專利名稱：試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)體液樣品中血清碳酸氫鹽濃度的酶方法中的試劑。本發(fā)明尤其涉及用于其中反應(yīng)樣品中氧化輔酶的量直接相當(dāng)于樣品中存在的碳酸氫鹽濃度的方法中的試劑。本發(fā)明也涉及測(cè)定碳酸氫鹽濃度的改進(jìn)方法。
體液樣品中待分析物(特別是碳酸氫鹽)的定量可包括將空白樣品與發(fā)生待分析物酶轉(zhuǎn)化的樣品進(jìn)行對(duì)照。
欲完成碳酸氫鹽的酶轉(zhuǎn)化，讓底物特異酶作用于已知用于血清碳酸鹽定量的酶底物。相對(duì)空白而言，反應(yīng)混合物中的變化可通過(guò)用不同方法測(cè)定混合物吸收度的變化來(lái)計(jì)算出。吸收度的變化與樣品中存在的碳酸氫鹽的數(shù)量直接相關(guān)。
雖然包括比色法測(cè)定、分壓分析和電極測(cè)試在內(nèi)的傳統(tǒng)方法已證明令人滿意，但酶分析法在測(cè)定血清碳酸氫鹽水平方面比其它這些方法更精確、可靠和簡(jiǎn)單。
樣品中總CO2的常用定量方法要求將病人的樣品與底物磷酸烯醇丙酮酸鹽(PEP)混合，在此時(shí)讀取空白讀數(shù)。然后向混合物中加入底物特異酶，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)，引起PEP轉(zhuǎn)化成草酰乙酸鹽(OAA)和磷酸鹽。
盡管隨后可有不同方法使草酰乙酸鹽與樣品中總CO2相關(guān)聯(lián)，但最常用的方法要求草酰乙酸鹽與還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和蘋果酸脫氫酶(MDH)偶合，此反應(yīng)結(jié)果是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化和蘋果酸鹽的生成。
產(chǎn)生的NAD+濃度與最初樣品中存在的總CO2濃度相關(guān)。
從歷史上來(lái)看，碳酸氫鹽酶試劑重構(gòu)穩(wěn)定性差。不穩(wěn)定的原因歸于溶液中內(nèi)源性成份的破壞，加之試劑攝入空氣中的CO2。通常來(lái)自玉米葉的PEPC(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)特別易受氧化降解作用的影響，通過(guò)內(nèi)源性污染物如NADH氧化酶和蛋白酶緩慢地降低PEPC的效力。盡管將NADH貯存在堿性的PH環(huán)境中能明顯改善其重構(gòu)穩(wěn)定性，但NADH(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)在溶液中特別是在酸性介質(zhì)中仍將迅速降解。
大多數(shù)測(cè)定血清碳酸氫鹽的試劑是在PH約為8.0的堿性條件下配制。在此PH值時(shí)，空氣中的CO2就成問(wèn)題了。外源性CO2的吸收引發(fā)一連串酶反應(yīng)，導(dǎo)致后來(lái)的NADH損失和吸收度及試劑穩(wěn)定性的必然降低。用劣質(zhì)的實(shí)驗(yàn)用水進(jìn)行試劑配制具有與上述相同的危害效應(yīng)。
因此，即使是很大程度地減少試劑與空氣中CO2的接觸，試劑也只有非常短的有效壽命。
克服以這一困難的一種方法是在用此試劑前生成還原型輔酶。
在F.Hoffmann La Roche AG的澳大利亞專利申請(qǐng)Au-A-61906/90中述及一種這樣的方法。所披露的方法中，還原型的輔酶就地生成于輔酶被待分析物、底物和特異酶再氧化的同時(shí)或之前。此步是通過(guò)包括酶和酶底物的反應(yīng)混合物來(lái)實(shí)現(xiàn)的，使空氣氧化的輔酶能夠還原。F.Hoffmann La Roche AG披露且優(yōu)選的這一特異反應(yīng)是 此反應(yīng)能使煙酰胺腺苷二核苷酸還原。
這種生成NADH的方法的問(wèn)題是不可能有穩(wěn)定的單一瓶裝的試劑形式。
F.Hoffmann La Roche AG通過(guò)將試劑分成2瓶在一定程度上克服這一問(wèn)題。第一類試劑含底物特異酶，就CO2定量而言為PEPC、MDH和G-6-P-DH。第二類試劑為酶底物和輔酶，就CO2測(cè)定而言為PEP、G-6-P和NAD+(氧化狀態(tài))。因此檢測(cè)反應(yīng)按如下進(jìn)行 其中(A)和(B)代表可選擇的相等同的途徑。
然而，這種試劑系統(tǒng)仍有困難。除兩種試劑瓶裝造價(jià)高、分列目錄和浪費(fèi)外，要求6-磷酸葡萄糖水平非常精確，而且此試劑系統(tǒng)限用于特定的化學(xué)分析儀。只要兩種試劑一結(jié)合，通過(guò)6-磷酸葡萄糖的耗竭，就由NAD+生成NADH。如果兩種試劑結(jié)合而沒(méi)有立即使用，因?yàn)?-磷酸葡萄糖這樣被耗竭，結(jié)合的試劑的穩(wěn)定性可能受到很大影響。如果6-磷酸葡萄糖量不精確或過(guò)量，則試劑的保溫時(shí)間選擇很關(guān)鍵。結(jié)果可以是假象性低吸收度變化和總體不精確的結(jié)果。
Modrovich的美國(guó)專利4,394,449中描述的一種早期方案用底物/酶對(duì)產(chǎn)生還原型輔酶，如同Roche的方案，然而，此例中6-磷酸葡萄糖是按下式由葡萄糖生成的。
然后在有酶6-磷酸葡萄糖脫氫酶存在下，NAD+與生成的6-磷酸葡萄糖反應(yīng)形成NADH。Modrovich配方中也同時(shí)包括NADH和NAD+以便當(dāng)NADH被氧化或降解時(shí)，試劑中的NAD+將有助于產(chǎn)生NADH。這也是一種兩瓶裝試劑。
第三種方法是Crowther等在美國(guó)專利5,116,728中描述的方法。此發(fā)明中利用酶/底物對(duì)的概念再生成NADH。此發(fā)明與Roche和Modrovich的不同，再生成反應(yīng)由于用很低水平的酶而降低至約最大反應(yīng)速率的2％。另外包括一種穩(wěn)定劑，實(shí)際上是加入NAD+，其加入量是理論上預(yù)先確定的、將建立NADH和NAD+之間平衡的量，以控制生成速率。該體系中既有NADH的生成也有再生。系統(tǒng)更依賴哪個(gè)還不清楚。此體系的不足是溶液中很低水平的酶很不穩(wěn)定，將影響試劑的長(zhǎng)期穩(wěn)定生。從ALT試劑聲稱的穩(wěn)定性可清楚向出這一點(diǎn)，即在冷凍環(huán)境中存放22天。另外它也要求試劑分為兩部分。
與上文所述每個(gè)發(fā)明采納的NADH產(chǎn)生機(jī)制，即相關(guān)的總的問(wèn)題是此反應(yīng)不可能是用單一瓶的一步反應(yīng)，因?yàn)橹灰患尤氩∪搜?，就同時(shí)發(fā)生兩種反應(yīng)(a)由于NADH轉(zhuǎn)化為NAD+而致的吸收度的降低，(b)由NAD+生成NADH導(dǎo)致吸收度的升高。
這兩個(gè)反應(yīng)以相似的速度進(jìn)行，結(jié)果是假象性低吸收度變化和總體不精確的結(jié)果。
因而，本發(fā)明的一個(gè)目的就是提供一種可用于血清碳酸氫鹽水平檢測(cè)的試劑系統(tǒng)，其基本上改進(jìn)了那些用于依賴于輔酶氧化而檢測(cè)血清碳酸氫鹽的酶分析法中的現(xiàn)有技術(shù)試劑系統(tǒng)所存在的問(wèn)題，特別是那些與試劑的內(nèi)源性和外源性污染有關(guān)的問(wèn)題。本發(fā)明的更進(jìn)一步目的是提供一種檢測(cè)病人樣品中碳酸氫鹽濃度的改進(jìn)方法，這種方法克服了那些包括輔酶的過(guò)早氧化和為最大限度減低試劑污染需要多種瓶系統(tǒng)在內(nèi)的與現(xiàn)有技術(shù)有關(guān)的問(wèn)題。
為此，提供了一種用于通過(guò)測(cè)定輔酶的氧化程度來(lái)進(jìn)行病人血清碳酸氫鹽濃度酶檢測(cè)的試劑，其特征在于通過(guò)選擇包括酶/底物對(duì)的輔酶還原系統(tǒng)來(lái)抗氧化、使所述試劑的整個(gè)貯存過(guò)程中能持續(xù)再生所述輔酶，從而穩(wěn)定所述試劑。
優(yōu)選的是輔酶還原系統(tǒng)包括一種酶和一種底物，所述酶對(duì)所述底物有不完全特異性，因而導(dǎo)致交叉反應(yīng)速率降低。
該試劑優(yōu)選是單一瓶裝劑型。
整個(gè)此說(shuō)明書中用的術(shù)語(yǔ)“不完全特異性”是就酶/底物對(duì)而言的，其中所選的底物不是所述酶的天然底物，因此對(duì)相關(guān)酶的交叉特異性小于100％。
本發(fā)明是基于通過(guò)彼此有不完全特異性的酶與底物結(jié)合，輔酶還原速度明顯減慢這一發(fā)現(xiàn)的。通過(guò)減慢還原反應(yīng)，試劑的必要組分可存放于一個(gè)貯存瓶?jī)?nèi)，內(nèi)容物通過(guò)低水平持續(xù)的輔酶再生來(lái)抗污染維持穩(wěn)定。通過(guò)減慢此過(guò)程，NADH的再生可在不影響血清碳酸氫鹽測(cè)定的情況下進(jìn)行。在試劑沒(méi)被應(yīng)用時(shí)，這種再生就可進(jìn)行，再生的速率可通過(guò)調(diào)節(jié)選擇的酶/底物對(duì)的種類和水平而進(jìn)行精細(xì)的調(diào)節(jié)。
在本發(fā)明的一個(gè)可選擇的實(shí)施方案中，提供了一種用于通過(guò)測(cè)定輔酶的氧化程度來(lái)測(cè)定病人血清碳酸氫鹽濃度的酶方法中的試劑，其特征在于通過(guò)包含酶/底物對(duì)的輔酶還原系統(tǒng)來(lái)抗氧化穩(wěn)定所述試劑，選擇酶/底物對(duì)使所述輔酶在20-25℃時(shí)以0.10-0.90mAbs/min的速率再生。
根據(jù)本發(fā)明這一方面，試劑中再生速率優(yōu)選為20-25℃時(shí)0.20-0.80mAbs/min。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，輔酶還原系統(tǒng)的底物和酶間等摩爾基礎(chǔ)上的特異性程度優(yōu)選小于100％，更優(yōu)選小于50％，最優(yōu)選小于10％。使用等摩爾基礎(chǔ)的交叉反應(yīng)性小于5％的酶/底物對(duì)為最佳。
優(yōu)選用于本發(fā)明試劑中的輔酶是還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，但煙酰胺次黃嘌呤二苷酸磷酸或硫代-NADH這些輔酶類似物也可是合適的。
在檢測(cè)血清樣品中的CO2含量時(shí)，輔酶還原系統(tǒng)中優(yōu)選應(yīng)用的酶是6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G-6-P-DH)和葡萄糖脫氫酶。
諸如甲酸脫氫酶、甘油脫氫酶、亮氨酸脫氫酶、L-丙氨酸脫氫酶、3α-羥基-類固醇脫氫酶、L-乳酸脫氫酶(產(chǎn)自乳桿菌菌種)或3-磷酸甘油脫氫酶也是合適的。優(yōu)選用于總CO2測(cè)定的試劑中的酶是6-磷酸葡萄糖脫氫酶。這可從任何合適的來(lái)源得到，如腸膜明串珠菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、Zymomonas Mobilus或酵母。
這類酶優(yōu)選源于微生物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，試劑中加入來(lái)自微生物的酶能消除象NADH氧化酶和蛋白酶這類以前嚴(yán)重影響試劑穩(wěn)定性的內(nèi)源性污染物的出現(xiàn)。微生物酶還有熱穩(wěn)定性更高的附加優(yōu)點(diǎn)，因此可提高其在溶液中的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。
6-磷酸葡萄糖脫氫酶的更優(yōu)選來(lái)源是腸膜明串珠菌。如果使用來(lái)自嗜熱脂肪芽孢桿菌或Zymomonas Mobilus的6-磷酸葡萄糖脫氫酶，反應(yīng)速率降低。與此相似，如果用酵母作為6-磷酸葡萄糖脫氫酶的來(lái)源，必須用輔酶NADPH作為NADH的替代物，因?yàn)榻湍?-磷酸葡萄糖脫氫酶僅作用于NADP+。
要注意的是，輔酶還原系統(tǒng)中底物和酶的選擇必須是二者彼此有不完全特異性，用于本發(fā)明試劑中的合適的底物包括5-磷酸核糖、1-磷酸葡萄糖、6-磷酸葡萄糖酸、6-磷酸-2-脫氧葡萄糖、6-磷酸-2-脫氧-2-氟葡萄糖、6-磷酸-2-脫氧-2-氯葡萄糖、6-磷酸-2-脫氧-2，2-二氟葡萄糖、6-磷酸-2-O-甲基葡萄糖、6-磷酸甘露糖、6-磷酸葡糖胺、6-磷酸-3-脫氧葡萄糖、6-磷酸-3-脫氧-3-氟葡萄糖、6-磷酸-3-O-甲基葡萄糖、6-磷酸阿洛糖、6-磷酸ahrose、6-磷酸-4-脫氧-4-氟葡萄糖、6-磷酸半乳糖、6-磷酸-5-硫-葡萄糖、膦酸酯類似物、6-stallate-葡萄糖、β-D-葡萄糖、D-半乳糖、2-脫氧葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、1-山梨糖、D-甘露糖、D-果糖、D-乳糖、D-山梨醇、D-甘露醇、蔗糖、肌醇、麥芽糖。
用NAD+作為試劑中優(yōu)選的輔酶，優(yōu)選的酶/底物組合是6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G-6-P-DH)/D-葡萄糖。優(yōu)選的D-葡萄糖的替代底物是那些，相對(duì)6-磷酸葡萄糖(G-6-P)和G-6-P-DH間的特異性，G-6-P-DH酶與所選擇的底物間反應(yīng)的速率小于50％，更優(yōu)選小于10％，最優(yōu)選小于5％。
D-葡萄糖/G-6-P-DH的一個(gè)優(yōu)選的替代物是根據(jù)下述D-葡萄糖為100％反應(yīng)底物的反應(yīng)應(yīng)用葡萄糖脫氫酶(GLD)。＋H+如果將葡萄糖脫氫酶作為酶，用于NAD輔酶還原的優(yōu)選的底物和它們與D-葡萄糖相比交叉反應(yīng)的相對(duì)程度如下底物相對(duì)活性木糖8.9％L-山梨糖0.3％D-甘露糖2.4％D-果糖 0.8％D-半乳糖0.1％D-乳糖 1.2％D-山梨醇0.1％肌醇0.2％麥芽糖 3.9％欄中的數(shù)字代表相對(duì)葡萄糖脫氫酶1β-D-葡萄糖與1β-D-葡萄糖的反應(yīng)速率的反應(yīng)速率。
或者，用甘油脫氫酶(GLY.DH)作為酶，在反應(yīng)中合適的底物和其相對(duì)于甘油(100％)的活性為底物 相對(duì)活性α-氯乙醇甘油 48.5％乙二醇7.8％2，3-丁二醇 52.6％亮氨酸脫氫酶(L.D)作為酶時(shí)，根據(jù)下述反應(yīng)合適的底物和它們相對(duì)于L-亮氨酸(100％)的活性為底物 相對(duì)活性L-纈氨酸 74％L-異亮氨酸58％L-正纈氨酸41％L-正亮氨酸10％L-蛋氨酸 0.6％L-半胱氨酸0.3％如果L-丙氨酸脫氫酶(A.D)類似亮氨酸脫氫酶那樣作為酶用于反應(yīng)系統(tǒng)中，合適的底物和其相對(duì)于L-丙氨酸(100％)的活性是底物 相對(duì)活性L-絲氨酸 5％3α-羥基類固醇脫氫酶(H.DH)與可用作酶與下列底物結(jié)合，這些底物相對(duì)于膽酸的活性也被列出底物 相對(duì)活性石膽酸 96％本膽酸 60％來(lái)自乳桿菌菌種的L-乳酸脫氫酶(LDH)在下述反應(yīng)中作為酶合適的底物和它們相對(duì)于L-乳酸的活性為底物相對(duì)活性α-氧代戊二酸 0.09％
草酰乙酸36％例如來(lái)自酵母的NADP為輔酶，優(yōu)選的底物/酶組合為G-6-P-DH/6-磷酸半乳糖25％G-6-P-DH/6-磷酸-2-脫氧葡萄糖 18％G-6-P-DH/6-磷酸葡糖胺2％右邊的數(shù)字代表相對(duì)G-6-P-DH/G-6-P對(duì)的相對(duì)反應(yīng)性。
還可用NADP作為輔酶結(jié)合酶/底物對(duì)3-磷酸甘油脫氫酶和磷酸二羥丙酮。
如本說(shuō)明書前言中所述及的，用于測(cè)定血清碳酸氫鹽水平的根據(jù)本發(fā)明試劑的其它需求為磷酸烯醇丙酮酸(PEP)，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)，還原型的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和蘋果酸脫氫酶(MDH)。
為使試劑達(dá)到最佳性能狀態(tài)，必須選擇PEP的水平。這可根據(jù)試劑選用的其它成分而變，然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明中1.5mmol/l到至少15mmol/L的濃度范圍是合適的。低于1.5mmol/L出現(xiàn)底物耗竭從而影響試劑的穩(wěn)定性。用PEP的不同鹽并不危及試劑的穩(wěn)定性。應(yīng)注意的是PEP水平越高，試劑的PH值越低。因此緩沖水平需調(diào)至最適PH水平。
試劑中輔酶的水平將根據(jù)下列因素變動(dòng)·測(cè)定中的線性要求·選擇的波長(zhǎng)·樣品與試劑的體積比率·所選分析儀的光度系統(tǒng)總的來(lái)說(shuō)，增大樣品體積增進(jìn)敏感性但降低所得讀數(shù)的線性，而降低樣品體積在損害靈敏度的情況下提高線性。
優(yōu)選的測(cè)量波長(zhǎng)是320-400nm，然而應(yīng)調(diào)節(jié)所用輔酶的水平以便吸收度不超過(guò)2.0A。根據(jù)本發(fā)明，吸收度的優(yōu)選波長(zhǎng)是380nm。
最好選擇PEPC的水平以便反應(yīng)終點(diǎn)能在要求的時(shí)間內(nèi)完成。例如，37℃下50mmol樣品，如果要求的完成時(shí)間為5分鐘，可選擇380U/L的水平。PEPC優(yōu)選得自微生物來(lái)源，以便降低試劑內(nèi)源性污染的危險(xiǎn)。
MDH也優(yōu)選得自微生物來(lái)源以便限制內(nèi)源性污染的危害。合適的水平是150-1500U/L，更優(yōu)選200-400U/L。
本發(fā)明的試劑除包括輔酶還原系統(tǒng)、其它必需底物和測(cè)定待分析物濃度必需的酶外，還可包括防腐劑、螯合劑、表面活性劑、蛋白酶抑制劑、緩沖劑、輔助因子、LDH抑制劑、抗菌劑和具有增強(qiáng)穩(wěn)定性功能但實(shí)質(zhì)上不影響本發(fā)明特征的其它成分。
選擇緩沖液的基本原則是在選擇的PH內(nèi)結(jié)合二價(jià)陽(yáng)離子最少且緩沖能力好。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)作法，若一種緩沖液的pKa值是所選的PH±1.0PH單位則認(rèn)為它是有效的。20℃根據(jù)時(shí)本發(fā)明試劑優(yōu)選的PH是7-9，更優(yōu)選8.0。在此優(yōu)選PH時(shí)，在溶液中最佳酶活性與酶和輔酶的穩(wěn)定性間達(dá)成平衡。較低的PH可導(dǎo)致輔酶的降解。
合適的緩沖液有HEPES，4-嗎啉丙磺酸(MOPS)或2-〔三(羥甲基)甲氨基〕-1-乙烷磺酸(TES)或其它好的緩沖液，TRICINE、BICINE、TEA和TAPS。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的緩沖液是總離子強(qiáng)度優(yōu)選為30-100mmol/L，更優(yōu)選為約58mmol/L的TRIS和/或HEPES。待檢測(cè)的樣品用合適的稀釋劑如去離子水或鹽水進(jìn)行稀釋。
在本說(shuō)明書別處所述的PEPC反應(yīng)中要求鎂離子作為輔助因子。4-20mmol/L的濃度是合適的。鎂離子的合適來(lái)源包括硫酸鎂(無(wú)水的)、氧化鎂和醋酸鎂以及其它合適的鎂鹽。
防腐劑如疊氮化鈉(NaN3)、羥苯甲酸、慶大霉素、麝香草酚和來(lái)自Boehringer Mannheim的無(wú)汞防腐劑是合適的。防腐劑的適當(dāng)用量是其在2-8℃貯存至少6-8個(gè)月仍保持防腐能力而不抑制試劑中的酶。要達(dá)這一標(biāo)準(zhǔn)，合適的范圍為0.1-1.0g/L。
諸如辛基苯氧基聚乙氧基乙醇或聚氧乙烯脂肪醇醚的非離子表面活性劑是合適的。PMSF或抑蛋白酶肽(Aprotinin)是已知的蛋白酶抑制劑，草氨酸鈉，草酸或棉子酚將抑制由乳酸脫氫酶造成的干擾。對(duì)丙酮酸鹽水平高的病人來(lái)說(shuō)，需要最后這種成份，因丙酮酸鹽可干擾碳酸氫鹽酶反應(yīng)。例如，草氨酸鈉合適的水平為1.0g/L。其它酶穩(wěn)定劑包括牛血清白蛋白、牛γ球蛋白、N-乙酰半胱氨酸和甘油。
還可用許多螯合劑，如EDTA、EGTA、N-(2-羥乙基)-乙二胺三乙酸(HEDTA)等等。若需要的話，也可以加入合適的消泡劑。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，試劑基本含有G-6-P-DH 輔酶還原D-葡萄糖 系統(tǒng)PEP 底物
PEPC 底物特異性MDH 酶NADH 輔酶另外，優(yōu)選還包括TRIS緩沖液、HEPES游離酸、草氨酸鈉、疊氮化鈉、牛血清白蛋白、硫酸鎂(無(wú)水的)。
根據(jù)本發(fā)明配制的一種試劑如下
本發(fā)明的另一方面，提供了通過(guò)測(cè)定輔酶氧化程度檢測(cè)體液樣品中碳酸氫鹽濃度的酶檢測(cè)方法的改進(jìn)，這種改進(jìn)包括通過(guò)選擇一種含酶/底物對(duì)的輔酶還原系統(tǒng)，使在整個(gè)試劑貯存過(guò)程中能持續(xù)再生輔酶來(lái)對(duì)抗輔酶的氧化，從而穩(wěn)定所述試劑。
本發(fā)明在這方面的一個(gè)優(yōu)選的方法中，酶/底物對(duì)的酶對(duì)所說(shuō)的底物具有不完全特異性，因而降低酶和底物間的交叉反應(yīng)速率。
本發(fā)明這方面的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，輔酶還原系統(tǒng)包含彼此間特異性如下的一種酶和底物相對(duì)于該酶與其天然底物的特異性，小于100％，優(yōu)選小于50％，最優(yōu)選小于10％。最合適的是酶/底物對(duì)相互間的特異性相對(duì)于該酶與其天然底物的特異性小于5％，最好大約為2％。
輔酶、底物和酶可根據(jù)待分析物從上文提到的與本發(fā)明試劑相關(guān)的那些物質(zhì)中選出。
本發(fā)明中此方面的一個(gè)實(shí)施方案中，用于測(cè)定總CO2濃度的輔酶還原系統(tǒng)的優(yōu)選成分為NADH、G-6-P-DH和D-葡萄糖以發(fā)生下述穩(wěn)定化反應(yīng)由于G-6-P-DH對(duì)D-葡萄糖的特異性低，該穩(wěn)定化反應(yīng)慢因而不與主要反應(yīng)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)當(dāng)加入體液樣品時(shí)發(fā)生這些反應(yīng)。
實(shí)施例一種按本發(fā)明配制的具體CO2試劑的穩(wěn)定性測(cè)試如下
配方
D-葡萄糖和G-6-P-DH的最佳水平是通過(guò)測(cè)試在D-葡萄糖和G-6-PDH濃度改變時(shí)NADH的再生速率來(lái)決定的。由NAD+到NADH的再生速率與酶G-6-PDH的量及在較小程度上與D-葡萄糖水平成比例。將2ml(每份)含250U/LMDH、400U/LPEPC、6mmol/L PEP和50mmol/L D-葡萄糖的碳酸氫鹽PH8.0的配制液加入石英杯中，并加入20μL50mmol/L碳酸氫鹽樣品。石英杯用封口膜密封防止CO2進(jìn)一步污染。NADH再生的時(shí)間過(guò)程用Shimadzu分光光度計(jì)在25℃、380nm波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)48小時(shí)。由這些結(jié)果確定優(yōu)選使用250mmol/L的D-葡萄糖，以使用較少的G-6-PDH達(dá)到相似的再生速率。G-6-PDH的最適范圍確定為2.5-5.0KU/L，因?yàn)檫@不會(huì)影響主要反應(yīng)達(dá)穩(wěn)定的終點(diǎn)。選擇G-6-PDH的水平為3.5KU/L，因?yàn)榇藵舛认略噭┘由w貯存在4℃時(shí)能供合適的NADH再生速率達(dá)6個(gè)多月。認(rèn)為合適的再生速率為20-25℃時(shí)0.10-0.90mAbs/min。
貯存條件加蓋且冷藏(2-8℃)分光檢測(cè)的參數(shù)(Shimadzu PC2101)·反應(yīng)溫度37℃·試劑與樣品體積比100∶1·波長(zhǎng)380nm·杯道長(zhǎng) 1cm這些分光檢測(cè)參數(shù)用于檢測(cè)下述指標(biāo)·380nm處試劑的初始吸收度·380nm處無(wú)試劑空白速率·反應(yīng)Δ吸收度)·37℃時(shí)完成時(shí)間)用50mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)品去檢測(cè)·20℃時(shí)的再生速率(用mAbs/min表示)得到下列結(jié)果<
相關(guān)性研究用新鮮試劑、2-8℃貯存達(dá)6個(gè)月的試劑和新鮮的常規(guī)試劑(不含再生系統(tǒng))檢測(cè)病人血清中碳酸氫鹽水平。結(jié)果(mmol/L)如下
<p>從上述列出的結(jié)果看，試劑加蓋貯存在2-8℃情況下，再生性CO2試劑顯示出至少6-7個(gè)月的穩(wěn)定性。試劑必須有1.0A的初始吸收度才起作用。7個(gè)月后，試劑仍有至少1.5A的吸收度。完成時(shí)間為4-5分鐘，幾乎沒(méi)有改變，因?yàn)樵跍y(cè)試時(shí)間內(nèi)靈敏度保持在0.67-0.7A，表明良好的穩(wěn)定性。線性關(guān)系的研究表明在新鮮試劑和28周的樣品中，線性關(guān)系都保持在至少40mmol/L處。
病人的相關(guān)資料進(jìn)一步證實(shí)，比較新鮮試劑與在2-8℃情況下貯存6個(gè)月的試劑在功能上沒(méi)有顯著性差異(r2＝0.997)。
根據(jù)本發(fā)明，與再生系統(tǒng)的聯(lián)合導(dǎo)致血清碳酸氫鹽檢測(cè)試劑在2-8℃加蓋時(shí)，重構(gòu)穩(wěn)定性從一個(gè)月提高到6-8個(gè)月。在室溫下、不加蓋的試劑的穩(wěn)定性從1天提高到大約7天。根據(jù)本發(fā)明的試劑和方法的其它優(yōu)點(diǎn)是試劑為單一瓶裝，從而減少了與現(xiàn)有技術(shù)試劑有關(guān)的空間和目錄問(wèn)題，并且適合各種測(cè)試設(shè)備系統(tǒng)。
應(yīng)認(rèn)識(shí)到有許多合適的“非天然”底物/酶對(duì)可用以減慢本發(fā)明中的試劑和方法中的輔酶的再生。除文中提到的那些外，還有其它非市售的或價(jià)格昂貴的這種酶/底物。
權(quán)利要求
1.用于通過(guò)測(cè)定輔酶氧化程度來(lái)進(jìn)行病人血清碳酸氫鹽濃度酶測(cè)定的試劑，其特征在于通過(guò)選擇含酶/底物對(duì)的輔酶還原系統(tǒng)抗氧化，使所述試劑的整個(gè)貯存過(guò)程中能持續(xù)再生所述輔酶，從而穩(wěn)定所述試劑。
2.權(quán)利要求1的試劑，其中所說(shuō)的再生速率范圍是20-25℃下0.10-0.90mAbs/min。
3.權(quán)利要求1或2的試劑，其中所述酶源于微生物。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的試劑，其中所述酶/底物對(duì)是6-磷酸葡萄糖脫氫酶/D-葡萄糖。
5.用于通過(guò)測(cè)定輔酶氧化程度來(lái)進(jìn)行病人血清碳酸氫鹽濃度的酶測(cè)定的試劑，其特征在于所述試劑是單一瓶裝，并通過(guò)選擇含酶/底物對(duì)的輔酶還原系統(tǒng)抗氧化，使所述試劑的整個(gè)貯存過(guò)程中能持續(xù)再生所述輔酶而被穩(wěn)定。
6.權(quán)利要求5的試劑，其中所述輔酶還原系統(tǒng)包括一種酶和一種底物，所述酶對(duì)所述底物有不完全特異性。
7.權(quán)利要求5至6中的試劑，其中所述酶與所述底物間的特異性程度在等摩爾基礎(chǔ)上小于50％。
8.權(quán)利要求5-7中的試劑，其中所述酶與所述底物間特異性程度在等摩爾基礎(chǔ)上小于10％。
9.通過(guò)測(cè)定輔酶的氧化程度來(lái)進(jìn)行體液樣品中血清碳酸氫鹽濃度檢測(cè)的酶方法的改進(jìn)，這種改進(jìn)包括選擇包含酶/底物對(duì)的輔酶還原系統(tǒng)抗氧化，使所述試劑的整個(gè)貯存過(guò)程中能持續(xù)再生所述輔酶，從而穩(wěn)定含所述輔酶的試劑。
全文摘要
用于通過(guò)測(cè)定輔酶氧化程度來(lái)進(jìn)行病人血清碳酸氫鹽濃度酶測(cè)定的試劑，其特征在于通過(guò)選擇含酶/底物對(duì)的輔酶還原系統(tǒng)抗氧化，使所述試劑的整個(gè)貯存過(guò)程中能持續(xù)再生所述輔酶從而穩(wěn)定所述試劑。通過(guò)測(cè)定輔酶的氧化程度來(lái)進(jìn)行體液樣品中血清碳酸氫鹽濃度檢測(cè)的酶方法的改進(jìn)，這種改進(jìn)包括選擇包含酶/底物對(duì)的輔酶還原系統(tǒng)抗氧化，使所述試劑的整個(gè)貯存過(guò)程中能持續(xù)再生所述輔酶，從而穩(wěn)定含所述輔酶的試劑。
文檔編號(hào)C12Q1/26GK1133070SQ94193817
公開日1996年10月9日 申請(qǐng)日期1994年7月13日 優(yōu)先權(quán)日1993年9月17日
發(fā)明者J·德喬吉 申請(qǐng)人:微量科學(xué)有限公司