專利名稱：一種抗寄生蟲新抗生素及其鹽類的制造方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種能從微生物培養(yǎng)物中提取抗寄生蟲的新抗生物質(zhì)戒臺霉素(JEITACINS)及其鹽類的制造方法。該抗生素及其可作藥用的鹽類的化學結構式為
式中R＝異丙基或異丁基已經(jīng)知道，作為抗寄生蟲的藥物，在抗生素中，有奧佛麥菌素(AVERMECTIN)、巴龍霉素(PAROMOMYCIN)，在合成藥中，有左旋咪唑(LEVAMISOLE)、氯硝柳胺(NICLOSAMIDE)等。這些藥物作為醫(yī)藥品和動物藥被用于治療線蟲病、絲蟲病等，其效果是肯定的。但是，已知的抗寄生蟲藥物具有毒性、副作用或耐藥性等問題。
本發(fā)明的目的，是要尋找毒副作用更小的抗寄生蟲藥物，以期提供有抗寄生蟲活性的物質(zhì)，解決人和動物治療中的需求。
本發(fā)明的要點，是以探索新的生物活性物質(zhì)為目標，從不同土壤樣品中分離菌種，并對其產(chǎn)物進行研究。結果發(fā)現(xiàn)了KP-197菌株，在其培養(yǎng)物中含有抑制寄生蟲運動活性的物質(zhì)。從該菌株的培養(yǎng)物中分離和精制出兩個抑制寄生蟲運動活性的純物質(zhì)。研究了這兩個物質(zhì)的理化特性，測定了其化學結構。具有這種化學結構的物質(zhì)，尚未見到報道。這些物質(zhì)統(tǒng)稱為戒臺霉素(JEITACINS)。結構式中R為異丙基的化合物叫戒臺霉素A(JEITACINSA)，R為異丁基的化合物叫戒臺霉素B(JEITACINSB)。戒臺霉素A和戒臺霉素B的理化性質(zhì)如下戒臺霉素A(1)白色粉末(2)元素分析C18H34N2O2計算值C69.57;H11.04;N9.02%實驗值C70.40;H11.09;N7.68%(3)分子量及分子式戒臺霉素A的質(zhì)譜，在m/z311處有(M+H)+的分子離子峰;在高分辨率質(zhì)譜分析中，在m/z293處有(M-OH)+的離子峰。由此確定，其分子式C18H34N2O2，分子量是310。
(4)紫外吸收光譜如圖1所示，在228mm處有一個特征性的吸收峰;在250nm處出現(xiàn)一個肩峰。
(5)紅外吸收光譜用KBr溶劑法測定，如圖2所示，其主要吸收極大波數(shù)如下2950、2870、1705、1475、1415、1380、1270、1090、960(cm-1)。
(6)核磁共振譜使用瓦利安XL-400，400MH核磁共振儀，在重氯仿中測定的1H核磁共振譜如圖3所示。
(7)呈色反應對甲氧基苯甲醛-硫酸陽性高錳酸鉀陽性硫酸陰性德拉根道夫試驗陰性(8)溶解性溶于丙酮、乙酸乙酯、氯仿、己烷、二甲基亞砜。不溶于甲醇、水。
(9)化學結構上述技術領域闡明的結構式中，R為異丙基的結構式，是根據(jù)(1)-(9)所列理化性質(zhì)與已知類似化合物進行比較得到的，它是14-甲基-1-乙烯偶氮氧15-烷-8酮。
戒臺霉素B(1)無色油狀物(2)分子式，在高分辨質(zhì)譜分析中，于m/z307處有(M-N)離子峰，由此確定起其分子式為C19H26N2O2，分子量為324。
(3)紫外吸收光譜同戒臺霉素A(4)紅外吸收光譜同戒臺霉素A(5)呈色反應同戒臺霉素A(6)溶解性
同戒臺霉素A(7)化學結構戒臺霉素B是戒臺霉素A的類似物，兩者在烷基側鏈上的炭原子數(shù)不同。
上述技術領域闡明的結構式中，R是異丁基的結構式，是根據(jù)(1)-(7)所列理化性質(zhì)與已知化合物進行比較得到的結果，它是15-甲基-1-乙烯偶氮氧基16烷-8酮。
能產(chǎn)生戒臺霉素的微生物屬于鏈霉菌屬，例如在本發(fā)明中分離到的鏈霉菌屬的KP-197菌株，是在本發(fā)明中使用的最有效菌株之一。該菌株的分類學特性如下(1)在各種培養(yǎng)基上的營養(yǎng)菌絲發(fā)達，未觀察到菌絲斷裂。在淀粉無機鹽培養(yǎng)基上，氣生菌絲很稀少，白色，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，孢子絲是直線狀，孢子鏈由20個以上孢子組成，孢子大小為0.7-1.0×0.7μm，圓柱形，孢子表面光滑，未發(fā)現(xiàn)菌核，孢子囊以及游動孢子。
(2)在各種培養(yǎng)基上的特征用塞戈瓦(E.B.SHIRLING和D.G.GOTTLIEB-國際系統(tǒng)細菌學雜志16卷313頁，1966年)法研究該產(chǎn)生菌的培養(yǎng)特征，結果如表所示(見第3頁表)(3)生理特性黑色素形成陽性酪氨酸瓊脂陽性蛋白胨酵母膏鐵瓊脂陽性葡萄糖蛋白胨明膠培養(yǎng)基(21-23℃)陽性胰蛋白胨酵母膏液體培養(yǎng)基陽性酪氨酸酶反應陽性硫化氫的產(chǎn)生陰性硝酸鹽還原陽性明膠液化(葡萄糖、蛋白胨、明膠培養(yǎng)基)(21-23℃)陽性淀粉水解陽性牛奶凝固(37℃)陰性牛奶胨化(37℃)陽性生卡溫度范圍15-38℃炭源利用(采用普戈瓦PRIDHOM-GOTTLIEB瓊脂作為基礎培養(yǎng)基)
利用D-葡萄糖，D-果糖、甘露糖稍利用D-甘露醇，(-阿拉伯糖，D-木糖、蔗糖，不利用L-鼠李糖，I-肌醇、棉子糖、密二糖、水楊酸。
纖維素分解陰性(4)細胞壁組成細胞壁的二氨基庚二酸(DAP)是LL-DAP。
綜上所述，該菌株的分類學特征可以歸納如下細胞壁的二氨基庚二酸是LL-DAP，孢子絲的形狀是直線形，孢子鏈，孢子表面光滑，營養(yǎng)菌絲為米色，氣生菌絲為白色，形成黑色素。由此可以確定，該菌株屬鏈霉菌屬(STREPTOMYCES)的一種。根據(jù)普柴氏分類法(PRIDHAMANDTRESNER)(伯述瓦細菌分類手冊第八版748-829頁，1974年)，確認該產(chǎn)生的菌株屬于白色系列的一種。
在本發(fā)明中，作為在培養(yǎng)基中的微生物的例子，首先使用了能產(chǎn)生戒臺霉素的屬于鏈霉菌屬的微生物。然而，只要能產(chǎn)生戒臺霉素的該菌株的變株，在本發(fā)明中亦可使用。
作為培養(yǎng)基，可以使用合成培養(yǎng)基或天然培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基通常含有適于培養(yǎng)放線菌的碳源、氮源和無機鹽類以及適量必要的其它營養(yǎng)物質(zhì)。
培養(yǎng)基中的碳源可以使用葡萄糖、甘油、果糖、麥芽糖、甘露糖、木糖、半乳糖、核糖、淀粉及其水解物等各種碳水化合物，使用濃度通常為0.1-5%。此外還有葡萄糖酸、丙酮酸、乳酸、醋酸等有機酸、甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸等氨基酸、甲醇、乙醇等醇類化合物，以及正鏈烷烴等非芳香族碳氫化合物或者動植物的各種油脂類均可使用。
作為氮源，可以使用銨、氯化銨、磷酸銨、硫酸銨、硝酸銨等無機酸或有機酸銨鹽、尿素、蛋白胨、NZ-胺、肉膏、酵母膏、干酵母、玉米漿、酪蛋白水解物、魚粉或其水解物、大豆粉或其水解物、脫脂大豆或其水解物等含氮有機物質(zhì)。還有甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸等氨基酸。無機鹽類使用各種磷酸鹽、硫酸鹽、食鹽等以及微量的重金屬鹽類。
在使用有特殊營養(yǎng)要求的變異株時，必須在培養(yǎng)基中添加能滿足其營養(yǎng)要求的物質(zhì)。這樣的營養(yǎng)物質(zhì)，在使用含有天然物質(zhì)的培養(yǎng)基時，不須特別添加補充。
發(fā)酵培養(yǎng)，通常是在振動或通氣攪拌等好氣條件下進行。實際生產(chǎn)時是采用深層通氣攪拌培養(yǎng)。培養(yǎng)基的pH值可以是5-8，但一般以中性pH較好。培養(yǎng)溫度可以為20-40℃，但一般在26-32℃較好(理想溫度為27℃左右)。液體培養(yǎng)基時間通常為3-6日，戒臺霉素的效價達到最高峰時停止培養(yǎng)。培養(yǎng)基成份、培養(yǎng)溫度、攪拌速度、通氣量等培養(yǎng)條件，根據(jù)使用的菌株和外界條件可適當調(diào)整選定，液體培養(yǎng)出現(xiàn)泡沫時可適當選用硅酮樹脂、植物油等表面活性劑消沫。
用上述方法在培養(yǎng)物中積累的戒臺霉素，通常存在于培養(yǎng)液中。為了從培養(yǎng)濾液中提取戒臺霉素，一般采用從微生物培養(yǎng)物中提取代謝產(chǎn)物的方法。這些方法可以單獨或者隨意結合或者反復使用。例如過濾、離心、透析、濃縮、干燥、冷凍、吸附、洗脫;對各種溶媒溶解度不同的方法(如沉淀、結晶、重結晶、轉(zhuǎn)溶、逆流配布)，層析等方法。
由于戒臺霉素主要產(chǎn)生在培養(yǎng)液中，因此為了分離、提取該化合物，首先從培養(yǎng)液中除去菌體，然后再從培養(yǎng)濾液中提取該物質(zhì)。
為了從培養(yǎng)濾液中提取戒臺霉素，使用非親水性的有機溶媒如乙酸乙脂等抽提，或者用活性炭、氧化鋁、多孔性高分子合成樹脂、離子交換樹脂等進行吸附，再用乙酸乙脂等溶媒洗脫，得到的提取液或洗脫液進行減壓濃縮，再用己烷等提取。這樣得到的粗提物，用通常精制脂溶性物質(zhì)的方法如硅膠或氧化鋁柱層析等進行精制。
該化合物可作藥用的鹽類如鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸、琥珀酸鹽等，使用常規(guī)方法可以制備。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是，用上述方法制備的活性物質(zhì)，其抗寄生蟲幕钚員認鐘幸┪鍇?，而茲袆虼闭J鐘幸┪锏?。緡撳实验是疫\墑饗叱媯˙URSAPHLENCHUSLIGNICLOUS)作為治療對象，采用木村等介紹的方法(AGRICULTUREBIOLOGICAICHEMISRY45，249，1981)測定戒臺霉素抑制松樹線蟲的運動活性，其結果是戒臺霉素A對線蟲的致死率(%)0.5ug/ml100%0.25ug/ml100%0.125ug/ml99%0.063ug/ml86%戒臺霉素B對線蟲的致死率(%)0.5ug/ml100%
0.25ug/ml100%0.125ug/ml93%0.063ug/ml80%已知藥物AVERMECTINBLA對線蟲的致死率(%)5ug/ml100%2.5ug/ml100%1.25ug/ml64%0.63ug/ml58%從以上比較試驗以看出，戒臺霉素的抗寄生蟲活性比已知藥物強十倍以上，前者療效明顯優(yōu)于后者。
急性毒性試驗是用小鼠作為實驗動物，經(jīng)腹腔途徑注射戒臺霉素10mg/kg不致死，用相同方法觀察已知藥AVERMECTINBLA的急性毒形，結果小鼠死亡?？梢?，戒臺霉素的急性低于已知抗寄生蟲藥物。
以上活性及毒性試驗表明，本發(fā)明所得到的戒臺霉素，作為人、動物和植物的抗寄生蟲藥是有用的。
實施例在500ml板口瓶中裝入100ml培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成份葡萄糖0.1%，馬鈴薯淀粉0.4%，蛋白胨0.5%，肉膏0.3%，酵母膏0.5%，碳酸鈣0.4%，pH7.0)，121℃，15分鐘蒸汽滅菌后，將一白金耳的KP-197的斜面培養(yǎng)物(其成份甘油1.0%，蘋果酸鈣1.0%，酵母膏0.1%，瓊脂1.5%)種入上述滅菌的培養(yǎng)基中，在旋轉(zhuǎn)搖床上27℃培養(yǎng)三天，將該培養(yǎng)作為種子。備30升的發(fā)酵罐二個，每個裝入15升培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基成份甘油2.0%，黃豆粉2.0%，NaCl0.3%，瓜氨酸0.01%，CoCl0.002%，pH7.0)，121℃30分鐘蒸汽滅菌后，往每個發(fā)酵罐中種入6瓶上述種子，攪拌速度250r.p.m通氣量15升/分，27℃120小時培養(yǎng)。
培養(yǎng)物離心(10，000r.p.m)，分離菌體和培養(yǎng)液，得到上清液30升，用6NHCl將上述清液的pH值調(diào)至3.0，再離心，得到沉淀物，往沉淀物中加入15升50%丙酮溶液，攪拌，提取，過濾，得到提取液，將其減壓濃縮至6升，加入3升乙酸乙酯，振動提取二次，得到的乙酸乙酯提取液，減壓濃縮，得到油狀粗提物，往粗提物中加入750ml己烷，提取兩次得到己烷提取液，減壓濃縮，得到粗制品4克，粗制品裝入硅膠柱(馬克公司制，ART7734，160克)層析，用己烷-乙酸乙酯溶液(30∶1)溶出，分份收集，各部份用松樹線蟲進行生物檢定，活性部份合并，減壓濃縮，得到粗制品30毫克，溶于少量氯仿中，每次取1/20的量進樣，用反向分離柱(山村化學研究所制，AM324(ODS，10×300mm)進行高壓液相層析，用60%乙腈水洗出，流速每分鐘2毫升，收集顯示保留時間18.5分與19.6分的各峰的活性部份，減壓濃縮干燥，分別得到戒臺霉素A7.2毫克和戒臺霉素B5毫克。


圖1，戒臺霉素A的紫外吸收光譜(在環(huán)己烷中測定)圖2，戒臺霉素A的紅外吸收光譜(在KBr溶液中測定)圖3，戒臺霉素A的質(zhì)子的核磁共振譜(在重氯仿中測定)
權利要求
1.一種能從微生物培養(yǎng)物中提取抗寄生蟲的新抗生物質(zhì)戒臺霉素及其鹽類的制造方法，其特征在于它是由從鏈霉菌屬的KP-197菌株中，用非親水性的有機溶媒提取制備的。
2.按權利要求1所述的制造方法，其特征是所說的KP-197菌株，其細胞壁的二氨基庚二酸是LL-DAP，孢子絲的形狀呈直線形，孢子鏈長，孢子表面光滑，營養(yǎng)菌絲為米色，氣生菌絲為白色，能形成黑色素。
3.按權利要求2所述的制造方法，其特征是所說的KP-197菌株，可在合成培養(yǎng)基或天然培養(yǎng)基中培養(yǎng)。這些培養(yǎng)基通常含有適于培養(yǎng)放線菌的碳源、氮源和無機鹽類的以及適量必要的其它營養(yǎng)物質(zhì)。發(fā)酵培養(yǎng)，通常是在振動或通氣攪拌等好氣條件下進行，深層通氣攪拌培養(yǎng)的溫度為20-40℃，PH值5-8，培養(yǎng)時間為3-6日。
4.按權利要求1所述的制造方法，其特征是為從培養(yǎng)濾液中提取戒臺霉素，使用非親水性的有機溶媒乙酸乙酯抽提，或者用活性碳、氧化鋁、多孔性高分子合成樹脂、離子交換樹脂進行吸附，再用乙酸乙酯溶媒洗脫，將得到的提取液或洗脫液進行減壓濃縮，再用乙烷提取，這樣得到的精提物，用通常精制酯溶性物質(zhì)的方法如硅膠或氧化鋁柱層析進行精制。
5.按權利要求1和4所述的制造方法，其特征是該化合物可作藥用的鹽類精鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽等，使用常規(guī)方法可以制備。
6.按權利要求4所述的制造方法，其特征是用此方提取制備的戒臺霉素A的分子式為C18H34N2O2，分子量為310，戒臺霉素B的分子式為C19H34N2O2，分子量為324。
7.按權利要求4所述的制造方法，其特征是用此方法制備的化合物，以松鼠線蟲作為治療對象，用已知藥物AVERMECTIN BLA進行對照試驗，結果表明，戒臺霉素的抗寄生蟲活性比對照組強十倍以上，而其毒性卻比對照組低，因此，本發(fā)明所得到的戒臺霉素，作為人、動物和植物的抗寄生蟲藥物是有用的。
全文摘要
一種抗寄生蟲新抗生素及其鹽類的制造方法，其特點是，從KP-197菌株培養(yǎng)物中，用溶媒法分離，提取和精制出具有抗寄生蟲活性的兩種物質(zhì)。該特質(zhì)的抗寄生蟲活性明顯高于已知藥物，而其毒性卻低于已知藥物，故可成為治療人、動物和植物寄生蟲的有效藥物。
文檔編號C12P1/04GK1034580SQ8810018
公開日1989年8月9日 申請日期1988年1月27日 優(yōu)先權日1988年1月27日
發(fā)明者蘇學惠, 大村智, 田中晴雄, 乙黑一彥, 姚恩泰 申請人:中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所, 北里研究所