專利名稱：防治大豆胞囊線蟲病的菌株及其制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，更確切地說，涉及用于防治植物根部病害，特別是用于防治大豆胞囊線蟲病的菌株及其制劑。
大豆是我國的重要栽培作物之一，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高。近年來由于種植面積不斷擴(kuò)大，重迎茬耕作問題突出，因而導(dǎo)致大豆病蟲害發(fā)病面積增加，危害日益嚴(yán)重。在諸多病蟲害中，以大豆胞囊線蟲(Hetero derag1ycines)病的危害最大，其發(fā)病面積約占大豆種植面積的70％以上，一般損失達(dá)10-40％，嚴(yán)重的甚至可造成大豆絕產(chǎn)。對(duì)于大豆根部的病害，目前多數(shù)是采用呋喃丹、多福合劑與乙基硫磷等化學(xué)農(nóng)藥以及各種化學(xué)種衣劑。這類藥物雖然在大豆生長前期有一定防效，但是由于這類化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，導(dǎo)致環(huán)境的嚴(yán)重污染。另外，由于藥物在土壤中長期積累，降低了土壤肥力，而且易使病菌及害蟲產(chǎn)生抗藥性，降低了藥物對(duì)病蟲害的防治效果。鑒于化學(xué)農(nóng)藥的諸多弊病，使得利用生物方法來防治植物寄生線蟲病日益受到關(guān)注。在生物防治的過程中，最關(guān)鍵的問題是要找到并分離出對(duì)特定的病蟲害有足夠殺滅能力的微生物菌株及用該菌株配制出適于使用的制劑。迄今為止，用淡紫擬青霉(Paccilomyceslilacinus)來防治根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)國外已做過不少試驗(yàn)，例如，菲律賓已有商品制劑(商品名BIOCON)投放市場，此制劑通過浸泡馬鈴薯塊莖來防治其根結(jié)線蟲病的效果很好。然而這種制劑對(duì)于防治大豆胞囊線蟲病的效果卻很不理想，所以迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)有利用深紫擬青霉制劑來防治大豆胞囊線蟲病的報(bào)導(dǎo)。這是因?yàn)?，?duì)于大多數(shù)植物而言，其生活環(huán)境十分復(fù)雜，菌劑與植物本身、病害蟲、土壤等各方面的條件互相影響。以往的生防菌劑多是作用方式和作用位點(diǎn)單一，因而防治效果有限，尤其是對(duì)用于植物根部病害的生防菌劑，由于土壤抑菌作用[即土壤抑制真菌孢子(也包括細(xì)菌、放線菌的繁殖體)萌發(fā)]的普遍存在，嚴(yán)重影響了菌劑實(shí)際應(yīng)用于大田中的病害蟲防治。特別是對(duì)大面積種植的大豆來說，至今仍未發(fā)現(xiàn)一種能有效地防治大豆胞囊線蟲病的生物防治方法。
本發(fā)明的目的是要提供一種適用于防治大豆胞囊線蟲病的菌株及其制劑。
本發(fā)明人經(jīng)過多年對(duì)各種有關(guān)菌株的篩選分離工作，90年在黑龍江省華楠縣孟家崗的大豆連作四年的田塊土壤中，測得每100g土中平均含有胞囊數(shù)67.5個(gè)。共檢測了128個(gè)胞囊，完全寄生的占9.5％。其中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)胞囊很特別，胞囊內(nèi)的物質(zhì)全部被消解掉，而真菌孢子充滿了整個(gè)體腔，將孢子轉(zhuǎn)移到PDA平板上培養(yǎng)繁殖，經(jīng)鑒定為淡紫擬青霉的特異菌株。另外對(duì)50余種土樣一萬多個(gè)胞囊測定的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)雖有一些寄生菌屬于淡紫擬青霉，但均未發(fā)現(xiàn)象上述菌株能在大豆胞囊線蟲雌蟲體內(nèi)產(chǎn)生大量孢子的現(xiàn)象，只是在胞囊內(nèi)產(chǎn)生菌絲，寄生或纏繞在卵上。因而本發(fā)明人確定，上述分離出的特異菌株是一種新菌株。將得到的菌株轉(zhuǎn)入含多菌靈(從0.1ppm至50ppm，逐漸增大濃度)的PDA培養(yǎng)基中，結(jié)果篩選出一種可耐50ppm多菌靈的生防菌株。多次轉(zhuǎn)代后，該菌株的產(chǎn)孢能力會(huì)有所下降，但可通過紫外誘導(dǎo)的方法使其復(fù)壯，即在20w紫外燈下15-20cm處，隔日輻照一次，每次約15min，一般輻照3-4次后即可挑選菌落中的回復(fù)部分，進(jìn)行單孢分離，即可實(shí)現(xiàn)菌株復(fù)壯。該菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，菌落正面呈暗紫紅色，背面為黑褐色。培養(yǎng)兩周后，其菌落直徑即達(dá)到79±4mm，產(chǎn)生大量分生孢子，其大小為(2.4±1.1)×(2.2±0.3)μm。該種菌可耐50ppm的多菌靈，可寄生于大豆胞囊線蟲的卵中及雌蟲體內(nèi)并能消解利用其中的物質(zhì)，最終使其分生孢子充滿整個(gè)雌蟲體腔并導(dǎo)致雌蟲死亡，從而使大豆胞囊線蟲由于無法繁殖而很快被消滅。而所測定的淡紫擬青霉中的其他菌株均未發(fā)現(xiàn)上述效果。于是，本發(fā)明人將這一特異的新菌株送往北京中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，其保藏日期為1995年10月23日，保藏號(hào)為CGMCC0241，其名稱為淡紫擬青霉CGMCC0241。另外，如果將本發(fā)明的淡紫擬青霉CGMCC0241采用液體發(fā)酵的三級(jí)發(fā)酵工藝，并加入復(fù)合添加劑制成該菌株的制劑，則更方便于在大面積的大豆種植田上用于大豆胞囊線蟲病的防治。
從而，本發(fā)明提供了一種用于防治大豆胞囊線蟲病的菌株，其特征在于，它是淡紫擬青霉CGMCC0241。
另外，本發(fā)明還提供了一種用于防治大豆胞囊線蟲病的菌株液體制劑，它是采用真菌菌株接種，通過液體三級(jí)發(fā)酵工藝而制成，其特征在于，用于接種的菌株為淡紫擬青霉CGMCC0241；液體發(fā)酵的溫度一般控制在24-30℃，優(yōu)選為26-28℃；PH值一般控制在5-8，優(yōu)選PH6-7；所說三級(jí)發(fā)酵最終結(jié)束時(shí)間的掌握條件是鏡檢觀察到的菌株液生孢子濃度達(dá)到5×108個(gè)/ml以上，優(yōu)選是達(dá)到7×108個(gè)/ml以上，并且菌絲干重達(dá)到2％(W/V)以上。
上述三級(jí)發(fā)酵工藝是指從試管原種開始，經(jīng)過三角搖瓶、種子罐、發(fā)酵罐的三級(jí)發(fā)酵，接種量一般為5-10％，這些是現(xiàn)有技術(shù)，但對(duì)本發(fā)明的淡紫擬青霉來說，在發(fā)酵過程中的溫度、PH值和發(fā)酵時(shí)間皆應(yīng)限定在上述范圍內(nèi)。發(fā)酵時(shí)間一般與培養(yǎng)基的組成、發(fā)酵溫度、發(fā)酵罐的體積、通氣條件等有關(guān)。通常搖瓶和種子罐的發(fā)酵時(shí)間各為1.5-2.5天，發(fā)酵罐的發(fā)酵時(shí)間為2-4天，總發(fā)酵時(shí)間約為一周。
上述的液體發(fā)酵所用的培養(yǎng)基設(shè)有嚴(yán)格限制，它可以采用現(xiàn)有技術(shù)中一般的真菌培養(yǎng)基，但本發(fā)明人通過研究后發(fā)現(xiàn)，根據(jù)大豆?fàn)I養(yǎng)需求及我國大豆主產(chǎn)區(qū)土壤礦質(zhì)元素的分布規(guī)律，應(yīng)適當(dāng)添加一定比例(從數(shù)個(gè)ppm至數(shù)百個(gè)ppm)的微量元素(如硼、鉬等)。在培養(yǎng)基中加入一定氯化鈉和鈣鹽(0.1-2％)，可明顯地增加產(chǎn)孢率和抑制雜菌生長。
因此，本發(fā)明采用的培養(yǎng)基成分如下培養(yǎng)基成分 含量蔗糖 2-5％(W/V，下同)NaCl0.2-2％KNO30.1-0.8％K2HPO40.02-0.2％CaCO3和/或CaCl20.1-0.8％FeSO4·7H2O 50-300ppmZnSO450-300ppmMgSO4·7H2O 200-1000ppmCuSO42-10ppmNaMoO4·2H2O 2-10ppmH3BO45-30ppm水 余量(補(bǔ)足100％)在上述成分中，一些元素(氯和鈣)具有抑制有害細(xì)菌生長的效果。同時(shí)，適量鈣鹽可在一定程度上提高植株耐病性。另外，由于我國大豆種植地區(qū)的土壤中缺少鉬和硼，因此適當(dāng)補(bǔ)充這兩種微量元素十分重要。其他各種成分都是有利于淡紫擬青霉的繁殖或有利于大豆生長的成分。
在菌株液體發(fā)酵的基礎(chǔ)上，控制發(fā)酵液PH值，并復(fù)合多種添加劑研制成具有多種作用方式，多位點(diǎn)的新型生防菌劑-大豆保根菌劑。首先，為利于真菌的生長繁殖，將發(fā)酵液PH值調(diào)至微酸性條件(PH6.0-6.5)。幾丁質(zhì)成分一方面在分解后可釋放出殺線物質(zhì)，同時(shí)又可以刺激加強(qiáng)生防菌對(duì)線蟲的侵染，而且還能夠給微生物、植株提供豐富的營養(yǎng)，克服土壤對(duì)真菌菌劑的抑制作用，增強(qiáng)植株耐病性。在發(fā)酵生產(chǎn)結(jié)束后，選擇加入0.2-0.5％(W/V)富含幾丁質(zhì)、膠原蛋白的物質(zhì)(主要為蝦、蟹等動(dòng)物的甲殼)。另外，一些植物具有良好的殺線蟲效果，選擇在發(fā)酵液中加入2-5％(W/V)的蒜汁和/或大麻汁。另外，在菌液中加入0.1-0.3％(w/v)的甲基纖維素，以增加菌液粘稠度和均勻度，同時(shí)使菌劑更牢固地包衣在大豆種子上。
上述的三類添加劑，既可單獨(dú)使用其中的任一類，也可以使用其中的任兩類或者三類結(jié)合使用。
另外，本發(fā)明菌株液體制劑的另一種優(yōu)選方案的特征在于，其中所說的菌株發(fā)酵液經(jīng)減壓濃縮，然后再加入上述各種添加劑中的一種或多種進(jìn)行復(fù)配而制成。其中所述的添加劑包括富含幾丁質(zhì)、膠原蛋白的物質(zhì)；蒜汁和/或大麻汁；甲基纖維素。該方案的優(yōu)點(diǎn)是便于貯存和運(yùn)輸。
另外，本發(fā)明菌株液體制劑的另一種優(yōu)選方案的特征在于，其中所說的菌株發(fā)酵液經(jīng)過過濾，將固、液組分分別處理、包裝，制成待播種時(shí)混合施用的制劑。該方案的優(yōu)點(diǎn)也是便于貯存和運(yùn)輸。
另外，本發(fā)明還提供了一種用于防治大豆胞囊線蟲病的固體菌珠制劑，其特征在于，它是由上述液體菌珠制劑與固體填充物按(0.5-1.3)∶1(w/w)混合、陰干和粉碎而制成。
上述的固體填充物最好是由硅藻土70重量％和草炭30重量％混合而成。
本發(fā)明的液體菌株制劑的使用方法如下按播種每畝所用的大豆種子量(約5-6kg大豆)加100ml的液體菌劑混合，包衣種子，待晾干后即可進(jìn)行正常播種。此外根據(jù)不同的耕作條件及生產(chǎn)規(guī)模，還可以采用其他后處理工藝，例如將液體菌劑濃縮后復(fù)配，或?qū)l(fā)酵液過濾，將固、液組分分別處理包裝，待播種時(shí)再混合施用。
本發(fā)明的固體菌株制劑的使用方法是將該制劑的粉碎細(xì)?；蚱涑尚晤w粒劑與大豆種子混合均勻后再進(jìn)行正常的播種。
與現(xiàn)有技術(shù)的化學(xué)農(nóng)約或類似生物農(nóng)約相比，本發(fā)明的用于防治大豆胞囊線蟲病的液體或固體菌株制劑具有如下優(yōu)點(diǎn)1、可以寄生于線蟲的胞囊、雌蟲體內(nèi)及卵中，抑制其發(fā)育和繁殖，從而顯著地減少土壤中線蟲種群數(shù)量；2、淡紫擬青霉在液體發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝物可抑殺胞囊線蟲的2齡幼蟲；3、能有效地克服土壤的抑菌作用，可以長期地保持淡紫擬青霉的殺線蟲的能力；4、可定殖于大豆植株的根際，拮抗線蟲及根腐菌的浸染；5、可調(diào)節(jié)根際微環(huán)境(包括酶活性及微生物群落)，有利于大豆生長；6、增加大豆須根量，并增加根瘤數(shù)量和體積；7、促進(jìn)大豆生長，增加大豆耐病性；8、制劑中的有機(jī)添加物分解后能釋放出抑殺線蟲及病菌的物質(zhì)，即通過多個(gè)位點(diǎn)、多種方式作用于線蟲生活史的各個(gè)階段，從而能長期地保持殺線蟲和抑制病菌的能力。
下面通過具體實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明。
實(shí)施例1
采用試管培養(yǎng)的淡紫擬青霉CGMCC 0241原種，再按三角搖瓶→種子罐→發(fā)酵罐的三級(jí)發(fā)酵工藝培養(yǎng)，接種量為7％，采用的培養(yǎng)基組合物成分如下培養(yǎng)基成分 含量蔗糖 3％(W/V，下同)NaCl 1％KNO30.3％K2HPO40.1％CaCO30.3％FeSO4·7H2O100ppmZnSO4100ppmMgSO4·7H2O500ppmCuSO45ppmNaMoO4·2H2O 5ppmH3BO410ppm水 余量(補(bǔ)足100％)控制發(fā)酵溫度在26-28℃；PH6.5±0.5一、二級(jí)發(fā)酵時(shí)間各定為2天，三級(jí)發(fā)酵結(jié)束時(shí)間定為發(fā)酵液中液生孢子濃度達(dá)到6×108個(gè)/ml，整個(gè)發(fā)酵時(shí)間為7天。發(fā)酵結(jié)束后測得的菌絲干重為2％(W/V)。調(diào)節(jié)菌液PH值為6.0，往該發(fā)酵液中加入0.25％(W/V)的蟹殼粉、3％(W/V)的蒜汁和0.2％(W/V)的甲基纖維素，混合均勻后按每100ml制劑與3kg大豆種子(一畝的用量)混合拌種，共試驗(yàn)100畝地。另外，為了對(duì)比起見，在同一地區(qū)劃出10畝地未使用本發(fā)明的制劑。結(jié)果表明，在使用本發(fā)明制劑的100畝大豆中，胞囊線蟲病明顯減輕，較對(duì)照減少65％，對(duì)根腐病防效40％以上，大豆的平均畝產(chǎn)要比未使用本發(fā)明制劑的平均畝產(chǎn)高出約20％。
權(quán)利要求
1.一種用于防治大豆胞囊線蟲病的菌株，其特征在于，它是淡紫擬青霉CGMCC0241。
2.一種用于防治大豆胞囊線蟲病的菌株液體制劑，它是采用真菌菌株接種，通過液體三級(jí)發(fā)酵工藝而制成，其特征在于，用于接種的菌株為淡紫擬青霉CGMCC0241；液體發(fā)酵的溫度一般控制為24-30℃；PH值為5-8；所說三級(jí)發(fā)酵最終結(jié)束時(shí)間的掌握條件是鏡檢觀察到的菌株液生孢子濃度達(dá)到5×108個(gè)/ml以上，并且菌絲干重達(dá)到2％(W/V)以上。
3.如權(quán)利要求2所述的菌株液體制劑，其特征在于，在制備該制劑時(shí)的發(fā)酵過程中使用的培養(yǎng)基組合物的成分如下培養(yǎng)基成分 含量蔗糖 2-5％(W/V，下同)NaCl 0.2-2％KNO30.1-0.8％K2HPO40.02-0.2％CaCO3和/或CaCl20.1-0.8％FeSO4·7H2O 50-300ppmZnSO450-300ppmMgSO4·7H2O 200-1000ppmCuSO42-10ppmNaMoO4·2H2O 2-10ppmH3BO45-30ppm水 余量(補(bǔ)足100％)
4.如權(quán)利要求2所述的菌株液體制劑，其特征在于，在該制劑中還含有0.2-0.5％(W/V)富含幾丁質(zhì)、膠原蛋白的物質(zhì)。
5.如權(quán)利要求2所述的菌株液體制劑，其特征在于，在該制劑中還含有2-5％(W/V)的蒜汁和/或大麻汁。
6.如權(quán)利要求2所述的菌株液體制劑，其特征在于，在該制劑中還含有0.1-0.3％(w/v)的甲基纖維素。
7.如權(quán)利要求2所述的菌株液體制劑，其特征在于，在該制劑中還含有0.2-0.5％(W/V)富含幾丁質(zhì)、膠原蛋白的物質(zhì)；2-5％(W/V)的蒜汁和/或大麻汁及0.1-0.3％(w/v)的甲基纖維素。
8.如權(quán)利要求2所述菌株液體制劑，其特征在于，其中所說的菌株發(fā)酵液經(jīng)減壓濃縮，然后再加入權(quán)利要求7中所述添加劑的一種或多種進(jìn)行復(fù)配而制成。
9.如權(quán)利要求2所述菌株液體制劑，其特征在于，其中所說的菌株發(fā)酵液經(jīng)過過濾，將固、液組分分別處理、包裝，制成待播種時(shí)混合施用的制劑。
10.一種用于防治大豆胞囊線蟲病的固體菌株制劑，其特征在于，它是由液體菌劑與固體填充物按(0.5-1.3)∶1(W/W)混合，陰干和粉碎而制成。
全文摘要
一種用于防治大豆胞囊線蟲病的菌株，其名稱為淡紫擬青霉CGMCC0241。一種用于防治大豆胞囊線蟲病的菌株液體制劑，它是用上述菌株接種，經(jīng)過三級(jí)發(fā)酵并加入復(fù)合添加劑而制成。發(fā)酵過程溫度為24-30℃；pH值為5-8；最終發(fā)酵結(jié)束時(shí)間的條件為鏡檢觀察到的液生孢子數(shù)在5×10
文檔編號(hào)C12N1/14GK1138096SQ9512111
公開日1996年12月18日 申請(qǐng)日期1995年12月29日 優(yōu)先權(quán)日1995年12月29日
發(fā)明者劉杏忠, 張新德, 謝云清, 孫漫紅 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物防治研究所, 黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)作物開發(fā)研究所