如采用鋁矽酸鹽、活性碳和聚合物吸附毒素物質。但是一旦毒素大量存在，現有的方法很難將其徹底脫除。因而降低毒素積累的措施主要為上述(1)和(2)。因而研發(fā)降低毒素的積累、食用安全，又可提高食品品質的毒素清除劑具有重要意義。

原花青素(procyanidins)最早是從山楂和葡萄皮、葡萄籽中提取的，加熱后能產生花青素的一類多酚化合物。后來在黑枸杞、沙棘籽、馬尾松樹皮、荔枝皮等植物組織中均發(fā)現有原花青素存在。其中低聚體的原花青素(Oligimers procyanidolic,OPC/PCO)由兒茶素和表兒茶素縮合而成，通常為二到四聚體。OPC由于含有多個酚羥基，當被氧化后會釋放出氫離子，因而具有良好的抗氧化活性，約為維生素E的50倍。有研究發(fā)現，植物果實中提取的原花青素能夠提高動物體內超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性，對自由基具有良好的清除能力。同時，該物質對人體并無明顯毒副作用，目前已常被用于藥品、化妝品、保健品當中，起清除氧自由基、抗衰老、抗腫瘤、抗菌等作用(張妍，吳秀香。原花青素研究進展。中藥藥理與臨床，2011，27(6)：112-115)。此外，OPC可作為一種天然安全的防腐劑用于食品的保鮮。OPC為暗紅色粉末狀，易溶于水，高溫易降解，在40℃以下穩(wěn)定，其光穩(wěn)定性較差，Vc和亞硫酸氫鈉能提高OPC的穩(wěn)定性。

原花青素的結構式如式(Ⅰ)所示：

技術實現要素：
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本發(fā)明的第一個目的是提供一種原花青素在抑制鐮刀菌產生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)毒素中的應用。

本發(fā)明的第二個目的是提供原花青素在脫除或降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒素中的應用。本發(fā)明具體提供原花青素在制備抑制鐮刀菌產生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒素的制劑中的應用。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種利用原花青素抑制鐮刀菌產生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒素的方法，將鐮刀菌接種于添加有原花青素的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。

優(yōu)選地，所述的鐮刀菌為層出鐮刀菌。

本發(fā)明所述的層出鐮刀菌，選擇能夠導致多種糧食、水果發(fā)病的致病菌層出鐮刀菌。

優(yōu)選地，所述的添加有原花青素的培養(yǎng)基為添加了濃度為0.05～1.0g/L的原花青素的察氏培養(yǎng)基。本發(fā)明所述的察氏培養(yǎng)基為察氏固體培養(yǎng)基和察氏液體培養(yǎng)基。

根據實際情況可以添加Vc和Ve混合使用，以增加效果。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提出的利用原花青素抑制鐮刀菌產生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒素的方法，其按照本發(fā)明提出的量來添加原花青素，能夠降低鐮刀菌30％～80％產毒量，其可以降低毒素的積累，從而保證食品的安全。

附圖說明：

圖1是實施例1的OPC對真菌菌落生長的影響情況；

圖2是實施例1的OPC對真菌菌落生長大小的影響記錄；

圖3是實施例1的OPC對真菌產毒的抑制影響。

具體實施方式：

以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。

實施例1：原花青素A₂制備分離和結構鑒定。

1、材料：

真菌：層出鐮刀菌(F.proliferatum)，由楊桃分離并進行形態(tài)和分子鑒定，發(fā)現能侵染多種植物。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato dextrose agar medium，PDA)：取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水1000mL煮沸30min，濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至1000mL，加葡萄糖20g和瓊脂15g，溶化分裝后121℃滅菌20min。

察氏固體培養(yǎng)基(Czapek’s agar medium，CA)：硝酸鈉3.0g/L，磷酸氫二鉀1.0g/L，硫酸鎂(MgSO₄·7H₂O)0.5g/L，氯化鉀0.5g/L，硫酸亞鐵0.01g/L，蔗糖30g/L，瓊脂20g/L，將上述成分按其含量溶于水中，于121℃滅菌20min。

察氏液體培養(yǎng)基(Czapek’s broth medium，CB)：硝酸鈉3.0g/L，磷酸氫二鉀1.0g/L，硫酸鎂(MgSO₄·7H₂O)0.5g/L，氯化鉀0.5g/L，硫酸亞鐵0.01g/L，蔗糖30g/L，將上述成分按其含量溶于水中，于121℃滅菌20min。

2、處理方式：

將層出鐮刀菌接種PDA后，28℃培養(yǎng)7天，以活化菌種待用。

將高溫滅菌的CA放置于超凈工作臺中，待冷卻至60℃以下，分別添加0.05g/L、0.10g/L、0.20g/L、0.50g/L、1.00g/L的OPC(原花青素)后，迅速搖勻，分裝20mL培養(yǎng)基到每一個培養(yǎng)皿中，待凝固后從PDA平板上接種層出鐮刀菌到各個CA板，28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)7天。

用打孔器在PDA平板上的菌落邊緣打直徑為5mm的菌碟。在每個盛100mL CB的三角瓶(250mL)中分別添加0.05g/L、0.10g/L、0.50g/L、1.00g/L的OPC后，每瓶接種3片菌碟，于28℃下振蕩(120rpm)培養(yǎng)7d后，過濾除去菌絲，待進行毒素的提取鑒定。

3、抑菌影響及抑毒影響

培養(yǎng)1、4、7天時，對CA培養(yǎng)平板上的菌落情況進行觀察，并用游標卡尺測量菌落生長大小，進行記錄。

取20mL的菌液，與20mL正己烷混合分層后，除去上層正己烷相。加入20mL乙酸乙酯提取，混合后離心3000g，4℃，5min分層。用乙酸乙酯提取3次后，對所得乙酸乙酯相進行旋蒸得到樣品，溶于100％甲醇待測。

對樣品進行毒素的定量分析是由高效液相色譜-串聯(lián)質譜系統(tǒng)(AB SCIEX公司，美國)即HPLC-MS/MS進行的。樣本(10μL)被注入到一個Ekspert 100高效液相色譜柱(C18色譜柱，100×2.1mm，3μm顆粒大小，Thermo,USA)。使用溫度35℃，流動相(A：乙腈和B：0.1％乙酸)。流動相1分鐘內從10％增加至15％，1到7.5分鐘增加至65％，然后從7.5至9.5分鐘下降到10％，并于該濃度持續(xù)額外的0.5分鐘，最后返回到初始條件。

泵的流量為0.5mL/min，在450℃條件下以氮氣作為霧化氣體。電噴霧電離(ESI)選擇[M-H]-。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的母離子設置為m/z 295.1，子離子設置為m/z 265.1和138。質譜分析條件為：離子噴霧電壓-4500V，入口電壓-10V，出口電壓-17V，錐孔電壓-60V及碰撞能量-15/-21V，定量的檢測限為0.1ng/mL。

4、實驗結果及分析

結果如圖1、2所示，OPC處理CA培養(yǎng)基后，層出鐮刀菌的菌落形態(tài)與對照組的差異在低濃度時有輕微的促進的現象，0.5g/L和1.0g/L的處理對菌落并沒有明顯的影響。

如圖3所示，OPC處理CB培養(yǎng)基后，對層出鐮刀菌產生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)毒素具有明顯的影響，隨著處理濃度的提高，其產生毒素的量明顯下降。說明OPC抑制了真菌產生該毒素。

從結果可以看出：OPC具有顯著的降低真菌產毒的作用，1.0g/L的OPC處理保鮮效果最好；OPC處理有濃度效應，即濃度越高降低效果越好。

本發(fā)明提出的利用原花青素抑制鐮刀菌產生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒素的方法，其按照本發(fā)明提出的量來添加原花青素，能夠降低鐮刀菌30％～80％產毒量，其可以降低毒素的積累，從而保證食品的安全。

以上對本發(fā)明提供的原花青素抑制鐮刀菌產生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒素的方法進行了詳細的介紹，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想，應當指出，對于本技術領域的技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權利要求的保護范圍內。