專利名稱：對在生物人工器官中被囊細胞的生長控制的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及在生物人工器官內(nèi)控制被囊之細胞生長的方法和組合物。
生物人工器官“BAO”是含活細胞并被設計用以提供宿主所需的代謝功能的裝置。
在BAO中被囊的細胞給宿主提供一種或多種生物活性分子，可以用這些分子防止或治療許多臨床癥狀，缺陷和疾病狀態(tài)。
例如可以用含分泌胰島素細胞的BAO治療糖尿病。通過使用分別分泌甲狀旁腺激素和促紅細胞生成素的細胞可以治療相似的其他疾病如甲狀旁腺功能減退和貧血。
還可以用生物人工器官供應生物活性分子以治療或預防神經(jīng)變性性疾病如Huntington’s疾病，帕金森氏病，老年性癡呆或獲得性免疫缺陷綜合癥相關的癡呆。另外，還可以通過BAO提供淋巴因子和細胞因子以調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)?？梢酝ㄟ^生物人工器官提供的其他生物活性分子包括兒茶酚胺，內(nèi)啡肽，腦啡肽以及其他用于治療疼痛的阿片樣物質或非阿片樣物質肽。通過使用BAO也可以治療酶缺陷。此外，生物活性分子可以從宿主中取出或消除有害分子。例如，BAO可以含有生產(chǎn)可用于從宿主中“掃除”膽固醇之生物活性分子的細胞。
各種“大被囊”BAO是已知的。參見如Aebischer(美國專利5158881)，Dionne等人(WO 92/03327)，Mandel等人(WO91/00119)，Aebischer(WO 93/00128)。BAO還包括血管外擴散室，血管內(nèi)擴散室，血管內(nèi)超濾室和微被囊。參見如Lim et al.，Science210908-910(1980)；Sun，A.M.，Methods in Enzumology 137575-579(1988)；Dunleavy et al.，(WO 93/03901)和Chich et al.，(美國專利5002661)。
由于BAO中被囊的細胞提供所需的代謝功能，所以令人滿意的是那些最好提供影響所述功能的生物活性分子的細胞。通常在BAO中使用分化的非分裂細胞優(yōu)于正在分裂的細胞，原因是它們可以使所需生物活性分子的生產(chǎn)最有利。例如由于認為分化特異性基因的表達和細胞分裂是拮抗過程，因此許多分化的非分裂細胞生產(chǎn)的所需治療蛋白質的量大于正在分裂的細胞。Wollheim，“Establishment and Culture of Insulin-secreting βCell Lines，”Methods in Enzumology，192，p.223-235(1990)。細胞復制能力隨細胞分化而降低。在許多情況下，增殖和分化是相互排斥的。Gonos，“Oncogenes in Cellular Immortalisation and Differentiation，”13，Anticancer Research，p.1117(1993)。
由于用于混入BAO中之組織的功能特性常常是依體內(nèi)分化組織的特性而定義的，所以，使用分化的組織是有利的。使用分化的非分裂細胞的另一優(yōu)點是在BAO中的細胞數(shù)目將保持相對穩(wěn)定。這樣又會導致產(chǎn)生更容易預測的結果和對受體宿主相對穩(wěn)定的劑量。另外，分化的細胞更適用于被囊了一種以上分泌生物活性分子之細胞的BAO。在所述BAO中，如果使用正在分裂的細胞，不同類型的細胞可能會以不同的速率生長，從而導致某一類型細胞過度生長。通過使用分化的非分裂細胞，更容易控制兩種或多種類型協(xié)同細胞的相對比例。
盡管在許多情況下使用分化的細胞是有利的，但是使用直接從哺乳動物中分離的分化細胞也存在著許多問題。
首先，分離的組織有潛在的污染，這要求對從各動物中取出的組織進行既費錢又花時間的檢測以確保所述組織物無病原體。
第二，由于在分離過程中使用機械或酶促分離方法，所以有可能在分離過程中損壞組織。機械操作不總是易標準化，這樣會導致分離之間的差異。
第三，在分離過程中可能會發(fā)生局部缺血，引起組織損傷。
第四，由于組織供體之間的差異，很難有可重復的產(chǎn)率。例如動物源的年齡，性別，健康狀況，激素狀態(tài)可能會影響所需組織的產(chǎn)率和質量。
第五，有時沒有足夠的源組織來滿足BAO的預定要求。這會發(fā)生在例如，源組織來源于小器官或對組織的最終要求量很高的情況下。如果待分離組織的來源是人，經(jīng)常會有供體組織的嚴重短缺。
第六，在一些情況下，需要用遺傳工程方法修飾BAO中所用的細胞。到目前為止，體外很難用遺傳工程方法修飾非分裂組織，而且待修飾細胞的產(chǎn)率和特性也不確定。因此，由于上述問題，在使用分化的非分裂細胞的同時，還需要生產(chǎn)并保持用于被囊在BAO中的分化的非分裂細胞的方法。
由于這些問題，已經(jīng)贊成在BAO內(nèi)使用正在分裂的細胞和細胞系以提供所需的生物功能。使用正在分裂的細胞的一個重要的優(yōu)點是所述細胞可以在體外大量生長并根據(jù)病原體進行篩選和收集成庫。這使得可以以較低的生產(chǎn)成本幾乎無限制地供應組織?？梢詫⒎蛛x方法如細胞分類或克隆用于細胞庫以發(fā)育具有改進特征的亞群體。另外，正在分裂的細胞和細胞系比分化的非分裂細胞更適合于使用遺傳工程方法。導入異源重組DNA的能力使得有許多新的可能性來改變被囊在BAO中之細胞的功能或表型。這樣反過來又給BAO提供了更廣泛的治療用途。
但是，正如上文所討論的，在BAO中被囊正在連續(xù)分裂的細胞的缺點是不能充分調(diào)節(jié)裝置的的細胞數(shù)目，從而導致在生產(chǎn)所需生物活性分子方面的可預測性降低。
盡管在大多數(shù)情況下，限制或使BAO內(nèi)的細胞生長最小，但在其他情況下，如，將BAO植入“敵對的”環(huán)境中，就會需要使細胞在BAO中緩慢增殖并保持細胞數(shù)目。
一般有另一個與被囊細胞有關的問題。各種類型的細胞都有細胞粘附特性，以致細胞彼此傾向于粘附并形成稠密的團塊或聚集，特別是如果所述細胞得不到足夠的底物的情況下。由于營養(yǎng)和氧相對難以到達植入在核中的細胞或由于在核內(nèi)有毒產(chǎn)物的堆集，所述細胞簇可發(fā)展成中央壞死區(qū)。壞死的組織還可釋放過量的細胞蛋白質，異蛋白質或其他對存活細胞有害的因子，如引發(fā)巨噬細胞或其他免疫反應的因子會多余地充斥在宿主中。當細胞用半透膜衣被囊在BAO中時，由于跨膜的擴散約束，這個問題就會更加嚴重。在BAO中氧會更少，得到營養(yǎng)的宿主就更少。另外，廢物在BAO中積累。
這些稠密的細胞量可緩慢地形成細胞生長的稠密菌落或在重新結合新鮮分散的細胞或有細胞-表面粘附蛋白介導的組織上迅速形成。具有高代謝活性的細胞或組織對于氧或營養(yǎng)喪失的影響是特別敏感的，而且在植入大細胞簇中央后很短的時間內(nèi)死亡。許多內(nèi)分泌組織(正常情況下由稠密毛細床支持)有這樣的行為；在被被囊后，胰島似乎就是特別敏感的。
這樣就需要控制被囊細胞生長的方法和組合物，所述細胞組合了正在增殖細胞和分化的非分裂細胞的各種優(yōu)點。本發(fā)明提供了方法和組合物，借助它們可以使細胞在體外無限增殖和發(fā)展，而且在細胞被被囊在BAO中時，可以控制增殖和分化之間的平衡以便所述裝置以所需的方式運行。因此，本發(fā)明可以調(diào)節(jié)在BAO中的細胞數(shù)目，并可因此提供改進了的被囊輸出水平的調(diào)節(jié)方法。本發(fā)明還提供了通過控制在BAO中的細胞位置而控制細胞生長的方法，由此減少在BAO中不希望有的壞死細胞核的形成。就特定類型的被囊細胞而言，控制BAO中的細胞數(shù)目和細胞位置還有利于促進BAO膜和其他裝置參數(shù)的最優(yōu)化。這是因為在BAO中，用于固定的細胞群體的所需裝置的特征比用于正在分裂細胞群體的更容易確定。另外，可以長期輸送生物活性分子。
本發(fā)明通過提供用于控制被囊到BAO中之細胞的分布(即在BAO中的細胞數(shù)目或細胞位置，或兼而有之)的方法和組合物而致力于解決上述問題。本發(fā)明的方法和組合物包括(1)修飾被囊到BAO中之細胞的方法和組合物和(2)修飾BAO內(nèi)生長表面的方法和組合物。
用于細胞操作的方法和組合物包括用編碼影響細胞增殖或分化之產(chǎn)物的基因對細胞進行遺傳改變。所述處理包括提供抑制增殖或誘導分化的化學化合物或生長因子。另外，所述處理可包含從生長介質中除去刺激增殖或抑制分化的化學化合物或生長因子。所述處理可以在被囊到BAO中之前或之后進行，優(yōu)選的是在被囊之前。另外可以用輻射控制細胞增殖。
用于生長表面修飾的方法和組合物包括用一種或多種細胞外基質分子(“ECM”)包被至少一個BAO內(nèi)的生長表面?？梢詫CM直接包被到BAO內(nèi)的腔表面或任何內(nèi)支持物上，或包被到微球載體(“微載體”)上?？梢栽賹⒓毎蚣毎N的微載體懸浮于生理上抑制細胞增殖的基質物質中。此外，基質物質可以是用化學或肽衍生物衍生的。
另外，可以通過化學處理修飾BAO的生長表面以抑制細胞附著或增強細胞附著于BAO的腔表面。此外，可以通過在加入細胞前加入惰性支架來修飾生長表面。支架在生理上抑制細胞的過度生長并給細胞附著提供額外的位點。應理解各種用于細胞修飾和生長表面修飾的方法和組合物不是相互排斥的，而且可以組合使用。


圖1描述了一個構建體的質粒圖譜，它含有于SV40早期區(qū)融合的2.3kb的鼠Mx1啟動子，其后有一來自小鼠β球蛋白3’非翻譯區(qū)的BamH1-Xba1片段。
圖2表示從被囊在對照，非衍生膜(在圖注中表示為“0％”)或1％或5％PEO-PDMS衍生的膜(在圖注中分別表示為“1％”和“5％”)中的BHK細胞，在4，11和25天后分泌的NGF(ng/ml/24h)。沒用基質(在圖注中表示為“無基質”)，用VitrogenTM基質(在圖注中表示為“vit”)或瓊脂糖基質(在圖注中表示為“agse”)被囊細胞。
圖3表示在沒有瓊脂糖基質(圖注n-mat-008，0709-n-m)或存在瓊脂糖基質(圖注agaro-008，agaro-0709)時，從在CultiSphersTM生長的BHK細胞中NGF的釋放。
圖4表示在被囊到有惰性PHEMA支架的BAO中之后的1，14和28天，來自PC21A細胞兒茶酚胺的釋放。A圖表示基礎兒茶酚胺的釋放；圖B表示K+激活的兒茶酚胺的釋放。在圖注中的縮寫L-dopa，NEPI，epi，DOPAC，DA和HVA分別代表L-多巴，去甲腎上腺素，腎上腺素，dopac，多巴胺和高香草酸。
圖5表示在被囊到有惰性PHEMA/MMA支架的BAO中之后的1，14和28天，來自PC21A細胞兒茶酚胺的釋放。A圖表示基礎兒茶酚胺的釋放；圖B表示K+激活的兒茶酚胺的釋放。在圖注中的縮寫L-dopa，NEPI，epi，DOPAC，DA和HVA分別代表L-多巴，去甲腎上腺素，腎上腺素，dopac，多巴胺和高香草酸。
圖6表示在被囊在BAO中2，20，40和80天后，存在褐藻酸鹽基質(圖注CS/AL)或存在瓊脂糖基質(圖注CS/AG)時，從在CultisphersTM上生長的SV40/Dβ 4-NGF細胞L-多巴釋放的情況。
本文所用的“生物人工器官”或“ BAO”是一種裝置，是被設計用來植入到宿主中或被制造出在體外發(fā)揮功能并永久地或可取出地附著于宿主。BAO含有生產(chǎn)生物活性分子的細胞或活組織，所述生物活性分子對宿主有治療作用。在植入到宿主受體中后，BAO應是生物上可相容的。因此，BAO不應引發(fā)使其不能操作或沒有治療用途的有害的宿主反應。例如通過在被膜周圍形成纖維變性結構，限制營養(yǎng)物質擴散到其中的細胞中就會發(fā)生所述的不可操作性。有害作用還包括被膜的排異或有毒或致熱化合物(如合成的聚合物副產(chǎn)物)從BAO中釋放到周圍的宿主組織中。
可以根據(jù)免疫隔離(immunoisolatory)特性建成含被囊細胞的BAO，所述特性防止宿主免疫系統(tǒng)的組分進入所述器官，由此保護生物人工器官中所含的細胞免于有害的免疫破壞。BAO的使用提高了可以在治療中使用的細胞類型的多樣性。在植入的BAO中，所述裝置(可以是或不是免疫隔離的)通常含有在半通透性物理膜內(nèi)生產(chǎn)所選之產(chǎn)物的細胞或組織，所述半通透性物理膜可以擴散營養(yǎng)物質，廢物，然后分泌的產(chǎn)物進入到周圍的宿主組織中并保留在含有它的細胞中，但同時使細胞和分子效應物免疫排異的有害作用最小。但并不是在所有的情況下都需要免疫隔離特性(例如，如果細胞是自體的或與宿主同系)。
“生物活性分子”是(a)可以在它被制造的細胞內(nèi)發(fā)揮功能或(b)可在細胞表面表達并影響細胞于其他細胞或生物活性分子(例如神經(jīng)遞質受體或細胞粘附分子)的相互作用，或(c)可以從它被生產(chǎn)的細胞中釋放或分泌并發(fā)揮其對宿主中不同靶細胞或靶分子(例如，神經(jīng)遞質，激素，生長因子或細胞因子)的作用的分子。
本文所用的術語“細胞”(除特別說明外)指任何形式，包括但不限于在組織、細胞團中所保留的細胞以及單個分離的細胞。本發(fā)明所用的細胞生產(chǎn)至少一種生物活性分子。
在BAO中細胞分布的控制指控制在BAO中的細胞數(shù)目，控制細胞在BAO中的空間位置或兩者兼而有之。
在本發(fā)明中可以使用許多類型的細胞。這些包括已知的，公開可得到的不死的細胞系及正在分裂的初級細胞培養(yǎng)物。適用于實施本發(fā)明的可公開得到的細胞系的實例包括L-6細胞，MDCK細胞，LLC-PK細胞，β-CH3細胞，C2細胞，副(by)倉鼠腎(BHK)，中國倉鼠卵巢(CHO)，小鼠成纖維細胞(L-M)，NIH瑞士小鼠胚胎(NIH/3T3)，非洲綠猴細胞系(包括COS-a，COS-1，COS-6，COS-7，BSC-1，BSC-40，BMT-10和Vero)，大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤(PC12)，大鼠神經(jīng)膠質腫瘤細胞(C6)，RAJI(人淋巴瘤)細胞，MOPC-31C小鼠漿細胞瘤，MN9D細胞，MN9H細胞，β-TC細胞，Hep-G2細胞，AT-T20細胞，β-細胞系如NIT細胞或RIN細胞，Ntera-2細胞(Pleasure et al.，Journ.Neuroscience，12，pp.1802-15(1992))和人星形細胞系如U-373和U-937。
可以使用的初級細胞包括從哺乳動物的CNS衍生的bFGF-反應性神經(jīng)干/祖代細胞(Richards et al.，PNAS 89，pp.8591-8595(1992)；Ray et al.，PNAS90，pp.3602-3606(1993))，初級成纖維細胞，神經(jīng)鞘細胞(WO92/03536)，星形細胞，少突神經(jīng)膠質細胞和其前體，成肌細胞和腎上腺嗜鉻細胞。例如一種所述的成肌細胞系是C2C12細胞系。
還可以根據(jù)所用的特定的生長控制和分化方法來選擇細胞。例如，在通過導入化學物質誘導分化的方法中很容易使用干細胞。通常干細胞是體內(nèi)靜止的不分化的細胞，但是能夠增殖并能產(chǎn)生具有生產(chǎn)大量祖代細胞的更多多干細胞，然后祖代細胞可產(chǎn)生分化的或可分化的子代細胞。干細胞代表了一類在培養(yǎng)中很容易擴增的細胞，通過施用特異性的生長因子可以分化到終。參見例如Weiss等人(PCT/CA 92/00283)。
根據(jù)本發(fā)明，成肌細胞是可被囊在BAO中的一類細胞。成肌細胞是肌細胞的前體細胞，最初來源于中胚層干細胞群體。成肌細胞是可經(jīng)在培養(yǎng)基中分化而得到的細胞系，如L-6和β-CH3細胞。初級成肌細胞很容易從尸檢或活檢中取出的組織中分離，然后純化并擴增。成肌細胞增殖并融合在一起形成分化的多核肌小管。肌小管不再分裂，但繼續(xù)生產(chǎn)肌蛋白。在增殖時，可以很容易地對成肌細胞進行遺傳工程處理以產(chǎn)生治療分子。將一種或多種基因導入到成肌細胞中以產(chǎn)生所需生物活性分子的方法是已知的。成肌細胞能夠遷移，融合到預先存在的纖維中，作為待導入基因的載體。Verma等人(WO 94/01129)；Blau等人，TIG，9，pp.269-74(9113)；WO 93/03768；WO 90/15862。然后被囊加工后的細胞并使其在BAO中分化或被囊分化細胞本身。
還可以根據(jù)所打算的應用來選擇細胞?？梢赃x擇BAO中的細胞來分泌神經(jīng)遞質。所述神經(jīng)遞質包括多巴胺，γ-氨酪酸(GABA)，血清素，乙酰膽堿，去腎上腺素，腎上腺素，谷氨酸和其他肽神經(jīng)遞質。還可以使用合成并分泌活性神經(jīng)遞質激動劑，類似物，衍生物或片段的細胞，例如分泌溴隱定，多巴胺激動劑的細胞和分泌L-多巴，多巴胺前體的細胞。
可以根據(jù)其分泌的激素，細胞因子，生長因子，營養(yǎng)因子，血管生成因子，抗體，血管凝集因子，淋巴因子，酶，和前體治療劑或激動劑，前體，活性類似物或其活性片段來選擇細胞。這些包括腦啡肽，兒茶酚胺，內(nèi)啡肽，腦啡肽，胰島素，VIII因子，促紅細胞生成素，物質P，神經(jīng)生長因子(NGF)，膠質細胞系-衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)，血小板衍生的生長因子(PDGF)，表皮生長因子(EGF)，腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，促神經(jīng)激素(neurotrophin)-3(NT-3)，促神經(jīng)激素-4/5，CDF/LIF，bFGF，aFGF，其他成纖維細胞生長因子的陣(array)睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)和白細胞介素。
從前文的描述應理解，在本發(fā)明方法中有用的細胞包括分泌所需生物活性分子的非轉化細胞，或轉化的細胞也可以完成這些。
已經(jīng)克隆了編碼各種生物活性分子的基因并公開了其核苷酸序列。許多那些基因都可從保藏中心如美國典型培養(yǎng)物收集中心(ATCC)或各種商業(yè)途徑得到。編碼不能公開得到的在本發(fā)明中有用的生物活性分子的基因可以用標準重組DNA方法，如PCR擴增，用來自任何公開序列的寡核苷酸探針篩選基因組和cDNA文庫而得到。在本發(fā)明中可以施用編碼生物活性分子的任何已知基因。參見例如美國專利5049493；Gage等人，美國專利5082670和美國專利5167762。
可以用標準技術將所需基因(即編碼適宜生物活性分子的基因)插入到適宜表達載體的克隆位點。這些技術是本領域專業(yè)人員熟知的。
然后可以用含所需基因的表達載體轉染在本發(fā)明方法中所用的細胞系?？梢允褂脴藴兽D染技術例如磷酸鈣共沉淀，DEAE-葡聚糖轉染，脂介導的方法或電穿孔。
本文提供控制分裂細胞生長的方法，借助所述方法可以控制增殖和分化之間的平衡以在BAO內(nèi)提供分化的非分裂被囊的細胞。還提供了控制分裂和非分裂細胞生長的方法，借助所述方法控制BAO內(nèi)的細胞分布和細胞數(shù)目，從而減少壞死細胞核的形成并減少細胞碎片。用遺傳工程方法控制增殖和分化通過用基因遺傳改變細胞，本文提供了控制細胞生長的方法和組合物，所述基因可編碼影響細胞增殖或分化的產(chǎn)物。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，使用條件性不死的細胞系以在BAO中達到控制生長的目的。用編碼促進增殖之產(chǎn)物的基因轉化初級細胞。將促進增殖的基因可操作地連接到可調(diào)節(jié)啟動子?？梢院侠淼匦薷挠蒐and等人描述的生產(chǎn)不死細胞的技術(Nature，304，pp.596-602(1983)或Cepko，Neuron，1，pp.345-53(1988))以生產(chǎn)條件性不死的細胞。
根據(jù)該方法，通過降低促進增殖之基因，如癌基因(如c-myc，v-mos，v-Ha-ras，SV40 T-抗原，來自腺病毒的E1-A)的表達可以抑制細胞增殖(即有絲分裂)。當BAO被植入到宿主體內(nèi)時，通過向降調(diào)節(jié)、抑制驅動癌基因表達的啟動子或使其失活來降低癌基因的表達。體外向上調(diào)節(jié)、激活或使可調(diào)節(jié)啟動子去阻制會導致表達促進增殖的基因，由此使細胞在體外增殖。適宜的啟動子是在體內(nèi)可被下降調(diào)節(jié)的啟動子，包括如糖皮質激素反應性啟動子，如PNMT(Hummang etal.，Neutoprotocols，3，pp.276-83(1993))和干擾素(“IFN”)-反應性啟動子如Ms1(Hug et al.，Mol.Cell.Biol.，8，pp.3065-79(1988)；Arnheiter etal.，Cell，52，pp.51-61(1990))，反轉錄病毒長末端重復啟動子，四環(huán)素反應性啟動子，如lac啟動子和胰島素反應性啟動子。還可參見McDonnell等人WO 93/23431。應理解啟動子的選擇應取決于所打算植入的位點。因此，根據(jù)本發(fā)明，糖皮質激素或IFN反應性啟動子對于植入到腦中是有用的。因此不能預期，這些啟動子在BAO植入到腦中后，將指導癌基因以顯著地水平進行表達。
在一個實施方案中，通過將癌基因與可調(diào)節(jié)啟動子可操作相連而產(chǎn)生條件性的不死的細胞。存在結合蛋白的情況下可激活或上調(diào)所述啟動子。通過將編碼結合蛋白的基因與四環(huán)素反應性啟動子相連，可調(diào)節(jié)結合蛋白的生產(chǎn)。
例如一個實施方案完成了含一構成性啟動子的轉化細胞，所述啟動子驅動tet阻遏表達。所述細胞還含有與CMV-IE啟動子可操作相連的異源基因。如果CMV-IE啟動子側翼為tet操縱子序列，則用tet阻遏物就可關閉從該啟動子開始的表達。存在tet時，由于tet與tet阻遏物結合，從而使其他轉錄因子以CMV-IE啟動子結合而發(fā)生轉錄。根據(jù)該實施方案，只有存在四環(huán)素時才會表達癌基因。因此存在四環(huán)素時，細胞可以在體外增殖。
在植入前數(shù)天，除去四環(huán)素可以降低轉基因表達，因此相應地減少或抑制細胞在BAO中的增殖。
在使用條件性不死之細胞的具體實施方案中，用Mx1啟動子達到控制生長的目的。Mx1基因編碼賦予對流感病毒A和B抗性的蛋白質。Mx1基因緊緊受其啟動子的調(diào)節(jié)。在不存在干擾素(“IFN”)的情況下，不表達基因，而存在IFNα和IFNβ時，所述基因是可誘導的。Arnheiter等人(Cell，52，pp.51-61(1990))報道了Mx1轉基因小鼠的生產(chǎn)，所述小鼠在數(shù)種組織中表現(xiàn)出用干擾素可誘導表達轉基因。SV40大T抗原能夠轉化來自許多組織的細胞并使其不死。
在一個實施方案中，可以將小鼠Mx1啟動子與SV40早期區(qū)融合，然后用嵌合基因生產(chǎn)轉基因小鼠。由Mx1啟動子元件提供的緊密調(diào)節(jié)使得人們可以控制組織或從轉基因動物中制備的細胞培養(yǎng)物中之癌基因的表達，由此產(chǎn)生條件性不死的細胞系。
存在IFNα或IFNβ時，用這種方法生產(chǎn)的細胞系可以象大多數(shù)其他細胞系一樣，以算術方式擴增。通過在被囊之前或之后除去IFNα或IFNβ可以停止細胞分裂。在優(yōu)選的實施方案中，用Weiss(PCT/CA92/00283)的方法，可以從含Mx1-SV40 T抗原構建體的轉基因小鼠中制備神經(jīng)干細胞(neurospheres)。然后被囊由此得到的條件性不死的神經(jīng)干細胞系，并將其植入宿主體內(nèi)。
另外，如果需要，根據(jù)標準方法，可以進一步基因修飾條件性不死的神經(jīng)干細胞系以釋放任何數(shù)量的生長因子或神經(jīng)遞質。在該實施方案中還使用了另一種IFN反應性啟動子。這些啟動子包括金屬硫蛋白，H-2Kb，H-2Dd，H-2Ld，HLA-A3，HLA-DRα，HLAI型基因，202，56K，6-16，IP-10，ISG15，ISG54，和2’，5’-oligo(A)合成酶。參見Hug。等人，Mol.Cell.Biol.，8，pp.3065-79(1988)。
該實施方案特別適用于被囊在BAO中用于植入腦中的細胞。IFNα和IFNβ在腦中的循環(huán)水平足夠低，以便由Mx1啟動子所驅動的轉錄活性不足以導致細胞增殖。在建立轉基因動物中，可以在數(shù)種組織中誘導T抗原的表達，但只有在胸腺中才能見到癌基因的自然表達。但是，癌基因的胸腺表達在表達SV40早期區(qū)的轉基因動物中是相當常見的現(xiàn)象。因此，在沒有顯著癌基因表達的情況下，可以將細胞在體內(nèi)保持在一種接近靜止的狀態(tài)。
另一實施方案利用了這樣的觀察結果即在用于體內(nèi)的有關遺傳工程細胞的傳統(tǒng)反轉錄病毒感染技術中，使用反轉錄病毒啟動子如長末端重復(“LTR”)啟動子。參見如Gage等人美國專利5082670。由這些啟動子驅動的基因表達通常在體內(nèi)受到下降調(diào)節(jié)。通常認為這種下降調(diào)節(jié)是由循環(huán)中的細胞因子介導的。在細胞被被囊在BAO中并植入體內(nèi)后，本發(fā)明就是利用這種一般來講有害的反轉錄病毒基因的下降調(diào)節(jié)來停止或降低細胞增殖。在所述情況下，不死的基因(癌基因)由LTR驅動。在細胞在體外保持或擴增時，所述基因也會使細胞“不死”。在植入后，存在細胞因子的情況下，“不死”的癌基因被下降調(diào)節(jié)，增殖降低或停止，細胞在所述裝置中靜止。
根據(jù)該實施方案，可以通過用反轉錄病毒感染或用含癌基因(如，c-myc，v-mos，v-Ha-ras，SV40 T抗原，來自腺病毒的E1)的cDNA進行DNA轉染生產(chǎn)條件性不死的細胞，所述癌基因與反轉錄病毒啟動子，如LTR啟動子可操縱相連。我們優(yōu)選莫洛氏鼠白血病病毒(MLV)，勞氏肉瘤病毒(RSV)和小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子序列。
這些轉化的細胞一般將在體外表達所述癌基因。用已建立的培養(yǎng)技術，在培養(yǎng)基中可以使成功轉化的細胞生長。通過加入地塞米松或表皮生長因子可以刺激LTR-轉基因表達以縮短培養(yǎng)轉化細胞所需的時間。優(yōu)選的在被囊和植入數(shù)天前，將細胞暴露于細胞因子，如γ-干擾素(IFN-γ)，TNF-α和轉化生長因子-β(TGFβ)，通過抑制LTR驅動的轉基因表達可以降低有絲分裂。Schinstine and Gage，Molecular andCellular approaches to the Treatment of NeurologicalDisease，71，ed.Waxman，S.G.(1993)；Seliger et al.，J.Immunol.，141，pp.2138-44(1988)；Seliger et al.，J.Virology，61，pp.2567-72(1987)；Seliger et al.，J.Virology，62，pp.619-21(1988)。
根據(jù)上述方法，任何適宜的細胞都可以是條件性不死的。通過本領域已知的篩選方法，包括本文提供的方法，本領域專業(yè)人員可以確定給定細胞類型有關條件性不死的適宜性。
本文通過轉化這些細胞以包括腫瘤抑制基因，如p53基因或RB基因，從而來停止或降低增殖，而提供了控制不死細胞系或連續(xù)增殖之細胞生長的方法。一般認為腫瘤抑制基因或抗癌基因是生長抑制基因。參見如Weiberg，Neuron，11，pp.191-96(1993)。例如，野生型p53激活片段1(WAF1)可以在培養(yǎng)基中抑制腫瘤細胞的生長。理論上由p53蛋白質誘導的基因可以介導其作為腫瘤抑制劑的生物學作用。E1-Deiry et al.，“ WAF1，a Potential Mediator of p53 Tumor Suppression”Cell，75，pp.817-825)1993)。WAF1基因也稱為CIP1基因。其他p53-介導的生長抑制基因包括GADD45和GADD153(或CHOP)。參見RonProc.Natl.Acad.sci.USA，91，pp.1985-86(1994)。本文可以使用用上述轉化的異源DNA轉化細胞的標準技術。
根據(jù)一個實施方案，用與可調(diào)節(jié)啟動子操縱相連的腫瘤抑制基因轉化不死的細胞或連續(xù)增殖的細胞。在體外培養(yǎng)轉化細胞，由此進行擴增時，用適宜的可調(diào)節(jié)或可誘導啟動子可以表達下降調(diào)節(jié)或關閉的轉基因。在被囊或植入后，表達腫瘤抑制基因，從而降低或停止細胞增殖。
酪氨酸羥化酶和促紅細胞生成素啟動子在本發(fā)明的該方面是有用的。這些啟動子通常在高O2條件下如在體外時，“下降調(diào)節(jié)”，但在低O2條件下，如在被囊在BAO中并植入宿主后，細胞所遇到的環(huán)境下，“上升調(diào)節(jié)”。
另外，可以使用適宜偶聯(lián)或去阻遏啟動子系統(tǒng)以按需調(diào)節(jié)增殖抑制基因。例如一個適宜的系統(tǒng)涉及使用由Hannan等人(Gene 130 pp.233-39(1993))描述的AP1啟動子和lac操縱基因/PGK1啟動子系統(tǒng)。AP1啟動子與lac阻遏物基因可操縱相連。lacO(lac操縱基因)和3-磷酸甘油酸激酶(PGK1)啟動子與增殖抑制基因可操縱相連。體外加入外源佛波醇酯誘導AP1啟動子，可導致lac阻遏物蛋白質的表達。存在阻遏物蛋白質的情況下，阻遏了lacO-PGK1啟動子構建體，而且不會表達增殖抑制基因。體內(nèi)不存在佛波醇酯的情況下，不表達阻遏物蛋白質，lacO-PGK1啟動子去阻遏，則表達增殖抑制基因。
根據(jù)一種方法，用編碼分化誘導產(chǎn)物的基因轉化適宜的細胞。所述分化-誘導基因與可調(diào)節(jié)啟動子可操縱相連。根據(jù)該方法，在被囊并植入宿主體內(nèi)后，將會表達分化-誘導基因。然而，通過適宜的下降調(diào)節(jié)，阻遏或失活可調(diào)節(jié)啟動子，可以體外抑制表達。正在分裂的細胞或已經(jīng)不死的初級細胞可以使用該方法。高遷移率組的染色體蛋白質14，“HGM”，是與調(diào)節(jié)細胞分化有關的基因的一個實例。如上文討論的用于增殖抑制基因的一樣，體內(nèi)上升調(diào)節(jié)，但在體外可以被“關閉”或下降調(diào)節(jié)的任何適宜的啟動子均可以用在該實施方案中。另外，如上文討論的有關調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因表達一樣，可以使用任何適宜的去阻遏啟動子，如上文討論的。
生長控制的另一種方法使用反義RNA或DNA或其衍生物。反義RNA或DNA是單鏈核酸，與一基因的編碼鏈或從該基因轉錄生產(chǎn)的“編碼”mRNA互補。如果反義RNA與mRNA同時存在于細胞中，那么反義RNA就與mRNA雜交形成不能通過制備蛋白質的核糖體翻譯的雙鏈。翻譯RNA可以經(jīng)微注射或大量加入到培養(yǎng)基中而施用于細胞。本發(fā)明優(yōu)選的方法是用真核表達載體植入靶細胞。Neckers et al.，“AntisenseTechnologyBiological Utility And Practical Considerations”Am.J.Physiol.265(Lung Cell.Mol.Physiol.，9)，pp.L1-L12(1993)。
根據(jù)該實施方案，可以將編碼與增殖誘導基因或腫瘤抑制基因反義之RNA的反義基因與可誘導啟動子操縱相連。在誘導啟動子后，就會生產(chǎn)反義RNA。根據(jù)該實施方案，如果所述轉化細胞含有增殖誘導基因，在體外將會停止或下降調(diào)節(jié)反義RNA的生產(chǎn)，但在體內(nèi)上升調(diào)節(jié)后，將會停止或降低增殖。
換言之，如果轉化細胞含有腫瘤抑制基因，在體外就會上升調(diào)節(jié)反義RNA生產(chǎn)，而在體內(nèi)下降調(diào)節(jié)，從而達到所需的生長控制目的。
另外，還可以用反義技術將任何反義基因構建成編碼產(chǎn)物之基因，所述產(chǎn)物是增殖或分化所必需的。適當?shù)恼T導表達反義基因可以使本領域專業(yè)人員達到控制本發(fā)明被囊細胞生長的目的。
優(yōu)選的是使用可調(diào)節(jié)啟動子/基因構建體，即使所述構建體成為誘導體內(nèi)細胞增殖所必需的或所需的，那么也可以在體內(nèi)操縱所述構建體。例如若是上文所討論的Mx1/SV40構建體，可以局部或全身加入IFN以誘導癌基因表達。在BAO中增加體內(nèi)細胞分裂可以增加細胞數(shù)目以代替BAO中死亡的細胞或增加從BAO中所需生物活性分子的輸出。用化合物控制生長和分化構建本發(fā)明的另一種方法，可以將細胞暴露于抑制增殖或誘導分化的處理中。在某些方法中，處理包括提供化合物或生長因子。在其他方法中，處理包括從生長培養(yǎng)基中除去化合物或生長因子?？梢栽诒荒矣贐AO之前或之后進行處理，優(yōu)選是在被囊之前。
所用的蛋白質或化合物取決于細胞類型或所需的效果。本領域專業(yè)人員用合理技術即根據(jù)細胞對所選化合物或蛋白質的反應可以篩選所給的細胞類型。
在一種方法中，通過包含從細胞生長培養(yǎng)基中除去增殖誘導化合物或生長因子的處理來控制細胞分布。在一個實施方案中，可以使用生長因子如表皮生長因子(“EGF”)，轉化生長因子α(“TGFα”)，雙調(diào)蛋白或任何其他適宜的試劑以誘導干細胞或祖代細胞(包括來自胚胎交感神經(jīng)節(jié)和不死祖代細胞)，優(yōu)選神經(jīng)干細胞(Weiss，PCT/CA 92/000283)的生長。這樣可以保持并增加體外神經(jīng)前體細胞的供應。不存在這些增殖誘導生長因子而被囊時，神經(jīng)前體細胞會停止分裂和分化。
還可以通過用例如佛波醇酯處理或在固定底物(包括帶離子電荷的表面如聚-L-賴氨酸和聚-L-鳥氨酸等)上生長進一步誘導神經(jīng)前體細胞分化。還可以通過用FGF家族的成員與至少1種由Ip等人(WO94/03199)描述的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)或神經(jīng)生長因子(NGF)家族中的成員結合處理來誘導分化。
在另一實施方案中，可以使用在基質中輸出的多譜系生長因子，也稱為“肥大細胞生長因子”，“干細胞因子”，“c-kit-配體”或“青灰因子”誘導造血干細胞的增殖。為了保持在體外供應正在分裂的細胞，存在肥大細胞生長因子存在的條件下培養(yǎng)造血干細胞。為了抑制或降低增殖，從培養(yǎng)基中除去肥大細胞生長因子。可以在被囊之前或之后完成該步驟，優(yōu)選在被囊之前。
前體促進增殖的多譜系生長因子的實例包括白細胞介素-3和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子。肥大細胞生長因子與前體多譜系生長因子或譜系特異性生長因子如促紅細胞生成素結合還可以影響細胞生長。例如，認為在誘導高度富集的鼠造血干細胞增殖時肥大細胞生長因子與IL-3有協(xié)同作用。Galli等人，“The biology of Stem Cell Factor，a NewHematopoietic Growth Factor Involved in Stem Cell Regulation，”Int.J.Clin.Lab.Res.，23，pp.70-77(1993)。
在本發(fā)明的另一方法中，通過提供抑制細胞增殖或誘導分化的化合物或生長因子可以控制BAO中的細胞分布。根據(jù)該方法，可以使用任何適宜的增殖抑制或分化誘導化合物。
應當理解，不同類型的細胞對不同的化合物有不同的反應。本領域專業(yè)人員可以用常規(guī)方法篩選特定的化合物以確定其在影響給定細胞類型之增殖或分化中的有效性。
在一個實施方案中，可以用細胞因子，包括例如轉化生長因子β1(TGFβ1)抑制細胞增殖或誘導細胞分化。例如通過暴露于TGFβ1和抗壞血酸可以降低在BHK細胞中的增殖并增強分化。相似地，可以用TGFβ1誘導成纖維細胞中的分化，而且還可作為角質化細胞和內(nèi)皮細胞的生長抑制劑。Phillips等人“ Ascorbic Acid and Transforming growthFactor-β 1Increase Collagen Biosynthesis via DifferentMechanismsCoordinate Regulation of Proα(III)Collagens，”Archiyesof Biochemistry and Biophysics，295，pp.397-403(1992)。
在另一實施方案中，可以用TGFβ1，血清素或FGF控制神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的生長。通過在自分泌方式中其自身的產(chǎn)物可以調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的生長。TGFβ1是人胰類癌細胞(BON)的自分泌生長抑制因子，而FGF和血清素是自分泌生長調(diào)節(jié)因子。TGFβ1對BON細胞生長的抑制作用可以通過加入血清素而逆轉。Townsend Jr等人，“studies ofGrowth Regulation in a Neuroendocrine Cell Line”ActaOncologica，32，pp.125-130(1993)。
根據(jù)本發(fā)明的方法，還可以使用各種其他的化學物質以抑制細胞增殖或誘導細胞分化。這些化學物質包括絲裂霉素C，5-溴-脫氧脲苷(BrdU)，前列腺素E1(PEGE1)，二丁酰cAMP，1-β-D-阿糖呋喃細胞因子(Ara-C)，煙酰胺和肝素。絲裂霉素特別適用于控制被囊的βHC細胞系的增殖。參見例如，Radvanyi等人，Mol.Cell.Biol.，13，pp.4223-27(1993)。
有時可以使用化學物質的組合。用絲裂霉素C和BrdU或PGE E1或二丁酰cAMP處理后，可以誘導人神經(jīng)胚細胞瘤細胞IMR-32分化。Gash等人，“Amitotic N euroblastoma Cells Used for Neural Implants inMonkeys，”Science，233，pp.1420-22(1986)。用Ara-C系列預處理人胚胎橫紋肌肉瘤細胞系還導致體外明顯的生長抑制，體內(nèi)致瘤性的喪失，而且甚至在除去所述化合物后還有進一步分化的表型。Crouch等人，“Ara-CTreatment Leads to Differentiation and Reverses the TransformedPhenotype in a Human Rhabdomyosarcoma Cell Line，”ExperimentalCell Research，204，pp.210-16(193)。認為煙酰胺(NIC)誘導人胎兒胰島細胞的分化和成熟。Otonkoski等人，“Nicotinamide is a Potnet Inducerof Endocrine Differentiation in Cultured Human Fetal Pancreatic Cells，”J.Clin.Invest.，92，pp.1459-66(1993)。
還已經(jīng)報道加入dbcAMP還影響正在發(fā)育組織的分化。例如認為dbcAMP調(diào)節(jié)星形細胞前體分化，誘導PC12細胞中軸突的形成，刺激施旺氏細胞增殖。Baron-Van Evercooren等人，“Schwann CellDifferentiation in vitroExtracellular Matrix Deposition and Interaction，”Dev.Neurosci.8，pp.182-96(1986)。相似地，可以通過暴露于抗壞血酸誘導施旺氏細胞的分化，出處同上。
此外，可以用涎腺糖肽(“ SGP”)分子抑制細胞增殖。例如從完整大腦皮層細胞分離的18 kDa的細胞表面涎腺糖肽抑制處于指數(shù)生長的Swiss3T3細胞的增殖。參見例如，Toole-Simms等人，Jour.Cell.Physiol.147，pp.292-97(1991)；Fattaey等人，Exp.Cell.Res.，194，pp.62-68(1991)。已經(jīng)有許多轉化的和未轉化的細胞類型表明對某些SGP是敏感的。這些細胞包括來自寬范圍的脊椎動物和無脊椎動物種的內(nèi)皮樣和成纖維細胞。參見例如Fattaey等人，Jour.cell.Physiol.139，pp.269-74(1989)(引入本文作為參考)。
應理解上述的某些處理對增殖和分化僅有暫時的作用。在這種情況下，植入到宿主體內(nèi)后，需要連續(xù)地給被囊細胞補充化合物或生長因子。這可以通過利用生長因子或化合物的生物可侵蝕聚合物非細胞源，或通過共被囊生長因子或化合物的細胞源或任何其他適宜的裝置來完成。參見美國專利5106627和5156844。通過輻射控制生長還可以通過將細胞暴露于適宜劑量的輻射如X射線，紫外線(UV)照射等來控制細胞增殖。在細胞經(jīng)輻射后，其通過細胞循環(huán)的進程就會受到抑制?？梢杂靡阎椒?，根據(jù)所選的細胞類型來確定臨界劑量率或最小劑量率。參見例如Stanley and Lee，Radiat.Res.133，pp.163-9(1993)；Mitchell等人，Radiat.Res.79，pp.537-51(1979)。例如用5和10mJ/cm2紫外線B(UVB)照射的正常人表皮角質化細胞顯示其在輻射后3-5天，增殖有顯著(高達78％)的降低。Prystowsky etal.，J.Invest.Dermatol.，101，pp.54-58(1993).Yi et al.，Radiation Research，133，pp.163-69(1993)提供了計算通過暴露于x射線而使細胞增殖停止所需的最低劑量的方法。利用細胞外基質分子控制生長和分化本文提供了通過僅用控制生長的細胞外基質(“ECM”)(或其組分)或與控制生長的生理學基質或其他調(diào)節(jié)生長的物質組合來修飾生長表面，從而控制BAO中細胞分布的方法。
在活組織中，ECM是從各種有細胞分泌的蛋白質或多糖形成的，然后在靠近分泌它們的細胞附近被組裝成網(wǎng)。ECM分子包括氨基葡糖聚糖和蛋白聚糖，如chrondroitin sulfate，纖維蛋白連接素，硫酸肝素，透明質酸酶，硫酸皮膚素，硫酸角質素，層粘連蛋白，膠原蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)和彈性硬蛋白。具體地說，在體內(nèi)膠原蛋白是ECM的主要組分。已知ECM分子使細胞增殖降低并能促進細胞分化。另外，在本發(fā)明方法中使用的非細胞ECM可以影響在BAO中所被囊細胞的空間位置。
可以通過培養(yǎng)已知沉積ECM的細胞，包括間質的或星形源的細胞得到ECM。用抗壞血酸和cAMP處理后，可以誘導施旺氏細胞合成ECM。這些ECM組分組裝成支持施旺氏細胞增殖的基膜的前體形式。此外，從內(nèi)皮細胞和從Engelbreth Holm-Swarm腫瘤細胞(EHS)重建的基膜凝膠天然生產(chǎn)的ECM支持各種上皮細胞和內(nèi)皮細胞的生長和分化。Barron-VanEvercooren et al.，“Schwann Cell Differentiation in Interaction，”Dev.Neurosci.，8，pp.182-96(1986)。
在一個實施方案中，通過用ECM包被BAO中的生長表面(或其生長控制組分)來控制生長。我們優(yōu)選用生產(chǎn)ECM的細胞在BAO中種植生長表面，然后培養(yǎng)細胞至融合。接著用洗滌劑和NH4OH處理細胞。再用所得的BAO(帶有包被在生長表面上的非細胞ECM)被囊生產(chǎn)所需生物活性分子的細胞。
在另一實施方案中，用基本相同的方法體外制備ECM，凍干，制成片段，然后與細胞混合作為懸浮液。然后將細胞/ECM片段共載到BAO中。
與在常規(guī)單層培養(yǎng)中生長的細胞相比，存在一些ECM分子時生長的細胞，其增殖降低，分化增強。例如，存在膠原蛋白凝膠時，在體外生長的已知合成特定甾類激素例如，醛固酮的腎上腺(adrenocortical)細胞其增殖降低。Fujiyama et al.，“Influence of Extracellular Matrix on theProliferation and differentiation of Adrencocortical Cells in Culture，”Path.Res.Pract.，189，pp.12051-14(1993)。
在膠原蛋白條件下進行培養(yǎng)時，施旺氏細胞還可表現(xiàn)出增殖降低而分化增加。
還知道在用IV型膠原蛋白和HSPG結合包被的表面上生長時，內(nèi)分泌細胞可在體外分化。IV型膠原蛋白是細胞粘附所必需的，而HSPG誘導分化。de Bruine et al.，“Extracellular Matrix Components InduceEndocrine Differentiation In Vitro in NCI-H716 Cells，”AmericanJournal of Pathology，142，pp.773-782(1993)。
可以將各種生長因子或化合物，包括上文討論的那些加到ECM組分中以進一步控制細胞的生長和分化。既可以在植入前，在體外將生長因子施用于細胞，或也可以在體內(nèi)施用于細胞，或兩者同時施用。參見例如，美國專利5156844和5106627，這兩篇文獻涉及傳遞生長因子的方法，利用共被囊的細胞或非細胞源的生長因子。另外，根據(jù)已知技術，用控制生長的肽可以衍生ECM分子。
例如，可以將調(diào)節(jié)細胞在其自身上生長，可逆地與特定ECM分子(如核心蛋白聚糖)結合的轉化生長因子β加到ECM中以促進ECM分子的生長抑制作用。
同樣地，也表明肝素可以抑制非轉化細胞和轉化細胞系生長。Matuoka et al.，Cell Structure and Function，9，p.357(1984)。
已經(jīng)報道抗堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)與ECM組分一起加入時可以促進內(nèi)分泌細胞的分化。參見de Bruine et al.，“ExtracellularMatrix Components Induce Endocrine Differentiation In Vitro in NCI-H716 Cells，”American Journal of Pathology，142，pp.773-782(1993)。
當生長因子與不同的ECM組分結合時，可以對細胞表現(xiàn)出不同的作用。例如，已經(jīng)表明，成纖維細胞生長因子對在層粘連蛋白上生長的嗜鉻細胞是有效的分化因子和弱分裂素。但是當將FGF加到在膠原蛋白上生長的嗜鉻細胞時，F(xiàn)GF是弱分化因子和強分裂素。環(huán)AMP類似物8-(4-氯苯基硫代)環(huán)AMP也有這種行為。 Chu etal.，Neuroscience，95，pp.43-54(1994)。
表1是已知影響特定類型細胞之增殖和分化的ECM分子生長因子和化合物的部分表。
表1影響增殖或分化的ECM分子，生長因子和化合物細胞類型分化誘導劑/生長抑制劑 增殖促進因子施旺氏 抗壞血酸；膠原蛋白(VitrogenTM) TGF-β；dbcAMPCultisphers/瓊脂糖PC12NCF；dbcAMP；SGP成纖維細胞 TGF-β-1；Cultisphers/瓊脂糖； VitrogenTM抗壞血酸；SGP成肌細胞膠原蛋白；抗壞血酸神經(jīng)干細胞 層粘連蛋白；EGF；bFGF；
肽2000；Cultisphers/肽2000佛波醇酯；肝素；FGF和 TGF-α；(CNTF或NGF) 雙調(diào)蛋白人胚胎橫紋肌 Ara-C肉瘤細胞系人胎兒胰島細胞 煙酰胺(NIC)成星形細胞 dbcAMPSwiss 3T3SGP腎上腺 膠原蛋白內(nèi)分泌IV型膠原蛋白+HSPG；bFGF+ECM組分嗜鉻細胞 FGF+層粘連蛋白；FGF+膠原蛋白；8-(4-8-(4-氯苯基硫代)氯苯基硫代)環(huán)AMP+環(huán)AMP+層粘連蛋白膠原蛋白造血干細胞肥大細胞生長因子BHK TGF β-1+抗壞血酸；來自E15大鼠腦膜細胞的ECM角質化細胞TGF β-1內(nèi)皮細胞 TGF β-1神經(jīng)內(nèi)分泌TGF β-1TGF β-1+抗壞血酸；(人胰類癌 血清素；FGF細胞(BON))成神經(jīng)細胞瘤 絲裂霉素C+BrdU；細胞系IMR-32 PGE1+dbcAMP；SGPSCT-1 膠原蛋白；抗壞血酸BAO內(nèi)的生長表面包括BAO的腔表面，另外還包括可被囊在BAO中的其他生長表面，如內(nèi)支持物。
微載體可以提供用于細胞生長的表面。利用微載體可以使被囊的細胞數(shù)目更多，均勻地分布在BAO內(nèi)，特別是對于生長接觸抑制的細胞。數(shù)種類型的微載體是市售的，包括Cytodex(Sigma，St.Louis，MO)葡聚糖微載體，和CultiSpherTM(HyClone Labs，Logan，UT)大孔明膠微載體和玻璃微載體。通常用這些微載體培養(yǎng)錨依賴性細胞。在大孔明膠微載體上生長的細胞系包括0BHK，BHK-21，L-929，CHO-K1，rCHO，MDCK，V79，F(xiàn)9，HeLa和MDBK。還可以用其他ECM分子(如FACT膠原蛋白包被的微載體(Solo Hill Labs，AnH arbor，MI))或非細胞ECM(基本如上所述)制備微載體。
在優(yōu)選的實施方案中，在被囊和植入前，可以將生產(chǎn)所需上文活性分子的細胞種植到ECM包被的微載體表面并在微載體上體外培養(yǎng)。Cherksey(WO 93/14790)涉及在玻璃和塑料微珠上培養(yǎng)細胞，然后將微珠植入到受體的腦中。
在本發(fā)明的另一實施方案中，可以將在微載體上種植的細胞于存在適宜生長抑制基質的條件下懸浮，然后被囊在BAO中。所述基質材料(如用于成纖維細胞的瓊脂糖或瓊脂；用于腎上腺細胞的膠原蛋白)可在生理學上進一步抑制細胞的贅疣。在例如Dionne Wo 92/19195中描述了所述水凝膠基質，該文獻引入本文作為參考。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，通過用影響細胞附著于所述基質的肽序列衍生，可以用瓊脂糖作為ECM的替代物。例如，用層粘連蛋白或纖維蛋白連接素的肽序列衍生瓊脂糖水凝膠。
用該方法，將細胞懸浮在由瓊脂糖組成的3-D基質中，所述瓊脂糖是用識別與細胞粘附有關的細胞表面受體分子之肽序列衍生的。已經(jīng)表明有數(shù)種肽序列可促進細胞粘附。參見例如，Pierschbacher etal.，science，309，pp.30-33(1984)；Graf et al.，Biochemistry，26，pp.6896-900(1987)；Smallheiser et al.，dev.Brain Res.，12，pp.136-40(1984)；Jucket etal.，J.Neurosci.Res.，28，pp.507-17(1991)。本發(fā)明衍生的瓊脂糖基質允許存在適宜的分子記號，所述記號用于3-D中的細胞粘附。瓊脂糖濃度優(yōu)選1.25％w/v或更少，最優(yōu)選約1.0％。我們優(yōu)選含RGD的序列(即ArgGlyAspl； SEQ ID NO 2的AA2-AA4)，含YIGSR的序列(TyrIleGlySerArg； SEQ ID NO1的AA5-AA9)，含IKVAV的序列(IleLysValAlaVal；SEQ ID NO3的AA1-AA15)等。可以用雙功能偶聯(lián)劑，如1’1羰基二咪唑或任何其他適宜的方法完成衍生。
用瓊脂糖代替ECM的一個特別的優(yōu)點是天然產(chǎn)生的ECM在體內(nèi)時間過長時會酶促降解，而瓊脂糖則不容易降解。使用瓊脂糖的優(yōu)點還有，因為它是一種確定的產(chǎn)物，不象MartrigelR，是一種從腫瘤細胞系中衍生的，是一種不確定的混合物。具體地說，已經(jīng)表明MartrigelR含bFGF，對于許多細胞來說是一種強分裂素。瓊脂糖是一種有多糖組成的透明的，熱可逆的水凝膠。除在生理學上限制細胞贅疣外，瓊脂糖本身可抑制增殖并誘導分化。參見例如Aulthouse，in“ Expression of the Human ChondrocytePhenotype In Vitro，”In vitro Cellular & Developmintalbiology，25，pp.659-668(1989)。
可以通過衍生物如PEO-PDMS(優(yōu)選對細胞沒有毒性作用)將瓊脂糖化學改性以進一步抑制細胞贅疣。
應該理解，不同類型的細胞對給定的ECM分子或對來自特定來源的非細胞ECM有不同的反應。參見例如，End and Engel，“MultidomainProteins Of The Extracellular Matrix And Cellular Growth”，pp 79-129，in Receptors for Extracellular matrix，[Eds] McdDonald andMecham，Academic Pree，New York(1991)，該文獻引入本文作為參考。本領域專業(yè)人員很容易對細胞進行篩選以確定其對ECM分子或來自特異性來源的非ECM的反應性，確定其在控制細胞分布中的有效性。通過在BAO中的生長表面修飾來控制生長本文提供了通過化學修飾生長表明以控制BAO中的細胞數(shù)目和細胞位置，從而控制BAO中細胞生長的方法?？梢孕揎椩贐AO中的生長表明可控制細胞向生長表面的粘附。BAO內(nèi)的生長表面可以是BAO的腔表面或內(nèi)膜，微載體或BAO內(nèi)放置的內(nèi)支持物。根據(jù)微載體和內(nèi)支持物的的實施方案，可以在這些結構上體外培養(yǎng)細胞，然后將其被囊在BAO中用于植入。
可以通過許多不同的方法(包括化學修飾)修飾BAO膜以產(chǎn)生羧酸基團，胺基或羥基或其他反應功能團，或通過吸附對其進行修飾?？梢杂眠@些反應功能基團(不存在于聚合物骨架上)作為位點進行進一步的衍生。
在一個實施方案中，修飾BAO的腔表面以促進細胞與該表面的粘附?？刂萍毎蚯槐砻娴恼掣皆谔岣呒毎婊钪惺怯杏玫摹Ｍㄟ^使細胞與膜優(yōu)先附著，用比利用水凝膠懸浮之固定技術少的細胞就可以使細胞均勻分布在被膜內(nèi)。使用的細胞越少，產(chǎn)生的細胞碎片量越少。另一個好處是由于細胞與膜近距離接觸，因而可以提高營養(yǎng)物質向細胞的擴散。如果使用膜修飾，而在被膜內(nèi)沒有基質材料，還可以避免通過凝膠運輸?shù)牟l(fā)問題和蛋白質或細胞產(chǎn)物與基質材料的吸附。通過用各種分子量的聚(d-賴氨酸)處理BAO的腔表面可以促進細胞附著。從pH11緩沖的溶液中，可以將聚(d-賴氨酸)吸附到BAO腔表面。我們優(yōu)選約67000g/mol的聚(d-賴氨酸)。
另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，肽衍生物，例如含RGD的序列(即ArgGlyAspl；SEQ ID NO2的AA2-AA4)，含YIGSR的序列(TyrIleGlySerArg；SEQ ID NO1的AA5-AA9)， 包括CDPGYIGSR(CysAspProGlyTyrIleGlySerArg；SEQ ID NO1)， 以及含IKVAV的序列(IleLysValAlaVal；SEQ ID NO3的AA11-AA15)(優(yōu)選CysSerArgAlaArgLysGlnAlaAlaSerIleLysValAlaValSerAlaAspArg(SEQID NO3))在促進細胞附著方面是特別有用的。例如，用已知技術，可以將這些肽中最常用的RGD (ArgGlyAspl；SEQ ID NO2的AA2-AA4)化學附著到BAO膜上。有些含RGD(ArgGlyAspl；SEQ ID NO2的AA2-AA4)的分子是市售的，例如，PepTite-2000TM(Telios)。
在另一實施方案中，可以修飾BAO膜以抑制通過例如PEO-PDMS或聚(d-賴氨酸)-藻酸鹽吸附的細胞附著。我們優(yōu)選PEO-PDMS修飾，特別是當生長表面是孔狀的時。這是因為，PEO-PDMS傾向于通過孔擴散并在其通過孔時經(jīng)疏水-疏水結合吸附到表面上。具體地說，低分子量(600-3000g/mol)PEO-PDMS是優(yōu)選的。
當細胞在微載體上生長并被囊在BAO中時，該實施方案是特別有用的。用該方法，可以達到均勻的細胞分布，可以控制細胞數(shù)目，可以將細胞粘附限于微載體上。
另外，可以結合使用促進并抑制細胞附著的化合物。例如可以用抑制細胞附著的化合物處理BAO的腔表面，用促進細胞附著的化合物處理細胞周圍的基質(如果使用的話)。
在另一實施方案中，通過在負載細胞前，在BAO內(nèi)放一惰性支架可改變BAO的低劣性。所述支架提供了在被膜內(nèi)粘附并均勻分布細胞的結構。在制備惰性支架中有用的化合物包括聚(羥基乙基異丁烯酸酯)(“PHEMA”)和聚(羥基乙基異丁烯酸酯-共-甲基異丁烯酸酯)(“ PHEMA/MMA”)。此外，可以用各種化學物質或蛋白質，包括上文討論的那些衍生支架以進一步控制生長和分化。根據(jù)該方法，將適宜的支架材料的溶液在BAO中沉淀以用于所需的支架。
另一實施方案完成了在作為內(nèi)支持物成分上的培養(yǎng)?？梢杂萌魏螌嵸|上生物相容材料，如鈦或適宜的聚合物制備所述內(nèi)支持物。所述支持物可以是支柱或經(jīng)過設計用來作為支架以給細胞生長提供大量的表面積。所述支架材料的一個實例是非編織的聚酯纖維(NWPF) (ReemayTennessee)。有許多種NWPF，單編織的密度和每片的厚度不同。所述技術使得可以精確地控制BAO中的細胞數(shù)目，以及在插入到BAO中之前，鑒定細胞/支架的能力。此外，在將所述材料插入到所述裝置中前，可以使在所述材料上培養(yǎng)(在裝置外)的細胞分化。可以修飾所述支架，例如用細胞粘附肽，以誘導細胞分化。另外，所述材料增加了BAO的強度。在待審批申請SN 08/105,728中描述了含內(nèi)支持物之BAO的編織。
在本發(fā)明中有用的BAO通常至少含有一個包圍含細胞核的可半滲透的外表面膜或外套。所述外套可以使營養(yǎng)物質，生物學活性分子以及其他所選的產(chǎn)物擴散到BAO。BAO是生物可相容的，而且優(yōu)選免疫隔離的。所述核含分離的細胞，可以懸浮在液體培養(yǎng)基中或固定在水凝膠基質中。
應該理解，前述控制BAO內(nèi)細胞分布的方法和組合物不是唯一的?？梢越Y合使用數(shù)種方法和組合物以達到所需的控制生長的目的。
例如，根據(jù)本發(fā)明方法，可以生產(chǎn)已經(jīng)遺傳方法修飾的細胞以使其包含控制生長的基因，所述細胞在ECM微載體上生長，然后被囊在BAO中的細胞/微載體簇中，已經(jīng)修飾了所述BAO中的一個或多個生長表面以控制細胞分布。
BAO的被囊膜可以是用與核相同的材料制成，或可以用不同的材料制成。在另一中情況下，將形成選擇性滲透的且生物相容性的BAO周圍或外周膜區(qū)。如果需要，還可以構建免疫隔離的膜。
根據(jù)數(shù)種因素選擇用于構建BAO的材料，，而且在Dionne WO92/19195中有描述。簡而言之，可以用各種聚合物或聚合物混合物制造被膜外套。形成BAO和其中生長表面的聚合物膜可包括聚丙烯酸酯(包括丙烯酸共聚物)，聚乙烯，聚氯乙烯共聚物，聚氨基甲酸乙酯，聚苯乙烯，聚酰胺，乙酸纖維素，硝酸纖維素，聚砜，聚磷嗪(polyphosphazenes)，聚丙烯腈，聚(丙烯腈/共氯乙烯)以及其衍生物，共聚物和混合物。
可以用本領域已知的任何適宜的方法生產(chǎn)BAO。如在Dionne WO92/19195和美國專利5158881和5284761(引入本文作為參考)中描述的，一種所述方法涉及共擠壓聚合物澆鑄溶液和混凝劑，這可包含生物組織，器官，或細胞懸浮液和/或其他治療劑。
所述外套可以是單層(1，2型)或雙層(4型)?？梢酝ㄟ^在復合擠壓時，只淬火一種聚合物溶液的表面，可生產(chǎn)單層空心絲。可通過淬火兩種聚合物溶液的表面，可生產(chǎn)雙層空心絲。通常與4型空心絲相比，1型空心絲的外表面有更大比例的大孔。2型空心絲介于中間。
各種被膜構型，如圓柱體的，圓盤形或球形都是可能的。
BAO外套的孔徑大小將決定選擇性滲透膜的正常分子量截斷(nMWCO)。大于nMWCO的分子不能通過所述膜。正常分子量截斷的定義是在對流條件下有90％的被排除。在需要BAO是免疫隔離的情況下，要選擇膜孔徑大小以使由細胞生產(chǎn)的特定因子擴散出載體，但阻止宿主免疫反應因子進入BAO中。通常nMWCO的范圍在50到200kD之間，優(yōu)選90到150之間。最適宜的膜組合物還能使在所選植入位點的宿主免疫效應物分子與BAO外膜組分之間的反應性最小。
構建BAO的核，以給隔離在其中的特定細胞提供適宜的局部環(huán)境。所述核可包含足以保持細胞生長的液體培養(yǎng)基。液體核特別適用于保持像PC12細胞這樣的轉化細胞系。另外，所述還可含有凝膠基質。凝膠基質可以由水凝膠(藻酸鹽，“VitrogenTM”，等)或細胞外基質組分組成。參見如Dionne WO 92/19195。
形成水凝膠的組合物分三類。第一類帶凈的負電荷(如藻酸鹽)。第二類帶凈正電荷(如膠原蛋白和層粘連蛋白)。市售細胞外基質組分包括MatrigelTM和VitrogenTM。第三類是帶凈中性電荷(如高度交聯(lián)的聚環(huán)氧乙烷或聚乙烯醇)。
可以使用任何適宜密封BAO的方法，包括適宜聚合物膠合劑和/或卷曲，打結和熱密封。這些密封技術是本領域熟知的。另外，可以使用適宜的“干”密封方法。用這種方法得到一基本上無孔的套筒，含細胞的溶液可以通過該套筒導入。填充后，密封BAO。在待審批美國申請系列No.08/082407(引入本文作為參考)中描述了所述方法。
優(yōu)選使用一種或多種體外檢測方法在植入體內(nèi)前確定BAO的功能度。本領域熟知的檢測方法或診斷試驗可用于該目的。參見，例如MethodsIn Enzymology，abelson[Ed]，Academic Press，1993。例如對分泌產(chǎn)物可用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附劑試驗)，層析或酶檢測，或特異性的生物試驗。如果需要，在從受體收集適宜樣品(如血清)并檢測它們可以監(jiān)測植入體的分泌功能。如果受體是靈長類，可以使用微透析。
BAO的數(shù)目和BAO的大小應足以在植入后產(chǎn)生治療作用，這可通過特定應用所需的生物活性量來確定。在分泌細胞釋放治療物質的情況下，用本領域熟知的標準劑量考慮和標準確定所需分泌物質的量。在Dionne，WO 92/19195中討論了需要考慮的因素。
在無菌條件下植入BAO。通常，將BAO植入宿主內(nèi)的位點，這可以將分泌的產(chǎn)物或功能適宜地傳遞給宿主并將營養(yǎng)物質傳遞給被囊細胞或組織，而且還可以出入BAO進行補充和/或替代。優(yōu)選的宿主是靈長類，最佳為人。
設想了許多不同的植入位點。這些植入位點包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)，包括腦，脊索，眼的房水和玻璃體。腦中的優(yōu)選位點包括紋狀體，大腦皮層，丘腦底部核和邁內(nèi)特核基底。其他優(yōu)選位點是腦脊髓液，最佳為蛛網(wǎng)膜下隙和側心室。腎囊下位點和腹膜內(nèi)和皮下位點或任何其他有治療益處的位點。
為了更好地說明本發(fā)明，列舉了下列實施例。這些實施例只是說明目的的，不以任何方式對本發(fā)明范圍構成任何限制。實施例實施例1-用Mx1啟動子控制生長將小鼠Mx1啟動子與SV40早期區(qū)融合，用嵌合擠壓產(chǎn)生轉基因小鼠。由于在INFα或INFβ存在下可誘導Mx1啟動子元件，所以可以控制在從轉基因動物制備的組織或細胞培養(yǎng)物中的癌基因表達。因此，產(chǎn)生條件性不死的細胞系。生產(chǎn)轉基因小鼠我們所用的Mx1-Tag構建體由與完整SV40早期區(qū)cDNA融合的約2kb的Mx1啟動子(即Xba1-EcoR1片段)組成，它編碼大T和小T抗原并與小鼠β球蛋白3’非翻譯區(qū)和poly-A信號的上游(BamH1-Xba1片段)融合。包含β球蛋白序列是為了提供剪接位點，同時提高cDNA在轉基因動物中的表達。圖1列出了Mx-1構建體的質粒圖譜。
通過將原核微注射到單細胞受精的小鼠卵細胞中的標準技術來生產(chǎn)含Mx1-Tag構建體的轉基因小鼠(brinster et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，pp.4438-4442(1985))。來自建立者動物之組織的Southern印跡分析證實在基因組中整合了完整拷貝的轉基因。
用識別SV40早期區(qū)序列的PCR擴增產(chǎn)物確定來自這些小鼠的后代是“DNA陽性”。條件性不死的干細胞從E15轉基因小鼠胚胎中除去紋狀體，將DNA陰性littermates放在于含EGF神經(jīng)球(neuroshperes)培養(yǎng)基(每100mlDDH2O 50ml，10XDMEM/F12 10ml，30％葡萄糖2.0ml，NaHCO31.5ml，1M HEPES 0.5ml，L谷氨酰胺1.0，10X激素混合物10ml，DDH2O 25ml(以洗滌過濾))的初級(個體)細胞培養(yǎng)物中。按照Weiss，PCT CA92/00283和Reynolds and Weiss，J.Neuroscience 12，pp.4565-74(1992)的方法制備神經(jīng)球。每周將細胞傳代7次，然后分成2組有和沒有外源干擾素(IFN)。以500,000細胞/5ml的密度將細胞放在含EGF神經(jīng)球培養(yǎng)基的T25燒瓶中。將1000單位/mlIFN加到1/2的細胞中。對照神經(jīng)球不加IFN。將細胞在37℃，5％CO2中保溫并每周傳代。
傳代30次后(有IFN23次)，以15ml 1.25百萬個細胞的密度，將細胞放在有1000單位IFN的含血清培養(yǎng)基(DMEM，5％胎牛血清，和1X L-谷氨酰胺)中。每隔一天加入新鮮IFN。
7天后，除去培養(yǎng)基，用Hanks’平衡的鹽溶液(HBSS)洗滌細胞，用胰蛋白酶稍微作用一下燒瓶。將細胞重懸在10ml含血清的培養(yǎng)基中，以1000 RPM離心2分鐘，吸出培養(yǎng)基。然后用火拋光的吸管通過研磨將細胞重懸在2ml的血清培養(yǎng)基中。
將約25000個細胞放在含5％FBS DMEM的聚鳥氨酸處理的蓋片上。每隔一天將IFN加到半部蓋片上(1000單位/ml)。根據(jù)下列方法，以不同的間隔將細胞進行SV40 T抗原(Tag)和膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)(一種在星形細胞中特異性表達的中間產(chǎn)物絲蛋白)染色。
在室溫，將蓋玻片在0.1M磷酸鹽緩沖鹽(PBS)的4％對甲醛中浸20分鐘，然后用PBS5分鐘洗滌兩次。用100％EtOH，將細胞滲透2分鐘，然后用0.1 MPBS費時5分鐘再洗滌兩次。用在0.1MPBS中稀釋的5％NGS(正常山羊血清)在室溫將細胞至少阻斷30分鐘。收集一級抗體，用1％NGS稀釋2小時，然后在室溫將下述用于蓋片將抗-Tag(小鼠單克隆)以1∶10稀釋，抗-GFAP(兔多克隆)以1∶500稀釋。除去一級抗體，然后用PBS將蓋玻片費時5分鐘洗滌兩次。
收集二級抗體，用1％NGS稀釋，然后按如下，在室溫黑暗中用于蓋片30分鐘GAM-FITC(1∶128)；GAR-Texas Red(1∶100稀釋的)。除去二級抗體，在黑暗中將蓋玻片費時5分鐘洗滌兩次。
用CitiflourTM(或其他抗嚙齒動物封固培養(yǎng)基)將蓋玻片封固在斜面上并于4℃貯存直到用備有若丹明和熒光素鏡片的熒光顯微鏡觀察。
在這組試驗中，我們著手確定從除去干擾素后，T-抗原水平的下降有多快。另外，我們要確定T-抗原水平對細胞增殖和分化的影響。通過監(jiān)測GFAP水平評價分化。GFAP是在成熟星形細胞中特異性表達的中間產(chǎn)物絲狀蛋白。觀察到下列免疫熒光結果。天IFN(1000單位/ml)對照(無IFN)Tag GFAP TagGFAP1 +++ - +++-4 +++ - + +/-7 +++ - +/-+/-10+++ - - +因此，正如由Tag和GFAP免疫染色所表明的，在血清培養(yǎng)基中經(jīng)過一段時間后，IFN處理的細胞連續(xù)表達T-抗原，連續(xù)增殖，而且無GFAP表達的跡象，而對照(無IFM)開始分化(上調(diào)GFAP表達)并停止分裂。這可以通過肉眼觀察蓋玻片來證實--在4天末，細胞數(shù)目有明顯的不同。在10天末，IFN處理的細胞比對照要多很多。
在該構建體中SV40T抗原的表達以劑量依賴方式受到調(diào)節(jié)。在我們已生產(chǎn)的細胞系中，在500-1000單位/ml的IFN劑量觀察到最大的T-抗原表達(由免疫熒光測量的)。在100單位/ml，我們觀察到最小到?jīng)]有表達。正如所期望的，增殖率與IFN劑量相關；在IFN為100單位/ml時，幾乎沒有或沒有細胞分裂。
在用上述Mx1 Tag EGF-反應性中性干細胞進行的進一步研究中，我們還表明可以控制增殖和分化。通過除去EGF，而加入IFN而迫使這些干細胞種群分化。隨著1000單位/ml α/β IFN的加入，平的，星形細胞樣細胞簇開始增殖，而且最終填滿培養(yǎng)皿。我們已將這些細胞在IFN中連續(xù)保持70代以上，在這一時期，有24-36小時保持了雙倍的速率。當用一組中性和膠質特異性抗體檢測時，這些IFN處理的細胞實際上都是nestin-和T-抗原陽性，但對谷氨酰胺合成酶有弱反應性，而且是GFAP陰性。
在除去IFN后，這些平細胞的分裂速率迅速降低，失去了T-抗原免疫反應性，而谷氨酰胺合成酶和GFAP免疫反應性逐漸提高。這些細胞在體外存活數(shù)月，在持續(xù)缺乏IFN的情況下，沒有增殖跡象。令人驚奇的是，加入IFN可以重新誘導T-抗原免疫反應性和細胞增殖。這提供了以受控制的方式有增殖或分化能力的細胞系。實施例2將實施例1中制備的細胞被囊并植入人宿主中。制備PAN/PVC纖維用干噴射-濕拔絲技術(Cabasso，Hollow Fiber Membranes，vol.12，Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology，Wiley，NewYork，3 rd Ed.，pp.492-517，1980；Dionne，WO 92/19195；美國專利No.5,158,881)制備選擇性滲透的空纖維。從12.5％聚丙烯腈聚乙烯氯化物(PAN/PVC)共聚物二甲亞砜(w/w)溶液中鑄造不對稱的空纖維。生產(chǎn)單層或雙層纖維。將這些纖維收集到非溶劑的水浴中，甘油處理，然后干燥。將細胞以25000細胞/μl的密度負載到PAN/PVC單層空纖維中，通過熱捏緊密封。植入到宿主中將被囊的細胞植入到人宿主中。植入位點包括側心室和腦紋狀體。將BAO植入到腦中的方法在Aebischer等人的WO 93/00127(引入本文作為參考)中有描述。實施例 3-新生星形細胞的條件性不死將含小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)之啟動子元件的片段與SV40早期區(qū)cDNA融合。通過電穿孔轉染E15大鼠腦衍生的新生星形細胞，通過試驗篩選轉化體進行增殖。取出正在分裂的細胞，增殖，然后用抗大T抗體檢測大T-抗原的表達。將轉化的細胞被囊在BAO中，然后基本上按實施例2所述植入宿主。將BAO在體內(nèi)保持一個月。取出BAO，將在BAO中的細胞分布與同時保持在體外的BAO進行比較。實施例4-膠原蛋白降低的SCT-1細胞增殖和由抗壞血酸誘導的SCT-1細胞分化從pO-SV40轉基因小鼠(Messing et al.，J.Neuroscience，14，pp.3533-39(1994))的坐骨神經(jīng)腫瘤中克隆SCT-1細胞。這些SCT-1細胞對施旺氏細胞標記S100和Po以及SV40 T-抗原有免疫反應性。
在下列三種條件下使SCT-1細胞生長 (1)在不含抗壞血酸的組織培養(yǎng)塑料上，(2)在存在50μg/ml抗壞血酸的組織培養(yǎng)塑料上以誘導分化，和(3)懸浮在I型膠原蛋白中。
在沒有抗壞血酸的塑料基層上，大多數(shù)細胞呈成纖維細胞樣形態(tài)。但是，存在一些兩極細胞。細胞在18-20小時內(nèi)加倍，但細胞不存在接觸抑制。
存在抗壞血酸時生長的SCT-1細胞生長更慢，對熒光素和IV型膠原蛋白染色更強。另一方面，層粘連蛋白免疫反應性與對照和抗壞血酸誘導的分化培養(yǎng)物相似。在I型膠原蛋白中懸浮的SCT-1細胞呈兩極形態(tài)，而且有絲分裂活性顯著降低(即加倍的時間≥30天)。實施例 5-用抗壞血酸和TGF-β抑制BHK細胞增殖使分泌CNTF的BHK細胞在DMEM(高葡萄糖)培養(yǎng)基中生長。用TGF-β(2.5ng/ml)和抗壞血酸(100μM)處理亞匯合的BHK培養(yǎng)物后，降低了有絲分裂。另外，細胞似乎延長了，有些細胞排成一列。這樣的數(shù)據(jù)表明TGF-β和抗壞血酸抑制BHK細胞的增殖并誘導其分化。
在進一步的試驗中，在被囊到BAO并植入前，用2.5ng/ml TGFβ和100μM抗壞血酸處理分泌hNGF的BHK細胞。用未處理的細胞作對照。具體變量包括a)TGFβ/抗壞血酸，沒有VituogenTM，b)TGFβ/抗壞血酸，VituogenTM，c)無TGFβ/抗壞血酸，有VituogenTM，d)無TGFβ/抗壞血酸，沒有VituogenTM。另外使用數(shù)種不同的聚合物。將被膜植入到成年大鼠的紋狀體中。在3mos后殺死大鼠。實施例 6-存在EGF時神經(jīng)干細胞增殖和在其不存在時的分化用Weiss等人(PCT/Ca 92/00283)方法制備神經(jīng)球。收集并分裂傳代68代的神經(jīng)球。將一半的神經(jīng)球研磨成單細胞懸浮液，將另一半保留為簇。對單細胞懸浮液進行單細胞計數(shù)，然后推測成簇的細胞有相同的濃度。將單細胞和簇分別懸浮在等量的VituogenTM和含20ng/ml EGF為對照的神經(jīng)球培養(yǎng)基或PC-1培養(yǎng)基中。
將細胞以25000細胞/μl的密度負載到單層空纖維PAN/PVC BAO(基本上按實施例2中所述制備的)中，然后套密封。將BAO保持在神經(jīng)球+EGF培養(yǎng)基或PC-1培養(yǎng)基(不含EGF)中。
3天和7天后放棄BAO，通過免疫細胞化學進行膠質纖維酸性蛋白(GFAP)染色。GFAP反應性表明神經(jīng)干細胞已分化成星形細胞。觀察到下列結果時間(天) GFAP反應性單細胞無EGF 3 ?。?GFAP單細胞，EGF 3 陰性細胞簇，無EGF 3 ?。?GFAP細胞簇，EGF 3 陰性單細胞，無EGF 7 強+GFAP單細胞，EGF 7 陰性細胞簇，無EGF 7 強+GFAP細胞簇，EGF 7 陰性在第7天，EGF不存在的情況下被囊神經(jīng)干細胞分化成星形細胞。實施例 7-ECM對BHK細胞的作用制備無細胞ECM將從15天齡大鼠胚胎得到的E15大鼠腦膜細胞置于多孔皿中并使其融合。2星期后收集單層細胞并使其接著生長。
無細胞ECM如下提取先用0.1％三硝基甲苯X-100洗滌劑處理30分鐘，然后用5mM NH4OH處理3分鐘。BHK-hNGF細胞按下述生產(chǎn)分泌NGF的BHK細胞系。將含約37bp的第一內(nèi)含子的3’末端，認為是前原NGF蛋白質和完整編碼序列的翻譯起始位點的雙鏈ATG序列以及人NGF基因(Hoyle et al.，Neuron，10 pp.1019-34(1993))的完整3’非翻譯區(qū)亞克隆到DHFR-為基礎的pNUT表達載體中，該載體緊位于小鼠金屬硫蛋白-1啟動子(-650到+7)和大鼠胰島素II基因(Baetge et al.，Proc.Natl.Cacd.Sci.，83，pp.5454-58(1986))第一內(nèi)含子的下游。
用磷酸鈣方法，用pNUT-βNGF構建體轉染幼倉鼠腎(BHK)細胞。使BHK細胞在含10％胎牛血清，1x青霉素/鏈霉素/氨芐青霉素B(0.8g/l)的DMEM中生長。用含200μM氨甲蝶呤(Sigma)的培養(yǎng)基將轉染的BHK細胞選擇3-4星期，用或不用200μM氨甲蝶呤將抗性細胞保持為多克隆種群。
以1.0×104細胞/孔的密度，將轉化的BHK-hNGF細胞鋪在含從腦膜細胞提取之ECM的平板中。以相同的密度將BHK-hNGF細胞鋪在不含ECM的對照平板上。在分裂(DIV)6次后，用血細胞計數(shù)器計數(shù)細胞。
對照孔的平均細胞計數(shù)為4.5×106+/-4.5×105細胞。提取的ECM平板的細胞計數(shù)平均為9.9×105+/-4.9×105細胞。這些結果表明，在處理的平板上，細胞生長降低了4.5倍。實施例8-細胞粘附到在內(nèi)支持物上的無細胞ECM上在進一步的試驗中，將初級腦膜細胞種到TECOTM聚氨基甲酸乙酯纖維上。所述纖維在BAO中用作內(nèi)支持物。用以10％FBS補充的DMEM為培養(yǎng)基。2星期后，用0.1％三硝基甲苯x-100將所述纖維提取30分鐘，然后用25mM NH4OH提取3分鐘。用抗熒光素抗體將部分纖維免疫染色以確定在纖維上是否存在無細胞ECM。在使用BHK細胞的細胞粘附試驗中使用其他纖維。實施例 9-BHK細胞在被囊在用PEO-PDMS改性的BAO中的微載體上的生長制備PEO-PDMS衍生的BAO按實施例2所述制備單層PAN/PVC空纖維BAO。這些BAO的ID為642.6±36.7μM，OD為787.8±32.2μM，壁厚為67.8±16.2μM，BSA排斥系數(shù)為100％，液壓滲透性為約21.8ml/分/m2/mmHg。
在無菌條件下，用PEO-PEMS衍生PAN/PVC BAO。通過用去離子水將1ml或5mlEPO-PDMS稀釋到100ml來制備1％或5％(v/v)PEO-PDMS溶液(Huls，PS073，MW＝3126g/摩爾；82重量％PEO。在注射到“濕”PAN/PVC膜之前，將溶液無菌過濾(0.2μm)。將所述膜熱擠壓，然后浸在水溶液中。72小時后以及在用細胞使用前，用Hanks’緩沖的鹽溶液漂洗纖維。
將在實施例7中所述的分泌NGF的BHK細胞負載到下述PEO-PDMS衍生的纖維上。負載和密封方法用PBS(不含鈣和鎂)漂洗生長到90％匯合的，生產(chǎn)NGF之BHK細胞的單細胞懸浮液，胰酶消化約1分鐘，以1000rpm離心3分鐘沉淀。將細胞重懸在培養(yǎng)基中達到2×107細胞/ml的終細胞濃度。
將細胞直接負載到EPO-PDMS衍生的纖維上，或與0.15％Vitrogen基質溶液或0.5％瓊脂糖溶液混合，然后負載。用24號斜角導管針和Hamilton注射器將約2.5ul細胞或細胞/基質漿(10000細胞/ul)負載到各纖維中。
通過將1-1.1cm長的干空纖維封固到套上來密封被膜，所述套在遠端有一中隔的固定物，其中有一使細胞注射到所述裝置腔中的負載通道。在流注2.5ul細胞懸浮液后，將所述隔膜裂掉，然后有輕微卷曲的丙烯酸酯(LuxtrakTMLCM 24，ICI Resins US，wilmington，MA)密封通道(“套”密封)。隨后在丙烯酸套外放一1.5cm 0.200”硅橡膠管來將被膜“栓住”。
用該方法制備下列BAO1 對照非衍生的套，無基質；2 對照非衍生的套，Vitrogen基質；3 對照非衍生的套，瓊脂糖基質；4 1％PEO-PDMS衍生的套，無基質；5 1％PEO-PDMS衍生的套，Vitrogen基質；6 1％PEO-PDMS衍生的套，瓊脂糖基質；7 5％PEO-PDMS衍生的套，無基質；8 5％PEO-PDMS衍生的套，Vitrogen基質；9 5％PEO-PDMS衍生的套，瓊脂糖基質；在被囊后，將BAO在O2保持4天，然后在研究期保持在低O2水平(50mmHg)。圖2表示在4，11和25天后NGF的分泌(用ELISA測量的)。
NGF釋放數(shù)據(jù)表明，如果只有基質，則對細胞的輸出沒什么影響。然而，存在PEO-PDMS時，當與瓊脂糖而不是基質一起使用時，NGF的釋放基本上較低，但與VitrogenTM一起使用時不受影響。另外，在改變時，PEO-PEMS的百分比顯然對NGF的釋放沒什么影響。從組織學數(shù)據(jù)看，用瓊脂糖被囊的BHK細胞有延長的形態(tài)，而且沿裝置壁排列；但是，在瓊脂糖本身中，幾乎沒有細胞是活的。在PEO-PDMS改性的纖維中，用瓊脂糖負載的BHK細胞還沿被膜的內(nèi)腔表面排列，但為圓形。在PEO-PDMS-PAN/PVC改性的纖維中的細胞比在含瓊脂糖的未改性纖維中的少，這表明細胞生長受到控制。在VitrogenTM負載的裝置中，細胞不受纖維改性的影響，沒有基質時，被囊的細胞也不受影響。
在含VitrogenTM基質的未改性纖維中，BHK細胞分布均勻，存活率為約75％。在裝置中央有一些細胞壞死。PEO-PDMS改性不會影響細胞分布，存活率或形態(tài)。用瓊脂糖作為基質，細胞分布非常好，存活率接近90％。當使用瓊脂糖基質時，BHK細胞的細胞形態(tài)受膜的PEO-PDMS衍生作用的影響(1％和5％)。在未改性的P(AN/VC)中，細胞延長，而在改性的P(AN/VC)中，細胞更圓。細胞不在瓊脂糖基質中，而在纖維和瓊脂糖“棒”之間的空間。沒有基質時，細胞分布不太令人滿意，細胞形成了大簇，而且存活率較低(約)60％。實施例10-BHK細胞在CultiSphersTM上的生長使實施例7中所述的分泌NGF的BHK細胞在膠原蛋白包被的CultiSphersTM上生長。用50ml PBS (CMF)將CultiSphersTM(1g)再水合。將15×106細胞懸浮在1ml再水合的CultiSphersTM中。將細胞/CultiSphersTM懸浮液直接負載到單層PAN/PVC空纖維中，或以1∶1的比例與1％瓊脂糖混合，然后負載到單層PAN/PVC空纖維中?；旧习磳嵤├?中所述制備所述纖維，然后基本上按實施例9中所述負載和密封。
在2，15和56天，用ELISA檢測被囊細胞NGF分泌的情況。培養(yǎng)基每星期補充3次。圖3表示了結果。NGF釋放數(shù)據(jù)表明，當被囊在BAO中時，BHK細胞可以在CultiSphersTM微載體上生長(圖3，圖注n-mat-008，0709-n-m)。此外，NGF釋放數(shù)據(jù)表明可以將BHK細胞/CultiSphersTM懸浮在瓊脂糖基質中，對NGF分泌幾乎沒有或沒有影響(圖3，圖注瓊脂糖-008，瓊脂糖-0709)。實施例11-用肽衍生物控制細胞數(shù)目和細胞分布在本實施例中，用PEO-PDMS，聚(d-賴氨酸)或PepTite 2000TM(一種市售的細胞粘附蛋白質)修飾BAO的腔表面。
在該研究中，使用幼倉鼠腎(BHK)細胞，因為它們是錨依賴性細胞，而且以前已經(jīng)表明粘附于空纖維膜。纖維基本上按實施例2所述制備單層PAN/PVC BAP。纖維的大小為625μM ID，50μM壁厚。通過將這些纖維浸在70％乙醇中過夜而進行消毒，然后重復用HBSS漂洗。衍生作用1 PDMS-PEO如下用PDMS-PEO衍生BAO。用去離子水，通過將1ml PEO-PDMS稀釋到100ml來制備1％PEO-PDMS(從Huls購買，PSO73，MW＝3126g/摩爾；82重％PEO)溶液。在注射到無菌膜之前，將溶液過濾(0.2μm)滅菌。在1％PEO-PDMS水溶液中，于室溫將所述膜浸24小時。在注射細胞前，用水(3次)和HBSS漂洗纖維。
2PdL如下用聚(d-賴氨酸)衍生BAO。在2mg/ml的分子量為67000的聚(d-賴氨酸)的水溶液中，于室溫將纖維浸24小時。在注射細胞前，用水將纖維漂洗3次，然后用HBSS洗3次。
3 PepTide 2000TM如下用PepTide 2000TM衍生BAO。在預先溶解在乙醇中的100mg/ml PepTide 2000TMPBS溶液中浸纖維。在室溫將所述纖維浸24小時，然后在注射細胞前，用PBS漂洗3次。
4 PAN/PVC在注射細胞前，在室溫用HBSS將對照纖維浸24小時。細胞將BHK細胞以5000細胞/ul的濃度負載到衍生的纖維中。密封纖維，然后將其放在含無血清培養(yǎng)基(PC1培養(yǎng)基)的螺旋帽試管中，在37℃的保溫箱中，在一旋轉盤上放2星期。所述盤的速度為2rpm。在適宜的時間，用4％對甲醛固定纖維，用梯度乙醇脫水，用蘇木精和曙紅(H&E)染色，用四氧化鋨進行細胞分布的組織學分析。
正如用四氧化鋨染色確定的，當用聚(d-賴氨酸)衍生時，PAN/PVC衍生的膜有良好的細胞分布，當用PepTide 2000時，細胞分布更均勻。
對于PAN/PVC膜，用兩種方法進行PepTide 2000TM改性。第一種，只改性膜的內(nèi)腔表面，第二種，處理內(nèi)腔表面和外表面。分析空BAO(即無細胞)的總氨基酸以確定聚(d-賴氨酸)和PepTide 2000TM的結合。與對照未改性膜結合的總氨基酸為約0.2ug/BAO。對于改性的內(nèi)腔表面膜，與聚(d-賴氨酸)-改性的膜結合的總氨基酸為約0.8ug/BAO，而對于內(nèi)腔表面和外表面均改性的膜來說，為約2.6ug/BAO。將用BHK細胞負載的相似BAO保持14天，然后進行組織學檢測。在對照未改性BAO中，細胞在纖維全長上，以大簇不均勻地分布。相反，在兩種改性的纖維中，細胞沿膜的腔表面均勻分布。
這些結果表明，聚(d-賴氨酸)和PepTide 2000TM在促進細胞附著于BAO腔表面方面是有效的，因此，對于控制BAO內(nèi)的細胞分布是有效的。實施例12-用ECM負載控制神經(jīng)球的生長基本上按實施例1制備71代神經(jīng)球。用0.5％瓊脂糖(Sea-PrepTM)預包被多孔平皿以使神經(jīng)球不附著在塑料平皿上。將細胞以約50000個細胞/孔的密度鋪在設計用來試驗的基質中。每種基質條件用三個孔；其中兩個孔含PC-1培養(yǎng)基(對照)，一個含神經(jīng)球+EGF培養(yǎng)基(EGF)。
評價只有皮衍生的I型膠原蛋白(ZydastTM；(CollagenBiomedical，Palo Alto))，腱衍生的I型膠原蛋白(OrganogenesisTM)，I型膠原蛋白(VitrogenTM，Celtrix，Santa Clara)和瓊脂糖，或與層粘連蛋白或PepTide 2000TM結合，或同時結合兩者在控制細胞生長方面的有效性。
在4和14天，用熒光素二乙酸鹽/propidium碘化物(FDA/PI)染色檢測細胞，評價細胞的活力，生長和分化。暴露于OrganogenesisTM膠原蛋白，PepTide 2000TM和層粘連蛋白組合的細胞表明，分化量最高，約90％的細胞進行了分化。約80％暴露于瓊脂糖，PepTide 2000TM和層粘連蛋白組合的細胞進行了分化。實施例13-用惰性支架控制BHK細胞在BAO中的數(shù)目和細胞分布使用兩種類型的PAN/PVC纖維(基本上按實施例2所述)有選擇性滲透膜的單層纖維在外表面，有選擇性膜的單層纖維在內(nèi)表面。
首先，將PAN/PVC纖維去甘油處理，通過浸在70％無菌過濾乙醇中過夜而將其消毒。然后用無菌水在約1-2小時內(nèi)將纖維漂洗三次。
其次，通過將1.5gPHEMA溶解在10ml 95％乙醇(190proof，Quantum)中制備濃度為15％的聚(羥乙基異丁烯酸酯)(“PHEMA”)支架基質。另外，通過將1.0gPHEMA溶解在10ml 95％乙醇中制備濃度為10％的聚(羥乙基異丁烯酸酯-共-甲基異丁烯酸酯)(“ PHEMA/MMA”)支架基質。為了更容易溶解聚合物，攪拌并加熱溶液。
用針管將PHEMA或PHEMA/MMA溶液負載到PAN/PVC纖維中，然后將其浸入無菌水中。將負載的纖維在水中放1小時以上以確保支架沉淀和乙醇從核中擴散出來。切掉纖維的末端，因為它們經(jīng)常塞滿了PHEMA或PHEMA/MMA。將所述纖維轉移到含無菌HBSS的平皿中。用這種方法制備用PHEMA，PHEMA/MMA負載的BAO和對照BAO。
使分泌NGF的BHK細胞(實施例7中所述的)在含谷氨酰胺的10％DMEM中生長，然后加入抗生素。用0.25％胰酶將細胞緩慢拖出燒瓶，洗滌，以1×107細胞/ml的密度重懸在PC1培養(yǎng)基中。
用22號Teflon導管，以10000細胞/ul的密度將BHK-NGF細胞負載到纖維中。熱擠壓密封BAO。
每中類型各制備5個BAO。四個放在含1ml PC-1培養(yǎng)基的24孔平板中。第五個放在垂直試管的約3-4ml PC-1培養(yǎng)基中。24小時后，將放在垂直試管中的BAO沿腔(縱向交叉切)切開，24小時后，通過熒光素二乙酸酯/propidium碘化物(FDA/PI)染色分析纖維內(nèi)的細胞分布。在熒光顯微鏡下觀察時，F(xiàn)DA染色的活細胞是綠的，PI染色的非活細胞是紅的。
將剩余的BAO再培養(yǎng)2星期。被囊后，將BAO在O2中保持4天，然后在研究期間保持在低O2水平(50mmHg)。
在4，7和14天后測量NGF分泌(用ELISA)來檢測BHK-NGF細胞的功能性。在研究期間，含BAO含PHEMA或PHEMA/MMA支架的BAO繼續(xù)分泌NGF。組織學和NGF釋放數(shù)據(jù)均表明PHEMA和PHEMA-MMA支架可以保持沿BAO分布的有功能活性的活細胞。用10％PHEMA-MMA支架試驗的結果最好。實施例14-用惰性支架控制BAO中PC12A細胞的數(shù)目和細胞分布評價PHEMA和PHEMA/MMA惰性支架在控制BAO中PC12分布方面的效力。
基本上按實施例2所述制備單層纖維。這些纖維通常有下列特征ID642μm，OD為787μm，壁厚68μm，排斥系數(shù)100％(BSA)，水合滲透性22ml//m2/mmHg。
基本上按實施例13所述用這些纖維制備惰性PHEMA和PHEMA/MMA支架。
將在HL-1培養(yǎng)基中的PC12A細胞(1×107細胞/ml)注射到纖維腔中，將纖維加熱密封以得到約1cm長的BAO。在37℃常壓，將所述裝置放在HL-1培養(yǎng)基中。為了評價被囊細胞的功能性，檢測在1，14和28天BAO釋放的基礎的和K+-引發(fā)的兒茶酚胺。在圖4A和5A(基礎釋放)和圖4B和5B(K+-引發(fā)釋放)中列出了結果。這些結果表明，正如有兒茶酚胺釋放所測量的，被囊在含有惰性PHEMA和PHEMA/MMA支架之BAO中的PC12細胞保持了其功能性。
在5小時和4天后，通過垂直切割一半的纖維，然后用FDA/PI染色來評價在BAO中的細胞分布。這些結果表明PHEMA和PHEMA/MMA支架是無毒的，而且支持PC12細胞的細胞存活和功能性。實施例15-用NWPF促進BAO中的細胞粘附和分化試驗六種NWPF(Reemay，Tennessee)#2470，#2295，#2024，#2055，#2033，#2250(Reemay #s)。接受的織物是平片形式將圓片打孔以嵌在24孔平板中。將NWPF圓片在1％十二烷基磺酸鈉(SDS)，w/v中浸6小時，然后用水漂洗(3次)。接著將圓片在1％硫酸(v/vH2O中)浸13小時(過夜)，然后用水漂洗3次。將圓片在紙巾上干燥，然后高溫高壓消毒。
用3種類型的細胞培養(yǎng)圓片以檢測細胞粘附BHK，AT-3和TSA細胞。將約100000個細胞加到在PC1培養(yǎng)基中含上述6種之一之NWPF的24孔平板中。用無血清培養(yǎng)基檢測細胞粘附，沒有血清的干擾(除TSA細胞外)。4天后，用PDA/PI檢測BHK和AT-3細胞的粘附。細胞有延長的形態(tài)，而且粘附在Reemay#2250和#2055上。在10天，BHK在#2250上生長最好。AT-3細胞與2020和2295粘附最好。在10天時，AT-3細胞在2024上生長最好。當在#2250，#2055上生長時，1天后，TSA細胞(在10％FCS中)有延長的形態(tài)，而在#2024上生長最好。在7天時，TSA細胞在#2055上生長最好。買施例16-在懸浮于基質材料中的微載體上的SV40/DβH-NGF細胞用多巴胺β-羥化酶(DβH)基因(Hoyle etal.，J.Neurosci.，14，pp.2455-63(1994))指導轉基因小鼠中SV40 T-抗原(tsa 58)(DβH-SV)和人生長因子(DβH-hNF)的共表達。嵌合基因的共表達導致在腎上腺髓質和去腎上腺交感神經(jīng)節(jié)中產(chǎn)生腫瘤。切下這些小鼠一只中腹腔區(qū)的腫瘤，將腫瘤組織機械溶解，然后放在細胞培養(yǎng)基(DMEM，10％FBS，37℃，5％CO2)中。在開始培養(yǎng)期，有兩種不同的細胞類型，大而平的成纖維細胞樣細胞和有延長的軸突突起的小而亮的細胞。小細胞表現(xiàn)出兒茶酚胺(catecholaminergic)能神經(jīng)元的特征，包括對神經(jīng)絲-L和-M以及酪氨酸羥化酶的免疫反應性。在這些細胞中也存在對SV 40 T抗原的免疫反應性，成纖維細胞樣細胞相反，它們對這些標記是陰性的。將這些細胞每星期傳代。
按實施例10所述使細胞在CultiSphersTM上生長，然后將其懸浮在藻酸鹽(1.5％)或瓊脂糖(1％)基質中。在藻酸鹽基質的情況下，在被囊后，通過將裝置在1％氯化鈣水溶液中浸5分鐘而交聯(lián)藻酸鹽。按實施例10中所述將細胞/CultiSphersTM/基質負載到PAN/PVC空纖維中。
將負載細胞的BAO保持在無血清培養(yǎng)基中。以選定的時間間隔，在于HBSS中保溫30分鐘前，洗滌裝置。收集基礎培養(yǎng)基，用HPLC-ED進行L-多巴檢測。在體外80天時，所述裝置繼續(xù)分泌L-多巴。實施例17-遺傳修飾的成肌細胞在分化后分泌NGF小鼠C2C12成肌細胞的優(yōu)點在于是迅速分裂的細胞，在體外可以大量生長，將其轉移以表達蛋白質并可分離所選的克隆。在暴露于含少量血清的培養(yǎng)基后，小鼠C2C12細胞可分化到有絲分裂后狀態(tài)。因此有利于將這些細胞與其組織不受控制的正在分裂的細胞進行被囊比較--后者繼續(xù)分裂直到它們充滿了被膜，而且在數(shù)月后觀察到碎片的積累。
我們檢測了轉染的C2C12成肌細胞系在融合成肌小管后繼續(xù)分泌hNGF的能力。
按制造商的說明，用Lipofectamine試劑(脂質轉染胺試劑)(Gibco)，用hNGF基因轉染C2C12成肌細胞(ATCC)。在1mg G418中將細胞篩選2周，然后檢測NGF輸出。將細胞以約260細胞/cm2鋪在帶或不帶蓋片的T75燒瓶和24孔平板中。用DMEM和10％FBS每周給細胞補充兩次。在1，5，8和13天收集細胞，并測量NGF分泌。在表2中列出了結果。表2對NGF分泌的C2C12篩選的時間表細胞系分泌培養(yǎng)時間％匯合％融合NGF
親本第一天250nt3/23/95+NGF第一天250nt3/23/95親本第5天 400nt+NGF第5天 300nt親本第8天 985***+NGF第8天 901 0.0018親本第13天1000 80 ND+NGF第13天100 50 0.014％融合＝形成肌小管的成肌細胞％“+NGF指用hNGF基因轉染的C2C12”“親本”指未轉染的C2C12細胞以pg/ml/細胞/24小時測量NGF分泌nt＝未試驗ND＝未檢測*天8細胞在增大，制備用于融合*天8在培養(yǎng)皿中不在T燒瓶中更融合(在燒瓶中完成流式細胞計數(shù))這些結果表明在終止分化成肌小管后，轉染的成肌細胞繼續(xù)分泌所需的異源產(chǎn)物，即NGF。實施例18-遺傳修飾的成肌細胞在分化后分泌CNTF我們用含人CNTF基因的pNUT表達載體(Baetge etal.，proc.Natl.Acad.Sci.USA，83，pp.5454-58(1986))轉染小鼠C2C12成肌細胞。用Northern印跡，ELISA試驗，和對胚胎脊髓運動神經(jīng)元培養(yǎng)物的ChAT活性分析hCNTF基因表達水平和所述因子的生物活性。發(fā)現(xiàn)一個C2C12克隆分泌約0.2g NCTF/10個細胞/天。在C2C12成肌細胞分化后，hCNTF的分泌率并未改變。最后，C2C12-hCNTF可以從axotomy-誘導的細胞死亡中救活運動神經(jīng)元。axotomy1周后，面(facial)核新生率的形態(tài)學研究表明，在對照動物中只保持了13.4％的面部運動神經(jīng)元，而hCNTF的連續(xù)釋放可使運動神經(jīng)元的存活率為22.7％。
序列表(1)總的信息(i)申請人Cytotherapeutics，Inc.(ii)發(fā)明題目對在生物人工器官中被囊細胞的生長控制(iii)序列個數(shù)4(iv)相應地址(A)地址James F.Haley，Jr.，F(xiàn)ISH & NEAVE(B)街道1251 Ave.of the Americas(C)城市New York(D)州New York(E)國家USA(F)郵編10020-1104(V)計算機閱讀形式(A)界面類型Floppy桌面(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)本發(fā)明數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(vii)優(yōu)先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S 08/279,773(B)申請日20-JULY-1994(C)申請?zhí)朥S 08/432,698(D)申請日09-MAY-1995(viii)律師/代理人信息(A)姓名Haley Jr.，James F.(B)登記號27，794(C)對照/卷號CTI-22 CIP PCT(ix)通訊信息(A)電話(212)596-9000(B)傳真(212)596-9090(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈類單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(xi)序列說明SEQ ID NO1cys Asp Pro Gly Tyr Ile Gly Ser Arg1 5(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長度6個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈類單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(xi)序列說明SEQ ID NO2Gly Arg Gly Asp Ser Pro1 5(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)長度19個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈類單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(xi)序列說明SEQ ID NO3Cys Ser Arg Ala Arg Lys Gln Ala Ala Ser Ile Lys Val Ala Val Ser Ala Asp1 510 15Arg(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈類單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(xi)序列說明SEQ ID NO4Gly Gly Gly Gly Gly1 5
權利要求書按照條約第19條的修改32 用重組DNA分子轉化的細胞，所述DNA分子含有a)在表達時能夠誘導細胞分裂的增殖-促進基因，b)與增殖-促進基因可操縱相連的Mx-1啟動子，其中通過暴露于足以表達增殖-促進基因量的干擾素，可誘導所述細胞增殖。
33 權利要求32的細胞，其中所述增殖-促進基因是SV40大T抗原。
34 權利要求32的細胞其中所述細胞衍生于神經(jīng)干細胞。
35 權利要求32的細胞其中所述細胞分泌生物活性分子。
36 權利要求35的細胞其中用含有編碼生物活性分子之基因的表達載體遺傳轉化所述細胞。
37 權利要求35或36的細胞，其中所述生物活性分子選自神經(jīng)遞質，激素，細胞因子，生長因子，營養(yǎng)因子，淋巴因子，血管生成因子，抗體，血管凝集因子和酶。
38 用重組DNA分子轉化的轉基因哺乳動物，所述DNA分子含有a)在表達時能夠誘導細胞分裂的增殖-促進基因，b)與增殖-促進基因可操縱相連的Mx-1啟動子。
39 權利要求38的轉基因哺乳動物，其中所述增殖-促進基因是SV40大T抗原。
40 權利要求38之轉基因哺乳動物的后代。
41 從權利要求38或40的轉基因哺乳動物分離的細胞。
42 權利要求41的細胞，其中所述細胞是神經(jīng)干細胞。
43 生產(chǎn)條件性不死之細胞的方法，包括如下步驟a)用重組DNA分子轉化的細胞，其包括在表達時能夠誘導細胞分裂的增殖-促進基因，及與增殖-促進基因可操縱相連的Mx-1啟動子，以便通過暴露于足以表達增殖-促進基因量的干擾素，可誘導所述轉化細胞增殖；b)培養(yǎng)所述轉化細胞。
權利要求
1 在生物人工器官中控制細胞分布的方法，包括將所述細胞暴露于抑制細胞增殖或促進細胞分化的處理，所述處理在植入宿主體內(nèi)后是有效的。
2 根據(jù)權利要求1的方法，其中所述處理包括用與可調(diào)節(jié)啟動子可操縱相連的促進增殖的基因轉化細胞以便在植入宿主體內(nèi)后可以抑制增殖促進基因的表達。
3 根據(jù)權利要求2的方法，其中所述增殖促進基因是癌基因。
4 根據(jù)權利要求3的方法，其中所述癌基因選自c-myc，v-mos，v-Ha-ras，SV40早期區(qū)和E1-A。
5 根據(jù)權利要求2的方法，其中，所述可調(diào)節(jié)啟動子選自四環(huán)素-反應性啟動子，干擾素-反應性啟動子，糖皮質激素-反應性啟動子和反轉錄病毒長末端重復啟動子。
6 根據(jù)權利要求5的方法，其中所述啟動子是Mx1啟動子，而增殖-促進基因是SV40早期區(qū)。
7 根據(jù)權利要求1的方法，其中，所述處理包括用與可調(diào)節(jié)啟動子操縱相連的增殖-抑制基因轉化細胞以便在植入宿主體內(nèi)后表達增殖-抑制基因，但在體外受到抑制。
8 根據(jù)權利要求7的方法，其中所述增殖-抑制基因是選自p53基因和RB基因的腫瘤抑制基因。
9 根據(jù)權利要求1的方法，其中所述處理包括用與可調(diào)節(jié)啟動子操縱相連的分化-誘導基因轉化細胞以便在植入宿主體內(nèi)后表達分化-誘導基因，但在體外受到抑制。
10 根據(jù)權利要求9的方法，其中所述分化-誘導基因是高遷移率的染色體蛋白質14。
11 根據(jù)權利要求1的方法，其中所述處理包括將細胞暴露于增殖-抑制化合物或分化-誘導化合物。
12 根據(jù)權利要求11的方法，其中增殖-抑制化合物或分化-誘導化合物選自佛波醇酯，肝素，TGF-β，抗壞血酸，分裂素，brdU，PGE1，dbcAMP，Ara-C，煙酰胺和SGP。
13 根據(jù)權利要求1的方法，其中所述處理包括從暴露于增殖-刺激化合物或分化-抑制化合物中取出細胞。
14 根據(jù)權利要求13的方法，其中增殖-刺激化合物或分化-抑制化合物選自EGF，TGF-α和雙調(diào)蛋白，所述細胞是神經(jīng)干細胞。
15 根據(jù)權利要求13的方法，其中增殖-刺激化合物或分化-抑制化合物是FGF生長因子家族成員和至少CNTF或NGF生長因子家族中一個成員的混合物，所述細胞是神經(jīng)干細胞。
16 根據(jù)權利要求13的方法，其中增殖-刺激化合物或分化-抑制化合物是多譜系生長因子，所述細胞是造血干細胞。
17 在生物人工器官中控制細胞分布的方法，包括將所述人工器官的至少一個生長表面暴露于抑制細胞增殖或促進細胞分化的處理，所述處理在植入宿主體內(nèi)后是有效的。
18 根據(jù)權利要求17的方法，其中所述處理包括用有效量的至少一種細胞外基質分子包被生長表面。
19 根據(jù)權利要求18的方法，其中用細胞外基質分子包被的生長表面包括生物人工器官的內(nèi)腔表面。
20 根據(jù)權利要求18的方法，其中用細胞外基質分子包被的生長表面包括生物人工器官內(nèi)被囊的微載體。
21 根據(jù)權利要求1的方法，其中所述處理包括將細胞懸浮在生物人工器官內(nèi)的水凝膠基質中，所述基質是用增殖-抑制或分化-誘導肽或肽序列衍生的。
22 根據(jù)權利要求21的方法，其中所述水凝膠基質是由肽序列衍生的瓊脂糖組成，所述肽序列選自含RGD的序列(ArgGlyAsp；SEQ ID NO2的AA2-AA4)，含YIGSR的序列(TyrIleGlySerArg；SEQ ID NO1的AA5-AA9)，含IKVAV的序列(IleLysValAlaVal；SEQ ID NO3的A11-AA15)。
23 根據(jù)權利要求20的方法，其中將所述微載體懸浮在權利要求21-22的任一種水凝膠基質中。
24 控制生物人工器官內(nèi)細胞分布的方法，包括將生物人工器官內(nèi)的至少一個生長表面暴露于促進細胞粘附于其上的處理。
25 根據(jù)權利要求24的方法，其中所述處理包括將化合物衍生或吸附到生長表面上，所述化合物選自聚(d-賴氨酸)含RGD的序列(ArgGlyAspl；SEQ ID NO2的AA2-AA4)，含YIGSR的序列(TyrIleGlySerArg；SEQ ID NO1的AA5-AA9)，含IKVAV的序列(IleLysValAlaVal；SEQ ID NO3的A11-AA15)。
26 根據(jù)權利要求24的方法，其中所述處理包括在生物人工器官內(nèi)形成惰性支架。
27 根據(jù)權利要求26的方法，其中所述惰性支架是由選自聚(羥乙基異丁烯酸酯)和聚(羥乙基異丁烯酸酯-共-甲基異丁烯酸酯)的化合物形成的。
28 控制生物人工器官內(nèi)細胞分布的方法，包括將生物人工器官內(nèi)的至少一個生長表面暴露于抑制細胞粘附于其上的處理。
29 根據(jù)權利要求28的方法，其中所述處理包括在生長表面上衍生或吸附PEO-PDMS。
30 根據(jù)權利要求1的方法，其中所述處理包括將細胞暴露于增殖-抑制劑量的UV輻射。
31 生物人工器官包括(a)生物可相容的，選擇性滲透的套；和(b)活細胞核，其中將細胞暴露于權利要求1-30的任一處理中，以便在植入宿主體內(nèi)后可以控制生物人工器官內(nèi)的細胞分布。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過將細胞暴露于一種處理而在生物人工器官中控制細胞分布的方法和組合物，所述處理在所述生物人工器官中抑制細胞增殖，促進細胞分化或影響細胞粘附于生長表面。所述處理包括(1)遺傳操作細胞，(2)將所述細胞暴露于增殖抑制化合物或分化誘導化合物或從暴露的增殖刺激化合物或分化抑制化合物中取出所述細胞；將所述細胞暴露于輻射，和(3)用ECM分子影響細胞增殖或粘附的分子，或惰性支架，或其組合修飾BAO的生長表面?？梢越M合使用這些處理。在生物人工器官中對被囊細胞的生長控制。
文檔編號C12N15/12GK1152938SQ95194187
公開日1997年6月25日 申請日期1995年7月20日 優(yōu)先權日1994年7月20日
發(fā)明者M·施恩斯廷, M·S·舒徹特, F·T·根泰爾, J·P·哈曼格, L·M·霍蘭德, B·M·卡恩, E·J·多赫逖, S·R·溫, P·阿比舍爾, A·麥辛 申請人:細胞治療公司