專利名稱：：抗菌素10381v，w，x，y，z1，z2，pre-b和t的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及抗菌素10381v，W，X，Y，Z1，Z2，Pre-b和t，它們是從微生物Streptomycesarginensis發(fā)酵啤酒的粗提取物中分離出來的。三種含硫多肽抗菌素，硫霉素I，II和III的分離，純制，物理化學及生物學特性見下列文獻所述J.Antibiotics，22(1)12—22(1969)，TetrahedronLett.，29(12)1401—4(1988)。該文中公開了改良的多肽抗菌素硫霉素I的結構。同時也提出了結構相關的抗菌素berninamycinA的結構修正。TetrahedronLett.，(31)2791—4(1978)中公開了硫霉素I的甲醇解產(chǎn)物。TetrahedronLett.，(9)735—6(1977)中公開了硫霉素I的酸性水解產(chǎn)品。化學文摘(ChemicalAbstracts)73(1)2666c(日本專利45006880)公開了經(jīng)StreptomycesVirdochromogenesVarSulfomycini培養(yǎng)物來制備硫霉素I的方法。美國專利4,007,090中公開并要求了新穎的，通過微生物燼灰綠色鏈霉菌發(fā)酵制備硫霉素I的方法。ChemicalAbstracts73(17)86558e(JapanesePatent45017588)中公開了經(jīng)培養(yǎng)StreptomycesViridochromogenesVarSufomycini來制備硫霉素II和III的方法，它們的紫外吸收和抗菌譜與硫霉素I的相似。J.Antibiotics，45(11)1809—1811(1992)及歐洲專利申請0274873(1988年7月20日出版)公開了A10255，一種硫肽抗菌復合物，它含有一個環(huán)肽核及氨基酸側鏈。J.Antibiotics，42(10)1465—9(1089)中公開了噻噁霉素、一種肽類抗菌素的分離及特性。1988年1月14日出版的InternationalPublicationNlumberWO88/00200中描述了10381b抗菌復合物的制備和性質。根據(jù)此文獻，10381b抗菌復合物是經(jīng)用營養(yǎng)培養(yǎng)基中微生物Streptormycesarginensis而發(fā)酵制得的，該文獻還進一步闡述了在10381b復合物中含有一組至少包括有5種主要對抗革蘭氏陽性菌的抗菌素，并且它們與所報告過的硫霉素族抗菌素有著相類似的物理特性。10381b復合物中的主要成份稱作10381b2和10381b3。在這兩種成份中，已將10381b2分離出來，其獲得的量及純度足夠用以確定其生物活性和化學特性。10381b2的結構被設想與來自綠色產(chǎn)色鏈霉菌的肽類抗菌素硫霉素I是相同的，這點已得到證實。10381b抗菌復合物具有對抗革蘭氏陽性菌的抗菌活性，因而它們可用于保障供食用動物的生長，如家禽，豬和牛。然而該文獻未講授或公開分離和鑒定10381b抗菌復合物中其它組份的方法，特別是本發(fā)明中的抗菌素10381v，W，X，Y，Z1，Z2pre—b及t。在InternationalPublicationNumberWO86/05785(1986年10月9日)以及A.D.Argoudelis等，TheJournalofAntibiotics，XL(6)750—760(1987年6月)文獻上描述了Arginomycin(抗菌素10381a1)的生產(chǎn)方法和性質。專利申請者未看到過在此領域里的參考文獻能或提出本發(fā)明的抗菌素1038IV，W，X，Y，Z1，Z2，pre—b和t。本發(fā)明具體提供了式I，II，III，IV，V，VI，VII或IX化合物或它們的藥理學上可接受的鹽；飼料組合物，它包括動物飼料和式I，II，III，IV，V，VI，VII或IX，或它們間的任何組合；動物用復合劑，它包括式I，II，III，IV，V-，VI，VII，或IX，或它們間的任何組合，以及合適的惰性載體；以及促進動物生長的方法，它包括給動物服用有效劑量的式I，II，III，IV，V，VI，VII或IX化合物或它們間的任何組合。測定，分離和鑒別這些抗菌素是困難和意想不到的，需要超出抗菌素行業(yè)常規(guī)的技術。另外這些抗菌素具有意想不到的優(yōu)點，例如抗菌素10381Y與10381b2相比具有更強的抗菌活性。從微生物Streptomycesarginensis啤酒發(fā)酵的粗提取物中，已分離出基本上純的抗菌素10381v，W，X，Y，Z1，Z2，pre—b及t。這些化合物的獨特的結構也已給出。在10381b抗菌復合物中，抗菌素10381Y的生物活性比起其它組分來要強些，詳見下文所述。天然存在的微生物，Streptomycesarginensis可以用來制備本發(fā)明中的抗菌素。因而，該微生物有可能以其自然存在的狀態(tài)來制備這些抗菌素。本發(fā)明所涉及的這些抗菌素不包括在自然界中可能有的，或肯定存在的任何組分，本發(fā)明提供了生產(chǎn)和分離這些抗菌素的方法，且所得的這些抗菌素有實用價值如用于藥理學及其它抗菌目的，以及獸用。在下面文字中當提到“10381b組份”時，其含義與前文中提到的10382b2組份是一致的?？咕?0381v，W，X，Y，Z1，Z2，pre—b及t是從S.arginensis培養(yǎng)物獲得的。該微生物的分類學和生長方面的描述見InternationalPublicationNumberWO88/00200(1988年1月14日出版)。10381b抗菌復合物的發(fā)酵和發(fā)現(xiàn)方面的描述也可參見該文獻。10381b抗菌復合物的較可取的制備方法見下文制備法1和2中所述，其中制備法2更為可取。一組突變體，其每一個與母體菌株Streptomycesarginensis相比都具有增高的效價，可用于10381b復合物組份的制備。采用標準的變異和選擇技術可制備這些新的菌株。變異方法包括化學變異法，用N-甲基-N’-亞硝基胍[Delic等人，(1970)，Mutat.Res.9167]，用亞硝酸[Crueger及Crueger(1984)，BiotechnologyATextbookofIndustrialMicrobiology，P.16，SinouerAssociates，Inc.，Sunderland，MA，USA]，以及用紫外光照射[Thrum(1984)BiotechnologyofIndus-trialAntibiotics(Vandamme，ed.)，MarcelDekker，NewYork，pp.373—374]。選擇技術包括簡單的再分離菌株的方法，即弧立的菌落的選擇，特殊菌落的形態(tài)學選擇，以及對組份類似物的耐受性選擇，雖然10381b復合物是生物合成途徑中的產(chǎn)物[Crueger及Crueger(1984)，BiotechnologyATextbookofIndustrialMicrobiology，pp.24—25，SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA，USA]。這些菌株是有用的，因為它們能產(chǎn)生更多的10381b復合物。這意味著用較少量的培養(yǎng)物就能得到分離組份所需的物質。該突變和選擇對10381b復合物中組份的比例沒有明顯的改變。從10381b抗菌復合物(它含有已知的10381b組份以及作為本發(fā)明的一部分所鑒定出的組份)粗品中分離出這些抗菌素是通過在反相—HPLC柱上經(jīng)層析分離來實現(xiàn)的?？扇〉钠鹗嘉餅槎伟l(fā)酵的10381b抗菌復合物粗品，因為其中富含本發(fā)明的組份。另外一種得到富含本發(fā)明組份的方法是對已有的啤酒提取物進行第二次提取?？扇〉膶游鲋鶠閆orbaxC8，5μm，流動相為水—四氫呋喃(THF)-乙腈(ACN)(60∶27∶3)，其它的柱，如，WatersDeltaPakC18也可用，但分離效果不佳?？烧{整流動相，從而得到不同的保留時間(也影響分離)。較可取的制備10381b組份的方法見下文實例6中所述。通常，本發(fā)明的抗菌素(包括大量純的抗菌素10381y)可用Wa-tersDeltaPakC18柱(50×300mm)以水-THF-ACN(60∶27∶3)作流動相，經(jīng)多次層析來制備用WatersDeltaPrep3000，每次加工約32mg，經(jīng)164次層析可加工約5.2g10381b抗菌復合物粗品。可形成組份10381b和10381x等的洗脫液匯合部份，并制成不同純度的產(chǎn)品。將10381y第一部份濃縮至80—150ml，并在同一層析柱上用同樣的流動相，重復層析。另一種改變的方法是將大約2升的最終匯合部分的10381y洗脫液濃縮至約600ml水濃縮物，用60ml二氯甲烷提取，提取物被蒸干，將殘留物溶于流動相中進行第二次層析。該改變的方法(針對10381y洗脫液最終匯合部份)導致較小的加料量，得到較好的層析分離結果，從而經(jīng)過下列步驟后得到18mg層析純的10381y將10381y匯合部分濃縮為水溶液，用1/10體積的二氯甲烷提取，將該提取液濃縮成為1ml左右的漿，加入3ml正庚烷完成重結晶，對該方法的更詳細描述詳見下列實例2。最純的抗菌素10381y可經(jīng)Zorbax5C8柱兩次層析而得到，流動相采用水-四氫呋喃-乙腈，詳見實例3所述。另外在下列表IA和IB中給出了本發(fā)明抗菌素10381v，W，X，Y，Z1，Z2，pre—b及t的分析HPLC保留時間。本發(fā)明抗菌素的結構是用核磁共振(NMR)和質譜(MS)來測定的。例如，應用該實驗分析出抗菌素10381y是InternationalPubli-cationNumberWO88/00200中10382b2組份減去兩個末端的脫氫丙氨酸殘基。因此，在下列結構式圖中，抗菌素10381y被確定為式IV化合物，且10382b2組分被確定為式VIII化合物(與硫霉素I相同)。另外在下列結構式圖中，式I化合物為抗菌素10381v；式II化合物為抗菌素10381W，式III化合物為抗菌素10381x；式IV化合物為抗菌素10381y，同上所述；式V化合物為抗菌素10381Z1；式VI化合物為抗菌素10381Z2；式VII化合物為抗菌素10381pre—b；式IX化合物為抗菌素t。在抗菌素式I—VII及IX中含有幾個不對稱碳原子，此點對本專業(yè)人員而言是顯而易見的。這些化合物的所有對映和立體異構體均包括在本發(fā)明的范圍內。本發(fā)明還提供了式I—VII和IX化合物的藥理學上可接受的鹽。藥理學可接受的鹽系指那些在藥物化學家眼中與母體化合物在配方，穩(wěn)定性，病人的適用性和生物利用度等性質方面相當?shù)哪切}。本發(fā)明的所有化合物可用作抗菌素，且可用于治療一些細菌感染和/或防止或減少一些微生物在各種環(huán)境中的生長。例如，已發(fā)現(xiàn)在對抗許多微生物方面，抗菌素10381y的生物活性是10381b復合物或10381b組份的兩倍左右。在下列表III中，應用體外最小抑制濃度(MIC)測定法(詳見下文實例5所述)，對10381b中三個主要組份(b，x及Y)與10381b復合物進行了比較。用該測定方法測定了化合物對一些類型厭氧菌的抑制的能力，這些厭氧菌通常對家禽，豬，牛等的內臟有抑制作用。在表III中，明顯表示出“Y峰”或抗菌素10381y與單獨的b和X峰物質或10381b復合物相比，活性更強(更低的MIC值)，特別是對抗梭狀芽胞桿菌屬和鏈霉菌屬，它們與雞和豬的生長抑制有關，而這些組份對瘤胃厭氧菌如M.elsdenii和S.ruminantium(它們是反芻動物微生物區(qū)系所必需的組份)等對抗活性較低，因此，除用限促進單胃動物如家禽和豬的生長之外，還可用于促進反芻動物，如牛的生長。下列表IV中給出了10381b組份中的一些組份和復合物的其它生物活性數(shù)據(jù)。這些生物活性數(shù)據(jù)是用下列所述實例5中的體外最小抑制濃度測定法來測定的。組份X，b和Y的生物活性數(shù)據(jù)見表IV中，表IV與表III的相當結果稍有不同。當比較個別的體外抗菌鑒定之間的實驗結果時，這樣的差別是常見的，特別是對不同批的抗菌素進行測試。除這些差異之外(以及除X組份對抗P10831C1菌株時結果不同之外)，兩種測定方法之間的結果是一致的，且表明至少在體外實驗中，組份Y是最具活性的，組份b作為單個組份次之。組份pre-b，V及W，等組份，象組份X那樣活性大大地降低。本發(fā)明的抗菌素也可用于促進反芻動物的生長，如，牛和羊，及非反芻動物，單胃動物，如家禽(例如，小雞和火雞)和豬的生長。用本發(fā)明的抗菌素促進動物，如家禽，豬和牛的生長時，所需的劑量及給藥方式均是獸醫(yī)專業(yè)人員所熟悉的常規(guī)方法。典型地，在飼養(yǎng)時，給動物喂本發(fā)明抗菌素，從而促進其生長。例如，較可取地可用抗菌素10381y制成粉末或顆粒狀，將其制成含有合適的惰性載體，如大豆粉，米糠或石灰石的混合劑，并加到飼料中。對小雞而言，能促進其生長的抗菌素10381y的有效量為約0.5—11mg/kg飼料，較可取的為約1—2mg/kg飼料，最可取的為1—1.5mg/kg飼料。對牛而言，10381y抗菌素的促生長的有效量為約1—55mg/kg飼料左右，較可取的為約2—6mg/kg飼料，最可取的為約2—3mg/kg飼料。無需進一步詳述，本領域的專業(yè)人員可用前述的方法完滿地再現(xiàn)本發(fā)明。下列詳細的例子描述了如何制備各種化合物和/或如何實施本發(fā)明的各個步驟，這些實例僅僅是要說明本發(fā)明而無意于限制本發(fā)明。本領域內的專業(yè)人員將會及時意識到反應過程中來自反應物或來自反應條件和技術方面的各種可能出現(xiàn)的變化。制備1，10381b抗菌素復合物的分離用NaOH將來自S.arginensis發(fā)酵的全啤酒的pH調節(jié)至10。然后用2×0.5體積的乙酸乙酯提取，用HPLC檢測提取完全與否。合并提取物，濃縮(旋轉蒸餾器，真空，40℃水溶)至0.4倍于啤酒的體積(部份10381b復合物可沉淀出來)。在攪拌下，慢慢加入1體積庚烷，使之沉降數(shù)分鐘，再加1滴庚烷檢查一下沉淀是否完全。如有需要可向漿內加入更多的庚烷。將混合物冷卻至4℃，過濾或離心分離出沉淀。用庚烷洗滌，干燥(40℃/真空)至恒重，HPLC分析。制備210381b抗菌素復合物的分離(參考流程圖A)用1體積乙酸乙酯(PH大約為7.5)對來自S.arginensis發(fā)酵的全啤酒進行提取。生成的乙酸乙酯提取物濃縮至30g/l。向其中加入2體積庚烷，冷卻至-20℃，用時2小時。離心，傾析，用庚烷洗滌，再次離心，傾析，最后干燥，得粗品10381b復合物。實例1抗菌素10381y的制備(小量)小量的不純的10381y可經(jīng)柱層析(Zorbax5C8)制備，以水-乙腈(ACN)(55∶45)作流動相，步驟如下將得自上述制備1和2中的20mg粗品10381b復合物(經(jīng)HPLC檢測含有85％10381b成份，以及未知數(shù)量的10381y成分)溶于1.0ml流動相水—乙腈(ACN)(55∶45)中；注入100μl的該溶液經(jīng)21×250mmZorbax5C8柱進行層析，流動相8ml/min；收集含有10381y峰(RT＝17min)的洗脫物，合并。將其冷凍，有機溶劑從冰上傾析出來并蒸發(fā)；加入800μl正庚烷后，殘渣經(jīng)100μl甲醇和300μl二甲醚重結晶。按照這一步驟，得到純度57％的1.5mg10381y。實例210381x，10381y(大量)，10381b以及其它較少的10381成份的分離A.DeltaPrep3000的制備制備層析在WatersDeltaPrep3000制備層析系統(tǒng)上進行，使用WatersDelta-PakC18徑向壓縮柱體(50×300mm，15μm顆粒，100A的孔徑)。DeltaPrep3000層析系統(tǒng)可使洗脫液流經(jīng)PharmaciaLKBBrommamodel2238UVICORDSIIUV檢測器(254nm處吸收)，它連接著PharmaciaLKBBromma型2210，二通道條形圖記錄儀和WatersMAXIMA820電子層析數(shù)據(jù)收集系統(tǒng)，層析運轉條件為層析柱的徑向壓力是600psi，且流速為35ml/min其結果是在層析過程中該系統(tǒng)產(chǎn)生350psi的回壓。B.柱上加料物質的制備加料物質的制備是將按上述制備1和2中所述相類似的方法制備出的500mg10381b復合物粗品溶解于31.25ml如下混合液中(乙腈(ACN)-milli-Q-水(水)-二甲基甲酰胺(DMF)(25∶5∶1.25))。用旋轉混合器和超聲波助溶。該溶液保存于4℃下過夜，期間有黑色物沉淀出來。用Beckman型J2—21離心機在5000rpm下對該混合物離心15分鐘，用HPLC分析固體顆粒，發(fā)現(xiàn)其中10381b組份小于1mg。傾出清潔的進料液，并在4℃下保存至須層析時。該清潔的溶液中固體成分按下列方法測定，將1ml溶液置于鋁盤中，緩緩灌入氮氣，用蒸汽加熱板加熱蒸發(fā)，直至溶劑蒸完，而后將該盤再置于用蒸汽加熱的真空塔中10分鐘，再稱重該盤子。在本實驗中，測得固體重量為16mg/ml。C.制備流動相可采用水-ACN-四氫呋喃(THF)(比例為60∶3∶27)的流動相，然而，也可采用比例為68∶3.3∶28.7或任何類似比例的流動相。當采用第一種比例時，用10ml/min的流速在1分鐘內裝樣品，而后用35ml/min的流量洗脫50分鐘。當采用第二種比例時，由于完成層析b組份的需要，故要洗脫60至70分鐘。除了水-ACN-THF流動相之外，也可采用含有乙酸銨-ACN的流動相。然而，經(jīng)證實該流動相效率低。采用大量UV規(guī)格的四氫呋喃(THF)將是十分昂貴的，也可采用非色譜規(guī)格的THF(Burdick&amp;Jackson)作為流動相。其它成份同上所述。HPLC跟蹤表明在UV規(guī)格及非色譜規(guī)格THF之間，在本實驗條件中無明顯的差異，非色譜規(guī)格的THF不影響10381b組份在254nm處的吸收，先前的實驗已證實非色譜規(guī)格ACN同樣對220nm以上的UV吸收無干擾作用。D.樣品收集和匯合部份的形成以每30秒一份的柱流出速度，在PharmaciaLKBBromma型2211SuperRac餾份收集器上收集柱層析洗脫液，用條形圖記錄作為指導，形成含有V，W，X，Y，Z1，Z2及pre-b組份的匯合餾份。1)組份10381x及10381b的制備方法分別收集并合并組份10381x及10381b2到4升為止。然后將合并液置于Buchi型RE-121旋轉蒸發(fā)器于40℃水浴中，近40托壓力下蒸除有機溶劑。將旋轉蒸發(fā)器的冷凝裝置置于4℃下的冷凍循環(huán)浴(EndocalRTE—5B)中。將每一匯合部份濃縮至原體積的1/5，在這期間有沉淀形成。將濃縮物在4℃下放置過夜。第二天分別離心，條件為在BeckmanJ2—21冷凍離心機上，5000rpm離心20分鐘，并用JA10離心頭。將上清液傾倒至分開的匯合部份中。沉淀物小團用上清液少許(幾毫升)重新制成漿狀物，然后將其轉移至50ml無菌一次性離心管中。每次得到4升匯合的洗脫液，按上述操作將沉淀小團加到上述管中，當管的大約1/2充滿后，在BeckmanJ2—21冷凍離心機(帶有JA—14頭和50ml采集杯)中，于5000rpm離心20分鐘。將上清液加到原先的上清匯合液中。用數(shù)毫升milli-Q-水(足以使小團成漿)洗滌沉淀小團，然后在5000rpm離心20分鐘，再將上清液傾至前面所述的上清匯合液中。用VirtisUnitrapII冷凍干燥機干燥經(jīng)洗滌的沉淀小團。在本實驗中，用HPLC測定上清液，發(fā)現(xiàn)僅少量的10381b和10381x組份，且它們的純度低于沉淀產(chǎn)物，故將其棄去。2)“Y”峰匯合部份的制備方法將“Y”峰餾份匯集到2升后，將該匯合部份置于旋轉蒸發(fā)器上，同前操作x—和b—匯合部份時一樣。然后再次層析。將y—濃縮液裝到DeltaPrep制備層析器上的體積，在每一批操作中可以變化，但一般都在80—150ml之間，這取決于可得到產(chǎn)品的總量。同上所述來收集餾份，再將含有x—和b—組份的餾份分別加回到它們各自的匯合部份中。匯集含有Y純組份的餾份，在旋轉蒸發(fā)器中，在40℃浴溫，40托壓力下，濃縮成水溶液，用2×0.1體積的二氯甲烷提取，根據(jù)純度(HPLC)匯集提取液，濃縮，轉移至20ml小瓶中，蒸發(fā)，用少量丙酮和3倍量庚烷進行結晶。將漿狀物離心，傾出上清液，用庚烷洗滌結晶，在約40托/30℃下干燥。對10381y組份層析所得的最后2升匯合部份，可采用如下改進的方法將匯合部份濃縮成水溶液，用1/10體積的二氯甲烷提取2次；合并提取液，再濃縮至小體積，將其轉移到20ml稱重的閃蒸小瓶中，在室溫下用經(jīng)濾凈的氮氣將其吹干，將干燥物再溶于5ml流動相中，水-ACN-THF(68∶3.3∶28.7)，進行第二次層析，匯集Y-餾份，并按上述操作方法加工。在本實驗中得到97％純度的10381y。為了分析起始物洗脫液和10381y的純化，采用了Whatman5—C8柱，0.01MPH5.5磷酸鈉-ACN(55∶45)，流速1ml/min，在248nm處檢測。然而，用Nucleosil5—C18柱，0.01mPH5.5磷酸鈉-ACN-THF(60∶3∶27)，流速1ml/min，在248nm處檢測，能更好地將組份10381b從組份10381y分離出來。E.結論在本實驗中加工約5.2g的10381b抗菌素復合物粗品，采用DoltaPrep3000經(jīng)180次循環(huán)操作，包括16次10381y的二次層析，結果得到下列組份的總產(chǎn)量約1484mg10381b，約379mg10381x及約50mg10381y。實例3制備抗菌素10381y(純品)采用Zorbax5C8及水—四氫呋喃—乙腈流動相進行雙層析可得到最純的10381y，詳見如下用水—四氫呋喃—乙腈流動相，將一支21×250ml的Zorbax5C8柱平衡，將200μl含有100mg/ml10381b復合物粗品的DMF溶液(該粗品中含有9.5％的10381y，并且采用上述制備1和2中所述方法制得的)注射到柱上，并以8ml/min的速度展開；收集合有10381y的洗脫液；在再次注射加料前，用80％含水乙腈溶液洗滌層析柱15分鐘(當過夜時，應將層析柱保存在該溶液中)。將一系列分離的10381y洗脫液匯集起來，濃縮為水溶液，并用二氯甲烷提?。徽舭l(fā)提取物，將殘余物再溶于二甲基甲酰胺中進行二次層析。再次濃縮10381y洗脫液，并用二氯甲烷提??；將提取物濃縮成為漿狀物，加入正庚烷使結晶完全。少量的(用該方法難以分離)可改用蒸發(fā)提取液的辦法，并冷凍干燥正丁醇溶液中的殘余物來分離。在本實驗中，從300mg10381b復合物粗品中得到6.5mg層析純的10381y。在下列表IA中給出了本發(fā)明10381組份的分析HPLC保留時間(實驗條件為用4.6×250mmZorbax5C8柱，1ml/min水-THF-ACN(60∶27∶3)。實例4測定抗菌素10381y(式IV)和其它10381抗菌素的結構用NMR(核磁共振)譜和質譜法來測定抗菌素10381y的結構。NMR的標準鑒定方法是用相關性光譜學(COSY)確定所有的H—H之間的相互關系，并用雜核相關光譜學(HETCOR)實驗將這些信息轉移到碳骨架上。在高度不飽和分子中(如10381y)就產(chǎn)生了困難，原因是有大量非質子化的碳原子在序列中出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象。這種情況下，可采用低靈敏度的相互反應，例如核極化效應(NOE)和遠程C—H相關性被用來跨接許多孤立的自旋體系。這些實驗的應用和分析導致鑒定抗菌素10381y為10381b減去2個末端脫氫丙氨酸殘基。因此，測得抗菌素10381y為式IV化合物，即是52-去[1-[[[1-(氨基羰基)乙烯基]氨基]羰基]乙烯基]-硫霉素I，見下列結構圖。分子中所有1H和13C共振的完整結果見下列表II。采用類似方法，得到其它組份的1H共振，詳見下列數(shù)據(jù)式I抗菌素10381v8.14，8.46，8.29/7.84，8.81，9.86，5.60／5.65，6.41/5.73，9.15，9.89，6.51，1.78，2.58，8.43，6.43，8.50，3.29，9.40，6.25，4.48，1.21，5.36，2.55，4.37，8.10，4.16，1.10，5.18，8.47.式VII抗菌素10381Pre—b7.49/7.91，5.63/6.10，9.10，5.71/5.71，10.03，6.52/5.94，10.48，8.24，8.48，8.64，9.97，5.57/5.53，6.49/5.76，9.21，9.71，6.57，1.76，2.62，8.21，4.73-4.84，8.75，9.50，6.27，4.49-4.58，1.20，4.95，2.54，4.49-4.58，8.10，4.18-4.27，1.13，5.23，8.42.式VI抗菌素10381z27.50/7.91，5.64/6.10，9.09，5.72/5.72，10.04，6.53/5.94，10.48，8.24，8.47，8.66，9.88，5.62/5.53，6.49/5.73，9.22，9.71，6.56，1.77，2.55，8.23，4.76，8.78，9.46，6.44，1.77，2.62，4.59，8.07，4.25，1.12，5.17，8.44.式III抗菌素10381x7.50/7.91，5.66/6.12，9.09，5.70/5.75，10.12，6.67/5.96，10.49，8.20，8.56，5.02，8.25，1.49，2.59，8.25，5.42，8.15，1.60，4.18/4.57，8.85，2.53，4.37，8.03，2.17，1.04，1.05，8.37.式II抗菌素10381w7.67/8.15，5.81/6.57，10.69，8.20，8.53，5.01，8.24，1.48，2.66，8.24，5.43，8.16，1.60，4.18/4.56，8.70，2.53，4.37，8.04，2.17，1.00，1.00，8.38.式IX抗菌素10381t8.01/7.82，8.49，8.13，2.53，5.02，1.49，8.19，8.23，5.43，1.60，8.15，2.53，4.55/4.20，8.86，4.38，2.18，0.96，0.96，7.90，8.36.采用電子噴射離子化，且在m/l1130.0處呈顯離子。獲得10381y(相應子M＋Na+加成物)的質譜數(shù)據(jù)，測得的平均質量為1107.0amu，它與具有C48H46O14N14S2分子式的分子量是一致的(計算得到的平均分子量＝1107.1)。采用上述類似的方法，得到如下所述的本發(fā)明中其它的10381b抗菌素的結構和平均質量式I化合物為抗菌素10381v(1037.7amu)；式II化合物為抗菌素10381W(815.7amu)；式III化合物為抗菌素10381x(953.9amu)；式IV化合物為抗菌素10381y，同上說明；式V化合物為抗菌素10381Z1(1201.5amu)；式VI化合物為抗菌素10381Z2(1185.7amu)；式VII化合物為抗菌素10381pre—b(1215.1amu)且式IX化合物為抗菌素10381t(746.2amu)。實例5抗菌素10381B組份的最小抑制濃度的測定用下述體外MIC(最小抑制濃度)測定法來比較10381b組份與10381復合物之間的生物活性。該測定方法衡量了化合物抑制某些厭氧菌生長的能力，這些厭氧菌通常對家禽，豬和牛的內臟產(chǎn)生抑制作用。I.化合物的制備用10％V/V乙醇/水將待測物制成2mg/ml的溶液。將該溶液稀釋為1mg/1ml，并進一步稀釋成為一系列10—2倍的稀釋液。在每一濃度下，將等分試樣置于無菌的陪替氏培養(yǎng)皿中，每個平皿中加入9體積的融化的瓊脂，混合后使其在室溫下固化。將平皿轉移到Coy箱中，使之干燥并用無氧大氣飽和。II.接種物的制備用于MIC測試的微生物(菌類)被接種到肉湯培養(yǎng)基中，使用前于39℃培養(yǎng)18—24小時。將培養(yǎng)物稀釋到與0.5MacFarland硫酸鋇標準液的混濁度相等，除了對豬的分離物P108—3C1，P105—1C3和P105—1C4(被稀釋1∶1)而外。所有的接種和稀釋均在厭氧室中進行，并使用肉湯培養(yǎng)基，并通過丁基橡膠塞用注射器轉移。將新鮮制備和稀釋的培養(yǎng)物裝于Steers氏復制裝置的小池內，該裝置可分配每32種培養(yǎng)物，每種約10μl預先接種到瓊脂平皿的表面。接種1小時后，接種物已被吸收，將培養(yǎng)皿插入，在38—39℃培養(yǎng)48小時。從培養(yǎng)室中取出培養(yǎng)皿，測定被試化合物的NIC。MIC值為能阻止被試微生物(菌)在瓊脂平皿上可檢出的生長所需的化合物最低濃度。對有些化合物測試時，在生長和非生長之間，難以在兩者之間劃分出明顯的界線。于是，被試化合物的MIC可考慮將濃度稀釋，該濃度或能產(chǎn)生模模糊糊的生長，或在測試區(qū)域內有3—5個個別的菌落。因此，每一組被試平皿對32種被試微生物(菌)的每一種將產(chǎn)生個別的MIC值。III.結論在表III中，使用上述分析方法，對下列抗菌素進行比較10381b復合物，10381b組份，10381x組份和10381y組份。雖然組份間確實的活性差別隨個別被試微生物而變化，但從表III看來是清楚的“Y峰”或抗菌素10381y始終是更具有活性的(較低的MIC值)，比起個別的b和x組份或1038lb復合物來，特別是對梭狀芽胞桿菌和鏈球菌種，已有報導這些菌種與在雞和豬體內的生長抑制有聯(lián)系，而對瘤胃厭氧菌如M.elsdenii和S.ruminantium(它們是反芻動物微生物區(qū)系的必需成分)保留著較低的活性，因此建議，其除了可用作單胃動物，如家禽或豬的生長促進劑外，還可用作反芻動物的生長促進劑。表IV列出了某些10381b組份和復合物的其它生物活性數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)是用上述分析方法獲得的。表IV中所述的本研究所發(fā)現(xiàn)的成分X，b，及y的生物活性數(shù)據(jù)與表III中所列的相當?shù)慕Y果稍有不同，這種差異在比較多次體外抗菌分析結果時是常見的，特別是當測試不同批號的抗菌素時更為常見。除了這些不同(以及X組份抗P1083C1菌株所獲得的不一致的結果)外，這兩種分析結果是一致的，并且可看出至少在體外，組份Y的活性是最強的，組份b的活性屬于各個組份之第二位。組份pre—b，V和W，象組份x一樣活性大大降低。實例610381b組份x，Y，W，V，PRE—B，Z1，Z2和T的分離和純化10381b復合物是經(jīng)Streptomycesarginensis在營養(yǎng)增養(yǎng)基中發(fā)酵而成的，粗品可采用乙酸乙酯提取，濃縮并用庚烷沉淀而得。獲得的產(chǎn)品然后再于下列各種載體上進行層析10381x，32mg粗品10381b復合物于WatersDelta—Prep(填裝有Delta—PakC18柱)系統(tǒng)上進行層析，流動相為水-ACN-THF(67∶3∶30)，流速35ml/min。層析結果用Pharmacia2238UVICORDSIIUV檢測器檢驗，波長254nm，分出組份10381b，10381x和其它少量組份。合并10381x洗脫液，儲存于4℃下。當已收集有多于50mg的化合物時，濃縮上述合并液至水漿狀并離心。將含有少量10381b的上清液傾析出去，將固體小團轉移至小瓶中并冷凍干燥。物理性質如下經(jīng)HPLC分析，此物純度＞90％，含痕量10381b，10381y和未知極性雜質。如果用于MS和NMR的話，不需進行二次層析純化。10381y。此化合物可用與10381x相同的層析方法分離得到。然而，由于10381y洗脫液的純度低于10381x，因此先將其濃縮至水溶液，并用2×0.1體積的CH2Cl2提取，合并提取液，蒸發(fā)；再溶于流動相中進行第二次層析。新的洗脫液再次合并，濃縮至水溶液，用CH2Cl2提取。提取物連續(xù)用0.2體積水洗滌，合并并蒸發(fā)。殘渣(43mg)轉移至閃爍計數(shù)小瓶中，在帶有3ml正庚烷作反相溶劑的1mlCH2Cl2中重結晶。所得漿狀物離心，用移液管移去上清液，結晶用1ml庚烷洗滌。物理性質如下HPLC檢查結果，所得的35mg10381y的純度為98％。10381W，此化合物的分離和純化可采用與10381y相同的兩次層析法。由第二次層析所獲得的固體(34mg)的純度要比相應的10381y餾分低，原因是在粗品復合物中，含有比10381y量少的。10381W。因此，由層析柱上脫落的大量其它物質污染了這些固體，使其結晶困難。將它們先溶于1.5ml甲醇＋1.5ml丙酮中，濾除蠟狀物(其中僅含痕量10381W，由HPLC檢查得)，使用2ml正庚烷＋0.1ml甲苯(避免形成兩相)，然后沉淀生成終產(chǎn)品10381W。物理性質如下得3.3mg74％純度的10381W。10381v，此化合物的分離方法同10381W，采用兩次層析法，并對合適的洗脫餾分進行提取。蒸發(fā)溶劑后獲得的固體的純度足以使之從ml丙酮(含2ml正庚烷)中重結晶出來。離心漿狀物，移去上清液，殘渣用庚烷洗滌并干燥。物理性質如下所得19mg10381v的純度為82％。10381pre—b，此化合物可從含18％10381pre—b的粗品中獲得，方法是通過單次層析(21×250mmZorbax(7μ)C8柱上，洗脫液水-ACN-THF(70∶3∶27)。將400mg起始物溶于8mlDMF中，分4次流過柱，洗脫液以相對低的流速(8ml/min)流動。合并含10381pre—b餾分(約1.2升)，濃縮至約300ml水溶液，經(jīng)冷凍干燥后得終產(chǎn)品10381pre—b。物理性質如下所得的11.5mg10381pre—b產(chǎn)品為層析產(chǎn)品。10381Z1。此產(chǎn)品的制備采用PrepPakC18柱進行單次層析。含10381Z1的終洗滌脫液合并，濃縮至500ml含26mg10381Z1的水溶液(用HPLC，假設其與10381b具相同的響應因子)。用CH2Cl2提取，僅有痕量此化合物，改用乙酸乙酯分別在PH＝6和pH＝9時提取，僅有一點改善，將部份提取的水溶液冷凍干燥。物理性質如下所得的23mg10381Z1的純度為91％。10381Z2。此產(chǎn)品可用與產(chǎn)品10381Z1相同的層析方法從10381Z2洗脫液中分離出來。將洗脫液濃縮至470ml水溶液，生成的沉淀經(jīng)離心和冷凍干燥分離。物理性質如下所得的16mg10381Z2的純度為80％。10381t。此化合物從復合物中分離出來，然后用上述分離10381y相同的方法進行兩次層析純化將30mg該產(chǎn)品置于WatersDeltaPrep(填裝有DeltaPakC18柱)系統(tǒng)上，以水-ACN-THF(67∶3∶30)作流動相，流速35ml/min。合并含10381t的洗脫部份，儲存于4℃，直至收集到足夠的洗脫液(1升洗脫液大約含5mg)，然后濃縮水溶液，用CH2Cl2提取。合并提取液并蒸發(fā)；將殘渣溶于DMF中，以21×250mmZorbaxC8柱進行層析，流動相為水-ACN-THF(70∶3∶27)，流速8ml/min。含幾乎是純10381t的洗脫液，合并并蒸發(fā)得最終固體產(chǎn)品1038t。物理性質如下經(jīng)HPLC檢查，得4mg10381t固體。本發(fā)明中10381t組份的分析HPLC的保留時間(使用4.6×250mmZorbax5C8柱；流動相為水-THF-ACN(70∶27∶3)，流速為1ml/min)列于下列表IB中。更純的10381t的制備方法如下以粗品10381b復合物作起始物，按下列方法分離1)以乙酸正丁酯提取全部啤酒，2)濃縮提取物，3)用庚烷沉淀10381復合物，4)用離心和干燥分離固體粗品。此物進一步干燥(至恒重)，用水(2ml/g固體)處理以除去約2％的極性雜質。將此上等產(chǎn)品作為起始物，用來從10381b和其它小量組份中層析分離出10381t。置于WatersDeltaPrep系統(tǒng)中的DeltaPakC18柱，用流動相(MP)水-THF-ACN(67∶3∶30)進行平衡，開始每批加樣品32mg，然后為每批64mg，對該起始行進行層析，流動相流速35ml/min。共計有2g粗品10381b進行層析。合并含10381t的洗脫餾分，存于4℃下，直到它們達到每批500ml，共兩批。這些洗脫液首先在真空蒸餾器中(約30托，45℃水浴)濃縮至水溶液，然后用3×0.1體積的CH2Cl2進行提取。提取物合并，分析，濃縮至干。將所得的含2.0和2.4mg10381t(HPLC)的固體與前面獲得的，具相似純度的樣品合并。每批固體用幾毫升CH2Cl2浸取并洗滌，直至沒有活性物質為止。合并提取物，濃縮，轉移到1.5ml管中并干燥。將從DeltaPak柱上大多數(shù)物質中游離出的固體重新溶于190μlDMF中進行第二次層析。此項分離在一個新的21×250mmZorbax7μmC8柱上進行，流動相為水-THF-ACN(70∶27∶3)。為了使展開過程中解吸物質對洗脫液的污染減低到最小程度，先用5mlMP-DMF(1∶1)和5mlDMF洗滌柱子。然后將起始物質，約10mg粗品10381t注入其中，并用MP(8ml/min)進行展開。本發(fā)明中的其它成分也可按類似上述方法進行操作，以獲得更純的產(chǎn)品。表IA10381b組分的分析HPLC保留時間在相同的HPLC系統(tǒng)中，相對于10381b組分保留時間的保留時間。表IB10381T組分的分析HPLC保留時間</tables>在相同的HPLC系統(tǒng)中，相對于10381b組分保留時間的保留時間。表II10381y在d6-DMSO中的NMR化學位移<p>表II(續(xù))10381y在d6-DMSO中的NMR化學位移<>注a說明是可以互換的。b說明28，31和31’系列與42，45和45’系列是可以互換的。表III組份10381y，X和b的生物活性(最小抑菌濃度M.I.C.μg/ml)菌體菌株復合物10381x10381b10381yC.莢膜梭菌P1083C10.41.60.4＜0.2C.莢膜梭菌P1051C350.0＞100.050.012.5S.糞鏈球菌P1051C412.550.012.51.6S.牛鏈球菌JB13.125.03.10.4C.莢膜梭菌A83-RKP0.41.60.80.4C.莢膜梭菌A83-30.86.33.1＜0.2C.莢膜梭菌A82-13.150.03.10.8S.糞鏈球菌71A0150.0100.025.06.3C.莢膜梭菌71A021.66.31.6＜0.2C.莢膜梭菌RF1B040.43.10.4＜0.2S.糞鏈球菌CCS1-036.350.012.51.6C.莢膜梭菌CCS2-090.41.60.8＜0.2C.莢膜梭菌CCS1-113.150.06.30.8B.脆弱擬桿菌UC937050.0100.025.01.6C.莢膜梭菌UC94521.66.33.1＜0.2B.多形擬桿菌UC901425.050.012.5＜0.2E.遲緩真桿菌L-34NGNGNGNGB.fibrisolvens490.41.66.3＜0.2B.fibrisolvensD10.83.10.8＜0.2M.elsdeniiB159＞100.0＞100.0＞100.0＞100.0L.multiparus401.66.31.6＜0.2S.ruminantiumGA192＞100.0＞100.0＞100.0＞100.0S.ruminantiumGA3150.0＞130.0100.025.0R.amylophilusH18＞100.0＞100.0＞100.0100.0R.生黃瘤胃球菌FD10.86.31.6＜0.2R.生黃瘤胃球菌C940.83.10.86.3E.ruminantiumGA1950.83.10.46.3P.ruminicola118B＜0.20.2＜0.2＜0.2F.necrophorumFN5052100.0＞100.0100.025.0F.necrophorumFN4070100.0＞100.050.025.0S.hyodysenteriaeB204NTNTNTNTS.hyodysenteriae16-4NTNTNTNT說明NG＝未生長，NT＝未測試；所有的MIC值以質量為基礎，未作純度校正。表IV菌株菌體復合物xpre-bbyC.莢膜梭菌P1083C10.8100.25.01.60.8C.莢膜梭菌P1051C325.0＞100＞10012.56.3S.糞鏈球菌P1051C43.1＞100＞1003.10.8S.牛鏈球菌JB11.6＞10050.00.80.8C.莢膜梭菌A83-RKP0.450.01.60.8＜0.2C.莢膜梭菌A83-3＜0.225.01.6＜0.2＜0.2C.莢膜梭菌A82-112.5＞100＞10012.512.5S.糞鏈球菌71A0112.5＞100＞10012.56.3C.莢膜梭菌71A02＜0.2ntnt＜0.2＜0.2C.莢膜梭菌RF1B04＜0.250.01.6＜0.2＜0.2S.糞鏈球菌CCS1-0312.5＞100＞1006.33.1C.莢膜梭菌CCS2-091.610050.00.8＜0.2C.莢膜梭菌CCS1-11＜0.2ntnt＜0.2＜0.2B.脆弱擬桿菌UC937025.0＞100＞10050.050.0C.莢膜梭菌UC94521.650.025.01.60.8B.多形擬桿菌UC901450.0＞100＞10025.050.0E.遲緩真桿菌L-34＜0.2＜0.2＜0.2＜0.2＜0.2B.fibrisolvens491.6＞10050.01.60.4B.fibrisolvensD10.4100.12.50.8＜0.2M.elsdeniiB159＞100＞100＞100＞100＞100L.multiparus403.1＞100＞1001.612.5S.ruminantiumGA1921.66.36.31.6＜0.2S.ruminantiumGA31nt6.350.00.8＜0.2R.amylophilusH181.625.0＞1001.6＜0.2R.生黃瘤胃球菌FD10.810025.01.60.4R.生黃瘤胃球菌C941.6＞10025.00.80.8E.ruminantiumGA19512.510012.512.50.8P.ruminicola118B＜0.212.5＜0.2＜0.2＜0.2F.necrophorumFN5052100.＞100＞100100.50.0F.necrophorumFN4070＞100＞100＞100100.50.0S.hyodysenteriaeB204＞100＞100＞100＞100＞100S.hyodysenteriae16-4＞100＞100＞100＞100＞100說明nt＝未測試表IV(續(xù))菌體菌株vwC.莢膜梭菌P1083C1100＞100C.莢膜梭菌P1051C3100＞100S.糞鏈球菌P1051C4＞100＞100S.牛鏈球菌JB1＞100＞100C.莢膜梭菌A83-RKP1.6＞100C.莢膜梭菌A83-30.812.5C.莢膜梭菌A82-1＞100＞100S.糞鏈球菌71A01＞100＞100C.莢膜梭菌71A02ntntC.莢膜梭菌RF1B040.8100S.糞鏈球菌CCS1-03＞100＞100C.莢膜梭菌CCS1-09＞100＞100C.莢膜梭菌CCS1-11ntntB.脆弱擬桿菌UC9370＞100＞100C.莢膜梭菌UC94526.3＞100B.多形擬桿菌UC9014＞100＞100E.遲緩真桿菌L-3425.025.0B.fibrisolvens4950.0＞100B.fibrisolvensD125.0＞100M.elsdeniiB159＞100＞100L.multtiparus40＞100＞100S.ruminantiumGA19210012.5S.ruminantiumGA3125.01.6R.amylophilusH183.1＞100R.生黃瘤胃球菌FD125.0＞100R.生黃瘤胃球菌C9425.0100E.ruminantiumGA19512.525P.ruminicola118B＜0.2＜0.2F.necrophorumFN5052＞100＞100F.necrophorumFN4070100＞100S.hyodysenteriaeB204＞100＞100S.hyodysenteriae16-4＞100＞100說明nt＝未測試圖示A結構式圖結構式圖(續(xù))結構式圖(續(xù))結構式圖(續(xù))結構式圖(續(xù))結構式圖(續(xù))結構式圖(續(xù))結構式圖(續(xù))權利要求1.具式I，II，III，IV，V，VI，VII或IX或其藥理學上可接受的鹽類。2.權利要求1中的式I，II，III，IV，V，VI，VII或IX化合物，不包括天然存在的。3.權利要求2中的I，II，III，IV，V，VI，VII或IX化合物，其以必要純的形式存在。4.權利要求1中的式IV化合物，其為52-脫[1-[[[1-(氨基羰基)乙烯基]氨基]羰基]乙烯基]硫霉素I。5.飼料組合物，其包含動物飼料和權利要求1中式I，II，III，IV，V，VI，VII或IX化合物或其任意結合物。6.動物用復合劑，其包含權利要求1中具式I，II，III，IV，V，VI，VII或IX化合物或它們的任意結合物以及合適的惰性載體。7.使用權利要求1中式I，II，III，IV，V，VI，VII或IX化合物或其任意結合物制備用于促進動物生長的藥物。8.權利要求7的應用，其中的動物選自家禽，羊，牛以及豬。9.權利要求8的應用，其中的動物為雞。10.權利要求9的應用，其中的化合物經(jīng)口服給藥，劑量約為每公斤飼料0.5～11mg。11.權利要求8的應用，其中的動物為豬。12.權利要求11的應用，其中的化合物經(jīng)口服給藥，劑量約為每公斤飼料1～55mg。全文摘要通過在水介質中對微生物Streptomyces.arginensis進行培養(yǎng)和分離，可以制得抗菌素10381V，W，X，Y，Z1，Z2，pre-b和t?？咕?0381y的結構見下列式IV。這些抗菌素可以抑制被選擇的菌種的生長，因而可以用作動物的生長促進劑。文檔編號C12R1/465GK1130385SQ94193314公開日1996年9月4日申請日期1994年9月6日優(yōu)先權日1993年9月10日發(fā)明者C·P·科尼爾,S·H·格羅得,H·F·梅爾申請人:厄普約翰公司