專利名稱：耳毒性耳聾易感性突變的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是在政府支持的由國家健康與NIDCD的基金(基金編號DC01402)下獲得的。本發(fā)明政府擁有一定的權(quán)利。發(fā)明的背景1.發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及遺傳診斷領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及檢測一種與耳毒性耳聾有關(guān)的人類線粒體核糖體RNA(rRNA)的改變。2.相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)的描述感覺神經(jīng)性耳聾，不論是同神經(jīng)肌肉疾病還是同糖尿病并發(fā)，均與異質(zhì)性線粒體DNA(mtDNA)突變有關(guān)(Shoffner，et al.，Adv.Human Genet.，19267-330，1990；Ballinger，et al.，Nature Genet.，111-15，1992；van den Ouweland，et al.，Nature Genet.，1368-371，1992；Reardon，et al.，Lancet，341376-1379，1992).已經(jīng)指出在兩種類型的非綜合征的耳聾中mtDNA突變的相似性，在遠(yuǎn)東的幾個伴家族性氨基糖苷以致的耳聾家族中，曾報告母系遺傳方式(Higashi，Clin.Genet.，35433-436，1989；Hu，et al.，J.Med.Genet.，2879-83，1991)，一個患母系遺傳先天性耳聾的阿拉伯-以色列大的家族被描述(Jaber，eta1.，J.Med.Genet.，2986-90，1992)。
由于精子顯然不提供線粒體給合子，因此線粒體DNA是完全通過母系傳遞的。這使人們可預(yù)想到線粒體基因的缺陷引起的疾病在兩個性別中將是相同，但只通過母系傳遞。在每一個細(xì)胞中有數(shù)百個線粒體，它們發(fā)揮不同的代謝功能，其中最重要的是通過氧化磷酸化過程合成ATP。每個線粒體包含了幾個線粒體DNA(mtDNA)染色體，在人類，它們是16,569個堿基對(bp)的雙鏈環(huán)。mtDNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)生在線粒體中。線粒體DNA編碼13個信使RNA、大和小核糖體RNA和22個翻譯所必需的轉(zhuǎn)移RNAs。使用線粒體特異的遺傳密碼信使RNA在線粒體特異的核糖體上翻譯出13種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)與約60種核編碼蛋白質(zhì)相互作用，形成氧化磷酸化所需的5種酶復(fù)合體。
不可逆的聽覺喪失是氨基糖苷抗生素(如鏈霉素、慶大霉素和卡那霉素)的主要并發(fā)癥(Sande，et al.，Antimicrobial agents，inGoodman andGilman′SThe Pharmacological Basis of Therapeutics，8thedition.eds，Gilman，et al.，Pergamon press，Inc.，Elmsford，NY，pp 1098-1116，1990)。在中國，由于廣泛使用氨基糖苷類藥物，在上海一個區(qū)，25％的聾啞的聽力的喪失可追溯到是使用了氨基糖苷類藥物(Hu，et al.，J.Med.Genet.，2879-93，1991)。在這些病人中，約1/4有其他親屬伴耳毒性耳聾。在所有易感性的垂直傳遞可追溯到的22例中，遺傳方式符合線粒體遺傳特征，例如只通過女性傳遞。在日本發(fā)生類似的情況，Higashi對28個鏈霉素以致的耳聾的家系進(jìn)行制表，發(fā)現(xiàn)除2個家系外，所有家系中易感性特征都是母系遺傳的(Higashi，Clin.Genet.，35433-436，1989)。上述的Hu等人還觀察到大多數(shù)家族性病例接受抗生素的時期比散發(fā)病例短得多，提示存在一種素因突變或遺傳易感性(Hu，et al.，同前)。
由于氨基糖苷的“天然靶位”是在進(jìn)化上相關(guān)的細(xì)菌核糖體，耳蝸線粒體核糖體是氨基糖苷類藥物耳毒性的最可能的靶位(Sande，et al.，同前)。在細(xì)菌學(xué)研究中，氨基糖苷似乎穩(wěn)定了70S核糖體中一些氨基酰-tRNA的錯配，從而引起翻譯過程中mRNA的錯讀(Hornig，et al.，Biochimie，69803-813，1987)。除了與核糖體蛋白的相互作用外，氨基糖苷與E.coli 16S rRNA相結(jié)合，此點已被化學(xué)保護(hù)和交聯(lián)實驗所證實(Moazed，et al.，Nature，327389-394，1987；Gravel，etal.，Biochemistry，266227-6232，1987)。這些物理實驗預(yù)示在翻譯保真性中至關(guān)重要的是小rRNA的區(qū)域。通過在細(xì)菌，酵母線粒體，四膜蟲屬和葉綠體中分離出氨基糖苷類藥物耐受的突變，這些突變定位于小rRNA上被預(yù)測為進(jìn)化上保守的區(qū)域。已證實了它們的相關(guān)性(Tzagaloff，et al.，J.Biol.Chem.，2575921-5928，1982；Spangler，et al.，J.Biol.Chem.，2606334-6340，1985；Gaut hier，et al.，Mol.Gen.Genet.，214192-197，1988；Melancon，et al.，Nucl.Acid s Res.，169631-9639，1988)。因此，線粒體rRNA基因，特別是相應(yīng)的12S rRNA基因，成為了在母系遺傳氨基糖苷以致耳聾中最主要的mtDNA突變位點的侯選者。
盡管已預(yù)期出線粒體DNA在耳毒性耳聾中的作用，但沒有合適的診斷性檢測來確定出那些危險個體。結(jié)果，至少在耳毒素是氨基糖苷類抗生素的情況下，醫(yī)生一直面臨著這種選擇的困境使用抗生素與患者可能發(fā)生不可逆的聽力的喪失。本發(fā)明通過提供一種快速的、非侵犯性的和高度準(zhǔn)確的診斷試驗來解決這個問題，該試驗可確定一個個體是否有耳毒性耳聾的風(fēng)險。發(fā)明的概述本發(fā)明來源于一個基本的發(fā)現(xiàn)易感耳毒性耳聾個體的線粒體中存在一種核酸序列改變了的核酸。
作為這個發(fā)現(xiàn)的一個結(jié)果，本發(fā)明第一次能夠應(yīng)用一種非侵犯性的、快速的和高敏感的技術(shù)讓耳毒性耳聾易感個體在接觸耳毒素(如一種抗生素)之前得到篩查。附圖的簡要說明

圖1顯示了三個母系傳遞的氨基糖苷類藥物以致的耳聾的系譜。實心符號表示個體確系在高頻感覺神經(jīng)性聽力喪失前曾接受鏈霉素治療；先證者A的父親(影線符號)因不明原因耳聾。水平小橫線表示采集了DNA樣本的個體。先證者用箭頭表示。家譜A和C來自上海。家譜B來自北京。
圖2是人線粒體12S rRNA(A部分)3′端和E.coli16S rRNA(B部分)的相應(yīng)區(qū)域(分別為SEQ.I.D.NOS.3和4.)，顯示了在四個伴有母系傳遞耳聾的家譜中1555位點A到G的突變。E.coli 16S rRNA功能區(qū)域描述如下在{}中的序列是與鏈霉素相交聯(lián)的；＊表示與tRNA結(jié)合的核苷酸；·表示在核糖體亞基分界面的核苷酸；用粗體表示核苷酸為在氨基糖苷類藥物結(jié)合時對化學(xué)修飾活性的改變；在E.coli序列中有下劃線的核苷酸表示在其它物種中氨基糖苷類藥物耐受突變的位置。發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明是涉及對具有改變的核苷酸序列的核酸的檢測方法，其中改變的核酸序列的存在與耳毒性耳聾易感性有關(guān)。改變的核苷酸序列或?qū)Χ拘远@不易感的正常人的核苷酸序列的相應(yīng)區(qū)域，被稱為“靶核酸序列”。靶核苷酸序列可能是，例如，與耳毒性耳聾易感性或素因增加有關(guān)的一個突變核苷酸、一個限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、一個缺失、插入或重組、一個核苷酸取代、或任何其它感興趣的哺乳類的核酸序列。
本發(fā)明以下述基本發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，即與耳毒性耳聾相關(guān)的突變發(fā)生在編碼線粒體rRNA的線粒體基因中。盡管曾經(jīng)懷疑過線粒體基因通過某種方式與耳毒性耳聾相關(guān)，但不知道發(fā)生這些缺失的靶基因就是rRNA基因。
根據(jù)本發(fā)明的方法，野生型基因的改變被檢測到。本發(fā)明的“野生型基因的改變”包括了所有突變類型--包含缺失。這改變可能是由于重組如插入、倒置和缺失或者是由于點突變。缺失可能是整個線粒體rRNA基因或只是基因的一部分。因此，突變的發(fā)現(xiàn)因此對可能存在耳毒性耳聾的易感性提供了證據(jù)。未缺失的線粒體rRNA等位基因可檢測當(dāng)其它突變，如插入、小缺失和點突變。據(jù)信，同野生型(非易感性)rRNA相比，在線粒體rRNA和基因中發(fā)現(xiàn)的突變通過“縮緊”位于突變的rRNA上的毒素結(jié)合口袋(binding pocket)而產(chǎn)生對耳毒性耳聾素因。當(dāng)耳毒素是一種氨基糖苷類抗生素時此點尤其確實。在后一種情況下，據(jù)信突變使線粒體rRNA二級結(jié)構(gòu)類似細(xì)菌rRNA，因此增加線粒體rRNA對作用于細(xì)菌核糖體水平的細(xì)菌抗生素的易感性。其他易感性突變的侯選基因是核編碼的線粒體核糖體蛋白基因、與耳毒素攝取或運輸有關(guān)的基因以及參與耳毒素代謝的基因。
點突變的檢測可通過應(yīng)用本領(lǐng)域公知技術(shù)對標(biāo)本中的等位基進(jìn)行分子克隆并對這些等位基因進(jìn)行測序來完成?；蛘?，可用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增直接從標(biāo)本制備的線粒體DNA的基因序列，然后鑒定擴(kuò)增的DNA序列。或者，單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、異源雙鏈和化學(xué)裂解等方法可用來在測序前確定突變點的位置。
聚合酶鏈反應(yīng)本身在是本領(lǐng)域公知的(Saili，etal.Science，239487，1988；U.S.Patent Nos.4，683，203 and 4，683，195)。為了擴(kuò)增靶核苷酸序列而使用的特異引物將在以后詳細(xì)討論。在被稱為等位基因特異的寡核苷酸(ASO)雜交技術(shù)中，通過與PCR-擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交，正常和突變的寡核苷酸可用于檢測靶核苷酸序列。本領(lǐng)域公知的連接酶鏈反應(yīng)也可用于擴(kuò)增線粒體序列(Wu，et al.，Genomics，4560，1989)。此外，可應(yīng)用被稱為等位基因特異的PCR技術(shù)(Ruano and Kidd，Nucleoti c Acids Research，178392，1989)。依照這個技術(shù)，應(yīng)用一些在其3′端與特定線粒體rRNA突變雜交的引物。如果特定的突變不存在，觀察不到擴(kuò)增產(chǎn)物?；虻牟迦牒腿笔б部捎每寺?、測序和擴(kuò)增來檢測。此外，可用基因或周圍標(biāo)記基因的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)探針來確定等位基因的改變或多態(tài)性片段中的插入。也可使用本領(lǐng)域所知的其它檢測插入和缺失的技術(shù)。
當(dāng)靶核苷酸序列需要擴(kuò)增時，可通過使用作為擴(kuò)增引物的寡核苷酸來實現(xiàn)。這些獨特的寡核苷酸是以識別突變核苷酸序列附近的旁側(cè)區(qū)域為基礎(chǔ)。例如，在本文具體描述的一個12S rRNA突變中，這些寡核苷酸引物包含依據(jù)線粒體共有序列，可與重鏈530-549位和輕鏈1899-1880位的旁側(cè)核苷酸序列雜交的序列和其互補(bǔ)序列。
如本文所述，分析了兩種不同的伴有母系傳遞易感性的非綜合征耳聾，一種需要一個外源因素，另一種需要核突變以利于表達(dá)。確定了12S rRNA基因1555位核苷酸的一個mtDNA突變，它似乎是病理性突變，其理由如下(1)在所有4個家系中這是唯一的一個共同突變；(2)此突變不存于278例大多數(shù)是同種族婚配的正常聽覺的對照組中；(3)在三個氨基糖苷以致的耳聾的家系中，沒有見到候選基因其它少見突變；(4)在阿拉伯-以色列家系中確定的其它突變，沒有一個在其他任何線粒體疾病中被描述為起病理作用，或在耳毒性耳聾的家系中被發(fā)現(xiàn)；(5)這個突變改變了12S rRNA高度保守區(qū)域的一個核苷酸；(6)在12S rRNA基因中突變的這個核苷酸處于已知的氨基糖苷的結(jié)合區(qū)域中(Moazed，et al.，同前)，在其它物種，已發(fā)現(xiàn)這個區(qū)域發(fā)生了氨基糖苷耐受的突變(Tzagaloff，et al.，同前，et al.，同前)。
1555 A→G突變是在耳毒性耳聾家系中所識別的三個序列改變中的唯一一個顯示出與疾病獨特的相關(guān)性的突變。兩個其它突變，663A→G和1736A→G，也在這三個母系遺傳耳毒性耳聾的家譜中發(fā)現(xiàn)，但這兩突變是中國人中普遍存在的多態(tài)性，頻率是10-11％。由于這兩個突變共同存于13個對照個體中，1555位突變最大可能是在含有這兩個突變的線粒體染色體上發(fā)生的。663A-＞G和1736A→G本身可能不是致病突變，因為氨基糖苷以致的耳毒性耳聾的總發(fā)病率估計在1∶10,000(Hu，etal.，同前)。更重要的是，具有這兩種突變的對照組中至少有4人接受過鏈霉素，但沒有疾病效應(yīng)。
在阿拉伯-以色列家族中發(fā)現(xiàn)一些家族特異的突變，這些突變可導(dǎo)致疾病表型，或增加了1555A-G突變的作用。同Leber′s遺傳性眼神經(jīng)視網(wǎng)膜病(LHON)相似，神經(jīng)特異的線粒體疾病可能也需要一個附加的核基因的參與(Vikki，et al.，Am.J.Hum.Genet.，48486-491，1991；Bu，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，888198-8202，1991)，任何一種或所有這些少見突變可能相互作用產(chǎn)生一個“病理性單倍型”。絕大多數(shù)LHON患者有單一的mtDNA點突變(Wallance，et al，Science，2421427-1430，1988；Howe 11，et al.，Am.J.Mu.Genet.，49929-950，1991；Howell，et a1.，Am.J.Hum.Genet.，48935-942，1991；Muoponen，et al.，Am.J.Mum.Genet.，481147-1153，1991)，但有些LHON病例看來似乎是由于多個突變的混合效應(yīng)導(dǎo)致了疾病(Brown，et al.，Genetics，130163-173，1992；Johns，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1741324-1330，1991；Brown，et al.，Am.J.Hum.Genet.，52378-385，1992)。因為1555突變在三個其它母系傳遞的耳聾易感家譜中被發(fā)現(xiàn)，在阿拉伯-以色列家譜中這突變被認(rèn)為是致病性缺陷。在這個家系中，其他mtDNA突變可能參與損害氧化磷酸化過程，但低于發(fā)生耳蝸改變所需的閾值。家系所有受檢成員都有病源性單倍型，每個突變似乎都是同質(zhì)性的(如果存在異質(zhì)，其在血中的水平將低于10％)。因此，未患病的家族成員具有相同mtRNA序列，而不耳聾的原因估計可能因為是沒有出現(xiàn)推定的常染色體隱性突變純合性。
為了不局限于一個特定理論，據(jù)信一個兩次打擊(two-hit)模型可解釋在這些家譜中出現(xiàn)的非綜合征性耳聾。除了相應(yīng)的1555A→G突變外，這個疾病可能由攝取外源性的氨基糖苷，以致氨基糖苷積聚在耳蝸(Sande，et al.，同前)；或者，在阿拉伯-以色列家譜中，通過假定的耳蝸特異的有12S rRNA突變核糖體亞單位與12SrRNA突變的相互作用而被加劇。兩者均將干擾或廢除線粒體核糖體的翻譯功能。
1555A→G突變影響了小rRNA高度保守區(qū)(圖2)，在生物體如細(xì)菌，植物，無脊椎動物和哺乳類，小rRNA有兩個伴保守序列的單鏈區(qū)，被兩個結(jié)構(gòu)上保守的莖-環(huán)分開(Neefs，et al，同前；Gutell，et al.，同前；Noller，et a1.，Ann.Rev.Biochem.，53119-162，1984)。細(xì)菌學(xué)的研究顯示分子的這個部分是mRNA被解碼的氨基酰位點的一部分，并位于核糖體亞單位界面(Hornig，et al，同前；Moazed，et al.，suora；Brimacombe，Biochemistry，274207-4213，1988)。氨基糖苷通過與該解碼區(qū)結(jié)合和穩(wěn)定錯配的氨基酰tRNAs而影響翻譯的忠實性(Hornig，et al.，同前)。在這個區(qū)域一些核苷酸(在圖2用粗體顯示)在與氨基糖苷的結(jié)合時受到影響。因為當(dāng)鏈霉素，慶大霉素，新霉素，卡那霉素或潮霉素被結(jié)合時，其對化學(xué)修飾劑的反應(yīng)性改變(Gravel，et al.，同前)。鏈霉素也將這個區(qū)域交聯(lián)到E.coli小rRNA的另一部分(Gravel，et al.，同前)，在那里鏈霉素耐受突變被發(fā)現(xiàn)(Montandon，etal.，EMBO J.，53705-3708，1986；Etzold，et al.，F(xiàn)EBS Lett.，219343-346，1987)。
最后，這個區(qū)域在氨基糖苷功能中是重要的，因為氨基糖苷的耐受突變(在圖1劃線處)在酵母線粒體(Tzagaloff，et al.，同前)和四膜蟲(Spangler，etal.，同前)的小rRNAs相似位點中被發(fā)現(xiàn)。有意義的是，其中兩個突變破壞了我們的突變位點相鄰的堿基對，實際上”增寬了”氨基糖苷的結(jié)合口袋。相反，1555A→G突變可產(chǎn)生一個新的C→G堿基對，延長莖/環(huán)和”縮緊”這個區(qū)域，使得二級結(jié)構(gòu)更近似于細(xì)菌小rRNA。據(jù)信1555A→G突變延長了這個雙螺旋，增寬了氨基糖苷的結(jié)合和增加了這些抗生素在翻譯忠實性作用的易感性。
在本發(fā)明的方法中可使用的引物包含足夠長度和適當(dāng)序列的寡核苷酸，以便提供特異開始，合成含靶核酸的足量核酸分子。如此，可以選擇性擴(kuò)增包含重要核酸的特異靶核酸。特別地，本文中的術(shù)語“引物”是指包含二個或更多個脫氧核糖核苷或核糖核苷的序列，最好至少是8個，這種序列有啟動合成一個引物延伸產(chǎn)物的能力，與一個靶核酸鏈充分互補(bǔ)。雖然寡核苷酸引物可以含少一些核苷酸，通常包含15-22或更多核苷酸，當(dāng)然其也可以少一些核苷酸。
有利于合成的實驗條件包括三磷酸脫氧核苷酸，聚合作用的因子如DNA聚合酶及合適的溫度和PH。為了達(dá)到最大擴(kuò)增效應(yīng)，引物最好是單鏈，但也可以是雙鏈。如果是雙鏈，在用于制備延伸產(chǎn)物前，引物首先要經(jīng)過將其鏈分離的處理。優(yōu)選地引物是一寡脫氧核糖核苷酸。引物必須足夠地長以便在聚合作用的以致劑的存在時引導(dǎo)延伸產(chǎn)物的合成。引物的精確長度取決于許多因素，包括溫度，緩沖液和核苷酸的組成。
根據(jù)本發(fā)明方法，所用的引物被設(shè)計成和待擴(kuò)增的突變型或野生型核苷酸序列的每條鏈均大致地互補(bǔ)?！按笾碌鼗パa(bǔ)”指的是在聚合作用的因子能工作的條件下，引物必須充分互補(bǔ)以致于能和其相應(yīng)的鏈雜交。也就是說，引物必須和待雜交的旁側(cè)序列有充分的互補(bǔ)性并允許靶核苷酸序列的擴(kuò)增。優(yōu)選地被延伸的引物末端和互補(bǔ)的目標(biāo)序列有優(yōu)選的堿基對的互補(bǔ)。
本發(fā)明方法所用的寡核苷酸引物可用于任何能產(chǎn)生大量靶核酸的擴(kuò)增過程。通常，一個引物同靶核苷酸序列的負(fù)鏈(-)互補(bǔ)，而另一個同正鏈(+)互補(bǔ)。將引物與變性后核酸一起退火，隨后用酶，如DNA多聚酶I的大片段(Klenow)或Taq DNA多聚酶和核苷酸或連接酶參與延伸，產(chǎn)生含靶核酸的合成的+和-鏈。因為這些新合成的核酸也是模板，所以變性、引物退火和延伸的重復(fù)循環(huán)導(dǎo)致被引物所限定區(qū)域(如靶核苷酸序列)的指數(shù)生成。擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物是散在核酸雙螺旋鏈，其末端與所采用的特異引物端相對應(yīng)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將知道其它也可用來增加靶核酸拷貝數(shù)目的擴(kuò)增的方法。
在本發(fā)明中所用的寡核苷酸引物可用任何合適的方法制備，如傳統(tǒng)的磷酸三酯和磷酸二酯方法或其自動的實施方案。在一個這樣的自動的實施方案中，用雙乙氨基磷酸酯作為起始材料并可以用Beaucage等人描述的方法進(jìn)行合成(Tetrahedron Lette rs，221859-1862，1981)。U.S.專利4,458,066中描述了一個在修飾的固相支持物上進(jìn)行寡核苷酸合成的方法。如上所述，一種可用于本發(fā)明的擴(kuò)增方法是U.S.專利4,683,202和4,683,195所描述的多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)。
任何純化或未純化核酸標(biāo)本均可用作為初始的核酸，條件是其含有或被懷疑有靶核酸特異的核酸序列。因此，此過程可以應(yīng)用DNA或RNA，它們可以是單鏈或雙鏈。在RNA被用作模板時需采用合適的酶和/或有利于模板逆轉(zhuǎn)錄成DNA的有利條件。此外，所使用的模板可以是有一條DNA鏈和一條RNA鏈組成的DNA-RNA雜合體。也可使用核酸的混合物或先前擴(kuò)增反應(yīng)的核酸產(chǎn)物(使用相同或不同引物)。被擴(kuò)增的核苷酸序列可以是一個大分子的一部分或最初作為一個不同分子存在，以便特異序列組成了整個核酸。不必要待擴(kuò)增的序列最初就必須是純化形式；它可以是一個復(fù)雜混合物的一個小部分，如包含在整個人類DNA中，只要線粒體DNA是被包括在內(nèi)即可。
當(dāng)標(biāo)本的靶核苷酸序列包含了兩條鏈時，在其被用作模板前需將核酸鏈分離開。解鏈可以作為一個單獨步驟或與引物延伸產(chǎn)物的合成同時進(jìn)行。這種鏈的分離可用許多適當(dāng)?shù)淖冃詶l件，包括物理，化學(xué)或酶學(xué)的方法來實現(xiàn)；“變性”這詞包含了所有這些方法。分離核酸鏈的一個物理學(xué)方法是加熱核酸直到它變性。典型熱變性所涉及的溫度范圍是從約80℃到105℃，時間約1到10分鐘。鏈的離開也可用一組稱之為解旋酶中的一個或具有解旋酶活性的Rec A酶在能變性DNA的核糖ATP存在時誘導(dǎo)。Kuhn Hoffmann-Berling(CSH-Quantitative Biology，4363，1978)描述了用解旋酶分離核酸鏈的適宜反應(yīng)條件，運用RecA的技術(shù)由C.Radding綜述(Ann.Rev.Genetics，16405-437，1982)。
若含有待擴(kuò)增的靶核酸的核酸是單鏈狀態(tài)，每條鏈的互補(bǔ)鏈?zhǔn)峭ㄟ^加入特異的互補(bǔ)的寡核苷酸引物而合成。在引物、聚合作用的因子和4種在以下將描述的三磷酸脫氧核苷酸存在下合成了引物延伸產(chǎn)物。產(chǎn)物和單鏈核酸互補(bǔ)，并與單鏈靶序列雜交。
當(dāng)核酸的互補(bǔ)鏈被分離時，不管核酸最初是雙鏈或單鏈的，分離的鏈可以用作另外核酸鏈合成的模板。這種合成是在允許引物同模板發(fā)生雜交的情況下進(jìn)行的。通常合成發(fā)生在PH優(yōu)選為7—9，最優(yōu)選為8的緩沖的水溶液中。優(yōu)選地，兩個寡核苷酸引物以過量的摩爾數(shù)(對于基因組核酸，通常引物∶模板比約108∶1)加入含分離的模板鏈的緩沖液中。然而，應(yīng)理解的是，如果本發(fā)明的方法被用于診斷，互補(bǔ)鏈的量可能是未知的，因此與互補(bǔ)鏈的量相應(yīng)的引物量是不可確定的。在實踐中，當(dāng)被擴(kuò)增的序列被包含在復(fù)雜的長鏈核酸鏈的混合物中時，加入的引物的量比互補(bǔ)鏈(模板)通常是摩爾過量。較大的摩爾過量有利于提高方法的效率。
在一些擴(kuò)增實施方案中，底物，如三磷酸脫氧核糖核苷酸dATP，dCTP，dGTP和dTTP以足夠的量單獨或和引物一起被加入合成混合物中，獲得的溶液被加熱到90℃-100℃，持續(xù)約1-10分鐘，優(yōu)選是1-4分鐘。在加熱過程后，將溶液冷卻到有利于引物雜交的溫度。向冷卻混合物中加入合適的因子使發(fā)生引物延伸反應(yīng)(在本文稱之為“聚合作用的因子”)，并在現(xiàn)有技術(shù)所知的條件下使反應(yīng)發(fā)生。如果其是熱穩(wěn)定性的，聚合作用的因子也可以同其它試劑一起加入。合成(或擴(kuò)增)反應(yīng)可發(fā)生在室溫直至一個高于該溫度聚合作用的因子便不再起作用的溫度。因此，例如，如果DNA聚合酶用作所述的因子，溫度通常不高于40℃，最方便的是反應(yīng)發(fā)生在室溫。
聚合作用的因子可以是任何具有完成引物延伸產(chǎn)物合成的功能的成分或系統(tǒng)，包括酶。合適的酶包括如E.coli DNA多聚酶I、Taq DNA多聚酶、E.coli DNA多聚酶I的Klenow片段、T4 DNA多聚酶，其它有效的DNA多聚酶、多聚酶突變蛋白質(zhì)(muteins)、逆轉(zhuǎn)錄酶、連接酶和其它酶，包括了熱穩(wěn)定酶(即那些在被放入到溫度足夠增高到引起變性后才發(fā)揮引物產(chǎn)延伸作用的酶)。合適的酶能促進(jìn)核苷酸以合適的方式結(jié)合，從而形成可與每條核苷酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物。通常合成將在每個引物的3′端開始沿模板鏈向5′方向進(jìn)行直到合成結(jié)束，產(chǎn)生不同長度的分子。然而，可能有些具聚合作用的因子，用上述相同的方法從5′端開始合成，沿另一個方向進(jìn)行。無論怎樣，本發(fā)明的方法不局限在這里描述的擴(kuò)增的實施方案。
在上述的雜交條件下，新合成的核苷酸鏈和其互補(bǔ)核酸鏈將形成一條雙鏈分子，這個雜交體被用于隨后的加工步驟。在下一步用上述的產(chǎn)生單鏈分子的任何步驟，將新合成的雙鏈分子進(jìn)行變性。
在單鏈分子上重復(fù)上述方法。為了在上述條件下繼續(xù)進(jìn)行反應(yīng)，如果需要的話，還需再加入聚合作用的因子、核苷酸和引物。合成將再一次在每條寡核苷酸引物的一端開始，沿著模板鏈進(jìn)行以產(chǎn)生另外的核酸。在這一步之后，延伸的產(chǎn)物的一半將由兩個引物所限定的特異核酸序列組成。在隨后步驟中，被兩個引物所限定的延伸產(chǎn)物以指數(shù)增長。
野生型基因的改變也可在基因的野生型表達(dá)產(chǎn)物的改變的基礎(chǔ)上被檢測到。這些表達(dá)產(chǎn)物包括線粒體rRNA，特別是12S rRNA。點突變量通過rRNA擴(kuò)增和測序或通過來自rRNA的cDNA分子克隆來檢測?？寺〉腸DNA的序列可用現(xiàn)有技術(shù)已熟知的DNA測序技術(shù)來測定，cDNA還可通過多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)如利用循環(huán)測序或不對稱PCR而被測序。
根據(jù)本發(fā)明，錯配可能是雜交的核酸雙螺旋，它們不是100％同源性的。不完全同源性可能是由缺失、插入、重排、取代或框架移動突變引起。錯配檢查可用來檢測在基因或其rRNA產(chǎn)物中的點突變。雖然這些技術(shù)的敏感性低于測序，但在進(jìn)行大的標(biāo)本量時較為簡便。一個錯配裂解技術(shù)的例子是RNA酶保護(hù)方法(Winter，et al.，Proc.Na tl.Acad.Sci.USA，827575，1985；Meyers，et al.，Science，2301242，1985)。在本發(fā)明的實踐中，該方法還包括應(yīng)用和人野生型基因編碼序列互補(bǔ)的標(biāo)記的核糖體探針，核糖體探針和從標(biāo)本中分離出的rRNA或DNA一起退火(雜交)，隨后用RNase A酶消化，它可檢測出在雙螺旋RNA結(jié)構(gòu)上的錯配。如果一個錯配被RNase A酶檢出，則其在錯配位點上被切除。因此當(dāng)退火的RNA標(biāo)本在一個電泳凝膠基質(zhì)上被分離時，如果一個錯配被檢出并被RNase A酶切除，就會見到一個RNA產(chǎn)物，該產(chǎn)物比核糖體探針和rRNA或基因形成的全長的雙螺旋RNA小，但其可以是兩者中的一部分。如果核糖體探針只包含線粒體rRNA或基因的一部分，為了檢測錯配，用許多這樣的探針去檢查整個rRNA序列可能會更好。
同樣，通過酶或化學(xué)裂解法，DNA探針可被用于檢測錯配(Cotton，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，854397，1988；Shenk，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，72989，1975)?；蛘?，錯配可以用錯配的雙螺旋相對于匹配的雙螺旋的電泳遷移率的改變而檢出(White，et al.，Genomics，12301，1992；Cariello，Huma n Genetics，42726，1988)。PCR-擴(kuò)增產(chǎn)物可用以篩查那些用SSCP分析時能引起DNA單鏈的電泳遷移率改變的變異(Orita，et al.，Genomics，5874，1989)。無論用核糖體探針還是DNA探針，可能含有突變的線粒體rRNA或DNA可在雜交前用PCR擴(kuò)增。線粒體基因DNA的改變也可用Southern雜交檢測，特別是這些改變是大的重組、缺失、或插入。
來自被PCR擴(kuò)增的標(biāo)本的rRNA基因的DNA序列也可用等位基因特異探針檢測。這些探針是核酸寡聚體，每個含有包含已知突變的rRNA基因序列區(qū)域。例如，一個寡聚體可能長約15核苷酸，對應(yīng)于rRNA基因序列的一個部分。利用一組這樣的等位基因特異的探針，可篩查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以確定在rRNA基因中以前已被確定的突變是否存在。等位基因特異的探針同擴(kuò)增的線粒體rRNA序列雜交可在一個尼龍膜上進(jìn)行。在嚴(yán)格雜交條件下與某一個特定探針雜交表明在標(biāo)本中存在與等位基因特異探針一樣的突變。
突變的線粒體rRNA基因或基因產(chǎn)物可在人體樣本或標(biāo)本如血液中被檢出。通過篩查這些標(biāo)本，可達(dá)到對耳毒性耳聾易感性的簡單早期診斷。本發(fā)明的診斷方法對于臨床工作者們選擇一個合適的治療過程是有用的，例如線粒體12S rRNA或基因呈現(xiàn)的改變可提示特定患者避免使用一種特定的耳毒性抗生素。其它能被篩查出可能對耳毒性耳聾易感性的突變基因可包括編碼線粒體核糖體蛋白基因的核基因。
本發(fā)明的引物對在應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)確定線粒體rRNA基因的核苷酸序列是有用的。成對的單鏈DNA引物可退火結(jié)合到線粒體rRNA或基因內(nèi)或周圍序列，以便引導(dǎo)線粒體rRNA或基因本身的DNA合成的擴(kuò)增。一整套的這些引物允許合成線粒體rRNA基因編碼序列全部的核苷酸。也可使用等位基因特異引物，這些引物只能退火到特定線粒體rRNA突變等位基因上，因此只能以突變的等位基因為模板擴(kuò)增產(chǎn)物。
為了方便克隆擴(kuò)增序列，可在引物5′端連有限制酶位點序列。這樣除了形成限制酶位點所必需的少數(shù)幾個核苷酸外，所有引物的核苷酸均來源于線粒體rRNA序列或線粒體rRNA的鄰近序列。這些酶和位點在本領(lǐng)域是眾所周知的。引物本身也可用本領(lǐng)域熟悉的技術(shù)合成。通常，引物利用商品化的合成儀合成。如果線粒體rRNA序列是已知的(Anders on，et al.，Nature，290457，1981)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地設(shè)計出特定引物。
本發(fā)明所提供的核酸探針可用于多方目的，它們可用于基因組DNA的S outhern雜交、用于上述的RNase保護(hù)方法來檢測點突變。所述的探針可用于檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，它們也可用于利用其它技術(shù)檢測線粒體rRNA基因或rRNA的錯配。錯配可用酶(如S1核酸酶)、化學(xué)品(如羥胺或四氧化鋨和六氫吡啶)或錯配雜種分子與完全匹配的雜種分子或靶序列的單鏈相比在電泳遷移率方面的改變來檢測。這些技術(shù)在本領(lǐng)域是公知的(Cotton，同前；Shenk，同前；Myers，同前；Winter，同前；White，同前；Orita，同前；and Novack，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83586，1986)。通常，探針是與線粒體rRNA基因編碼序列互補(bǔ)，當(dāng)然探針與rRNA的相應(yīng)區(qū)域也是共模板的。一整組核酸探針被用于組成一個檢測野生型線粒體rRNA基因的改變的試劑盒。試劑盒可以和整個線粒體rRNA基因雜交。探針彼此間是重疊或是鄰接的。在一優(yōu)選的實施方案中，若增加耳毒素易感性的突變位于線粒體16S rRNA的1555位核苷酸，所用的雜交探針是能與包含5′-CGA·CTT·GTC·TCC·TCT-3′(SEQ.I.D.NO.1)的正常序列的線粒體核苷酸序列雜交，及與5′-CGA·CTT·GCC·TCC·TCT-3′(SEQ.I.D.NO.2)的突變序列雜交，以及與其互補(bǔ)序列雜交的探針。
如果用一個核糖體探針檢測rRNA的錯配，該探針與人野生型線粒體rRNA基因的rRNA互補(bǔ)。核糖體探針通常用放射性，發(fā)色和熒光物質(zhì)標(biāo)記，這些都可用本領(lǐng)域熟悉的任何方法完成。如果核糖體探針被用于檢測DNA的錯配，其可以是正義也可以是反義性的。同樣，DNA探針也可以被用于檢測錯配。
核酸探針也可以與線粒體12S rRNA基因的突變等位基因互補(bǔ)。以雜交為基礎(chǔ)，所述的探針在檢測其它患者的相似突變上比錯配更有用。這些在上文已討論過并被稱之為等位基因特異探針。如上所述，線粒體rRNA探針也可用于與基因組DNA的Southern雜交來測出大的染色體改變?nèi)缛笔Щ虿迦?。探針也可用于從具有耳毒性耳聾素因的患者及沒有該素因的正常個體的組織中選擇線粒體rRNA基因的cDNA克隆。此外，這些探針可用于檢測組織中的線粒體rRNA，以確定野生型線粒體基因的改變是否導(dǎo)致表達(dá)降低。如果提供線粒體rRNA編碼序列(Anderson，et al.，Nature，290457，1981)，則本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地設(shè)計出的特定探針。
在本發(fā)明的一個實施方案中，包含10-50堿基的寡核苷酸序列純化的核酸片段經(jīng)放射性標(biāo)記。通過Southern雜交技術(shù)標(biāo)用記好的制備物探測核酸。來自于一個標(biāo)本的核苷酸片段在擴(kuò)增前或擴(kuò)增后，通過凝膠電泳分離成不同分子量的片段，轉(zhuǎn)移到結(jié)合核酸的膜上。
將包含靶核酸序列的核苷酸片段與標(biāo)記探針雜交，放射性探針和靶核酸片段的結(jié)合通過放射自顯影鑒定(見Genetic Engineering，1，ed.RobertWilliamson，Academic Press，(1981)，72-81)?；蛘邅碇S便的核酸可直接被結(jié)合到膜上，放射性探針選擇性地與感興趣的具有特異序列的核酸結(jié)合，其結(jié)合程度通過直接計數(shù)放射量而被定量。
當(dāng)靶核酸沒有被擴(kuò)增時，可直接用一個適當(dāng)?shù)碾s交探針與分離的哺乳動物核酸進(jìn)行檢測。當(dāng)靶核酸被擴(kuò)增的情況下，可在擴(kuò)增后用適當(dāng)雜交探針進(jìn)行檢測。
本發(fā)明的探針可用于檢查被測特異片段的分布，以及探針結(jié)合的(相對)程度以確定是否存在結(jié)合(雜交)特別強(qiáng)的序列，因此可提示某個體可能患耳毒性耳聾風(fēng)險的高低。
在大多數(shù)情況下，探針將用一個原子或無機(jī)基團(tuán)標(biāo)記，最常用的是放射性同位素，但也可能是重金屬。通常，可采用放射性標(biāo)記。放射性標(biāo)記包括32P、125I、3H、14C、35S等。任何可提供足夠信號和相當(dāng)半衰期的放射性標(biāo)記都可采用。其它標(biāo)記包括配體，它可作為對標(biāo)記配體等的特異結(jié)合配對成員。已經(jīng)采用許多不同的標(biāo)記進(jìn)行免疫測定，這些均可在本發(fā)明分析中采用。標(biāo)記物的選擇由影響雜交率的標(biāo)記效果、探針與突變核苷酸序列的結(jié)合能力所決定。以下這一點是必需的標(biāo)記物要能提供足夠敏感性以檢測可雜交的突變核苷酸序列的量。另一點要考慮的是探針要便于合成、現(xiàn)有的測試設(shè)備、自動化能力、方便等等。
根據(jù)標(biāo)記物的本性，標(biāo)記物同探針結(jié)合的方式將不同。對于放射性標(biāo)記物，可采用多種不同的技術(shù)。通常采用的是用α-32P-dNTP進(jìn)行缺口翻譯，或用堿性磷酸酶進(jìn)行末端水解后用γ-32P ATP和T4多核苷酸激酶標(biāo)記上放射性32P?；蛘撸珊铣珊塑账?，以放射性同位素替代一個或多個現(xiàn)有的元素，如用氚替代氫。如果需要，標(biāo)記的互補(bǔ)鏈可用作探針以增強(qiáng)雜交的標(biāo)記物濃度。
當(dāng)應(yīng)用其它放射性同位素標(biāo)記物時，可采用不同的連接基團(tuán)?？捎脽o機(jī)酸如32P磷酸或14C有機(jī)酸酯化末端羥基，或其它酯化方法為標(biāo)記物提供連接基團(tuán)?；蛘咧虚g的堿基可用可激活的連接基團(tuán)取代，然后與標(biāo)記物連接。
作為報導(dǎo)基團(tuán)的有價值的酶類主要是堿性磷酸酶、水解酶，特別是酯酶和葡萄糖苷酶，或氧化還原酶，特別是過氧化物酶。熒光復(fù)合物包括熒光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹酰、7-羥香豆素，等等?；瘜W(xué)發(fā)光包括如蟲熒光索和2，3-雙氫二氮雜萘二酮(如氨基苯二酰一肼)。
探針可用于與固定在非水溶性的孔狀支持物上的核苷酸序列雜交。根據(jù)核酸的來源，核酸固定在支持物上的方法可不同。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員知道，或容易確定，可用于本發(fā)明的方法的不同的支持物。
來自標(biāo)本的核酸點在或鋪在濾膜上提供許多個體部分。膜是惰性多孔固相支持物，如硝酸纖維素或尼龍膜。標(biāo)本中存在的任何哺乳類細(xì)胞經(jīng)處理釋放出其核酸。核酸的溶解和變性以及后來的洗滌，可用適宜的溶液作用足夠的時間以溶解細(xì)胞和變性核酸。其它變性劑包括升高溫度、有機(jī)試劑(如酒精、酰胺、胺類、尿素、苯酚和亞砜)或某些無機(jī)離子(如硫氰酸鹽和高氯酸鹽)?；蛘?，通過標(biāo)準(zhǔn)程序從血中分離核酸，隨后將DMA加到膜上。
變性后，膜在水性緩沖溶液如Tris(通常pH約6-8，常常為7)緩沖液中洗脫。用與溶解和變性時采用的相同程序洗一或多次。在溶解、變性和洗脫完成之后，點上核酸斑點的膜在高溫下干燥，通常為50℃-70℃或紫外交聯(lián)(對于尼龍膜)。經(jīng)過這一程序，核酸被固定在點加的位置上，在方便時便可用探針分析。
在一個輕度升高的溫度下在無探針的雜交溶液中將膜保溫足夠的時間，使膜完全浸濕完成預(yù)雜交過程?？刹捎貌煌碾s交溶液，包含從20％到60％(體積)，最好是30％的非極性有機(jī)溶劑或水性雜交溶液。
上述具體的雜交技術(shù)不是本發(fā)明的要點。其它雜交技術(shù)是眾所周知的或容易被本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所掌握。隨著雜交技術(shù)的改進(jìn)，它們在本發(fā)明的方法中可隨時被采用。
雜交溶液中標(biāo)記探針的總量變異很大，取決于標(biāo)記物的性質(zhì)、能結(jié)合到膜上的標(biāo)記探針的量和雜交強(qiáng)度。通常，采用遠(yuǎn)遠(yuǎn)比計算的濃度過量的探針，以增強(qiáng)探針與固定在膜上的靶核酸的結(jié)合率。
可采用不同程度的雜交嚴(yán)格條件。條件越嚴(yán)格，探針與單鏈靶核酸序列之間雜交形成雙螺旋所需的互補(bǔ)性越大。嚴(yán)格性可通過溫度、探針的濃度、探針長度、離子強(qiáng)度及雜交時間等控制。通常，雜交的嚴(yán)格性通過調(diào)節(jié)甲酰胺的濃度在20％到50％范圍以控制反應(yīng)溶液極性的改變。采用的溫度正常在20℃-80℃的范圍，通常為30℃-75℃(通常參見Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel，ed.，Wiley&Sons，1989)?；蛘?，當(dāng)非退火探針被洗去時，嚴(yán)格性可控制。
在膜與雜交溶液在合適溫度下持續(xù)接觸足夠時間使發(fā)生雜交后，然后將膜移入含有氯化鈉、檸檬酸鈉和十二烷基硫酸鈉的第二種溶液。膜在第二種溶液中持續(xù)的時間可為5分鐘到3小時或更長的時間。第二種溶液和溫度(通常低于解鏈溫度5℃)決定了嚴(yán)格性、雙螺旋和短的互補(bǔ)序列。對于短的寡核苷酸探針，通過在洗脫液中加入四甲基氯化銨，解鏈溫度可根據(jù)探針的長度而不是其序列而標(biāo)準(zhǔn)化，(Dilella and Woo，Meth.Enzymol.，152447，1987)?，F(xiàn)在可遵照標(biāo)記物的性質(zhì)測試膜上的雙螺旋。當(dāng)標(biāo)記物是放射性時，膜干燥后進(jìn)行X光膠片曝光。本發(fā)明測試中所用的材料適宜于制備試劑盒。這種試劑盒包含一個分隔的包裝，可容納小的一個或多個容器如小瓶、試管等，每種容器包含一種本方法所用的的試劑。
例如一個容器包含一個已被或可以被檢測性標(biāo)記的雜交探針。還可包含第二個容器(如果存在)灌裝裂解緩沖液。試劑盒還可包含裝有用以擴(kuò)增目標(biāo)核酸序列的各種核苷酸的容器，，和/或一個包含報導(dǎo)者的容器(如一個生物素結(jié)合蛋白如親和或鏈親和素，結(jié)合到報導(dǎo)分子，如酶、熒光或同位素標(biāo)記物)。
根據(jù)本發(fā)明，還提供了對攜帶突變線粒體rRNA等位基因的細(xì)胞提供野生型線粒體rRNA功能的方法。提供這種功能可抑制對耳毒性耳聾的素因。野生型線粒體rRNA基因或基因的一部分可在一個載體中導(dǎo)入細(xì)胞，以便該基因以染色體外形式存在。在這種情況下，基因由細(xì)胞從染色體外的部位表達(dá)。如果一個基因部分被導(dǎo)入并在攜帶突變線粒體rRNA等位基因的細(xì)胞中表達(dá)，該基因的部分應(yīng)編碼對耳毒性耳聾不易感所必需的線粒體rRNA的一部分。優(yōu)選的是野生型線粒體rRNA基因或其一部分是以如此方式導(dǎo)入突變的細(xì)胞中，即它與線粒體中內(nèi)源性突變的線粒體rRNA基因發(fā)生重組。將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的方法，如電穿孔、磷酸鈣共沉淀和病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)是本領(lǐng)域所熟悉的，方法的選擇也在常規(guī)操作者的能力之內(nèi)。用野生型線粒體rRNA基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可作為研究失去對耳毒性耳聾和藥物治療易感性的模型系統(tǒng)，這些藥物治療在易感個體中不導(dǎo)致耳毒性耳聾。
對耳毒性耳聾的易感性可通過在人正常組織中檢測線粒體rRNA基因的突變來確定。如，一個獲得種系突變線粒體rRNA的個體易于對耳毒性耳聾易感。這可以通過對來自該個體任何組織的編碼線粒體rRNA的DNA的檢測而確定。最簡單的是，抽取血液，從血細(xì)胞中提取編碼線粒體rRNA的DNA。此外，通過測定胎兒細(xì)胞或羊水中線粒體rRNA基因的易感性突變進(jìn)行產(chǎn)前診斷。野生型線粒體rRNA等位基因的改變，無論是點突變還是缺失，都可通過以上所述的任何方法得到檢測。
根據(jù)本發(fā)明，cDNA分子是無內(nèi)含子的線粒體rRNA基因的編碼分子。他們可通過以線粒體rRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄而成。這些分子在載體和細(xì)胞系中能得到繁殖是本領(lǐng)域所熟知的。應(yīng)用合成化學(xué)技術(shù)也可制備cDNA。
以上一般性地描述了本發(fā)明。通過參照以下的實施例可獲得更徹底的理解，本文中提供這些實施例僅僅為了解釋的目的，而不是試圖局限本發(fā)明的范圍。
實施例1家系耳聾突變的檢測本實施例描述了三個母系傳遞的氨基糖苷致耳聾的家系的基因分析(圖1)。在給予鏈霉素后所有患病個體均發(fā)生了高頻感覺神經(jīng)性聽力的喪失。
在本研究中，包含線粒體12S和16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(分別在核苷酸(nt)648-1601和1671-3229之間)被直接測序(Anderson，et al.，Nature，290457-465，1981)。序列是來自兩個獨立的患者，來自圖1中家系A(chǔ)的先證者的母親、來自家系C的先證者。二個患者在12S rRNA基因有相同的4個序列的改變663 A→G、750 A→G、1438 A→G、1555 A→G，在16S rRNA基因有3個序列改變1736 A→G、2706 A→G、和3107位核苷酸1個堿基的缺失。在nt750、1438、2706和3107的“突變”實際上是Cambridge序列上的錯誤(Marzuki，et al.，Hum.Genet.，88139-145，1991)。等位基因特異寡核苷酸雜交(Conner，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80278-282，1983；Saiki，et al.，Nature，234163-166，1986；Dilella，et al.，Meth.Enzymol.，152447-451，1987)被用來篩查另外一個耳毒性耳聾的患者(圖1中的先證者B)以及聽力對照組，來檢測3個“真”突變663 A→G，1555 A→G和1736 A→G。第三個患者也存在所有3個突變。
在對照組278個個體中沒有發(fā)現(xiàn)12S rRNA基因1555A→G的突變，對照組包括138個亞洲人(117個中國人，21個非中國人)、60阿拉伯人、55個高加索人和25個黑人。而在亞洲對照組中663 A→G和1736 A→G突變發(fā)生率為11％(13/115)和10％(13/130)。同樣的13個對照者同時有663和1736突變。1555 A→G突變在3個家系中是同質(zhì)的(見下)。A.DNA的加工和擴(kuò)增除了先證者C、以色列-阿拉伯先證者的表弟和33個對照的DNA是從EB病毒轉(zhuǎn)變的淋巴母細(xì)胞系中分離出來外，其他人的DNA都是從血標(biāo)本中分離獲得?？偣矙z測了278個對照個體，包括138個亞洲人(117個中國人，21個非中國人)、60個阿拉伯人、55個高加索人和25個黑人。
mtDNA在Perkin-Elmer/Cetus熱循環(huán)儀中擴(kuò)增(Saiki，et al.，Science，239487-491，1988)，用100ng DNA、每個引物10pmol、10mM Tris-Hcl pH8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2、200μM dNTPs和1U Taq DNA多聚酶(Perkin-Elmer/Cetus)，25-100μl體積，起始變性95℃5分鐘，以后95℃30秒；55℃1分鐘；65℃1.5分鐘/kb。
為了用PCR測序，PCR產(chǎn)物用Promega′s Magic PrepTM試劑盒從低熔點膠中(GeneLine LMP agarose，Beckman Instruments)純化，用[α-35S]dATP(NEW/Dupont)和New England Biolabs循環(huán)測序試劑盒進(jìn)行測序。B.突變的分析等位基因特異寡核酸雜交(Conner，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80278-282，1983；Saiki，et al.，Nature，324163-166，1986)用PCR產(chǎn)物進(jìn)行，PCR產(chǎn)物煮沸后用冷18xSSC稀釋，用斑點點樣器(Schleicher and Schuell)點在magnaNT尼龍膜上(Micron Separation，Inc.)。合成的寡核苷酸長15堿基，突變或正常的核苷酸位于中央位置，如上所述，用[α-32P]dCTP(ICN Biochemical)或Boehringer Mannheim Biochemical公司的3′端標(biāo)記試劑盒所供給的地高辛-ddUTP標(biāo)記。在所推薦的緩沖液中于在37℃雜交保溫箱(Robbins Scientific)中雜交。在室溫用2X SSC、0.1％SDS初步洗脫后，在含3M四甲基氯化銨(Sigma Chemical Co.)、50mM Tris-HCl pH 8.0、2mM EDTA中于46℃嚴(yán)格洗脫(Dilella，et al.，Meth.Enzymol.，152447-451，1987)。對于地高辛標(biāo)記的探針，根據(jù)廠家的要求，用化學(xué)發(fā)光法檢測標(biāo)記信號。
對改變了限制酶切位點的突變，作為對完全消化和異質(zhì)的陽性對照，合成了包含一個額外被測酶切位點的PCR產(chǎn)物。根據(jù)廠家的指南(New England Biolabs)進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)物的消化，PCR產(chǎn)物可直接使用，或者先用pH8.2的50mM Tris乙酸緩沖液從低熔點膠中分離出來。限制酶酶解產(chǎn)物電泳后用澳化乙錠染色顯示。
捕獲-寡核苷酸核苷酸摻入(TONI)分析如所描述的進(jìn)行(Prezant，et al.，Hum.Mut.，1159-164，1992)。簡單說來，3′端靠著突變位點而5′端生物素化的寡核苷酸通過摻入模板特異的下一個核苷酸而延長。平行的反應(yīng)只包含一種對應(yīng)于正?；虍惓Ｐ蛄械姆派湫訹α-32P]dNTP。放射標(biāo)記的寡核苷酸反應(yīng)產(chǎn)物被連接著磁珠的鏈抗生物素蛋白(Advanced Magnetics)所捕獲，洗脫后在液閃計數(shù)儀上通過Cerenkov計數(shù)進(jìn)行定量。
若進(jìn)行Southern印跡雜交，1μg基因組血DNA用8UBsmA1(New England Biolabs)消化。經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，通過毛細(xì)現(xiàn)象轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(MagnaNT，Micron Separations，Inc.)，通過Amersham的多引物試劑盒用[α-32P]dCTP標(biāo)記標(biāo)記mtDNA片段(在nt319和2590之間的PCR產(chǎn)物)，印跡膜與探針線在Boehringer Mannheim雜交緩沖液中55℃雜交16個小時。嚴(yán)格洗脫液包含0.1X SSC、0.1％SDS，在55℃洗脫。
在一個先天性母系遺傳耳聾的阿拉伯-以色列家系中，rRNA基因的序列分析結(jié)果為12S rRNA基因中發(fā)現(xiàn)9個突變，在16S rRNA基因中發(fā)現(xiàn)3個，包括上述的4個Cambridge序列中的錯誤。在7個“真的”12S rRNA基因的突變中，有4個(825 T→A，851 A→G，930 G→A和1555 A→G)在對照組中很少見或從未見到；在16SrRNA基因中的一個突變(1822 T→C)也少見。除了1555 A→G突變外，這些殘基在進(jìn)化上不保守(Neefs，et al.，Nucl.Acids Res.，19 Supplement1987-2018，1991；Gutell，et al.，Prog.in Nucl.Acid Res.& Molec.Biol.，32155-216，1985；Gutell，et al.，Nucl.Acids Res.，26167-180，1981)。
根據(jù)PCR擴(kuò)增的DNA片段的兩條鏈的測序和SSCP/異源雙螺旋分析，似乎所有的mtDNA突變都是同質(zhì)的。此外，如果正常序列以10％或更高水平存在的話，在用檢測突變的分析方法測定了至少12-20個家系成員時，應(yīng)該檢測出異質(zhì)性。所有限制酶消化都是完全的，因為包含每種酶的PCR產(chǎn)物被選作對照位點。而且，在等位基因特異的寡核苷酸雜交中也沒有發(fā)現(xiàn)異質(zhì)的證據(jù)(Conner，同前；Saiki，同前；Dilella，同前)。
1555 A→G突變廢除了一個BsmA I限制酶切位點，應(yīng)用Southern印跡分析探索了其異質(zhì)的可能性。正常mtDNA在這個區(qū)域有兩個BsmA1片段(1106和1460bp)，而患者有相應(yīng)的2566bp的突變片段。對來自阿拉伯-以色列家系中的3個成員(兩個耳聾和1個未發(fā)病)、5個患耳毒性耳聾家系成員(4個來自家系A(chǔ)和1個為家系B的先證者)和一聽覺對照的基因組DNA消化物進(jìn)行了比較，沒有發(fā)現(xiàn)異質(zhì)的證據(jù)，因為耳聾家系成員沒有正常大小的BsmA I片段。
在三個耳毒性耳聾的家系中，對表1中用粗體強(qiáng)調(diào)的阿拉伯-以色列家系中少見的突變進(jìn)行了篩查，除了在三個家系中均存在1555A→G突變外，在他們中沒有發(fā)現(xiàn)那些少見突變。
表1在阿拉伯-以色列家譜中的mtDNA突變基因替代突變保守性* 檢測** 突變對照數(shù)/對照總數(shù)12S rRNA 709G→A否 ASO3/19769G→A否 ASO4/19825T→A否 ASO2/103851A→G否 ASO0/107930G→A否 ASO5/1071018G→A否 ASO4/191555A→G＝B，M，RASO0/27816S rRNA 1822T→C否 ASO1/110tRNA agn 5704C→T＝B，M，RASO0/106tRNA agp 7521G→A否 ASO3/19ATP酶6 8582C→A(Ala→Val) 否 Fnu4H I、 1/1098701A→G(Thr→Ala) 否 TONI測定 4/168860A→G(Thr→Ala) 否 Hha I(+) 13/17CO 3 9559G→C(Arg→Pro) 否 TONI測定 5/5ND 310143G→A(Gly→Ser) 否 Alu I(+) 1/10710398A→G(Thr→Ala) ＝B，M，RASO15/35ND 411025T→C(Leu→Pro) ＝B ASO0/109tRNA Ser(AGY)12236G→A ＝B，M ASO6/100ND 512950A→G(A8n→Ser) ＝B，M，R，X Hha I 0/11013105A→G(Ile→Val) ＝B，M，R，X ASO4/42Cytb15884G→A(Ala→Thr) 否 HaeIII(-)＊ 在牛(B)、小鼠(M)、大鼠(R)和爪蟾(X)中蛋白編碼基因的氨基酸或rRNAs和tRNAs的核苷酸的保守性，否＝不保守。＊＊檢測方法包括等位基因特異的寡核苷酸雜交(ASO)、PCR產(chǎn)物的RFLP分析和TONI分析(模板特異的核苷酸摻入分析)，(-)和(+)分別代表所顯示的限制酶切位點的缺失和得到。除了以上的突變，我們發(fā)現(xiàn)了Cambridge共有序列上的6個已知為錯的序列改變(在ntl438、13702、14199、14272、14368和15326)、蛋白編碼基因中另外44個中性突變和Cambridge上的3個新錯誤(在nt740、2706和3107)(Prezant，et al.，已投稿)。以前所述的多態(tài)性包括位于nt8701、8860、9559和10398的突變(文獻(xiàn)20、35、43、47)。用黑體表示的突變在對照組中的發(fā)生率＜5％。除了1555A→G突變在全部278個對照篩查外，對照組包括了阿拉伯-以色列人、高加索人、亞洲人和黑人各35個。
實施例2散發(fā)性耳毒性耳聾突變的檢測本實施例描述了對無耳聾家族歷史但在接觸氨基糖苷后表現(xiàn)嚴(yán)重聽覺喪失的個體的研究結(jié)果。
血標(biāo)本采自36個學(xué)生(18個女性，18個男性)，年齡12至21歲，來自北京的三個耳聾學(xué)校和一個上海耳聾學(xué)校的學(xué)生。開始耳聾的時間是從1到10歲，聽覺的喪失在抗生素治療的6個月內(nèi)被診斷，16例兒童接受鏈霉素，10例為慶大霉素，4例為卡那霉素，5例為慶大霉素和卡那霉素混用及1例鏈霉素和慶大霉素混用。大多數(shù)病例是門診患者，對輕微發(fā)熱性疾病(如上呼吸系統(tǒng)感染)給予抗生素治療。聽覺的喪失的嚴(yán)重性通過聽力學(xué)測定為嚴(yán)重或明顯。病史方面，沒有其它家族成員耳聾，不知是否有其它家族成員經(jīng)氨基糖苷治療后聽覺喪失。
除了mtDNA核苷酸1261和2866之間的區(qū)域通過PCR擴(kuò)增外，患者標(biāo)本如同在實施例1中描述的一樣進(jìn)行處理。在25μl的體系中加入100ng DNA、每個引物各10pmol、10mM Tris-HCl pH 8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2、100μM dNTPs和1U Taq DNA多聚酶(Perkin-Elmer/Cetus)，開始在95℃變性5分鐘，其后95℃變性30秒，54℃1分鐘，65℃3.5分鐘，在Perkin-Elmer/Cetus熱循環(huán)儀中擴(kuò)增mtDNA(Saiki，etal.，Science，239487-491，1988)。
通過等位基因特異的寡核苷酸雜交，研究結(jié)果顯示在36例中有1例有12S rRNA基因1555 A→G突變。所有其它35例患者這個位置上為正常的A核苷酸。
1555A→G突變廢除了一個BsmA I限制位點，應(yīng)用Southern即跡分析對該突變異質(zhì)性的可能性進(jìn)行進(jìn)一步研究。正常mtDNA在擴(kuò)增的ntl261至2866區(qū)域有兩個BsmA I位點，產(chǎn)生206、293和1106bp的限制性片段，而患者有206bp片段和相應(yīng)突變的1399bp片段。在新近確定的具1555 A→G突變的患者中，Southern印跡分析沒有顯示異質(zhì)的證據(jù)(＜＜1％)。對有1555 A→G突變的患者的臨床咨詢是他的母系親屬不能使用氨基糖苷。
本發(fā)明的許多實施方案已被描述。但是，必須知道，可進(jìn)行許多改進(jìn)而不脫離本發(fā)明的目的和范圍。相應(yīng)地，應(yīng)該理解本發(fā)明不局限在具體描述的實施方案中，而只應(yīng)由后附的權(quán)利要求書的范圍而限定。
序列總結(jié)序列ID NO.1是與正常線粒體12S rRNA核苷酸序列雜交的探針核苷酸序列。
序列ID No.2是與突變線粒體12S rRNA核苷酸序列雜交的探針核苷酸序列。
序列ID No.3是人線粒體12S rRNA 3′端核苷酸序列。
序列ID No.4是與序列ID No.3相應(yīng)區(qū)域的大腸桿菌16S rRNA核苷酸序列。序列表(1)一般信息(i)申請人Cedars-Sinai Medical Center(ii)發(fā)明名稱耳毒性耳聾易感性突變的檢測方法(iii)序列數(shù)目4(iv)聯(lián)系地址(A)收信人Spensley Horn Jubas&Lubitz(B)街道1880 Century Park East，Suite500(C)城市Los Angeles(D)州California(E)國家USA美國(F)郵編90067(v)計算機(jī)可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機(jī)IBM兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOC(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.25(vi)本申請資料(A)申請?zhí)朠CT(B)申請日期1994年6月30日(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)姓名Gerardi，Michael M.
(B)注冊號33，698(C)代表/檔案號FD-2773(ix)通訊聯(lián)系信息(A)電話(310)553-5050
(B)傳真(310)553-4619(2)SED ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度15堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置1..15(xi)序列描述SED ID NO1CGACTTGTCT CCTCT(2)SED ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度15堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置1..15(xi)序列描述SED ID NO2CGACTTGCCT CCTCT(2)SED ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度127堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型rRNA(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵misc_RNA(B)位置1..127(xi)序列描述SED ID NO3AUGCACACCG CCCGUCACCC UCCUCAAGUA UACUUCAAAG GACAUUUAAC UAAAACCCCU 60ACGCAUUUAU AUAGAGGAGA RCAAGUCGUA ACAUGGUAAG UGUACUGGAA AGUGCACUUG 120GACGAAC 127(2)SED ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度151堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型rRNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵misc_RNA
(B)位置1..151(xi)序列描述SED ID NO4AUGCACACCG CCCGUCACAC CAUGGGAGUG GGUUGCAAAA GAAGUAGGUA GCUUAACCUU 60CGGGAGGGCG CUUACCACUU UGUGAUUCAU GACUGGGGUG AAGUCGUAAC AAGGUAACCG120UAGGGGAACC UGCGGUUGGA UCACCUCCUU A 15權(quán)利要求
1.檢測人類耳毒性耳聾遺傳素因的方法，包括檢測人類組織中野生型線粒體rRNA基因編碼序列的改變或該序列表達(dá)產(chǎn)物的改變，所述改變表明對耳毒性耳聾易感。
2.權(quán)利要求1的方法，其中表達(dá)產(chǎn)物是一種rRNA。
3.權(quán)利要求2的方法，其中rRNA是12S rRNA。
4.權(quán)利要求2的方法，其中野生型線粒體rRNA的改變是通過組織來源的rRNA與線粒體rRNA基因探針的雜交檢測。
5.權(quán)利要求1的方法，其中野生型線粒體rRNA基因編碼序列的改變是用線粒體rRNA基因編碼序列的探針與從組織中分離出的DNA雜交檢測。
6.權(quán)利要求5的方法，進(jìn)一步包括將來自對耳毒性耳聾不易感個體的線粒體DNA與線粒體rRNA基因編碼序列的探針進(jìn)行Southern雜交；和比較線粒體rRNA基因探針與潛在易感耳毒性耳聾個體的組織的雜交和與不易感耳毒性耳聾個體的組織的雜交。
7.權(quán)利要求5的方法，其中線粒體rRNA基因編碼序列的探針檢測限制片段長度多態(tài)性。
8.權(quán)利要求1的方法，其中野生型線粒體rRNA基因編碼序列改變的檢測是通過當(dāng)分子(1)線粒體rRNA基因或從組織中分離出的線粒體rRNA，和(2)與人野生型線粒體rRNA基因編碼序列互補(bǔ)的核酸探針相互雜交后形成雙螺旋時，鑒定分子(1)和(2)間的錯配來進(jìn)行。
9.權(quán)利要求5的方法，其中線粒體rRNA基因編碼序列的探針與主要由核苷酸648到1601或其一部分組成的線粒體rRNA核苷酸序列雜交。
10.權(quán)利要求9的方法，其中線粒體rRNA基因編碼序列進(jìn)一步包含旁側(cè)調(diào)節(jié)序列。
11.權(quán)利要求1的方法，其中野生型線粒體rRNA基因編碼序列的改變通過組織中線粒體rRNA基因序列的擴(kuò)增和擴(kuò)增的線粒體rRNA序列與核酸探針的雜交而被檢出，所述的探針包含正常或突變序列的線粒體rRNA序列。
12.權(quán)利要求1的方法，其中野生型線粒體rRNA基因編碼序列的改變通過組織中線粒體rRNA基因分子克隆和克隆的線粒體rRNA基因的全部或部分的測序而檢測。
13.權(quán)利要求1的方法，其中野生型線粒體rRNA基因編碼序列的改變的檢測出包括對缺失突變的篩查。
14.權(quán)利要求1的方法，其中野生型線粒體rRNA基因編碼序列的改變的檢測包括對點突變的篩查。
15.權(quán)利要求1的方法，其中野生型線粒體rRNA基因編碼序列的改變的檢測包括對插入突變的篩查。
16.權(quán)利要求1的方法，其中野生型線粒體rRNA基因編碼序列的改變的檢測包括對重排突變的篩查。
17.權(quán)利要求1的方法，其中耳毒素是一種氨基糖苷。
18.檢測人類耳毒性耳聾的遺傳素因的方法，包含檢測人類組織中野生型核基因編碼序列的改變或該序列的表達(dá)產(chǎn)物的改變，改變提示對耳毒性耳聾的易感性。
19.權(quán)利要求18的方法，其中核基因表達(dá)產(chǎn)物是線粒體核糖體蛋白亞基。
20.權(quán)利要求18的方法，其中核基因表達(dá)產(chǎn)物與耳毒素攝取或運輸有關(guān)。
21.權(quán)利要求18的方法，其中核基因表達(dá)產(chǎn)物與耳毒素代謝有關(guān)。
22.與人類線粒體rRNA基因編碼序列或該序列表達(dá)產(chǎn)物的改變互補(bǔ)的核酸探針，其中所述的改變伴有耳毒性耳聾。
23.權(quán)利要求22的核酸探針，其中所述序列的表達(dá)產(chǎn)物是12S rRNA。
24.權(quán)利要求22的核酸探針，其中所述的改變是1555核苷酸從腺嘌呤到鳥嘌呤的改變。
25.檢測野生型線粒體rRNA基因或基因表達(dá)產(chǎn)物改變的試劑盒，其中所述的改變伴有耳毒性耳聾，所述的試劑盒包含被分隔的包裝，在緊密限制下容納一個或多個容器，容器中裝有與所述改變互補(bǔ)的核酸探針。
26.權(quán)利要求24的試劑盒，其中試劑盒包含多個重疊或鄰接的核酸探針。
27.權(quán)利要求25的試劑盒，其中探針能同整個線粒體rRNA基因雜交。
28.權(quán)利要求24的試劑盒，其中rRNA基因編碼12SrRNA。
全文摘要
描述了與耳毒性耳聾、尤其是與服用氨基糖苷類藥物有關(guān)的耳聾相關(guān)的線粒體核苷酸的檢測方法。
文檔編號C12Q1/68GK1126496SQ94192651
公開日1996年7月10日 申請日期1994年6月30日 優(yōu)先權(quán)日1993年6月30日
發(fā)明者內(nèi)森·費舍爾-古德西蘭, 托尼·普雷津特 申請人:錫達(dá)斯-賽奈醫(yī)學(xué)中心