專(zhuān)利名稱(chēng)：應(yīng)用鏈霉屬菌wyec108控制植物病原菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能抑制土生植物病原菌生長(zhǎng)并促進(jìn)植物生長(zhǎng)的鏈霉屬細(xì)菌新菌株。
背景技術(shù)：
真菌性植物病原菌在農(nóng)業(yè)和園藝產(chǎn)業(yè)上引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。許多不同類(lèi)型的真菌性植物病原菌已被描述這些病原菌引發(fā)諸如(濕)爛病，白色腐爛病，棕色腐爛病和根腐爛病的植物疾病。這些疾病能殺死萌發(fā)的幼苗，降低植物活力并對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)量產(chǎn)生不利影響。
為減少真菌感染，在苗圃植物的苗圃上，可以在蒸汽滅菌或化學(xué)處理的土壤上生長(zhǎng)幼苗。然而，這些處理也去掉了土壤中的有益微生物，包括在正常情況下與土壤真菌相競(jìng)爭(zhēng)的微生物。在此情況下，如果意外地引入真菌性病原菌，它會(huì)迅速傳播并產(chǎn)生普遍的疾病。
在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，被植物病原性真菌感染的土壤不適于生長(zhǎng)某些農(nóng)作物。例如，在密歇根州和其它產(chǎn)大豆州，大豆生產(chǎn)經(jīng)常受到由真菌Phytophera megasperma引起的疫霉屬根腐爛病的嚴(yán)重限制(Filinow and Lockwood，1985)。Pythium真菌種類(lèi)在加利福利亞州，華盛頓州和愛(ài)達(dá)荷州的部分地區(qū)土壤中普遍存在。Pythium ultimum是遇到的最普遍的病原菌種類(lèi)，并與幼苗芽前和芽后的(濕)爛相聯(lián)系。這些是生長(zhǎng)于這些州的土壤和其它州和其它國(guó)家的土壤中的小麥、豌豆、鷹嘴豆和其它農(nóng)作物植物的嚴(yán)重病原菌(Trapero—Casas etal.，990；Stanghellini and Hancock，1970；Kraft and Burke，1971；Westerlund et al.，1988)。使用化學(xué)試劑來(lái)控制真菌性植物病原菌通常并不實(shí)際，因?yàn)榛ㄙM(fèi)昂貴，缺乏效力并且會(huì)出現(xiàn)具有抗性的真菌菌株。而且從環(huán)境角度來(lái)看，不應(yīng)使用化學(xué)殺真菌劑。
本發(fā)明的目的是提供減少植物被真菌性病原菌感染的生物控制方法。
發(fā)明概要上述目的是經(jīng)過(guò)分離許多顯示出有效抑制真菌性植物病原菌生長(zhǎng)的放線菌類(lèi)細(xì)菌來(lái)實(shí)現(xiàn)的。特別是本文命名為鏈霉屬菌WYEC108(本文也稱(chēng)作WYEC108)的一種分離的放線菌類(lèi)細(xì)菌對(duì)大范圍的真菌性植物病原體(包括引起通常作濕爛病，根腐爛病，白色腐爛病和棕色腐爛病的植物疾病的病原菌)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的拮抗作用。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是鏈霉菌屬WYEC108的生物學(xué)純的培養(yǎng)物。
本發(fā)明還提供了適于用鏈霉菌屬WYEC108處理植物種子或植物根的各種組合物。這些組合物對(duì)降低植物對(duì)真菌感染的易感性和促進(jìn)處理的植物的生長(zhǎng)有用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這類(lèi)組合物包含鏈菌霉WYEC108生物學(xué)純的培養(yǎng)物和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基。在特定實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基可包含藻酸鹽凝膠，泥炭、沙或玉米粉。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括包含泥炭、沙和玉米粉的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基和鏈霉菌屬WYEC108。在另一實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基包含每克轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基至少105集落形成單位。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包含含有鏈霉菌屬WYEC108的藻酸鹽凝膠塊。這種凝膠塊能直接加到生長(zhǎng)植物的根部或園藝或農(nóng)用土壤中以減少由植物病原性真菌引起的對(duì)植物的損害。
本發(fā)明還包含降低植物對(duì)真菌感染易感性的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包含將鏈霉菌屬WYEC108傳遞到植物根部。在另一實(shí)施方案中，該方法包含將種子浸入含有鏈霉菌屬WYEC108的組合物中并隨后將覆蓋的種子種植在適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)培養(yǎng)基中。在這種方法中，適當(dāng)?shù)慕M合物包括含有鏈霉菌屬WYEC108的藻酸鹽凝膠。
附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1包括掃描電子顯微照片，顯示鏈霉菌WYEC108的螺旋形鏈(上面)和表面的孢子(下面)。
圖2顯示生長(zhǎng)于感染了腐霉屬種類(lèi)的土壤上的鷹嘴豆植物。右側(cè)植物由用鏈霉菌WYEC108處理過(guò)的種子生長(zhǎng)而成。左側(cè)植物由未處理過(guò)的種子生成。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明描述了從土壤中分離許多放線菌類(lèi)菌株。這些菌株中許多顯示出能有效降低真菌性病原菌對(duì)植物(包括萵苣、鷹嘴豆和胡椒)的影響。特別是本發(fā)明闡述了本文稱(chēng)作鏈霉菌WYEC108的菌株的分離。菌株WYEC108對(duì)大范圍的真菌性植物病原菌(包括引起幼苗芽前和芽后的濕爛病，根腐爛病，棕色腐病和白色腐爛病的病原菌)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的拮抗作用。因此，菌株WYEC108特別適于作為生物控制劑、能用于保護(hù)植物免遭這些植物病原菌的感染。因而鏈霉菌WYEC108在降低植物對(duì)真菌感染的易感性的方法中有用。于是，用鏈霉菌WYEC處理過(guò)的植物將顯示出降低真菌感染的影響。易感染的未處理的植物被真菌感染后影響該植物的某些生長(zhǎng)特征。例如未處理的植物遭受真菌性病原菌作用后與未受真菌性病原菌作用的植物相比在植物高度、植物生物量和作物產(chǎn)量上顯著減少。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，用鏈霉菌WYEC108處理過(guò)并接著受真菌性病原菌作用的植物與受真菌性病原菌作用的未處理植物相比在植物高度、植物生物量和農(nóng)作物產(chǎn)量上表現(xiàn)出降低的嚴(yán)重程度較輕微。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，用鏈霉菌WYEC處理并受真菌性病原菌作用的植物可顯示出與未處理，未受病原菌作用的植物相似的生長(zhǎng)特征。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，用鏈霉菌WYEC108處理并遭受真菌性病原菌作用的植物表現(xiàn)出生長(zhǎng)特征優(yōu)于未處理未受病原菌作用的植物。
菌株WYEC108在與根際小菌叢的競(jìng)爭(zhēng)中定居于植物根上。菌株WYEC108表現(xiàn)出促進(jìn)生長(zhǎng)于蒸汽滅菌土壤上的萵苣植物和生長(zhǎng)于耕地上的胡椒植物的生長(zhǎng)。
本發(fā)明還包括生產(chǎn)適于摻入轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中的菌株WYEC108營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞或孢子的方法。含有WYEC108營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和孢子及轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基的組合物顯示出具有長(zhǎng)的貯存壽命并適于將菌株WYEC108傳遞給植物。
材料和方法細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基所有的細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基用蒸餾水配制并在使用前壓熱滅菌。所有的細(xì)菌樣品用標(biāo)準(zhǔn)的無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室技術(shù)處理以保持純凈。
YGM(酵母提取物/葡萄糖/無(wú)機(jī)鹽)培養(yǎng)基含有0.6％/(wt/vol)酵母提取物(Difco Laboratories，Detroit，Michigan)，1.0％(wt/vol)葡萄糖，無(wú)機(jī)磷酸鹽溶液(5.3g Na2HPO4，1.98g KH2PO4，0.2g MgSO4·7H2O，0.2g NaCl，0.05gCaCl2·2H2O，每升去離子H2O中加1.0ml微量元素(Pridham andGottlieb，1948)；pH7.1到7.2)。微量元素溶液由0.64gCu-SO4·5H2O，0.11g FeSO4·7H2O，0.79g MnCl2·4H2O，0.15g ZnSO4·7H2O溶于100ml蒸餾水中組成。
WYE(水/酵母提取物/瓊脂)培養(yǎng)基對(duì)Reddi和Rao(1971)作了修飾，它含有酵母提取物(Oxoid，0.25g/l)作為唯一的碳和氮源并含有瓊脂(Oxoid，18.0g/l)。培養(yǎng)基用K2HPO4(0.5g/l)緩沖到pH7.2—7.4。
WYEC(水/酵母提取物/纖維素/瓊脂)是在WYE瓊脂中加了一薄層覆蓋瓊脂。覆蓋瓊脂含0.25g/l纖維素(SolkaFloc，Sigma Chemical Co.)和18.0g/l瓊脂，溶于蒸餾水中。
CYD(酪蛋白氨基酸/酵母提取物/右旋糖瓊脂)培養(yǎng)基含酪蛋白氨基酸(Difco0.5g/l)。酵母提取物(Oxoid或Dif-co0.8g/l)，D—葡萄糖(0.4g/l)，K2HPO4(2.0g/l，pH7.2—7.4)和18.0g/l瓊脂，溶于蒸餾水中。
YCED(酪蛋白氨基酸/酵母提取物/右旋糖/瓊脂)是對(duì)Reddi和Rao(1971)的修飾，它含有酵母提取物(Oxoid，0.3g/l)，酪蛋白氨基酸(Difco，0.3g/l)，D—葡萄糖(0.3g/l)和瓊脂(Oxoid，18.0g/l)。培養(yǎng)基用K2HPO4(2.0g/l)緩沖。
CYPC(纖維素/酵母提取物/蛋白胨/培養(yǎng)料提取物/瓊脂)含有纖維素(Solka Flock，Sigma Chemical Col.5.0g/l)，酵母提取物(1.0g/l)，蛋白胨(Oxoid，1.0g/l)，磷酸鹽緩沖液(K2HPO4，0.75g/l)，瓊脂(18.0g/l)，并用培養(yǎng)料提取物(100ml/l)代替培養(yǎng)基中的100ml蒸餾水。將它直接注入且不用作覆蓋瓊脂。
MSSC(無(wú)機(jī)鹽/淀粉/酪蛋白/瓊脂；Turhan，1981)含有由NaCl(2.0g/l)，MgSO4·17H2O(0.05g/l)，CaCO3(0.02g/l)，F(xiàn)eSO4·18H2O(0.01g/l)和KNO3(2.0g/l)組成的無(wú)機(jī)鹽溶液，加入包括可溶淀粉(10.0g/l)和酪蛋白(0.3g/l)的有機(jī)組分并加入瓊脂(18.0g/l)。培養(yǎng)基用K2HPO4(2.0g/l)緩沖。
孢子形成培養(yǎng)基(ATCC培養(yǎng)基#5)含酵母提取物(1.0g/l)，牛肉膏(1.0g/l)，胰蛋白胚(2.0g/l)，F(xiàn)eSO4(0.01g/1)，葡萄糖(10.0g/l)和瓊脂(15.0g/l)。培養(yǎng)基在壓熱滅菌前調(diào)到pH7.2(ATCC細(xì)菌和噬菌體目錄第17版)。
CYG培養(yǎng)基含酪蛋白氨基酸(酸水解產(chǎn)物)(5.0g/l)，酵母提取物(5.0g/l)和萄萄糖(10.0g/l)，溶于蒸餾水，調(diào)到Ph7.1—7.2。
轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基(含下面所述比例的沙/玉米粉/水或泥炭/沙/玉米粉)使用前進(jìn)行蒸汽滅菌。經(jīng)壓熱滅菌3次，每次90分鐘來(lái)進(jìn)行典型的滅菌。
細(xì)菌生長(zhǎng)的收獲為了鏈霉菌WYEC108菌絲體的生長(zhǎng)，含500mlYGM培養(yǎng)基(pH7.1—7.2)的1升錐形瓶中接種20ml種子培養(yǎng)物(按實(shí)施例II所述制備)，在30℃下以250rpm搖動(dòng)培養(yǎng)3天。然后5000rpm離心10分鐘收獲菌絲體。作為選擇，可使培養(yǎng)物靜置直到菌絲體和孢子沉到錐形瓶底來(lái)收獲菌絲體。然后小心倒去上清液培養(yǎng)基，濃縮的菌絲體和孢子懸液直接用于接種轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基。
在固體培養(yǎng)基(例如孢子形成瓊脂)上生長(zhǎng)也產(chǎn)生細(xì)胞和孢子。經(jīng)過(guò)從瓊脂表面刮到蒸餾水中從孢子形成瓊脂上收獲菌絲體和孢子。然后孢子和菌絲體懸液直接混合進(jìn)轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中。
為了生產(chǎn)鏈霉菌WYEC108孢子，向含1200ml YGM培養(yǎng)基的2升錐形瓶中各接種50ml種子培養(yǎng)物并在30℃下以250rpm搖動(dòng)培養(yǎng)12—18天。9000rpm離心10分鐘收獲孢子。真菌性病原菌Phthium ultimum PuMXL從園藝研究國(guó)際組織(英國(guó)，Worthing Road；Littlehampton，West Sussex BN1764)微生物和農(nóng)作物保護(hù)部門(mén)的培養(yǎng)物保藏中心獲得。白腐菌Phane-rochaete chrysosporium和Coriolus versicolor；棕色腐菌Postiaplacenta，Caldariomyces fumago和Gloeophyllum trabeum；土生真菌性病原菌Rhizoctonia solani，F(xiàn)usarium sambucinctum，Geotrichum candidum，和Verticillium dahliae來(lái)自愛(ài)達(dá)荷大學(xué)(Moscow，ID)細(xì)菌學(xué)系Don L.Crawford教授的培養(yǎng)物保藏中心。Phthium irregulare，Phgtophthora capsici，phytophthoracinnamomi，Phytophthora parasitica，Sclerotinia Cepivorum和Sderotinia Sclerotiorum來(lái)自愛(ài)達(dá)荷大學(xué)(Moscow.ID)植物土壤昆蟲(chóng)科學(xué)系Dr.Wesley Chun的培養(yǎng)物保藏中心。Fusariu-moxysporum來(lái)自愛(ài)達(dá)荷大學(xué)(Moscow.ID)森林資源系Dr.Arthur D.Partridge的培養(yǎng)物收集中心。所有培養(yǎng)物在土豆右旋糖瓊脂或玉米粉瓊脂上保種并在25℃下生長(zhǎng)。這些菌株獲得時(shí)鑒定為病原菌，但沒(méi)有重新檢測(cè)其致病力。土壤生物鑒定為用于生物鑒定，從愛(ài)達(dá)荷MOSCOW附近Palouse地區(qū)的幾處收集天然感染Pythium ultimum的土壤。從在前兩季收獲過(guò)小麥和豌豆的耕地上部15cm收集土壤。按下面方法測(cè)定腐霉屬(Pythium)種類(lèi)的土壤種群1.0g空氣干燥的土壤在50ml無(wú)菌蒸餾水中形成的土壤稀釋液用渦流管混合器徹底混合。0.1ml充分混合稀釋的樣品以小滴加到老化3天的2％水瓊脂板(Stanghellini and Hancock，1970)上。平板在25℃下培養(yǎng)并使用低倍(X10)解剖顯微鏡在熒光照明下定期觀察以測(cè)定存在的腐霉屬種類(lèi)的特性和數(shù)量。在估計(jì)最終種群前，培養(yǎng)12，48和72小時(shí)后檢查每個(gè)板上的菌落。根據(jù)在顯微鏡下腐霉屬種類(lèi)真菌菌絲體的形態(tài)學(xué)特征和在2％(w/v)水瓊脂板上的生長(zhǎng)方式來(lái)鑒定。生長(zhǎng)于2％(w/v)水瓊脂板上純凈培養(yǎng)物的真菌菌落用作觀察鑒定目的的對(duì)照(Stanghellini and Hancock，1970；Stasz et al.，1980)。
對(duì)這些土壤的檢查表明在播種時(shí)(1992年春季)空氣干燥的土壤中P.ultimum和P.irregulare種群密度分別為354±15和194±11cfu/g。其它腐霉屬種類(lèi)的種群密度為57±9cfu/g空氣干燥的土壤。P.ultimum和P.irregulare是從收集的土壤中分離出的最普遍的種類(lèi)。
實(shí)施例I對(duì)真菌性植物病原菌表現(xiàn)出拮抗作用的放線菌類(lèi)菌株的分離從4種與根際相關(guān)的和4種與根系不相關(guān)的土壤樣品中分離放線菌類(lèi)菌株。然后試驗(yàn)這些菌株以便用作真菌性植物病原菌的抑制劑。放線菌類(lèi)的分離經(jīng)系列稀釋/涂板技術(shù)從8種不同土壤中分離出放線菌類(lèi)分離物。稀釋液(10-5到10-7)涂板到各種瓊脂分離培養(yǎng)基上。這些培養(yǎng)基組合物在上面“材料和方法”中所了闡述。根據(jù)分離時(shí)所用的分離培養(yǎng)基命名放線菌類(lèi)分離物。例如，WYEC108在WYEC培養(yǎng)基上分離，YCED9在YCED培養(yǎng)基上分離。一般來(lái)說(shuō)，這類(lèi)培養(yǎng)基缺乏有機(jī)碳，能有效控制真細(xì)菌類(lèi)和真菌生長(zhǎng)并幫助分離生長(zhǎng)緩慢的放線菌類(lèi)。由于WYE和YCED瓊脂是特別有效的分離培養(yǎng)基，因此主要使用它們。稀釋液平板在25℃培養(yǎng)4到10天，使放線菌形成孢子，然后挑出菌落并劃線到WYE或YCED瓊脂板上進(jìn)行純化。從這些平板上將純菌落轉(zhuǎn)移到Y(jié)CED瓊脂斜面或CYD瓊脂斜面上，25℃或37℃培養(yǎng)，直到形成孢子，貯存于5℃?zhèn)溆?。種子培養(yǎng)物每3到4周轉(zhuǎn)移一次。土壤(I)與根系無(wú)關(guān)的土壤土壤樣品(100到200g)取自英國(guó)4個(gè)地方土壤剖面的上部7.5到10cm處。包括在Rustington，West Sussex的栽培玫瑰花園(土壤S1)；在Littlehampton，West Sussex園藝研究國(guó)際組織(H.R.T.)農(nóng)場(chǎng)小麥地的行間(土壤S2)；在南威爾士Wynd Cliff硬材森林貯備區(qū)的森林土壤(土壤S6)，在West Sussex，South Downs，Hastings Hill有時(shí)牧羊的草地(土壤S7)。這些土壤認(rèn)為與根系無(wú)關(guān)，盡管它們含不同量的植物根。(II)與根系有關(guān)的土壤基本上按Miller et al.(1990)的方法從4個(gè)地區(qū)制備與根系有關(guān)的土壤。土壤3(S3)與英國(guó)West Sussex H.R.I.玫瑰花園的蒲公英植物(Taracum officinale)根相聯(lián)系。土壤(S5)與小麥根相聯(lián)系，取自與S2相同的土壤(West Sussex.Littlehampton H.R.I.農(nóng)場(chǎng)的小麥地)。土壤4(S4)也與小麥根相聯(lián)系，但土壤取自West Sussex，沿South Downs Way的Big-nor Hiu田野。土壤8(S8)與亞麻子植物根相聯(lián)系并取自與S7取樣地相鄰的田野(West Sussex，South Downs，HastingHill有時(shí)牧羊的草地)。
從土壤分離的放線菌類(lèi)可分成從與根際無(wú)關(guān)(S1，S2，S6和S7)或與根際有關(guān)(S3，S4；S5和S8)的土壤分離的放線菌類(lèi)。經(jīng)過(guò)在100℃干燥3g(濕重)樣品(一式三份)58h并重新稱(chēng)重來(lái)鑒定所有土壤的水份含量。經(jīng)過(guò)徹底混合土壤水為1∶1的懸液，使固體沉積2h。取上清液測(cè)pH值來(lái)鑒定土壤pH。收集后，土壤貯存于4℃?zhèn)溆?24到48h)。經(jīng)過(guò)對(duì)這些菌株形成的菌落顯示為典型放線菌類(lèi)菌落(堅(jiān)硬并呈革質(zhì)，具有含孢子的氣生菌絲)的觀察檢查來(lái)證實(shí)分離物是放線菌類(lèi)菌株。鑒定這些菌株為放線菌類(lèi)的進(jìn)一步證實(shí)可經(jīng)顯微鏡檢術(shù)獲得。測(cè)定生長(zhǎng)的pH范圍試驗(yàn)每個(gè)放線菌分離物在pH5.5到8.0的生長(zhǎng)力。培養(yǎng)物以點(diǎn)接種到用100mM濃度的K2HPO4和KH2PO4緩沖液組合物緩沖成pH5.5，6.0，6.5，7.0和8.0的CYD瓊脂板上。壓熱滅菌前將每種培養(yǎng)基的最終pH調(diào)成其最終值。25或37℃培養(yǎng)5到7天后檢查培養(yǎng)物的生長(zhǎng)。經(jīng)觀察評(píng)估平板上的很少或觀察不到的生長(zhǎng)(±)，一些生長(zhǎng)(+或++)，或優(yōu)良生長(zhǎng)(+++)。
如表I所示，與根際有關(guān)的土壤得到的分離物數(shù)量幾乎是與根際無(wú)關(guān)的土壤的兩倍。試驗(yàn)了每種分離物在pH5.5到pH8.0范圍的CYD瓊脂培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)。所有分離物在pH6.5到8.0生長(zhǎng)，僅9號(hào)在pH6.0不生長(zhǎng)，57個(gè)(21％)在pH5.5時(shí)不生長(zhǎng)。在pH5.5生長(zhǎng)的菌株中，取決于分離物的不同生長(zhǎng)狀況從很差到優(yōu)良之間變動(dòng)。經(jīng)培養(yǎng)5—10天后肉眼和顯微鏡觀察菌落還測(cè)定了分離物在CYD瓊脂上形成孢子的能力。
表I選擇性培養(yǎng)基土壤土壤pHYCEDWYE 總數(shù)與根系無(wú)關(guān)的土壤 7717.5 8 162425.4 561167.2 2082877.4 13114與根系相關(guān)的土壤 14037.0 17 223947.6 32 336556.5 11 152687.3 8210總分離物 114 103217
體外拮抗試驗(yàn)根據(jù)在CYD瓊脂上充分生長(zhǎng)和大量形成孢子的能力選擇了82個(gè)分離物。
使用體外平板試驗(yàn)檢測(cè)這些分離物抑制P.ultimum生長(zhǎng)的能力。將每種放線菌劃線接種到玉米粉瓊脂(CMA)板中心的一側(cè)。將培養(yǎng)物在25℃培養(yǎng)大約8天或直到培養(yǎng)物形成孢子。然后將含活躍生長(zhǎng)的P.ultimum菌絲體的CMA瓊脂塊(0.5cm2)無(wú)菌放置到平板中央。繼續(xù)培養(yǎng)96小時(shí)。48小時(shí)和96小時(shí)后檢查對(duì)P.ultimum生長(zhǎng)的抑制。當(dāng)在放線菌菌落方向P.ultimum菌絲體的生長(zhǎng)停滯或受阻時(shí)表明有抑制作用。本試驗(yàn)的結(jié)果如表II所示。
表II培養(yǎng)物 來(lái)源 生長(zhǎng)干pH5.5觀察到的拮抗作用a(土壤) (+或-) 48hr96hr拮抗的(96hr)WYEC108 8 + ++++++YCED11 + ++ ++YCED92 + ++++++YCED35 4 + + +YCED48 4 + + +YCED95 7 + + +YCED106 7 + +++++WYE214 + + +WYE224 + + +WYE304 - + +WYE314 + + +WYE781 + ++ ++WY88 1 + + +WYE906 + ++++++WYE916 + ++++++WYE971 + ++ ++MSSC12 + + +MSSC22 + + +
培養(yǎng)物 來(lái)源 生長(zhǎng)于pH5.5 觀察到的拮抗作用a(土壤) (+或-)48hr96hr無(wú)拮抗的(96hr)WYE6 1+ +-WYE9 3+ --WYE11 3+ +-WYE12 4+ +-WYE13 4+ --WYE20 4+ --WYE23 3+ --WYE27 4- --WYE28 3+ --WYE29 4+ +±WYE34 3+ --WYE35 3+ --WYE38 4+ --WYE42 3+ --WYE43 4+ --WYE45 3+ --WYE47 3+ --WYE53 4+ --WYE54 3+ --WYE56 3+ --WYE68 5+ --WYE69 6+ --WYE73 6+ --WYE75 2+ --WYE77 2+ ± ±WYE84 2+ --WYE85 2+ --WYE93 1+ --WYE94 1+ --WYE120 8+ --WYE121 7+ --
培養(yǎng)物 來(lái)源 生長(zhǎng)于pH5.5觀察到的拮抗作用a(土壤) (+或-) 48hr96hrYCED111 +--YCED154 +--YCED164 +--YCED173 +--YCED254 +--YCED284 +--YCED293 +--YCED303 +--YCED313 +--YCED324 +--YCED414 +--YCED444 +± -YCED544 +--YCED564 +--YCED625 +--YCED645 ---YCED715 +--YCED735 +--YCED856 ---YCED885 +--YCED937 +--YCED967 +--YCED988 +--YCED105 7 +--WYEC101 4 +--WYEC104 8 +--WYEC107 7 -± -WYEC111 8 +--WYEC113 8 +± ±WYEC116 8 +--WYEC118 7 +--CYPC2 6 +--CYPC5 6 +--
a.對(duì)P.ultimum的抑制定義為在平板上生長(zhǎng)放線菌的一側(cè)菌絲生長(zhǎng)量較少和生長(zhǎng)輕微停滯。
+++.抑制圈≥2.0cm的非常強(qiáng)烈抑制。
++.抑制圈≥1.0cm的非常強(qiáng)烈抑制。
+.生長(zhǎng)明顯停滯，菌落周?chē)忻黠@的抑制圈。
±.對(duì)P.ultimum有輕微的抑制(菌絲生長(zhǎng)量較小和生長(zhǎng)停滯)一.無(wú)抑制96小時(shí)后，5種分離(WYEC108，YCED9，YWE91，WYE90和YCED106)對(duì)P.ultimum表現(xiàn)出非常強(qiáng)的拮抗作用，4種(YCED1，YCED106，WYE97和WYE98)表現(xiàn)出強(qiáng)烈拮抗作用，其它10種表現(xiàn)出微弱拮抗作用。剩下的分離物無(wú)拮抗作用或有非常微弱的頏抗作用。明顯抑制P.ulti-mum生長(zhǎng)的培養(yǎng)物在從與根際相關(guān)的土壤中分離的菌株和從與根際無(wú)關(guān)的土壤中分離的菌株中的分布大約相等。
在玉米粉瓊脂(CMA)上也檢查了70種在pH5.5生長(zhǎng)的分離物對(duì)白斑腐菌Phanerochaete chrysosporium的體外拮抗作用。對(duì)白斑腐菌表現(xiàn)出一定程度拮抗作用的13種分離物如表III所示。以抑制圈的大小定義的拮抗作用程度范圍從非常強(qiáng)烈(+++)到相當(dāng)弱(+)。對(duì)P.Chrysosporium表現(xiàn)出拮抗作用的5種培養(yǎng)物(WYEC108，WYE78，WYE90，YCED9和MSSC2)在CMA上進(jìn)一步檢查了它們對(duì)其它白斑腐菌(Coriolus Versicolor)和2類(lèi)棕斑腐菌(Postia placenta和Gloeophyuum trabeum)的拮抗作用。4種分離物(MSSC2，YCED9，WYE90，WYEC108)對(duì)上述白斑和棕斑腐菌表現(xiàn)出非常強(qiáng)烈的拮抗作用。一種分離物(WYEC78)僅對(duì)兩種白斑腐菌表現(xiàn)出強(qiáng)烈拮抗作用。
表III來(lái)源生長(zhǎng)于pH5.5觀察到的拮抗作用a培養(yǎng)物(土壤) (+或-) 48hr96hr有拮抗的WYEC108b8 + +++ +++WYE224 + ++ ++WYE78c1 +++WYE90b6 + +++ +++WYE971 + ++ ++YCED9b2 + +++ +++YCED29 3 +++YCED41 4 +++YCED48 4 +++YCED95 7 + +++CYPC26 + ++ ++CYPC56 +++MSSC2b2 + +++ ++a.對(duì)P.ChrySosporium的抑制定義為在放線菌生長(zhǎng)的平板一側(cè)區(qū)域菌絲的生長(zhǎng)量較少和生長(zhǎng)輕微停滯。
+++.抑制圈≥2.0cm的非常強(qiáng)烈的抑制
++.抑制圈≥1.0cm的強(qiáng)烈的抑制+.生長(zhǎng)明顯停滯，菌落附近有明顯的抑制圈±.對(duì)P.Chrysosporium的輕微抑制(菌絲生長(zhǎng)量較少且生長(zhǎng)停滯)一.無(wú)抑制b.對(duì)Coriolus versicolor，Postia placenta，Gloeophyllumtrabeum和P.Chrysosporium的抑制。
c.除P.chrysosporium外，對(duì)Postia placenta和Gloeophyl-lum trabeum的抑制。
體內(nèi)生物鑒定以測(cè)定放線菌分離物在萵苣幼苗上的活性使用Lynch et al.(1991，1992)的生物控制試驗(yàn)程度試驗(yàn)12種分離物對(duì)萵苣(Latuca sativa)種子發(fā)芽和長(zhǎng)出的影響。
對(duì)于對(duì)照植物，向9cm直徑的塑料盆中裝入萵苣盆栽混合物并用培養(yǎng)皿填塞下去。在上面放入10個(gè)萵苣種子。輕輕壓進(jìn)盆栽混合物中，并輕輕覆蓋上疏松的混合物。危害后將盆放在水槽中的托盤(pán)上。在黑暗中20到22℃培養(yǎng)直到明顯發(fā)芽(大約3天)。然后將托盤(pán)轉(zhuǎn)移到維持在15到25℃的溫室毛細(xì)草度上并根據(jù)需要澆水。定期計(jì)數(shù)每個(gè)盆中發(fā)芽的幼苗數(shù)，計(jì)數(shù)到第18天。
對(duì)于用放線菌分離物處理的植物，向盆中裝入接種了特異性放線菌孢子的盆栽混合物。用CYD種子斜面的孢子接種盆栽混合物，平均水平為108到109cfu/g(干重)盆栽混合物。經(jīng)過(guò)接種時(shí)在CYD瓊脂板上的活體計(jì)數(shù)測(cè)定盆栽混合物的cfu/g，然后按上述種植萵苣種子，蓋上少量的接種過(guò)的盆栽混合物，隨后與對(duì)照相同進(jìn)行處理。
對(duì)于用特異性放線菌和濕爛病真菌Pythium ultimum(菌株P(guān)uMXL，Lynch et al.，1991)處理過(guò)的植物，混合物還以ca.200孢子囊/g(干量)的混合物接種真菌性病原菌。使用Lynch等(1991，1992)的程序生產(chǎn)病原菌孢子囊并接種盆栽混合物。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行孢子囊計(jì)數(shù)，用前經(jīng)通過(guò)萵苣傳代證實(shí)P.ultimum菌株的致病力。
在所有處理中，準(zhǔn)備一式五盆。在溫室里，盆的放置以隨機(jī)的區(qū)組排列并補(bǔ)充“衛(wèi)士植物”包圍，衛(wèi)士植物用于提供均勻的條件并權(quán)當(dāng)緩沖物。種植18天后，收獲植物，測(cè)量最終伸出的突出體，測(cè)定濕重量和干重(地面上的葉和莖)。植物濕重和干重記錄為每盆總mg生物量，并作為每個(gè)植物的平均mg生物量。此值報(bào)道為5份的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。因此，每個(gè)值是根據(jù)每次處理種植的50粒種子(種植了5盆，每盆10粒種子)得到的。同樣計(jì)算種子發(fā)芽百分?jǐn)?shù)和最終植物長(zhǎng)出值。
表IV濃度×105每盆的健康 幼苗重量放線菌類(lèi)cfug-1植物數(shù)(n)鮮重 干重菌株干重混合物 -P1 +P1*-P1 +P1 -P1 +P1未接種的對(duì)照 9.83.6 1.340.75 0.074 0.034YCED85 5.19 10.06.6a 1.440.98 0.087 0.054aWYE27 3.02 10.05.0 1.540.72 0.090 0.039YCED64 3.21 9.85.6a 1.440.91 0.084 0.057aWYEC107 2.88 9.85.6a 1.68a 0.81 0.096 0.041WYE41 1.18 10.04.2 1.450.73 0.087 0.047YCED106 1.30 10.05.4a 1.490.69 0.08 0.040YCED71 5.25 10.06.2a 1.420.85 80.082 0.050WYE88 1.44 10.06.2a 1.420.73 0.082 0.042MSSC1 2.13 9.84.6 1.381.16a0.079 0.060aWYE21 9.56 10.06.6a 1.491.09a0.091 0.059aWYE30 18.9010.05.0 1.530.86 0.088 0.046WYE28 0.18 10.03.6 1.390.90 0.079 0.049P1*P.ultimum200個(gè)孢子囊每g干重量盆栽混合物。其中n＝總共5盆的10株植物中每盆的健康植物平均數(shù)。
a.與相應(yīng)的時(shí)照值以P＝0.05水平的顯著不同，自由度＝100當(dāng)不存在病原菌時(shí)(表IV是表示為“—P1”)，接種放線菌的盆和對(duì)照盆(無(wú)放線菌)之間種子發(fā)芽和產(chǎn)生健康植物百分?jǐn)?shù)無(wú)明顯區(qū)別。所有例子中種子發(fā)芽和生長(zhǎng)平均≥98％。然而，放線菌類(lèi)的存在有時(shí)使種子生長(zhǎng)延遲1到3天(數(shù)據(jù)未顯示)。同樣，不存在病原菌時(shí)在接種放線菌的盆和對(duì)照盆之間以鮮重或干重測(cè)量的植物幼苗重一般無(wú)明顯區(qū)別。接種了WYEC107的盆是一個(gè)例外，其中放線菌的存在明顯提高了植物生物量的產(chǎn)量。
存在病原菌時(shí)(+P1)，種植20天后在對(duì)照盆中每盆健康植物數(shù)平均為每10.0株中有3.6株，而無(wú)病原菌的對(duì)照盆中每10.0株中有9.8株。然而，當(dāng)存在特異性放線菌時(shí)，可見(jiàn)在接種病原菌的盆中有些健康植物數(shù)明顯提高。12種放線菌中的7種(YCED85，YCED64，WYEC107，YCED106，YCED71，WYE88，和WYE21)明顯提高健康植物產(chǎn)量。其中，YCED85，YCED64和WYE21與僅有病原菌的對(duì)照相比還明顯提高植物干重產(chǎn)量。WYE21相對(duì)于僅有病原菌的對(duì)照而言還明顯提高濕重產(chǎn)量。不明顯提高健康植物量的一個(gè)菌株(MSSCl)使植物幼苗的鮮重和干重產(chǎn)量都提高(表IV，5和7欄)。因此，證明MSSCl在保護(hù)植物抵抗比本實(shí)驗(yàn)所用劑量更低的P.ultimum上是有用的。
實(shí)施例II鏈霉菌WYEC108的分離根據(jù)伯捷氏細(xì)菌分類(lèi)手冊(cè)(1986)定義的鏈霉菌屬形態(tài)特征鑒定菌株WYEC108是鏈霉菌屬種類(lèi)。WYEC108是絲狀細(xì)菌，在氣生菌絲體上產(chǎn)生孢子鍵。如上所述。鏈霉菌屬WYEC108作為許多放線菌類(lèi)菌株中的一員被分離，分離這些放線菌的土壤取自英國(guó)的8個(gè)不同地點(diǎn)。鏈霉菌屬WYEC108與其它放線菌類(lèi)一起以系列稀釋/涂板技術(shù)從取自英國(guó)West Sussex，South Downs，Hasting Hill耕地的與亞麻子植物根相聯(lián)的根系土壤中分離出。該土壤的稀釋液(10-5和10-7)涂板到分離瓊脂培養(yǎng)基WYE上。稀釋液板在25培養(yǎng)4到10天，使放線菌類(lèi)菌落生長(zhǎng)和形成孢子。然后挑出菌落，劃線到WYEC瓊脂板上進(jìn)行純化。從這些板上將純化的WYEC108菌落轉(zhuǎn)移到CYD瓊脂斜面上，25℃培養(yǎng)到形成孢子，貯存于4℃?zhèn)溆谩７N子培養(yǎng)物每3到4周轉(zhuǎn)移一次。
鏈霉菌屬WYEC108的鑒定如上所述，檢查分離的放線菌類(lèi)菌株在CYD瓊脂上充分生長(zhǎng)和大量形成孢子的能力。隨后，試驗(yàn)大量分離物在體內(nèi)抑制植物病原菌Pythium ultimatum生長(zhǎng)的能力。還試驗(yàn)了分離物在體外對(duì)白斑腐菌Phanerochaete Chrysosporium和Coriolus Versicolor及棕斑腐菌Postia placenta和Gloeophyllumtrabeum的拮抗作用。作為這些試驗(yàn)的結(jié)果，根據(jù)其有利特性選出了這些菌株中的一種，本文稱(chēng)作鏈霉菌屬WYEC108。
生長(zhǎng)于酪蛋白氨基酸/酵母提取物/右旋糖(CYD)板上的鏈霉菌屬WYEC108菌落用掃描電子顯微鏡檢術(shù)進(jìn)行了檢查。樣品制備如下(1)用含1.5％戊二醛的0.2M二甲胂酸鈉緩沖液覆蓋CYD板上的鏈霉菌屬WYEC108菌落并固定至少2小時(shí)；(2)使用0.2M二甲胂酸鈉緩沖液經(jīng)過(guò)用吸管吸出上次的液體并用新緩沖液代替來(lái)徹底洗滌(2X)菌落。注意確保樣品不干涸；(3)經(jīng)制備含菌落的瓊脂“栓”取出菌落；(4)將“栓”放入單個(gè)網(wǎng)眼容器中并在100％乙醇(2X)中進(jìn)行脫水(J.T.Baker Inc.，Phillipsberg，NJ)；(5)然后在臨界點(diǎn)干燥器中干燥樣品并使用膠體銀輸導(dǎo)染料在單個(gè)標(biāo)本樁中封固。用60/40金—鈀覆蓋后用掃描電子顯微鏡觀察。圖1是掃描電子顯微照片，顯示了鏈霉屬WYEC108的螺旋形鏈(上部)和孢子表面(下部)。觀察到孢子表面相當(dāng)光滑。
也鑒定了菌株WYEC108的各種生理特征菌株WYEC108在蛋白胨—酵母—鐵瓊脂和蛋白胨—鐵瓊脂(DifcoLab.Detroit，Michigan)上都不產(chǎn)生黑色素或H2S。鏈霉菌屬WYEC108在CYD板上產(chǎn)生的孢子團(tuán)顏色是灰色。菌株在45℃不生長(zhǎng)。鏈霉菌屬WYEC108屬于按伯捷氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)(1986)定義的利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)種類(lèi)。因此，這種微生物也可稱(chēng)作利迪鏈霉菌(Streptomyces Lydicus)WYEC108，為了簡(jiǎn)潔，本文稱(chēng)該微生物為鏈霉菌屬WYEC108，或簡(jiǎn)稱(chēng)為WYEC108。
ATCC保藏號(hào)按照布達(dá)佩斯條約的規(guī)定于1993年6月29日將鏈霉菌屬WYEC108保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(Rockville，MD)。該菌株命名的ATCC保藏號(hào)為No.55445。
鏈霉菌屬WYEC108種子培養(yǎng)物的制備對(duì)于短期使用，將鏈霉菌屬WYEC108在CYD瓊脂或孢子形成瓊脂斜面上25℃培養(yǎng)直到形成孢子并貯存在4℃?zhèn)溆?。?duì)于長(zhǎng)期貯存的培養(yǎng)物將單個(gè)瓊脂斜面或平板上的孢子懸浮于10ml無(wú)菌的YGM培養(yǎng)基中制備10ml孢子懸液。然后用該孢子懸液接種含100ml YGM(酵母提取物/萄萄糖/無(wú)機(jī)鹽)培養(yǎng)基的250ml錐形瓶。接著在30℃下將錐形瓶以250rpm搖動(dòng)培養(yǎng)32—36小時(shí)以提供標(biāo)準(zhǔn)接種物。
生長(zhǎng)于YGM的標(biāo)準(zhǔn)接種物樣品也用于制備甘油培養(yǎng)物，適于長(zhǎng)期貯存于—70℃和適于凍干。
實(shí)施例III鏈霉菌屬WYEC108對(duì)真菌性植物病原菌的體外拮抗在菌落生長(zhǎng)抑制方面測(cè)定了鏈霉菌屬WYEC108抑制選定的真菌性植物病原菌生長(zhǎng)的能力。
將鏈霉菌屬WYEC108劃線接種玉米粉瓊脂(CMA)(Difco Lob.，Detroit，Michigan)平板中央的一側(cè)。接種的平板在25℃培養(yǎng)大約8—12天直到培養(yǎng)物形成孢子。經(jīng)過(guò)裸眼觀察灰色氣生菌絲體和孢子團(tuán)可檢查孢子的形成。經(jīng)過(guò)相差顯微鏡檢術(shù)(1000)可觀察孢子形成。從真菌培養(yǎng)物前緣取下含活躍生長(zhǎng)的特定真菌性植物病原菌菌絲體的5mm直徑的CMA瓊脂圓片并無(wú)菌放置到瓊脂平板的中央。平板在25℃下培養(yǎng)直到試驗(yàn)真菌達(dá)到不合鏈霉菌屬WYEC108的對(duì)照平板邊緣。經(jīng)過(guò)測(cè)定在鏈霉菌屬WYEC108影響下真菌性病原菌的放射狀生長(zhǎng)與在對(duì)照板上的單獨(dú)生長(zhǎng)之比率來(lái)定量對(duì)真菌生長(zhǎng)的抑制。取決于選定的病原性真菌的不同在培養(yǎng)48、96和192小時(shí)后記錄真菌生長(zhǎng)的抑制百分?jǐn)?shù)。生物測(cè)定在5個(gè)平板上重復(fù)，分別測(cè)定抑制，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差來(lái)記錄。
這些體外生物測(cè)定的結(jié)果如表V所示。這一資料表明鏈霉菌屬WYEC108對(duì)大范圍的真菌性植物病原菌，包括濕爛病(Pyhthium ultimum)，根腐病(Pythium ultimum，Rhizocto-mia solani，F(xiàn)usarium solani.和Phytophthora cinnamomi)，白斑腐病(Phanerochaete chrysosporium和CorioluS versicolor)，棕斑腐病(Postia placenta和Gloeophyllum trabeum)和葉及莖腐病(Sclerotinia sp.)真菌表現(xiàn)出非常強(qiáng)烈的拮抗作用。
表V真菌性抑制百分?jǐn)?shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差a觀察到的拮抗作用病原菌48小時(shí)96小時(shí)Pythium irregulare 100±0.0 100±0.0Pythium ultimum 100±0.0 100±0.0Rhizoctonia solani 100±0.0 84±0.0Fusarium oxysporum26±2.5 26±3.6Fusarium sambucinctum 44±2.4 35±2.4Fusarium solani 36±2.5 19±2.5Phytophthora capsici 100±0.0 100±0.0Phytophthora cinnamomi 100±0.0 100±0.0Phytophthora parasitica 100±0.0 100±0.0Sclerotinia cepivorum100±0.0 95±1.5Sclerotinia sclerotiorum 100±0.0 100±0.0Phaneroehaete chrysosporium 100±0.0 100±0.0Coriolus versicolor 100±0.0 100±0.0Postia placenta 100±0.0c100±0.0dCaldariomyces fumago 100±0.0c100±0.0dGloeophyllum trabeum 100±0.0c100±0.0dGeotrichum candidum 47±2.1 45±2.1Verticillium dahliae 73±2.0c59±2.0d
a.該值由5個(gè)重復(fù)的平板單個(gè)值取平均數(shù)得到。經(jīng)過(guò)分別測(cè)量每個(gè)平板中菌絲體的生長(zhǎng)來(lái)測(cè)定單個(gè)值。
b.真菌性病原菌抑制定義為在鏈霉菌屬WYEC108的影響下病原菌菌絲生長(zhǎng)比在對(duì)照CMA板上的單獨(dú)生長(zhǎng)。
c和d分別為在培養(yǎng)96小時(shí)和192小時(shí)的抑制％。
實(shí)施例IV使用鏈霉菌屬WYEC108處理種子經(jīng)過(guò)給未發(fā)芽的鷹嘴豆種子施用菌株WYEC108并將這些種子種植在用真菌性植物病原菌P.ultimatum和P.irreg-ulare感染的土壤中來(lái)測(cè)定鏈霉菌屬WYEC108細(xì)胞保護(hù)植物抵抗植物病原菌的效力。
經(jīng)乙醚提取從培養(yǎng)物中提取由菌株WYEC108產(chǎn)生的胞外代謝物。還測(cè)定了這些代謝物對(duì)萌發(fā)的鷹嘴豆幼苗感染真菌的影響。鏈霉菌屬WYEC108的生長(zhǎng)為了菌株WYEC108細(xì)胞的生長(zhǎng)，向1升含有500mlYGM(pH7.1—7.2)的錐形瓶中接種20ml種子培養(yǎng)物并在30℃以250rpm搖動(dòng)培養(yǎng)3天以產(chǎn)生細(xì)胞團(tuán)。為了產(chǎn)生抗真菌代謝產(chǎn)物，向含500ml CYD(pH7.1—7.2)的1升錐形瓶中接種20ml種子培養(yǎng)物并在30℃以下250rpm搖動(dòng)培養(yǎng)7天。用鏈霉菌屬WYEC108和抗真菌代謝產(chǎn)物處理種子經(jīng)以5000rpm離心10分鐘從500ml培養(yǎng)3天的YGM液體培養(yǎng)物中收獲鏈霉菌屬WYEC108菌絲體懸液。收獲的菌絲體重量懸于200—300ml滅菌的3％(W/V)藻酸鈉溶液中以得到1.0—1.2×104cfu/ml的培養(yǎng)物密度。然后將鷹嘴豆種子加入充分混合的細(xì)胞藻酸鹽懸液中并一個(gè)一個(gè)地將種子轉(zhuǎn)移到滅菌的0.25M CaCl2蒸餾水溶液中。這些種子用于下面所述的生物控制試驗(yàn)中。
按下面以純化形式獲得鏈霉菌WYEC108產(chǎn)生的抗真菌代謝物。過(guò)濾7日齡的500ml培養(yǎng)物以去掉細(xì)胞，接著使用提取漏斗以150ml乙醚進(jìn)行提取。然后經(jīng)真空蒸發(fā)去掉乙醚并將所得的提取物重溶于1.5ml蒸餾水中。將這一溶液通過(guò)無(wú)菌的0.45μm濾器過(guò)濾滅菌并加入到10ml 3％(W/V)藻酸鈉溶液中。純化的抗真菌代謝和可用于保護(hù)植物抵抗真菌感染。優(yōu)選的是抗真菌代謝物可被純化以便基本上不含WYEC108細(xì)胞。然而，WYEC108細(xì)胞和/或孢子以及抗真菌代謝物制品預(yù)期也對(duì)真菌性植物病原菌有效?？拐婢x物—藻酸鹽懸液按上面所述用于處理鷹嘴豆種子以便用于生物控制試驗(yàn)?；铙w生物控制試驗(yàn)被P.ultimum和P.irregulareis自然感染的土壤在上面“材料和方法”中已描述。這種農(nóng)用土壤用于本活體生物控制試驗(yàn)。經(jīng)過(guò)徹底混合土壤∶水(1∶1)懸液，使固體沉降2小時(shí)，測(cè)上清液的pH來(lái)測(cè)定土壤的pH值為pH5.6。切碎土壤，徹底混勻并放入苗盆(10cm深X直徑10cm)中。
將用鏈霉菌屬WYEC108或抗真菌代謝物處理過(guò)的未發(fā)芽的鷹嘴豆種子種入感染的土壤中進(jìn)行活體生物控制試驗(yàn)。未處理的種子種入相同的土壤中用作對(duì)照。該方法包括下面的步驟1).每個(gè)盆底放入1cm深的泥炭以防止土壤流失且還能提供通氣和排水。
2).用感染的土壤填塞苗盆。
3).從底部澆水使土壤浸透。土壤表面浸透后，將未處理的和處理的鷹嘴豆種子放到土壤上并用相同的土壤覆蓋1.5—2.0cm深。經(jīng)過(guò)從下面濕土壤空隙的毛細(xì)作用使上部濕潤(rùn)。在3份相同的苗盆中各植入10粒種子。土壤中不加肥料。為減少干燥和阻止表面結(jié)塊，用干凈的塑料布蓋住苗盆直到幼苗長(zhǎng)出。從幼苗長(zhǎng)出后開(kāi)始，如果需要，向盆頂噴灑更多的水，實(shí)驗(yàn)在15—30℃具有12hr光照和12hr黑暗和循環(huán)光周期(16000lux)的溫室中進(jìn)行。
定期計(jì)數(shù)鷹嘴豆幼苗萌發(fā)數(shù)，20天后計(jì)下最終萌發(fā)數(shù)。萌發(fā)數(shù)據(jù)以每種處理的平均數(shù)來(lái)報(bào)道。鏈霉菌屬WYEC108作為生物控制劑的能力以總萌發(fā)數(shù)，植物高度，植物鮮重為基礎(chǔ)并與未用生物控制劑處理的種子萌發(fā)的對(duì)照植物進(jìn)行比較。生物控制試驗(yàn)的結(jié)果如表VI所示。
表VI
c.在3％的藻酸鹽中，覆蓋于種子上。
d.不含WYEC108x.指在欄中這種標(biāo)記的值在P＝0.05水平差異不顯著。
鏈霉菌屬WYEC108細(xì)胞和這些細(xì)胞產(chǎn)生的抗真菌代謝物都減少鷹嘴豆Pythium濕爛病。
當(dāng)種子用鏈霉菌WYEC108細(xì)胞覆蓋時(shí)，植物表現(xiàn)出茁壯生長(zhǎng)。與覆蓋了鏈霉菌屬WYEC108細(xì)胞的種子發(fā)芽的植物相比，對(duì)照(未處理的)鷹嘴豆種子萌發(fā)的植物高度和鮮重明顯減少。由于當(dāng)種子天然感染P.ultimum和).irregular的土壤中時(shí)，由P.ultimum引起的種子腐爛和芽前的濕爛病使未處理的鷹嘴豆種子出芽率大量降低(6.7％出芽率)。與此相反，播種前用鏈霉菌WYEC108細(xì)胞處理的種子萌發(fā)率為63.3％。僅用藻酸鹽處理的種子萌發(fā)率不增加。Pythium根腐病的典型癥狀包括根毛缺乏和根褪色在收獲的對(duì)照種子發(fā)芽的鷹嘴豆根中較明顯，但在用鏈霉菌屬WYEC108細(xì)胞處理的種子長(zhǎng)成的植物中缺乏這些癥狀。在對(duì)照中，鷹嘴豆的損傷主要以種子腐爛，出芽前的濕爛病的形式出現(xiàn)，萌發(fā)和生長(zhǎng)的鷹嘴豆幼苗發(fā)育遲緩，其根被P.ultimum嚴(yán)重感染。圖2顯示了生物控制試驗(yàn)中的鷹嘴豆植物的并肩比較。左側(cè)顯示的對(duì)照植物從未處理的種子發(fā)芽而成，表現(xiàn)出普遍的根部感染并缺乏次生根和根毛，而右側(cè)所示的從鏈霉菌屬WYEC108覆蓋的種子萌發(fā)的植物表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)并正常形成次生根和根毛。
以乙醚可溶性代謝物形式的抗真菌代謝物處理的鷹嘴豆種子的萌發(fā)率(33.3％)比對(duì)照種子(6.7％)要高，但比鏈霉菌WYEC108細(xì)胞覆蓋的種子(63.3％)要低。用抗真菌代謝物處理的種子長(zhǎng)出的植物與對(duì)照植物相比表現(xiàn)出茁壯生長(zhǎng)，根較長(zhǎng)，根毛發(fā)育的密度較高。
實(shí)施例V鏈霉菌屬WYEC108對(duì)Pythium ultimum引起的根部感染和種子腐爛的影響檢查按實(shí)施例IV所述生長(zhǎng)于天然感染Pythium ultimum的土壤中并用WYEC108預(yù)先處理和不處理的鷹嘴豆幼苗以測(cè)定菌株WYEC108對(duì)P.ultimum感染的影響。
用生長(zhǎng)20天后收獲的對(duì)照(未處理的)鷹嘴豆幼苗研究P.ultimum引起的根部感染。從這些對(duì)照植物腐爛的根中還分離出了引起根腐爛的P.ultimum。經(jīng)過(guò)先用自來(lái)水洗滌鷹嘴豆根(小根和根毛)部的土壤并接著用無(wú)菌蒸餾水漂洗兩次來(lái)完成P.ultimum的分離。用剃刀刀片無(wú)菌切下褪色的和腐爛的根并放在3日齡2％水瓊脂板上。將平板在室溫培養(yǎng)24—48小時(shí)并在相差顯微鏡下(X40)觀察。從感染的鷹嘴豆根部長(zhǎng)出的P.ultimum在新鮮的2％水瓊脂上傳代培養(yǎng)并隨后按以前所述(Ingram and Cook，1990)進(jìn)行鑒定。
用20天后收獲的腐爛的對(duì)照種子研究由P.ultimum引起的種子腐爛。用無(wú)菌牙簽將腐爛種子的一部分無(wú)菌放入3日齡2％水瓊脂板上，室溫下培養(yǎng)24—48小時(shí)。按上面所述檢查平板。
觀察感染生長(zhǎng)于天然感染的土壤中的未處理的鷹嘴豆植物根的Pythium。P.ultimum是從腐爛的種子和根中分離出的最普遍的種類(lèi)。P.irregulare通常較少觀察到。
在用實(shí)施例II中所述的鏈霉菌屬WYEC108細(xì)胞藻酸鹽懸液處理的種子發(fā)芽的20日齡鷹嘴豆植物根部檢查了鏈霉菌屬WYEC108對(duì)根部的附著。這些植物生長(zhǎng)于如實(shí)施例II中所述的天然感染P.ultimum和P.irregulare的土壤中。從苗盆中取出植物并輕輕用自來(lái)水洗滌以去掉附著的根際土壤。然后用無(wú)菌蒸餾水漂洗。經(jīng)過(guò)將部分根放到玻璃片上，加一滴亞甲藍(lán)，然后蓋上蓋玻片制備顯微鏡檢術(shù)的根樣品。接著用相差顯微鏡(X1000)觀察制備的樣品。
存在于種子上的鏈霉菌WYEC108與萌發(fā)的根相聯(lián)系。隨著根的伸長(zhǎng)，鏈霉菌運(yùn)輸?shù)缴扉L(zhǎng)的根毛和尖端，觀察到鏈霉菌WYEC108廣泛定居于主根，次生根，根毛和尖端。與未覆蓋WYEC108的種子萌發(fā)的對(duì)照植物相比，被鏈霉菌屬WYEC108覆蓋的種子長(zhǎng)出的植物更健康，具有更長(zhǎng)的根且根毛以更大的密度存在。這一差別明顯與生物控制劑定居于根部相聯(lián)系。被生物控制劑定居的根不顯示出任何根疾病的癥狀。在存在當(dāng)?shù)馗H微生物區(qū)系競(jìng)爭(zhēng)的條件下，鏈霉菌WYEC108表現(xiàn)出優(yōu)良的根部定居。抗菌活性鏈霉菌屬WYEC108除了具有定居于植物根部和產(chǎn)生抗菌代謝物的能力外，還觀察到WYEC除P.chrysosporium外，108溶解真菌細(xì)胞壁和真菌卵孢子。使用掃描電子顯微鏡檢術(shù)表明鏈霉菌屬WYEC108菌絲定居于真菌菌絲或卵孢子(包括Pythium ultimum菌絲和卵孢子表面。被定居的菌絲和卵孢子被鏈霉菌屬WYEC108降解，很可能是WYEC108分泌細(xì)胞外酶(如幾丁質(zhì)酶和纖維素酶)的結(jié)果。已表明鏈霉菌屬WYEC108產(chǎn)生這兩種酶。很可能鏈霉菌屬WYEC108還產(chǎn)生一系列其它的細(xì)胞外降解酶。
實(shí)施例VI鏈霉菌屬WYEC108摻入轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中接下面方法配制適于長(zhǎng)期保存活鏈霉菌屬WYEC108孢子并用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的組合物。向含500ml YGM培養(yǎng)基(pH7.0—7.1)的1升錐形瓶中接種20ml種子培養(yǎng)物并在30℃下以250rpm搖動(dòng)培養(yǎng)3天。培養(yǎng)后，在5,000rpm下離心10分鐘收獲培養(yǎng)物，收獲的物質(zhì)重懸于1600ml 10％YGM中并與滅菌的8gNH4Cl溶于400ml蒸餾水的溶液混合。然后向裝有4kg滅菌的由沙—水—玉米粉混合物以9—2—1(W/W)的比例組成的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基的塑料容器中接種2升細(xì)胞與NH4Cl的混合物。在培養(yǎng)培養(yǎng)物前，將轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基滅菌2次(121℃3小時(shí))。然后將混合物在25℃培養(yǎng)10—14天以增加混合物中存在的孢子數(shù)。在10—14天的培養(yǎng)中鏈霉菌屬WYEC108產(chǎn)生孢子，導(dǎo)致cfu/g轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基增加(平均水平為108到109cfu/g轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基(干重))。然后將這種混合物貯存于4℃?zhèn)溆谩?br> 作為選擇，除了YGM培養(yǎng)基外，細(xì)胞和孢子也能在CYG培養(yǎng)基中生產(chǎn)。作為離心收獲細(xì)胞的其它選擇，也可使培養(yǎng)瓶靜置以便細(xì)菌菌絲體和孢子沉積。此后，小心倒出清亮的上清液濃縮的菌絲體/孢子懸液直接接種到轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中。當(dāng)使用這種收獲程序時(shí)，不必向培養(yǎng)基中加入NH4Cl，因?yàn)榧?xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基(YGM或CYG)是合適的氮源。
實(shí)施例VII鏈霉菌屬WYEC108對(duì)萵苣幼苗萌發(fā)率和鮮重的影響為測(cè)定鏈霉菌屬WYEC108對(duì)萵苣生長(zhǎng)的影響，使萵苣種子生長(zhǎng)于上面實(shí)施例IV所述的含鏈霉菌屬WYEC108的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中或生長(zhǎng)于蒸汽滅菌的土壤中。每種生長(zhǎng)培養(yǎng)基中共植入30粒種子(盆中每4×3.5cm一粒種了)，生長(zhǎng)21天后記錄萌發(fā)率。生長(zhǎng)35天后，以收獲地面上生長(zhǎng)的植物測(cè)定鮮重。鮮重以平均值記錄。結(jié)果如下面表VII所示。
表VII萌發(fā)的植物數(shù) 鮮重處理 萌發(fā)率(％)7天 9天 21天 (g/植物)無(wú)菌土壤131721 (21/30)70 0.81+種子轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基+WYEC108232729 (29/30)97 1.41+種子這些結(jié)果表明用鏈霉菌屬WYEC108處理的萵苣種子萌發(fā)率和幼苗鮮重都提高。
實(shí)施例VIII含鏈霉菌屬WYEC108的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基在耕地上的使用為測(cè)定鏈霉菌屬WYEC108摻入上述轉(zhuǎn)移培養(yǎng)在時(shí)作為生物控制劑的有效性進(jìn)行了活體生物控制試驗(yàn)。
使用在YGM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)了3天的鏈霉菌屬WYEC108，按在上面實(shí)施例VIII所述生產(chǎn)鏈霉菌屬WYEC108并摻入轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中。在盆栽幼苗前以在CYD板上進(jìn)行平板計(jì)數(shù)測(cè)定在轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中鏈霉菌屬WYEC108的起始數(shù)量大約為1.0—1.2×10cfr/g土壤。然后這種處理的土壤用于填塞苗盆(4cm/13.5cm)。
對(duì)照植物生長(zhǎng)于含蒸汽滅菌土壤(100℃滅菌60分鐘)的盆中。
然后在僅裝有蒸汽滅菌土壤或裝有用含鏈霉菌屬WYEC108的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基接種的蒸汽滅菌土壤混合物的苗盆中植入胡椒幼苗(綠色辣胡椒)。在溫室中生長(zhǎng)6周后，將這些植物移植到耕地上。在一些例子中，移植前將含450±17cfu/g Phytophthora parasitia的100g轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基接種到種植孔中。
移植55天后測(cè)植物高度并以平均植記錄。移植后再培養(yǎng)110天后經(jīng)收獲并測(cè)植物鮮重測(cè)定植物生物量。此時(shí)，以平均值記錄形成的胡椒數(shù)及每植物的胡椒重。該野外試驗(yàn)的結(jié)果如表VIII所示。
表VIII植物 生物量 胡椒產(chǎn)量#胡椒處理 高 鮮重 鮮重每植物(cm) (g/植物) (g/植物)b對(duì)照22.4ky274.1Ky19.1ky158.8ky未處理c用WYEC29.1m 353.3m 36.5m 279.8m108處理的b束處理的+20.3k 238.5k 13.8k 151.2kP.parasiticadc用WYEC108處理28.6m 266.6k 22.7k 221.6的+P.parasiticadb.胡椒植物生長(zhǎng)于僅含蒸汽滅菌土壤的盆(4cm×13.5cm)。
c.胡椒植物生長(zhǎng)于裝有蒸汽滅菌土壤和含鏈霉菌屬WYEC108的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基的混合物的盆中。
d.移植前100g含Phytophthora parasitia的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基接種到單獨(dú)的孔中(450±17cfu/g轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基)。
y.指在欄中標(biāo)有相同字母的值在P＝0.05水平差異不顯著。
如表VIII所示，在未接受WYEC108的對(duì)照植物相比用WYEC108處理的胡椒幼苗當(dāng)不存在P.parasitica時(shí)植物高度，生物量，胡椒數(shù)和胡椒產(chǎn)量在統(tǒng)計(jì)上明顯提高。比較表VIII橫排3和4表明菌株WYEC108能保護(hù)胡椒免受P.parasitica的有害影響。而且與不含P.parasitica未處理的植物相比用菌株WYEC108處理的相對(duì)不存在P.parasitica時(shí)基生長(zhǎng)有顯著的增強(qiáng)。
除了本實(shí)施例所述的實(shí)驗(yàn)外，WYEC108在保護(hù)一系列植物抵抗真菌感染方面表現(xiàn)為有效。試驗(yàn)的植物包括下面表IX所示的植物。
表IX用WYEC108保護(hù)農(nóng)作物抵抗真菌感染用WYEC108試驗(yàn)的植物a野外試驗(yàn) 溫室/實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)植物(+/-) (+/-)萵苣 - +鷹嘴豆 - +綠豆 - +胡椒 + -棉花 + +Turf Grass+ +洋蔥 + +馬鈴薯 + +a.試驗(yàn)在溫室或野外進(jìn)行，或兩者都做，如表所示。試驗(yàn)比較了用WYEC108處理的植物與未處理的對(duì)照植物和/或與用WYEC108和一種特異性真菌病原菌(Pythium，Aphanomyces，Rhizoctomia，F(xiàn)usariun，Phytophthora或Phy-tomatotrichum)處理的植物。在每種情況下，WYEC108都保護(hù)植物抵抗真菌性疾病。
實(shí)施例IX鏈霉菌屬WYEC108孢子在液體培養(yǎng)基中的生產(chǎn)生物控制劑必須存活持久的時(shí)間以滿足裝運(yùn)的需要和農(nóng)用的時(shí)間方式。在具體生物控制組合物中使用菌株WYEC108的孢子而不用營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞改善了生物控制組合物的貯存壽命，因?yàn)殒咦釉谟泻l件下和經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)一段時(shí)間后仍保持活力。
典型地，鏈霉菌屬種類(lèi)的孢子只在固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生。然而，如下面所闡述的，發(fā)現(xiàn)下面的方法適于在液體培養(yǎng)基中產(chǎn)生孢子。
向含1200ml YGM培養(yǎng)基(pH6.5)的2升錐形瓶中各接種50ml種子培養(yǎng)物(如實(shí)施例II所述生產(chǎn))并在30℃以下250rpm搖動(dòng)培養(yǎng)12—18天。以相差顯微鏡(X1000，用亞甲藍(lán)染色)觀察來(lái)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)物中的孢子產(chǎn)生。900rpm離心10分鐘收獲孢子。
然后，將孢子重懸于1600ml滅菌的10％YGM液體培養(yǎng)基中，加入400ml含8g NH4Cl溶于蒸餾水的無(wú)菌溶液(得到最終孢子密度為1.0—1.2×107cfu/ml)。然后將這種混合物直接接種到4kg由沙，水和玉米粉以9∶2∶1(W/W)的比例組成的無(wú)菌轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中。接種孢子前轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基高壓滅菌2次(121℃ 3小時(shí))。
以所述方式在液體培養(yǎng)物中直接產(chǎn)生孢子避免了需要對(duì)混合物進(jìn)行進(jìn)一步的培養(yǎng)。含孢子的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基貯存于4℃?zhèn)溆谩?br> 檢查了以所述液體培養(yǎng)方法產(chǎn)生的孢子在4℃貯存4個(gè)月后的存活率。1ml孢子懸液接種到含100ml滅菌的10％YGM液體培養(yǎng)基(pH6.5)的瓶中，在30℃以下250rpm搖動(dòng)培養(yǎng)。以相差顯微鏡檢術(shù)(X1000，用亞甲藍(lán)染色)觀察孢子發(fā)芽。大約8天時(shí)孢子完全發(fā)芽。這一簡(jiǎn)單的觀察試驗(yàn)表明貯存這段時(shí)間后，存活率無(wú)損失。
按下面所述試驗(yàn)摻入轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基(沙、水、玉米粉為9∶2∶1)的鏈霉菌屬WYEC108的存活率。將1.0g含鏈霉菌屬WYEC108的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基樣品進(jìn)行系列稀釋并涂布到CYD瓊脂板上。平板在25℃下培養(yǎng)直到形成菌落。用貯存30天的樣品記錄下平均水平為108到109cfu/g轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基(干重)。
作為選擇，從孢子形成瓊脂的瓊脂板上得到的孢子重懸于10—20ml無(wú)菌蒸餾水或YGM培養(yǎng)基中并混合進(jìn)10—100g轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中，以得到活體數(shù)為1012到1014cfu/g培養(yǎng)基的密度。然后將這種混合物空氣干燥，徹底混勻并貯存于4℃?zhèn)溆?，該混合物是一種濃縮產(chǎn)品，能用另外的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基稀釋成任一所需cfu/g的較低最終活體數(shù)。
實(shí)施例X藻酸鹽凝膠混合物的穩(wěn)定性以5000rpm離心10分鐘從500ml 3日齡YGM液體培養(yǎng)物中收獲鏈霉菌屬WYEC108菌絲體。收獲的菌絲體重懸于125ml 10％YGM中并加入125ml滅菌的5％(W/V)藻酸鈉溶液使培養(yǎng)物密度為1.0—1.2×104cfu/ml。經(jīng)向滅菌的0.25M CaCl2蒸餾水溶液中一滴一滴地加入細(xì)胞藻酸鹽懸液形成含鏈霉菌屬WYEC108菌絲體的藻酸鹽塊。
為了測(cè)定以這種方法形成的藻酸鹽塊的存活率，含培養(yǎng)物的藻酸鹽塊接著平鋪到滅菌的塑料培養(yǎng)皿(10cm×10cm)上并在層流無(wú)菌通風(fēng)櫥中干燥1小時(shí)。成塊的鏈霉菌屬WYEC108在250℃貯存6到8個(gè)月后易于形成孢子(平均水平為108到109cfu/g干燥的藻酸鹽塊)。當(dāng)它們?cè)?50℃下的無(wú)菌水中培養(yǎng)時(shí)，這些孢子易于發(fā)芽。以相差顯微鏡檢術(shù)(X1000倍放大率，用亞甲蘭染色)觀察孢子的發(fā)芽。
實(shí)施例XI含鏈霉菌屬WYEC108的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基的優(yōu)選組合物上面已闡述了分離放線菌類(lèi)菌株，檢查這些菌株用作生物控制劑的方法，以菌絲體形式和以孢子，合適的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基及在優(yōu)選的實(shí)施例中的鏈霉菌屬WYEC108生產(chǎn)這些生物控制劑的方法，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，對(duì)本發(fā)明以許多種形式進(jìn)行修改且不偏離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)是顯而易見(jiàn)的。
下面闡述了本發(fā)明作為選擇的實(shí)施例，并描述了特別優(yōu)選的實(shí)施方案。最適培養(yǎng)條件菌株WYEC108生長(zhǎng)的最適條件包括溫度在20℃和30℃之間，pH值在pH5.5和pP7.5之間，發(fā)酵攪拌速度在200rpm和300rpm之間。在YGM液體培養(yǎng)基中和30℃，pH6.5，以200rpm搖動(dòng)的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)72小時(shí)(到對(duì)數(shù)期末)時(shí)，一般可獲得鏈霉菌屬WYEC108的最大細(xì)胞團(tuán)產(chǎn)量，為大約5.3g干重的生物量/升。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的加倍時(shí)間是大約10小時(shí)。經(jīng)過(guò)使用更高接種水平的對(duì)數(shù)期細(xì)胞可明顯減少72小時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。
作為選擇，可在固體瓊脂培養(yǎng)基(如孢子形成瓊脂)上生產(chǎn)孢子。這些孢子可經(jīng)過(guò)利進(jìn)合適的液體培養(yǎng)基(如10％YGM)中來(lái)直接收獲，然后直接摻入轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中。這種方法避免了需要對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行液體生長(zhǎng)。因此縮短了生產(chǎn)程序。優(yōu)選的和作為選擇的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基鏈霉菌屬WYEC108可被摻入轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中用于園藝和農(nóng)業(yè)方面。實(shí)施例VI描述了一種轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基的配方，它包含以9—2—1(W/W)比例混合的沙—水—玉米粉。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將明白轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基的配方受到所需生物控制劑特定應(yīng)用的支配。例如，可將各種有機(jī)和無(wú)機(jī)填充物(如粘土、蛭石、小麥麩、玉米棒子或幾丁質(zhì))加入轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中。根據(jù)所需的結(jié)構(gòu)和物理特征來(lái)決定轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基成份的比率。例如，諸如水份保持能力，適于處理和運(yùn)輸?shù)妮p重，為菌絲體和植物根生長(zhǎng)和伸展提供空間的多孔性等特性是重要的。作為選擇，可向藻酸鹽懸液中加入鏈霉菌屬WYEC108的營(yíng)養(yǎng)菌絲體或孢子以生產(chǎn)對(duì)這種菌株的藻酸鹽包埋塊。生產(chǎn)藻酸鹽塊的方法是本領(lǐng)域已知的并在Lewis等的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.4668512中作了進(jìn)一步的描述。其它成份(如肥料)也可摻入這些塊中。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的確定了包含以1∶3.5∶1重量/重量的比率混合的泥炭—沙—玉米粉的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基是特別合適的。這一比率提供了合適的密度和水份保持能力，使這種產(chǎn)品能在農(nóng)業(yè)和園藝應(yīng)用中使用。然而，正如上面所述，這些組合物和其它組合物的其它比率作為轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基也是可接受的。例如，一種有效的作為選擇的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基包含泥炭(620g)—沙(3380g)—玉米粉(270g)—幾質(zhì)(10g)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，向大約1.6升收獲的含如上所述生長(zhǎng)于YGM培養(yǎng)基的鏈霉菌屬WYEC108菌絲體的培養(yǎng)物培養(yǎng)液(對(duì)數(shù)期細(xì)胞，例如大約72小時(shí)的培養(yǎng)物)中加入400ml無(wú)菌NH4Cl溶液(含8g NH4Cl溶于400ml蒸餾水中)并接種到含4kg滅菌的由泥炭沙和玉米粉組成的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基的塑料容器中。在接種鏈霉菌WYEC108前，將轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基滅菌2次(121℃ 3小時(shí))。接種后的容器在30℃培養(yǎng)10到14天，使形成的孢子達(dá)到最大數(shù)。然后容器貯存于4℃?zhèn)溆谩?br> 在轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中使用NH4Cl給鏈霉菌WYEC108的孢子發(fā)芽提供了氮源。除NH4Cl外，其它氮源也可用于該目的，這對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。例如，正如本文所述，在摻入轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基前，當(dāng)孢子重懸于細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基(如10％YGM)時(shí)，不需要加入這種氮源。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基包含足夠量的氮源。經(jīng)過(guò)測(cè)定增加或減少特定氮源的量對(duì)出芽率的影響或改變氮源的影響可確定氮源的“足夠量”所包含的量，這對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員言是顯而易見(jiàn)的。一種氮源的足夠量是指使霉菌屬WYEC108的孢子容易出芽的特定氮源的量。
在選擇的實(shí)施方案中，正如實(shí)施例XI所述，鏈霉菌屬WYEC108的孢子在液體培養(yǎng)基中產(chǎn)生并直接摻入優(yōu)選的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中，然后貯存于4℃。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，鏈霉菌屬WYEC108加入轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中使終濃度至少為1×105cfu/g。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中鏈霉菌屬WYEC108的終濃度在1×105cfu/g和1×108cfu/g之間。
實(shí)施例XII含有鏈霉菌屬WYEC108的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基配方的詳細(xì)描述以下面所述程序大量生產(chǎn)含鏈霉菌屬WYEC108的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基的優(yōu)選組合物。所述的全部程序都使用標(biāo)準(zhǔn)的無(wú)菌技術(shù)(例如，在紫外燈滅菌的層流室中)進(jìn)行以保證無(wú)菌，直到被最終用戶打開(kāi)包裝袋。細(xì)胞的產(chǎn)生1).將從CYD斜面得到的鏈霉菌WYEC108孢子懸浮于10ml滅菌的YGM或CYG培養(yǎng)基(pH6.5)中，這一接種懸液用于接種培養(yǎng)瓶。
2).接種6個(gè)含100ml YGM(pH6.5)的250ml瓶。每瓶使用10ml孢子懸液作為接種液。接種后，在30℃下以200rpm將瓶搖動(dòng)培養(yǎng)36小時(shí)。
3).用上面制備的菌絲體接種液(每瓶100ml接種液)接種6個(gè)各含1.1升YGM培養(yǎng)液(pH6.5)的2.0升瓶。接種后，瓶在30℃下以200rpm搖動(dòng)培養(yǎng)大約24到48小時(shí)或更長(zhǎng)(達(dá)4天)。這成為發(fā)酵罐的接種液。發(fā)酵
上面制備的大約7.2升種子培養(yǎng)物接種到含40升無(wú)菌YGM培養(yǎng)基(pH6.5)的發(fā)酵罐中(＝15％的接種體積；該方法是用與實(shí)施時(shí)一樣高的細(xì)胞懸液密度進(jìn)行接種)。發(fā)酵罐在30℃下攪拌發(fā)酵大約72小時(shí)(接近對(duì)數(shù)期末)。發(fā)酵罐收獲1).含WYEC108細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)液(大約培養(yǎng)72小時(shí)后)無(wú)菌收獲到無(wú)菌的20升塑料瓶中。
2).將無(wú)菌NH4Cl溶液加入仍含WYEC108細(xì)胞的收獲培養(yǎng)液中(每3.2升收獲的培養(yǎng)液使用16gNH4Cl溶于800ml蒸餾水中配成的溶液，預(yù)先以高壓滅菌來(lái)除菌)。所得的1.2升體積的含NH4Cl的細(xì)胞懸液在接種到預(yù)先制備的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基前經(jīng)過(guò)搖動(dòng)瓶子使其充分混勻。轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基的制備1)分別稱(chēng)量轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基的每種成份并加入大型可滅菌的盤(pán)子或其它容器中。組合的混合物定義為轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基。它由泥炭，沙和玉米粉(540g∶2700g∶540g∶比例為1∶3.5∶1W/W)組成。
2)將轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基徹底混勻并用堅(jiān)實(shí)的鋁箔或棉花胎覆蓋，然后滅菌2次(每次在121℃下90分鐘，兩次滅菌期間間隔12小時(shí))。
3)第二次滅菌后和在接種含菌株WYEC108的收獲培養(yǎng)物和NH4Cl溶液(上面制備的)前將轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基冷卻到室溫。將鏈霉菌屬WYEC108摻入轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中以產(chǎn)生泥炭、沙、水、玉米粉和NH4Cl的混合1)大約0.5升含菌株WYEC108—NH4Cl溶液(上面制備的)的收獲培養(yǎng)物徹底摻入到所需數(shù)量的每個(gè)含3.78kg轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基的預(yù)先滅菌的塑料容器中。
2)然后將接種的容器在30℃下培養(yǎng)10—14天(培養(yǎng)到20天可能是最佳的)，此后貯存于4℃?zhèn)溆?該混合物在數(shù)目?jī)?nèi)保持穩(wěn)定)。處理和運(yùn)輸1)使用小無(wú)菌鏟或等效工具將含鏈霉菌屬WYEC108的完全組合物無(wú)菌轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的三層塑料袋中，優(yōu)選在紫外滅菌的層流櫥中進(jìn)行。
2)然后將裝滿的袋子封口并放入用于裝運(yùn)的1.5立方英尺移動(dòng)盒中。然后用強(qiáng)力膠帶密封每個(gè)盒子。
實(shí)施例XIII將含鏈霉菌屬WYEC108的混合物摻入苗圃苗床中如實(shí)施例XIII所述的含鏈霉菌屬WYEC108生物控制劑的混合物和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基與苗圃土壤或盆栽混合物混合，使鏈霉菌的終濃度≥1.0—1.2×105或更大的cfu/g土壤。育苗程序如下1)每個(gè)盆底(或苗床)放入大約1.0cm的泥炭以防止土壤(或盆栽混合物)流失且還能提供通氣和排水。
2)然后向苗盆中填入農(nóng)用(苗圃或盆栽混合物)土壤達(dá)到盆(或苗床)頂下大約3.0cm處。然后向盆(苗床)澆水至浸透。
3)然后向每個(gè)盆(床)上部加入大約1.5cm含鏈霉菌屬WYEC108的混合物和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基。如果需要，也可將混合物預(yù)先與苗圃土壤或盆栽土壤混合以增加體積和調(diào)節(jié)cfu/g數(shù)。然而，為產(chǎn)生最佳效力，在最終混合物中cfu/g應(yīng)維持在至少105cfu/g。
4)將種子放到制備的苗盆或苗床表面并蓋上另外1.5cm(大約)的苗圃土壤或盆栽土壤/混合物。
5)然后加入少量水濕潤(rùn)土壤和種子。
6)為了減輕干燥和防止結(jié)塊，一般用干凈的黑塑料布覆蓋盆，直到幼苗萌發(fā)(如果控制濕度可不需這一步)。
7)幼苗萌發(fā)后，如果需要，向盆(或床)頂漬灑更多的水。
由于提供了本發(fā)明的實(shí)施例和優(yōu)選實(shí)施例，在不偏離本發(fā)明和其主要方面的前提下作出轉(zhuǎn)移和修改對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此我們?cè)噲D用附加的權(quán)利要求來(lái)覆蓋所有這類(lèi)落入本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍內(nèi)的變化和修改。
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權(quán)利要求
1.一種微生物鏈霉菌WYEC108的生物學(xué)純的培養(yǎng)物，具有ATCC55445的鑒定特征。
2.權(quán)利要求1的微生物，其中微生物能對(duì)敏感植物的真菌感染提供保護(hù)。
3.一種組合物，包含一種鏈霉菌屬WYEC108的生物學(xué)純的培養(yǎng)物；和一種轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基至少包含下列成份中的一種藻酸鹽凝膠，泥炭，沙和玉米粉。
5.權(quán)利要求3的組合物，其中轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基包含足夠量的氮源。
6.權(quán)利要求4的組合物，其中轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基包含泥炭、沙、玉米粉和足夠量的氮源。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中氮源是氯化銨。
8.權(quán)利要求3的組合物，其中鏈霉菌屬WYEC108生物學(xué)純的培養(yǎng)物包含鏈霉菌屬WYEC108的孢子。
9.一種用于保護(hù)植物抵抗真菌感染的組合物，包含合適的鏈霉菌屬種類(lèi)和在合適的容器內(nèi)的傳遞裝置。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中鏈霉菌屬種類(lèi)是鏈霉菌屬WYEC108。
11.一種組合物，包含一種由鏈霉菌屬WYEC108產(chǎn)生的抗真菌代謝物的純化制品；和一種轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中的組合物進(jìn)一步包含鏈霉菌屬WYEC108的細(xì)胞和孢子。
13.一種降低植物對(duì)真菌感染的易感性的方法，其中的方法包含將鏈霉菌屬WYEC108傳遞到植物的根部。
14.一種降低植物對(duì)真菌感染的易感性的方法，其中的方法包含下列步驟將種子浸入含鏈霉菌屬WYEC108的組合物中；和將種子種植在合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基上。
15.權(quán)利要求14的方法，其中組合物進(jìn)一步包含藻酸鹽凝膠。
16.一種保護(hù)植物抵抗真菌感染的方法，包含下列步驟提供一種鏈霉菌屬WYEC108的培養(yǎng)物；制備含所述培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基；以及將所說(shuō)的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基傳遞給植物。
17.一種促進(jìn)植物生長(zhǎng)的方法，包含給種子或幼苗提供一種組合物，該組合物包含一種轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基和選自由鏈霉菌屬WYEC108細(xì)胞，鏈霉菌屬WYEC108孢子和由鏈霉菌屬WYEC108產(chǎn)生的抗真菌代謝物組成的一組中的至少一種成份。
全文摘要
本發(fā)明涉及適于降低植物對(duì)真菌性植物病原菌感病性的生物控制制劑。在本發(fā)明的一個(gè)方面，將一種新分離的鏈霉屬菌株(鏈霉屬菌WYEC108)摻入適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)移培養(yǎng)基中并施加到植物種子和植物根上。
文檔編號(hào)C12R1/465GK1126424SQ94192638
公開(kāi)日1996年7月10日 申請(qǐng)日期1994年6月29日 優(yōu)先權(quán)日1993年6月30日
發(fā)明者唐納德L·克勞福特, 徐衡源 申請(qǐng)人:愛(ài)達(dá)荷研究基礎(chǔ)公司