專利名稱：角化細(xì)胞生長因子的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白純化領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及角化細(xì)胞生長因子純化領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
多肽生長因子是細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì)(Rubin等(1989)美國國家科學(xué)院院刊86802-806)。這些分子通常由一種細(xì)胞類型釋放，影響其它細(xì)胞類型的增殖。
生長因子的一個(gè)家族是成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)。目前已知8種FGF家族成員，它們?cè)谝患?jí)結(jié)構(gòu)上有親緣關(guān)系堿性成纖維細(xì)胞生長因子，bFGF(Abraham等(1986)，EMBO雜志，52523-2528)；酸性成纖維細(xì)胞生長因子aFGF(Jaye等(1986)，科學(xué)，233541-545)；int-2基因產(chǎn)物，int-2(Dickson和Peters(1987)，自然，326833)；hst/kFGF(Delli-Bovi等(1987)，細(xì)胞，50729-737)和Yoshida等(1987)美國國家科學(xué)院院刊847305-7309)；FGF-5(Zhan等(1988)，分子細(xì)胞生物學(xué)83487-3495)；FGF-6(Marics等(1989)，癌基因，4335-340)；角化細(xì)胞生長因子(Finch等(1989)，科學(xué)，24752-755；Rubin等(1989)，美國國家科學(xué)院院刊，86802-806；Ron等(1993)，生物化學(xué)雜志，268(4)2984-2988；和Yan等(1991)，體外細(xì)胞發(fā)育生物學(xué)27A437-438)；以及富組親動(dòng)蛋白(hisactophilin)(Habazzettl等(1992)，自然，359855-858)。
FGF家族蛋白中角化細(xì)胞生長因子(KGF)是間質(zhì)組織來源的非成纖維上皮(尤其是角化細(xì)胞)細(xì)胞增殖的專一性效應(yīng)物。術(shù)語“天然KGF”指具有SEQ ID NO2給出的氨基酸序列的天然人類(hKGF)或重組(rKGF)多肽(帶或不帶信號(hào)序列)或其等位變異體。(除非另有說明，本文描述的分子的氨基酸編號(hào)對(duì)應(yīng)SEQ ID NO2的氨基酸32至194給出的天然分子成熟形式(無信號(hào)序列)的編號(hào)。)可從天然來源分離到天然KGF。例如可從胚胎肺成纖維細(xì)胞系條件化的培養(yǎng)基中分離到hKGF(Rubin等(1989)，引文同上)。三個(gè)層析步驟，即肝素-瓊脂糖TM(Pharmacia，Piscataway，新澤西)親和層析，HPLC凝膠過濾和反相HPLC被用來獲得純化的hKGF制備物。從10升條件培養(yǎng)基中回收約6mg hKGF。根據(jù)細(xì)胞分裂素活性試驗(yàn)，這些層析步驟僅回收了0.8％的總hKGF。另一個(gè)實(shí)施例講授用另一種層析步驟，用肝素-瓊脂糖TM親和層析和Mono-STM離子交換層析(Pharmacia，Piscataway，新澤西)分離細(xì)菌生產(chǎn)的rKGF(Ron等(1993)，生物化學(xué)雜志，2682984-2988)。
角化細(xì)胞生長因子的性質(zhì)表明有可能將它用作特異性刺激上皮細(xì)胞生長的藥物。因此需要研制出一種或多種方法來得到相當(dāng)大量的均質(zhì)角化細(xì)胞生長因子，以提供足夠量的物質(zhì)用于全面的體外和體內(nèi)生物評(píng)價(jià)及用于潛在的醫(yī)療用途。
本發(fā)明的目的是提供一種新的角化細(xì)胞生長因子純化方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及角化細(xì)胞生長因子(KGF)的第一種純化方法，該方法包括a)得到含KGF的溶液；b)將來自步驟(a)溶液中的KGF與陽離子交換樹脂結(jié)合；c)用洗脫溶液從陽離子交換樹脂上洗脫KGF；d)將步驟(c)的洗脫液通過分子量排阻基質(zhì)；e)從分子量排阻基質(zhì)中回收KGF。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及角化細(xì)胞生長因子(KGF)的第二種純化方法，該方法包括a)得到含KGF的溶液；b)將來自步驟(a)溶液中的KGF與陽離子交換樹脂結(jié)合；c)用洗脫溶液從陽離子交換樹脂上洗脫KGF；d)對(duì)步驟(c)洗脫液作斥水作用層析；e)從步驟(d)的斥水作用層析中回收KGF。
一般可用適當(dāng)?shù)木彌_液(例如磷酸鹽緩沖鹽水，乙酸鈉或Tris-HCl)在優(yōu)選pH 6.8-7.5范圍進(jìn)行第一和第二種方法的陽離子交換層析步驟。用于該步驟的合適的柱子包括羧甲基纖維素，羧甲基瓊脂糖和硫酸化瓊脂糖和纖維素柱(例如S-瓊脂糖Fast FlowTM樹脂柱，Mono-STM樹脂柱和CM-纖維素柱TM脂柱，購自Pharmacia，Piscataway，新澤西)。流速依柱大小而變。
可用任意合適的緩沖液(例如磷酸鹽緩沖液，優(yōu)選pH為約7.0和7.5進(jìn)行第一種方法的凝膠過濾步驟。用于此步驟的合適柱子包括基于瓊脂糖、基于丙烯酰胺、基于二氧化硅或基于聚合物的排阻柱(例如SephadexG-75TM和Superdex-75TM樹脂柱，可購自Pharmacia)。
在第二種方法的具體優(yōu)選實(shí)施方案中，在斥水作用步驟之前可將游離巰基氧化，討論見下?？捎萌魏窝趸绞?。例如蛋白可暴露于空氣中的氧一段時(shí)間?？蛇x地用各種氧化方法。一種方法特別適用于角化細(xì)胞生長因子，其中與天然KGF分子相比，一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基缺失或被取代。該方法中將氧化劑(例如，胱胺二鹽酸鹽或其它適當(dāng)?shù)难趸瘎珉装彼?、氧化型谷胱甘肽或二價(jià)銅)加至終濃度，優(yōu)選地調(diào)pH至7-9.5之間，在用胱胺二鹽酸鹽時(shí)更優(yōu)選pH9.0±0.3，優(yōu)選地保持溫度10-30℃一段時(shí)間。氧化天然KGF或有類似半胱氨酸殘基模式(pattern)的其它角化細(xì)胞生長因子可用第二種方法。該方法中，氧化是這樣完成的加入合適量的離子強(qiáng)度修飾劑(例如(NH4)2SO4)，優(yōu)選地調(diào)pH至7.5-9.5，優(yōu)選地23±5℃適當(dāng)時(shí)間。
用合適的緩沖液(例如磷酸鈉)，pH優(yōu)選地在約6.0-8.0之間，更優(yōu)選地為約pH7.0，以2-0M的遞減線性(NH4)2SO4梯度洗脫，以完成第二種方法的斥水作用步驟。用于些步驟的適宜柱子包括烷基或苯基取代的樹脂(例如丁基-650 ToyopearlTM樹脂柱，購自Toyohaas Inc.，Montgomeryville，賓州，以及苯基瓊脂糖TM樹脂柱和苯基SuperoseTM樹脂柱，購自Pharmacia)。
本發(fā)明的方法可用于純化KGF。因此應(yīng)當(dāng)理解術(shù)語“角化細(xì)胞生長因子”和“KGF”用在本說明書中指包括，并且除非另有說明，可互換地指，天然KGF和KGF類似物蛋白(或“突變蛋白”)，KGF類似物蛋白的特征在于，其肽序列基本上與天然KGF肽序列相同并且保留天然KGF的部分或全部生物活性，尤其是非成纖維上皮細(xì)胞增殖活性(例如表現(xiàn)為激活BALB/MK角化細(xì)胞的激活比NIH/3T3成纖維細(xì)胞強(qiáng)至少500倍，BALB/MK角化細(xì)胞的激活比BS/589上皮細(xì)胞或CC1208上皮細(xì)胞的激活強(qiáng)至少50倍，由H胸苷摻入確定)?！疤卣髟谟?，其肽序列基本上與天然KGF肽序列相同”指的是能優(yōu)選地在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與SEQ ID NO1的核苷酸201至684雜交的DNA序列編碼的肽序列。
為確定兩段氨基酸序列的對(duì)應(yīng)氨基酸位置可將兩段序列并列，使殘基的匹配最大化，包括平移氨基和/或羧基端，需要時(shí)在候選物中引入間隙(gap)或去除作為插入序列的殘基?？捎靡阎页Ｒ?guī)的序列同源性/-致性掃描算法程序(例如Pearson和Lipman(1988)，美國國家科學(xué)院院刊，852444-2448；Altschul等(1990)，分子生物學(xué)雜志，215403-410；Lipman和Pearson(1985)，科學(xué)，2221435或Devereux等(1984)，核酸研究，12387-395)作數(shù)據(jù)庫檢索、序列分析和操作。
雜交時(shí)的嚴(yán)謹(jǐn)條件是雜交反應(yīng)中鹽、溫度、有機(jī)溶劑和其它典型受控參數(shù)的嚴(yán)謹(jǐn)組合條件。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的例子是在4×SSC中62-67℃雜交，然后用0.1×SSC在62-67℃洗約1小時(shí)?？蛇x地，嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的例子為在45-55％甲酰胺、4×SSC中40-45℃雜交(見T.Maniatis等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1982)，387至389頁)。
因此，蛋白包括天然KGF的片段、嵌合體或雜交分子的等位變異體或氨基酸的缺失、替換或插入。KGF的一個(gè)例子包括這樣一些蛋白，其相應(yīng)于SEQ ID NO2中的Cys1和Cys15的殘基被替換或缺失，所得分子的穩(wěn)定性比原分子高(見共有的U.S.S.N.0.8/487,825，1995年7月7日提交)。KGF的另一個(gè)例子包括電荷變化多肽，其中天然KGF的氨基酸殘基41-154中一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選的是殘基Arg41、Gln43、Lys55、Lys95、Lys128、Asn137、Gln138、Lys139、Arg144、Lys147、Gln152、Lys153或Thr154)缺失或被中性殘基或帶負(fù)電荷的殘基替換，使蛋白正電荷減少(見共有的U.S.S.N.08/323,337，1994年10月13日提交)，另一KGF的例子包括將具有高度環(huán)形成能力的至少一個(gè)氨基酸替換天然KGF的環(huán)形成區(qū)Asn115-His116-Tyr117-Asn118-Thr119中至少一個(gè)氨基酸得到的蛋白(見共有的U.S.S.N.08/327,473，1994年10月13日提交)。另一個(gè)例子包括在天然KGF的123-133區(qū)(SEQ ID NO2的氨基酸154-164)有一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、缺失或添加的蛋白；這些蛋白可能具有激動(dòng)或拮抗活性。
特別公開的蛋白包括下列KGF分子(表示的方法為SEQ ID NO2給出的成熟蛋白(無信號(hào)序列)中該位置的氨基酸，后面是括號(hào)中的該氨基酸位置，再后面是替換的殘基或用“-”表示缺失)C(1，15)S、ΔN15-ΔN24、ΔN3/C(15)S、ΔN3/C(15)-、ΔN8/C(15)S、ΔN8/C(15)-、C(1，15)S/R(144)E、C(1，15)S/R(144)Q、ΔN23/R(144)Q、C(1，15，40)S、C(1，15，102)S、C(1，15，102，106)S、ΔN23/N(137)E、ΔN23/K(139)E、ΔN23/K(139)Q、ΔN23/R(144)A、ΔN23/R(144)E、ΔN23/R(144)L、ΔN23/K(147)E、ΔN23/K(147)Q、ΔN23/K(153)E、ΔN23/K(153)Q、ΔN23/Q(152)E/K(153)E；R(144)Q和H(116)G。
本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員也應(yīng)當(dāng)理解，許多宿主-載體系統(tǒng)可用來表達(dá)KGF蛋白編碼序列。這包括但不限于真核細(xì)胞系統(tǒng)，如病毒(例如牛痘病毒、腺病毒等)感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)；病毒(如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；微生物如含有酵母載體的酵母；或原核細(xì)胞系統(tǒng)如噬菌體DNA，質(zhì)粒DNA或粘粒DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。這些載體的表達(dá)元件的強(qiáng)度和特異性不同。根據(jù)所用的宿主-載體系統(tǒng)可用許多合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件中的任一種。
一旦KGF表達(dá)的蛋白產(chǎn)物被分離、純化及檢測(cè)KGF活性(用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所知的方法)，可將其配成許多藥物組合物。典型地這些組合物含有合適的，通?；瘜W(xué)成分確定的藥劑載體或賦形劑，根據(jù)給藥所需形式，還可含有其它成分。這種組合物可含有水質(zhì)載體或由固相制劑組成，其中KGF被加入非水質(zhì)載體如膠原、透明質(zhì)酸和各種聚合物。組合物可適當(dāng)?shù)嘏渲埔员阌枚喾N途徑給藥，包括注射、口服、局部、鼻腔內(nèi)和肺部給藥。
附圖簡(jiǎn)述

圖1給出天然KGF的核苷酸(SEQ ID NO1)和氨基酸(SEQ IDNO2)序列(編碼天然KGF成熟形式的核苷酸由SEQ ID NO1的堿基201至681給出，KGF成熟形式由SEQ ID NO2的氨基酸殘基32至194給出)。
圖2A、2B和2C分別給出pCFM 1156，pCFM 1656和pCFM 3102的質(zhì)粒圖譜。
圖3給出RSH-KGF構(gòu)建體的核苷酸(SEQ ID NO3)和氨基酸(SEQ ID NO4)序列。
圖4給出包含于KGF質(zhì)粒的構(gòu)建體的核苷酸(SEQ ID NO5)和氨基酸(SEQ ID NO6)序列。
圖5給出化學(xué)合成的OLIGO(OLIGO#6至OLIGO#11；分別為SEQID NO12-17)。它們被用于在包含于KGF質(zhì)粒的構(gòu)建體中將Kpn I位點(diǎn)和EcoRI位點(diǎn)之間的DNA序列替換成Kpn I位點(diǎn)(SEQ ID NO6中的氨基酸位置46-85)，以制備KGF(dsd)中的構(gòu)建體。
圖6給出用于構(gòu)建KGF(密碼子最優(yōu)化)的化學(xué)合成OLIGO(OLIGO#12至OLIGO#24，分別為SEQ ID NO18-30)。
圖7給出在天然KGF氨基酸位置1和15用絲氨酸替換半胱氨酸的KGF類似物C(1，15)S的核苷酸(SEQ ID NO31)和氨基酸(SEQ IDNO32)序列。
圖8給出天然KGF氨基酸位置1和15的半胱氨酸被替換成絲氨酸且氨基酸位置144的精氨酸被替換成谷氨酸的KGF類似物C(1，15)S/R(144)E的核苷酸(SEQ ID NO33)和氨基酸(SEQ ID NO34)序列。
圖9給出天然KGF氨基酸位置1和15的半胱氨酸被替換成絲氨酸且氨基酸位置144的精氨酸被替換成谷酰胺的KGF類似物C(1，15)S/R(144)Q的核苷酸(SEQ ID NO35)和氨基酸(SEQ ID NO36)序列。
圖10給出天然KGF N末端前15個(gè)氨基酸缺失的KGF類似物ΔN15的核苷酸(SEQ ID NO37)和氨基酸(SEQ ID NO38)序列。
圖11給出天然KGF N末端前23個(gè)氨基酸缺失的KGF類似物ΔN23的核苷酸(SEQ ID NO39)和氨基酸(SEQ ID NO40)序列。
圖12給出天然KGF N末端前23個(gè)氨基酸缺失且氨基酸位置144的精氨酸被替換成谷酰胺的KGF類似物ΔN23/R(144)Q的核苷酸(SEQ ID NO41)和氨基酸(SEQ ID NO42)序列。
實(shí)施例下列實(shí)施例描述的許多操作規(guī)程的標(biāo)準(zhǔn)方法或合適的可選操作規(guī)程，由常見的分子生物學(xué)手冊(cè)提供，如《分子克隆》第二版，Sambrook等，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1987)和《分子生物學(xué)當(dāng)代操作方法》Ausabel等，Green出版附屬機(jī)構(gòu)/Wiley交叉科學(xué)，紐約(1990)。實(shí)施例1制備編碼KGF和KGF類似物的DNA通過動(dòng)物細(xì)胞RNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和化學(xué)合成的(大腸桿菌最優(yōu)化密碼子)寡聚核苷酸(“OLIGO”)的PCR克隆全長人類KGF基因(編碼具有天然KGF序列的多肽)。兩種方法的描述如下用從已知生產(chǎn)該多肽的細(xì)胞中分離的RNA作PCR擴(kuò)增。首先用硫氰胍破碎人類成纖維細(xì)胞系A(chǔ)G1523A(得自醫(yī)學(xué)研究用人類遺傳變異細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，Camden，新澤西)細(xì)胞，然后提取(根據(jù)Chomyzinski等(1987)，生化年刊，172156的方法)。用總RNA的標(biāo)準(zhǔn)逆轉(zhuǎn)錄酶操作方法生成KGF cDNA。用KGF cDNA作模板，引物OLIGO#1和OLIGO#2編碼KGF基因5′和3′的DNA序列，進(jìn)行KGF基因的PCR(PCR#1)擴(kuò)增(9600型熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，康涅迪格)；28個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)為94℃變性1分鐘，60℃退火2分鐘，72℃延長3分鐘)。PCR#1產(chǎn)物的等分試樣用作第二輪KGF PCR(PCR#2)擴(kuò)增的模板，擴(kuò)增條件同上，僅是退火溫度為50℃。對(duì)KGF基因的表達(dá)克隆用嵌套PCR引物制造KGF基因兩端的方便的限制位點(diǎn)。用OLIGO#3和OLIGO#4修飾PCR#2的DNA產(chǎn)物，在基因的5′和3′端分別引入MluI和Bam HI限制位點(diǎn)(PCR#3，30個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)包括94℃變性1分鐘，60℃退火2分鐘，72℃延長3分鐘)。然后將DNA用MluI和Bam HI切割，酚抽提，乙醇沉淀。再重懸并(用T4連接酶)連接到含“RSH”信號(hào)序列的序列的pCFM1156質(zhì)粒中(圖2A)得到RSH-KGF構(gòu)建體(圖3)。
連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化(根據(jù)Hanahan(1983)，分子生物學(xué)雜志，166557的方法)大腸桿菌FM5菌株(ATCC53911)，在LB+卡那霉素上28℃鋪平板。選幾個(gè)轉(zhuǎn)化體，在含20μg/ml卡那霉素的小量液體培養(yǎng)物中生長。從每種培養(yǎng)物的細(xì)胞中分離RSH-KGF質(zhì)粒，進(jìn)行DNA測(cè)序。由于KGF基因內(nèi)在的Nde I位點(diǎn)不可能將天然基因序列直接克隆到含有括號(hào)內(nèi)的NdelI和Bam HI限制位點(diǎn)的所需表達(dá)載體中。用三步(three-way)連接可以做到。在專一的Bsm I和Sst I限制位點(diǎn)切割RSH-KGF質(zhì)粒，用1％瓊脂糖凝膠電泳后分離到～3kbp的DNA片段(含有KGF基因的3′端)。進(jìn)行PCR(PCR#4)，如進(jìn)行PCR#3時(shí)所述但將OLIGO#3換成OLIGO#5。然后用Nde I和Bsm I切割PCR DNA產(chǎn)物，4％瓊脂糖凝膠電泳后分離到311bp的DNA片段。連接用的第三段是pCFM1156用NdeI和Sst I切割后1％瓊脂糖凝膠電泳分離的1.8kbpDNA片段。如上述連接(T4連接酶)、轉(zhuǎn)化、卡那霉素篩選和DNA測(cè)序，挑選含有圖4的構(gòu)建體和名為KGF的質(zhì)粒的克隆。由于有產(chǎn)生截短產(chǎn)物的內(nèi)在核糖體結(jié)合位點(diǎn)，用嵌合合成的OLIGO(OLIGO#6至OLIGO#11)取代專一性Kpn I和EcoR I位點(diǎn)間的KGF DNA序列以最少使用內(nèi)在起始位點(diǎn)(圖5)。
OLIGO#1 (SEQID NO7)5′-CAATGACCTAGGAGTAACAATCAAC-3′OLIGO#2 (SEQID NO8)5′-AAAACAAACATAAATGCACAAGTCCA-3′OLIGO#3 (SEQID NO9)5′-ACAACGCGTGCAATGACATGACTCCA-3′OLIGO#4 (SEQID NO10)5′-ACAGGATCCTATTAAGTTATTGCCATAGGAA-3′OLIGO#5 (SEQID NO11)5′-ACACATATGTGCAATGACATGACTCCA-3′OLIGO#6 (SEQID NO12)5′-CTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCC-3′OLIGO#7 (SEQID NO13)5′-AAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTT-3′OLIGO#8 (SEQID NO14)5′-GCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTG-3′OLIGO#9 (SEQID NO15)5′-TCTTGGGTGCCCTTGACTTTGCCGCGTTTGTCGATACGCAGGTAC-3′OLIGO#10 (SEQID NO16)5 ′-ACAGCAACAGTACGGATTTCCATAATATTGTAGTTGTTTTTCATC-3′OLIGO#11 (SEQID NO17)5′-AATTCAGATTCAACACCTTTGATTGCAACGATACCA-3′OLIGO用T4多聚核苷酸激酶磷酸化，再熱變性。溫度緩慢降至室溫使單鏈(ss)OLIGO形成雙鏈DNA片段。用T4連接酶將內(nèi)在OLIGO粘末端和整個(gè)雙鏈OLIGO片段共價(jià)連接到Kpn I和EcoR I切割的KGF質(zhì)粒上。將新質(zhì)粒命名為KGF(dsd)。
用PCR擴(kuò)增化學(xué)合成的OLIGO#12至24，構(gòu)建完整的大腸桿菌密碼子最優(yōu)化的KGF基因。OLIGO#12 (SEQID NO18)5′-AGTTTTGATCTAGAAGGAGG-3′OLIGO#13 (SEQID NO19)5′-TCAAAACTGGATCCTATTAA-3′OLIGO#14 (SEQID NO20)5′-AGTTTTGATCTAGAAGGAGGAATAACATATGTGCAACGACATGAC-TCCGGAACAGATGGCTACCAACGTTAACTGCTCCAGCCCGGAACGT-3′OLIGO#15 (SEQID NO21)5′-CACACCCGTAGCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGTGTTC-GTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAA-3′OLIGO#16 (SEQID NO22)
5′-CGTGGTAAAGTTAAAGGTACCCAGGAAATGAAAAACAACTA-CAACATCATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAA-3′OLIGO#17(SEQ ID NO23)5′-GGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAAC-TGTACGCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAA-3′OLIGO#18(SEQ ID NO24)5 ′-CTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGA-CCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGT-3′OLIGO#19(SEQID NO25)5′-ATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCT-CACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAATAGGATCCAGTTTTGA-3′OLIGO#20(SEQ ID NO26)5′-TACGGGTGTGACGTTCCGGG-3′OLIGO#21(SEQ ID NO27)5′-CTTTACCACGTTTGTCGATA-3′OLIGO#22(SEQ ID NO28)5′-ATTCAACACCTTTGATTGCA-3′OLIGO#23(SEQ ID NO29)5′-CCAGGATCAGTTCTTTGAAG-3′OLIGO#24(SEQ ID NO30)5′-GAACCGGGATACCTTTCTGG-3′OLIGO#12至24被設(shè)計(jì)成無論是“Watson”還是“Crick”鏈編碼天然KGF的整個(gè)DNA序列均由OLIGO表示，經(jīng)PCR擴(kuò)增能生產(chǎn)出需要的雙鏈DNA序列(圖6)(PCR#5，9600型熱循環(huán)儀，Perkin-ElmerCetus；21個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)包括94℃變性31秒，50℃退火31秒，73℃延伸31秒；21個(gè)循環(huán)完成后最后延伸7分鐘終止PCR)。PCR擴(kuò)增后用Xba I和Bam HI切割DNA片段，將521bp片段連接到用相同酶切割的表達(dá)質(zhì)粒pCFM1156中。PCR#5用外在引物(100pmol/100μlrxn)OLIGO#12和OLIGO#13，1μl/100μl rxn的由連接(T4連接酶)OLIGO#14至OLIGO#19(OLIGO#15至OLIGO#18用T4多聚核苷酸激酶磷酸化)并且OLIGO#20至OLIGO#24作連接的band-aid寡聚核苷酸(Jayaraman等(1992)，生物技術(shù)12∶392)得到的KGF模板。最終的構(gòu)建體稱為KGF(密碼子最優(yōu)化)。
所有本文描述的KGF類似物部分地由見于KGF(dsd)或KGF(密碼子最優(yōu)化)或二者組合的DNA序列組成。在編碼用一種或多種上述DNA片段合成技術(shù)制得的特定KGF氨基酸的DNA序列中方便的限制位點(diǎn)插入序列以進(jìn)一步修飾這些序列。用上述技術(shù)可合成任一全部上述類似物。不過，作為一般OLIGO設(shè)計(jì)的一部分，適當(dāng)時(shí)用最優(yōu)化的大腸桿菌密碼子，盡管在受檢查的任一基因中部分或全部為大腸桿菌優(yōu)化密碼子并不會(huì)顯著增大從培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞中得到的蛋白的產(chǎn)率。圖7到12用合適的例子給出如下特定KGF類似物的核苷酸和氨基酸序列構(gòu)建體C(1，15)S(圖7)；C(1，15)S/R(144)E(圖8)；C(1，15)S/R(144)Q(圖9)；ΔN15(圖10)；ΔN23(圖11)和ΔN23/R(144)Q(圖12)。本文描述的所有KGF類似物構(gòu)建體均由DNA序列證實(shí)。實(shí)施例2從大腸桿菌中純化用三種不同的表達(dá)質(zhì)?？寺GF類似物基因，即pCFM1156(ATCC#69702)，pCFM1656(ATCC#69576)和pCFM 3102(分別為圖2A，2B和2C)。通過用PCR重疊寡聚物誘變作一系列定點(diǎn)堿基變化可從pCFM1156質(zhì)粒得到p3 102質(zhì)粒。從質(zhì)粒復(fù)制啟動(dòng)子PcopB緊鄰5′的Bgl III位點(diǎn)(pCFM1656質(zhì)粒bP#180)開始前進(jìn)至質(zhì)粒復(fù)制基因，堿基對(duì)變化如下pCFM1656 bp# pCFM1656中的堿基對(duì) 在pCFM3102中堿基對(duì)變成# 204T/A C/G# 428A/T G/C# 509G/C A/T# 617-- 插入2個(gè)G/C堿基對(duì)# 677G/C T/A# 978T/A C/G# 992G/C A/T# 1002 A/T C/G# 1005 C/G T/A# 1026 A/T T/A# 1045 C/G T/A# 1176 G/C T/A# 1464 G/C T/A# 2026 G/C 堿基對(duì)缺失# 2186 C/G T/A# 2479 A/T T/A# 2498-2501 AGTGGTCA
TCACCAGT# 2641-2647 TCCGAGC 堿基對(duì)缺失AGGCTCG# 3441 G/C A/T# 3452 G/C A/T# 3649 A/T T/A# 4556 -- 插入的堿基對(duì)(SEQ ID NO67)5′-GAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAG-3′(SEQ ID NO68)3′-CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC-5′從上可見pCFM1156，pCFM1656和pCFM3102十分相似且含有許多相同的限制位點(diǎn)。為方便起見選取了這些質(zhì)粒，以便新構(gòu)建體可簡(jiǎn)單地交換載體DNA組分。所有克隆操作均用宿主大腸桿菌菌株FM5(ATCC53911)，用Gene PulserTM轉(zhuǎn)染儀(BioRad Laboraties INC.Hercules加州)。根據(jù)生產(chǎn)商的說明用電洗脫或根據(jù)Hanahan((1983)，引文見上)的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
首先，將O.1ml適當(dāng)菌株的冷凍甘油貯存物轉(zhuǎn)移到含500ml Luria肉湯的2L燒瓶中，得到在3個(gè)pCFM載體之一含有所需構(gòu)建體的所需重組大腸桿菌克隆的小量新鮮培養(yǎng)接種物。30℃振蕩培養(yǎng)16小時(shí)，然后將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含8L無菌分批培養(yǎng)基的15L發(fā)酵罐中(Tsai等(1987)，工業(yè)微生物學(xué)雜志2181-187)。
從用投料#1培養(yǎng)基送料開始批量送料發(fā)酵(Tsai等(1987)，引文見上)。OD600達(dá)到35時(shí)，迅速將培養(yǎng)物溫度升至37℃以擴(kuò)增質(zhì)粒。37℃兩小時(shí)后，將培養(yǎng)物的溫度迅速升至使CI阻遏物變性。停加投料1，改加投料2，開始送料的速率為300ml/小時(shí)。投料2含有175g/L胰蛋白胨，87.5g/L酵母提取物，260g/L葡萄糖。42℃1小時(shí)后，將培養(yǎng)物溫度降至36℃，保溫6小時(shí)。
然后終止發(fā)酵，通過離心至1L離心管中的塑料袋里收集細(xì)胞。400rpm離心60分鐘得細(xì)胞沉淀，除去上清，-90℃冰凍細(xì)胞糊狀物。
各種KGF類似物在大腸桿菌中表達(dá)后，用下述方法純化天然KGF、C(1，15)S、C(1，15)S/R(144)E、C(1，15)S/R(144)Q、ΔN15、ΔN23和ΔN23/R(144)Q。高細(xì)胞密度發(fā)酵得到的細(xì)胞糊懸浮于4℃O.2M NaCl，20mM NaPO4、pH7.5中得10-20％溶液(重量/體積)，用合適的高剪切混合器完成。然后將溶液通過勻漿器(APV Gaulin，Inc.Everett，麻省)三次裂解懸浮細(xì)胞。用合適的熱交換裝置將流出的勻漿冷卻至4-8℃。用J-6BTM離心機(jī)(Beckman儀器公司，Brea，加州)，JS4.2轉(zhuǎn)頭，4200 rpm 4℃離心30-60分鐘除去裂解物中的殘片。然后將上清小心地脫水，上樣到預(yù)先制好的4℃0.2M NaCl，20mM NaPO4，pH7.5平衡的450ml(5cm×23cm)S-瓊脂糖Fast FlowTM樹脂柱上(Pharmacia，Piscataway，新澤西)。接下來用5倍柱體積的0.4M NaCl，20mM NaPO4，pH7.5 4℃洗柱。用5L 0.5M NaCl，20mM NaPO4，pH7.5洗脫下所需蛋白。再次收集50mL級(jí)分，持續(xù)監(jiān)測(cè)洗脫液的A280。A280鑒定的含有洗脫物質(zhì)的級(jí)分用14％凝膠作SDS-PAGE來驗(yàn)證所需多肽的存在。
然后收集含所需蛋白的級(jí)分，再加入等體積蒸餾水。將稀釋的樣品上樣到先前制好的用0.4M NaCl，20mM NaPO4，pH6.8 4℃平衡的450ml(5cm×23cm)S-瓊脂糖Fast Flow柱。用2250mL 0.4M NaCl，20mMNaPO4，pH6.8洗柱，再用20柱體積的從0.4M NaCl，20mM NaPO4，pH6.8到0.6M NaCl，20mM NaPO4，pH6.8的線性梯度洗脫蛋白。再收集50mL級(jí)分，持續(xù)監(jiān)測(cè)洗脫液的A280。收集含有蛋白的級(jí)分(用14％SDS-PAGE確定)，再通過一個(gè)350cc攪拌室(Amicon Inc.Mayberry，麻省)中的YM-10膜(10,000截?cái)喾肿恿?濃縮至30-40 mL體積。
預(yù)先制好1,300mL(44cm×85cm)Superdex-75TM樹脂(Pharmacia)用含有1×PBS(Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水，“D-PBS”，無鈣無鎂)或0.15M NaCl，20mM NaPO4，pH7.0的柱緩沖液平衡，將濃縮物加樣。樣品進(jìn)入柱后，用柱緩沖液從凝膠過濾基質(zhì)中洗脫蛋白。此后回收10mL級(jí)分，匯集含類似物(14％SDS-PAGE確定)的級(jí)分。典型的最終匯集物中蛋白濃度為約5-10mg/mL。除非另有說明，上述操作均在4-8℃下進(jìn)行。
用可選的純化方法純化天然KGF、C(1，15)S和ΔN23。該方法包括下述步驟，除非特別說明，所有方法、溶液和物質(zhì)均在23±5℃。
細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)階段完成后，將細(xì)胞培養(yǎng)物冷卻至4-8℃，離心或用相似方法收集細(xì)胞。根據(jù)每單位重量細(xì)胞糊中預(yù)計(jì)的蛋白產(chǎn)量和需要純化的蛋白量，將適當(dāng)重量的細(xì)胞糊懸浮于5倍細(xì)胞糊重量的20mMNaPO4，0.2M NaCl，pH7.5溫和緩沖液。用高剪切混合器將細(xì)胞分散成均質(zhì)溶液。勻漿過程中保持細(xì)胞糊分散液的溫度為4-8℃。
然后加壓裂解細(xì)胞，例如將細(xì)胞漿分散液通過適當(dāng)大小的細(xì)胞勻漿器兩次。將勻漿低溫保持于5±3℃。用預(yù)先制好的裝備了具有適當(dāng)量的濾器表面積的濾器，用適當(dāng)體積的0.2M NaCl，20mM NaPO4，pH7.5平衡的深度濾器套(housing)(Cuno公司，Meriden，CT)使細(xì)胞裂解物澄清。平衡和澄清在5±3℃下進(jìn)行。澄清前用適當(dāng)量的合適的過濾助劑將濾器預(yù)包被并且與細(xì)胞裂解物徹底混合，之后將溶液通過濾器以澄清裂解物。用0.2M NaCl，20mM NaPO4，pH7.5洗濾器。將濾過液和任何后續(xù)清洗液收集于適當(dāng)容積的冷凍容器中，所有操作均低于10℃。
澄清后的裂解物通過預(yù)先制好的SP-瓊脂糖Fast Flow柱，每2g細(xì)胞裂解物至少1mL樹脂。SP-瓊脂糖Fast Flow柱用冷的(5±3℃)0.2M NaCl，20mM NaPO4，pH7.5平衡。保持柱的溫度低于10℃。澄清后的裂解物(5±3℃)加樣到離子交換樹脂上，持續(xù)監(jiān)測(cè)洗脫物的A280。樣品上樣后先用冷的0.2M NaCl，20mM NaPO4，pH7.5洗柱再用23±5℃的0.3M NaCl，20mM NaPO4，pH7.5洗柱。
用范圍為0.2-1M NaCl，20mM NaPO4，pH7.5的線性梯度洗脫所需蛋白。根據(jù)洗脫物的A280收集幾個(gè)級(jí)分的大量產(chǎn)品。洗脫后合并這些級(jí)分并記下體積。
進(jìn)行氧化步驟以氧化游離的巰基。對(duì)于與天然KGF相比半胱氨酸模式改變的蛋白，加氧化劑(例如，胱胺二鹽酸化物或其它合適的氧化劑如胱氨酸，氧化型谷胱甘肽或二價(jià)銅)至終濃度1-20mM，pH調(diào)至7-9.5，用胱胺二鹽酸化物時(shí)在pH9.0±0.3 10-30℃下氧化適當(dāng)長的時(shí)間。氧化天然KGF蛋白時(shí)加入適量的(NH4)2SO4，如1-2M(NH4)2SO4，調(diào)pH7.5±0.5，在一段時(shí)間內(nèi)保持溫度為23±5℃。
氧化后，將溶液pH調(diào)到6.5和9.5之間。必要的話在溶液中加入固體(NH4)2SO4，終濃度2M。將溶液通過適當(dāng)?shù)某吻鍨V器除去顆粒。
過濾的氧化產(chǎn)物作斥水作用層析(HIC)。HIC基質(zhì)是丁基-650MToyopearlTM樹脂(Tosohaas Inc.，Montgomeryville，賓州)。將含蛋白溶液上樣到預(yù)先用2M(NH4)2SO4，0.15M NaCl，20mM NaPO4，pH7.0平衡的柱上。上樣后用2M(NH4)2SO4，0.15M NaCl，20mM NaPO4，pH7.0洗柱。用0.15M NaCl，20mM NaPO4，pH7.0中遞降線性2-0M的(NH4)2SO4梯度洗脫所需蛋白。洗脫液A280增加顯示所需蛋白開始洗脫，收集這些級(jí)分。每級(jí)分的等分試樣用SDS-PAGE分析。然后收集含所需蛋白的各級(jí)分，徹底混合，確定合并物體積及其中蛋白濃度。
合并的含蛋白HIC洗脫液被濃縮并更換洗脫緩沖液。典型地將蛋白濃縮至5.0-10.0mg/ml。用配備了PelLIconTM盒式系統(tǒng)(Millipore公司，Bedford，麻省)和合適截止大小的膜的超濾系統(tǒng)作超濾。
濃縮后，將樣品對(duì)合適的緩沖液透濾。濃縮步驟的留存物對(duì)0.15MNaCl，20mM NaPO4，pH7.0透濾直到留存物的電導(dǎo)在0.15M NaCl，20mM NaPO4，pH7.0溶液的電導(dǎo)的5％以內(nèi)。
另外將濃縮透濾的含蛋白樣品通過0.1μm PosidyneTM濾膜(PallInc.，Cortland，NY)去除可能存在的沉淀物和細(xì)菌內(nèi)毒素。確定了溶液的蛋白濃度并根據(jù)最終大量產(chǎn)品所需濃度，用0.15M NaCl，20mM磷酸鈉，pH7.0將溶液稀釋至所需終濃度。然后用0.22μm濾膜作最后的無菌過濾，將最終的大量產(chǎn)品轉(zhuǎn)移至不含致熱源的容器中貯存(約5℃)和進(jìn)一步配制。實(shí)施例3從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中純化本實(shí)施例描述在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)的兩種生物活性重組KGF(rKGF)形式的表達(dá)，分離和表征。
用PCR擴(kuò)增得自正常人類真皮成纖維細(xì)胞(Clonetech公司，圣迭戈，加州)的cDNA，分離到人類KGF基因。用逆轉(zhuǎn)錄酶制得cDNA后用PCR擴(kuò)增KGF基因。用OLIGO#25和OLIGO#26從cDNA中擴(kuò)增出基因，第二次PCR擴(kuò)增后用OLIGO#27和OLIGO#28在片段末端加上Hind III和BglII限制位點(diǎn)，如圖1所述。
OLIGO#25(SEQ ID NO45) 5′-CAATCTACAATTCACAGA-3′OLIGO#26(SEQ ID NO46) 5′-TTAAGTTATTGCCATAGG-3′OLIGO#27(SEQ ID NO47) 5′-AACAAAGCTTCTACAATTCACAGATAGGA-3′OLIGO#28(SEQ ID NO48) 5′-AACAAGATCTTAAGTTATTGCCATAGG-3′克隆和確證DNA序列后使用KGF基因DNA。用OLIGO#29和OLIGO#30進(jìn)行擴(kuò)增。
OLIGO#29(SEQ.ID.NO49)5′-CGGTCTAGACCACCATGCACAAATGGATACTGACATGG-3′OLIGO#30(SEQ.ID.NO50)5′-GCCGTCGACCTATTAAGTTATTGCCATAGGAAG-3′有義引物OLIGO#29在起始密碼子ATG上游有Xba I位點(diǎn)和一致Kozak翻譯序列(5′-CCACC-3′)。反義引物OLIGO#30含有SalI克隆位點(diǎn)和另一個(gè)終止密碼子。PCR擴(kuò)增(94℃變性30秒，55℃退火40秒，72℃延伸40秒)18個(gè)循環(huán)后，用Xba I和SalI消化產(chǎn)物并與類似消化的pDSRα2的DNA連接(根據(jù)Bourdrel等(1993)，蛋白實(shí)驗(yàn)與純化，4130-140和Lu等(1992)，Arch.Biochem.Biophys.，298150-158)的方法)。這樣得到KGF/pDSRα2質(zhì)粒，其中人類KGF基因在SV40早期啟動(dòng)子和α-FSH多聚腺苷化序列之間。選出兩個(gè)克隆，DNA序列分析證實(shí)構(gòu)建到所需載體。
用Pvu I線性化2微克KGF/pDSRα2 DNA。然后用標(biāo)準(zhǔn)磷酸鈣沉淀法(Bourdrel等，引文見上)用處理過的DNA轉(zhuǎn)染前一天接種到0.8×106細(xì)胞/60mm的培養(yǎng)血中的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞里。兩周后選出單個(gè)的克隆轉(zhuǎn)移到24孔板上。細(xì)胞匯合后調(diào)節(jié)培養(yǎng)基被認(rèn)為不含血清，用抗大腸桿菌表達(dá)的人類KGF的多克隆兔抗血清Western印跡法分析其等分試樣。
Western印跡樣品在12.5％(W/V)SDS聚丙烯酰胺上走膠，用半干轉(zhuǎn)移儀(Hoefer Scientific Instruments，舊金山，加州)400mA 1小時(shí)電印跡到硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)移緩沖液是20mM Tris，150mM甘氨酸，25％甲醇。用PBS中10％正常山羊血清溫育，封閉硝酸纖維素膜。用抗大腸桿菌來源的KGF的兔抗血清作一抗。使用時(shí)用PBS中1％正常山羊血清稀釋10,000倍，與封閉的硝酸纖維素膜室溫溫育12小時(shí)，然后用PBS洗3次，每次30分鐘，除去多余的抗體。硝酸纖維素膜在100ml含VectastainTM生物素化山羊抗兔IgG(二抗，Vector Labs，Burlingame，加州)的PBS中1％正常山羊血清里室溫溫育30分鐘。用PBS洗3次，每次10分鐘。之后在100ml依制造商說明(Vector Labs)制備的含鏈親合素(streptavidin)和生物素化過氧化物酶的1％正常山羊血清溶液中室溫溫育30分鐘。用PBS洗3次后用100ml PBS中的60μL30％(W/V)H2O2和20mL甲醇中的50mg 4-氯萘酚混合物溫育，將KGF交叉反應(yīng)物質(zhì)顯色。10分鐘后水洗終止反應(yīng)。
分析印跡顯示KGF特異性抗體與三個(gè)不同蛋白帶相聯(lián)系，其中兩個(gè)緊密相關(guān)，分子量為約25-29KDa，另一個(gè)估計(jì)分子量為約17KDa，而163個(gè)氨基酸的成熟蛋白的估計(jì)分子量約為18.8KDa。另外，用Western分析確定分泌量大于2.0mg rKGF每升的幾個(gè)高度表達(dá)克隆被選出并被移入搖瓶(根據(jù)Lu等人的方法，引文見上)以得到大體積的無血清的條件化培養(yǎng)基，用于陽離子交換層析和凝膠過濾純化KGF，如下述。
純化3升無血的條件化培養(yǎng)基中的KGF。將填充了450ml磺乙基陽離子交換柱，一種用20mM磷酸鈉pH7.5預(yù)平衡過的S瓊脂糖Fast Flow(Pharmacia)柱用培養(yǎng)基直接上柱。用5倍柱體積的20mM磷酸鈉，0.2M NaCl pH7.5洗柱。然后用20倍柱體積的20mM磷酸鈉，pH7.5中0.2至1.0M NaCl線性梯度洗脫rKGF。收集50mL級(jí)分并持續(xù)A280監(jiān)測(cè)。用SDS-PAGE分析每一級(jí)分的等分試樣以檢測(cè)KGF蛋白。用預(yù)制的14％Tris-甘氨酸預(yù)制凝膠(根據(jù)Laemmli(1970)自然，227680-685的方法)在電泳系統(tǒng)(Novex，圣迭戈，加州)上作SDS-PAGE。上樣前將樣品與非還原性SDS樣品緩沖液混合，不需加熱。用考馬斯藍(lán)或銀染檢測(cè)蛋白?？吹絻蓚€(gè)晚期洗脫峰含有蛋白帶，對(duì)應(yīng)Western印跡檢測(cè)到的25-29KDa和17KDa帶。含有這些峰的級(jí)分分別濃縮到小于1.0mL的體積中作凝膠過濾。
凝膠過濾用的Superdex-75TM樹脂柱(HR10/30，Pharmacia)用PBS，pH7.2預(yù)平衡，用下述分子量標(biāo)準(zhǔn)(BioRad，舊金山，加州)甲狀腺球蛋白(670KDa)，γ球蛋白(158KDa)，卵清蛋白(44KDa)，肌球蛋白(17KDa)和維生素B-12(1.4KDa)標(biāo)定。經(jīng)過這些純化步驟得到的rKGF約被純化2000倍，特別包括由銀染確定的17KDa和30KDa的物質(zhì)。
由于是較高分子量的物質(zhì)，rKGF被作為主要對(duì)稱峰洗出，該峰被稱作KGF-a。用SDS-PAGE分析少量該物質(zhì)(3μg/泳道對(duì)6μg/泳道)分辨出有1-2KDa分子量差異的兩條帶。將低分子量物質(zhì)KGF-b凝膠過濾得到具有預(yù)計(jì)移動(dòng)率的蛋白制備物。KGF-a和KGF-b的純化后總回收率均為約30-40％。
還分析了KGF-a和KGF-b的氨基酸序列。儀器是自動(dòng)測(cè)序儀(477A或470A型，應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，F(xiàn)oster城，加州)，裝備有120A型在線PTH氨基酸分析儀和900A型數(shù)據(jù)收集系統(tǒng)(用Lu等(1991)，生物化學(xué)雜志，2668102-8107的方法)。KGF-a的Edman序列分析顯示主要N末端序列為X1-N-D-M-T-P-E-Q-M-A-T-N-V-X2-X3-S-[SEQID NO51]。從N末端第三個(gè)氨基酸天冬氨酸起始的次級(jí)序列占整個(gè)可測(cè)序蛋白的1.6％。由于序列分析時(shí)沒有苯基乙內(nèi)酰硫脲基(phenylthiohydantoinyl)(PHT)氨基酸信號(hào)，因此不能確定X1，X2和X3。由cDNA預(yù)測(cè)的KGF的N末端氨基酸序列顯示X1和X3是Cys殘基，X2是天冬酰胺。X1和X3不存在顯示這些半胱氨酸可能形成二硫橋。根據(jù)同義N連糖基化序列Asn-X-Ser，對(duì)應(yīng)于X2的預(yù)測(cè)的Asn殘基不存在顯示這是潛在的N連糖基化位點(diǎn)。
有趣的是，KGF-bN末端序列分析顯示N末端氨基酸序列為S-Y-D-Y-M-E-G-G-D-I-R-V-(SEQ ID NO52)表明它是KGF的N末端截短形式，在Arg32-Ser24肽鍵處被蛋白水解切割。
用已知方法(Sasaki等(1987)，生物化學(xué)雜志，26212059-12076；Takeuchi等(1988)，生物化學(xué)雜志，2633657-3663；Zsebo等(1990)，細(xì)胞，63195-201)用糖苷酶(唾液酸苷酶，O-聚糖酶和/或N-聚糖酶)處理蛋白來進(jìn)一步將純化的KGF-a和KGF-b定性。這些數(shù)據(jù)顯示KGF-a含N連和O連糖。而低分子量形式的KGF-b可能只含N連糖。糖苷酶處理并不能使KGF-b分子量減少，表明該分子未糖基化。實(shí)施例4生物活性稀釋每種KGF類似物，通過測(cè)量Balb/MK細(xì)胞的[3H]胸苷攝入(用Rubin等(1989)的方法，引文見上)試驗(yàn)其生物活性。首先用含有50％定制的Eagle氏MEM，50％定制的F12，5μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白，5ng/ml硒酸鈉，0.0005％HSA和0.005％Tween 20的生物試驗(yàn)培養(yǎng)基稀釋樣品。然后將KGF樣品加到接種了Balb/MK細(xì)胞的Falcon primeria 96孔板中。測(cè)量DNA合成中[3H]胸苷的攝入，并通過與天然KGF標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照轉(zhuǎn)化成輸入天然KGF濃度。每種受試的類似物均表現(xiàn)促細(xì)胞分裂劑活性。
用從Balb/MK小鼠表皮角化細(xì)胞制取的分離的KGF受體膜制備物檢查與KGF受體的相互作用(操作步驟依據(jù)Massague(19932)，生物化學(xué)雜志，25813614-13620)。具體地說，各種形式的KGF用50mMTirs-HCl，pH7.5含0.2％牛血清清蛋白稀釋至濃度在每50μL 0.8至100ng范圍內(nèi)。它們單獨(dú)地與膜制備物(75ng/mL)和125I標(biāo)記的大腸桿菌來源的KGF(1.5ng)溫育。在4℃進(jìn)行受體結(jié)合和競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)16小時(shí)，其后取樣、離心，用上述稀釋緩沖液洗兩次，除去未結(jié)合和非特異性結(jié)合的標(biāo)記的KGF。對(duì)樣品計(jì)量剩余的放射性。用非競(jìng)爭(zhēng)百分比對(duì)每個(gè)KGF樣品濃度作圖，做KGF樣品和標(biāo)記的KGF受體結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)曲線。放射性受體試驗(yàn)非競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)顯示大腸桿菌來源的KGF，KGF-a和KGF-b有相似的受體結(jié)合活性。
盡管本發(fā)明已被一般地以及用優(yōu)選實(shí)施方案作了如上描述，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員應(yīng)當(dāng)理解基于上述描述，可以有其它的變異形式或修飾存在。
序列表(1)一般資料(i) 申請(qǐng)人Amgen Inc.(ii) 發(fā)明名稱角化細(xì)胞生長因子的純化方法(iii)序列數(shù)52(iv)相關(guān)地址(A)收信人Amgen Inc(B)街道1840 DeHavilland Drive(C)城市Thousand Oaks(D)州California(E)國家U.S.A(F)郵編91320-1789(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)當(dāng)前申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S08/487,830(B)提交日期(C)分類未知(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度862個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)漕愋臀粗?ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1CAATCTACAA TTCACAGATA GGAAGAGGTC AATGACCTAG GAGTAACAAT CAACTCAAGA60TTCATTTTCA TTATGTTATT CATGAACACC CGGAGCACTA CACTATAATG CACAAATGGA 120TACTGACATG GATCCTGCCA ACTTTGCTCT ACAGATCATG CTTTCACATT ATCTGTCTAG 180TGGGTACTAT ATCTTTAGCT TGCAATGACA TGACTCCAGA GCAAATGGCT ACAAATGTGA240ACTGTTCCAG CCCTGAGCGA CACACAAGAA GTTATGATTA CATGGAAGGA GGGGATATAA300GAGTGAGAAG ACTCTTCTGT CGAACACAGT GGTACCTGAG GATCGATAAA AGAGGCAAAG360TAAAAGGGAC CCAAGAGATG AAGAATAATT ACAATATCAT GGAAATCAGG ACAGTGGCAG420TTGGAATTGT GGCAATCAAA GGGGTGGAAA GTGAATTCTA TCTTGCAATG AACAAGGAAG480GAAAACTCTA TGCAAAGAAA GAATGCAATG AAGATTGTAA CTTCAAAGAA CTAATTCTGG540AAAACCATTA CAACACATAT GCATCAGCTA AATGGACACA CAACGGAGGG GAAATGTTTG600TTGCCTTAAA TCAAAAGGGG ATTCCTGTAA GAGGAAAAAA AACGAAGAAA GAACAAAAAA660CAGCCCACTT TCTTCCTATG GCAATAACTT AATTGCATAT GGTATATAAA GAACCCAGTT720CCAGCAGGGA GATTTCTTTA AGTGGACTGT TTTCTTTCTT CTCAAAATTT TCTTTCCTTT780TATTTTTTAG TAATCAAGAA AGGCTGGAAA AACTACTGAA AAACTGATCA AGCTGGACTT840GTGCATTTAT GTTTGTTTTA AG 862(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度194個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述 SEQ ID NO2Met His Lys Trp Ile Leu Thr Trp Ile Leu Pro Thr Leu Leu Tyr Arg15 10 15Ser Cys Phe His Ile Ile Cys Leu Val Gly Thr Ile Ser Leu Ala Cys20 25 30Asn Asp Met Thr Pro Glu Gln Met Ala Thr Asn Val Asn Cys Ser Ser35 40 45Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile50 55 60Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg Ile Asp65 70 75 80Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn85 90 95Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly100 105 110Val Glu Ser Glu phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr115 120 125Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu130 135 140Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly145 150 155 160Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly165 170 175Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala180 185 190Ile Thr(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度595個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述 SEQ ID NO3ATCGATTTGA TTCTAGAAGG AGGAATAACA TATGAAAAAG CGCGCACGTG CTATCGCCAT60TGCTGTGGCT CTGGCAGGTT TCGCAACTAG TGCACACGCG TGCAATGACA TGACTCCAGA 120GCAAATGGCT ACAAATGTGA ACTGTTCCAG CCCTGAGCGA CACACAAGAA GTTATGATTA 180CATGGAAGGA GGGGATATAA GAGTGAGAAG ACTCTTCTGT CGAACACAGT GGTACCTGAG 240GATCGATAAA AGAGGCAAAG TAAAAGGGAC CCAAGAGATG AAGAATAATT ACAATATCAT 300GGAAATCAGG ACAGTGGCAG TTGGAATTGT GGCAATCAAA GGGGTGGAAA GTGAATTCTA 360TCTTGCAATG AACAAGGAAG GAAAACTCTA TGCAAAGAAA GAATGCAATG AAGATTGTAA 420CTTCAAAGAA CTAATTCTGG AAAACCATTA CAACACATAT GCATCAGCTA AATGGACACA 480CAACGGAGGG GAAATGTTTG TTGCCTTAAA TCAAAAGGGG ATTCCTGTAA GAGGAAAAAA 540AACGAAGAAA GAACAAAAAA CAGCCCACTT TCTTCCTATG GCAATAACTT AATAG595(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度186個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Lys Lys Arg Ala Arg Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly1 5 10 15Phe Ala Thr Ser Ala His Ala Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gln Met20 25 30Ala Thr Asn Val Asn Cys Ser Ser Pro Giu Arg His Thr Arg Ser Tyr35 40 45Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Iie Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg50 55 60Thr Gln Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr65 70 75 80Gln Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala85 90 95Val Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala100 105 110Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp115 120 125Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala130 135 140Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn145 150 155 160Gln Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys165 170 175Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr180 185(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度499個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO5TATGTGCAAT GACATGACTC CAGAGCAAAT GGCTACAAAT GTGAACTGTT CCAGCCCTGA60GCGACACACA AGAAGTTATG ATTACATGGA AGGAGGGGAT ATAAGAGTGA GAAGACTCTT 120CTGTCGAACA CAGTGGTACC TGAGGATCGA TAAAAGAGGC AAAGTAAAAG GGACCCAAGA 180GATGAAGAAT AATTACAATA TCATGGAAAT CAGGACAGTG GCAGTTGGAA TTGTGGCAAT 240CAAAGGGGTG GAAAGTGAAT TCTATCTTGC AATGAACAAG GAAGGAAAAC TCTATGCAAA 300GAAAGAATGC AATGAAGATT GTAACTTCAA AGAACTAATT CTGGAAAACC ATTACAACAC 360ATATGCATCA GCTAAATGGA CACACAACGG AGGGGAAATG TTTGTTGCCT TAAATCAAAA 420GGGGATTCCT GTAAGAGGAA AAAAAACGAA GAAAGAACAA AAAACAGCCC ACTTTCTTCC 480TATGGCAATA ACTTAATAG499(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長度164個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gln Met Ala Thr Asn Val Asn Cys1 5 10 15Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly20 25 30Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg35 40 45Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn50 55 60Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile65 70 75 80Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys85 90 95Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu100 105 110Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His115 120 125Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val130 135 140Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro145 150 155 160Met Ala Ile Thr(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長度25個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO7CAATGACCTA GGAGTAACAA TCAAC 25(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長度26個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO8AAAACAAACA TAAATGCACA AGTCCA 26(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長度26個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸
(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO926ACAACGCGTG CAATGACATG ACTCCA(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征(A)長度 31個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO10ACAGGATCCT ATTAAGTTAT TGCCATAGGA A 31(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO11ACACATATGT GCAATGACAT GACTCCA27(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長度37個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO12CTGCGTATCG ACAAACGCGG CAAAGTCAAG GGCACCC 37(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特征(A)長度44個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO13AAGAGATGAA AAACAACTAC AATATTATGG AAATCCGTAC TGTT 44(2)SEQ ID NO14的資料(i)序列特征(A)長度37個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1437GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT GAATCTG(2)SEQ ID NO15的資料(i)序列特征(A)長度45個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述 SEQ ID NO15TCTTGGGTGC CCTTGACTTT GCCGCGTTTG TCGATACGCA GGTAC 45(2)SEQ ID NO16的資料(i)序列特征(A)長度45個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述 SEQ ID NO16ACAGCAACAG TACGGATTTC CATAATATTG TAGTTGTTTT TCATC 45(2)SEQ ID NO17的資料(i)序列特征(A)長度36個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO17AATTCAGATT CAACACCTTT GATTGCAACG ATACCA36(2)SEQ ID NO18的資料(i)序列特征(A)長度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO18AGTTTTGATC TAGAAGGAGG20(2)SEQ ID NO19的資料(i)序列特征(A)長度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO19TCAAAACTGG ATCCTATTAA20(2)SEQ ID NO20的資料(i)序列特征(A)長度91個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO20AGTTTTGATC TAGAAGGAGG AATAACATAT GTGCAACGAC ATGACTCCGG AACAGATGGC 60TACCAACGTT AACTGCTCCA GCCCGGAACG T 91(2)SEQ ID NO21的資料(i)序列特征(A)長度90個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO21CACACCCGTA GCTACGACTA CATGGAAGGT GGTGACATCC GTGTTCGTCG TCTGTTCTGC 60CGTACCCAGT GGTACCTGCG TATCGACAAA 90(2)SEQ ID NO22的資料(i)序列特征(A)長度90個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO22CGTGGTAAAG TTAAAGGTAC CCAGGAAATG AAAAACAACT ACAACATCAT GGAAATCCGT60ACTGTTGCTG TTGGTATCGT TGCAATCAAA 90(2)SEQ ID NO23的資料(i)序列特征(A)長度90個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO23GGTGTTGAAT CTGAATTCTA CCTGGCAATG AACAAAGAAG GTAAACTGTA CGCAAAAAAA60GAATGCAACG AAGACTGCAA CTTCAAAGAA 90(2)SEQ ID NO24的資料(i)序列特征(A)長度90個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO24CTGATCCTGG AAAACCACTA CAACACCTAC GCATCTGCTA AATGGACCCA CAACGGTGGT60GAAATGTTCG TTGCTCTGAA CCAGAAAGGT 90(2)SEQ ID NO25的資料(i)序列特征(A)長度88個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO25ATCCCGGTTC GTGGTAAAAA AACCAAAAAA GAACAGAAAA CCGCTCACTT CCTGCCGATG60GCAATCACTT AATAGGATCC AGTTTTGA 88(2)SEQ ID NO26的資料(i)序列特征(A)長度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO26TACGGGTGTG ACGTTCCGGG20(2)SEQ ID NO27的資料(i)序列特征(A)長度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO27CTTTACCACG TTTGTCGATA 20(2)SEQ ID NO28的資料(i)序列特征(A)長度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO28ATTCAACACC TTTGATTGCA20(2)SEQ ID NO29的資料(i)序列特征(A)長度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO29CCAGGATCAG TTCTTTGAAG 20(2)SEQ ID NO30的資料(i)序列特征(A)長度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO30GAACCGGGAT ACCTTTCTGG20(2)SEQ ID NO31的資料(i)序列特征
(A)長度495個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO31ATGTCTAATG ATATGACTCC GGAACAGATG GCTACCAACG TTAACTCCTC CTCCCCGGAA60CGTCACACGC GTTCCTACGA CTACATGGAA GGTGGTGACA TCCGCGTACG TCGTCTGTTC 120TGCCGTACCC AGTGGTACCT GCGTATCGAC AAACGCGGCA AAGTCAAGGG CACCCAAGAG 180ATGAAAAACA ACTACAATAT TATGGAAATC CGTACTGTTG CTGTTGGTAT CGTTGCAATC 240AAAGGTGTTG AATCTGAATT CTACCTGGCA ATGAACAAAG AAGGTAAACT GTACGCAAAA 300AAAGAATGCA ACGAAGACTG CAACTTCAAA GAACTGATCC TGGAAAACCA CTACAACACC 360TACGCATCTG CTAAATGGAC CCACAACGGT GGTGAAATGT TCGTTGCTCT GAACCAGAAA 420GGTATCCCGG TTCGTGGTAA AAAAACCAAA AAAGAACAGA AAACCGCTCA CTTCCTGCCG 480ATGGCAATCA CTTAA495(2)SEQ ID NO32的資料(i)序列特征(A)長度164個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO32Met Ser Asn Asp Met Thr Pro Glu Gln Met Ala Thr Asn Val Asn Ser1 5 10 15Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly20 25 30Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu phe Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg35 40 45Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn50 55 60
Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile65 70 75 80Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys85 90 95Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu100 105 110Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His115 120 125Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val130 135 140Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro145 150 155 160Met Ala Ile Thr(2)SEQ ID NO33的資料(i)序列特征(A)長度495個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO33ATGTGCAATG ATATGACTCC TGAACAAATG GCTACCAATG TCAACTGTTC CTCTCCGGAG60CGCCACACCC GGAGTTACGA TTACATGGAA GGTGGGGATA TTCGCGTACG TCGTCTGTTC 120TGCCGTACCC AGTGGTACCT GCGTATCGAC AAACGCGGCA AAGTCAAGGG CACCCAAGAG 180ATGAAAAACA ACTACAATAT TATGGAAATC CGTACTGTTG CTGTTGGTAT CGTTGCAATC 240AAAGGTGTTG AATCTGAATT CTATCTTGCA ATGAACAAGG AAGGAAAACT CTATGCAAAG 300AAAGAATGCA ATGAAGATTG TAACTTCAAA GAACTAATTC TGGAAAACCA TTACAACACA 360TATGCATCTG CTAAATGGAC CCACAACGGT GGTGAAATGT TCGTTGCTCT GAACCAGAAA 420GGTATCCCTG TTCAAGGTAA GAAAACCAAG AAAGAACAGA AAACCGCTCA CTTCCTGCCG 480ATGGCAATCA CTTAA495(2)SEQ ID NO34的資料(i)序列特征(A)長度164個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO34Met Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gln Met Ala Thr Asn Val Asn Cys1 5 10 15Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly20 25 30Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg35 40 45Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn50 55 60Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile65 70 75 80Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys85 90 95Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu100 105 110Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His115 120 125Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val130 135 140Gln Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro145 150 155 160Met Ala Ile Thr(2)SEQ ID NO35的資料(i)序列特征(A)長度495個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO35ATGTCTAATG ATATGACTCC GGAACAGATG GCTACCAACG TTAACTCCTC CTCCCCGGAA 60CGTCACACGC GTTCCTACGA CTACATGGAA GGTGGTGACA TCCGCGTACG TCGTCTGTTC120TGCCGTACCC AGTGGTACCT GCGTATCGAC AAACGCGGCA AAGTCAAGGG CACCCAAGAG180ATGAAAAACA ACTACAATAT TATGGAAATC CGTACTGTTG CTGTTGGTAT CGTTGCAATC240AAAGGTGTTG AATCTGAATT CTATCTTGCA ATGAACAAGG AAGGAAAACT CTATGCAAAG300AAAGAATGCA ATGAAGATTG TAACTTCAAA GAACTAATTC TGGAAAACCA TTACAACACA360TATGCATCTG CTAAATGGAC CCACAACGGT GGTGAAATGT TCGTTGCTCT GAACCAGAAA420GGTATCCCTG TTCAAGGTAA GAAAACCAAG AAAGAACAGA AAACCGCTCA CTTCCTGCCG480ATGGCAATCA CTTAA 495(2)SEQ ID NO36的資料(i)序列特征(A)長度164個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO36Met Ser Asn Asp Met Thr Pro Glu Gln Met Ala Thr Asn Val Asn Ser1 5 10 15Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly20 25 30Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg35 40 45Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn50 55 60Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile65 70 75 80Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys85 90 95Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu100 105 110Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His115 120 125Asn Gly Gly Glu Met Pne Val Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val130 135 140Gln Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro145 150 155 160Met Ala Ile Thr(2)SEQ ID NO37的資料(i)序列特征(A)長度450個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO37ATGTCTTCTC CTGAACGTCA TACGCGTTCC TACGACTACA TGGAAGGTGG TGACATCCGC 60GTACGTCGTC TGTTCTGCCG TACCCAGTGG TACCTGCGTA TCGACAAACG CGGCAAAGTC 120AAGGGCACCC AAGAGATGAA AAACAACTAC AATATTATGG AAATCCGTAC TGTTGCTGTT 180GGTATCGTTG CAATCAAAGG TGTTGAATCT GAATTCTACC TGGCAATGAA CAAAGAAGGT 240AAACTGTACG CAAAAAAAGA ATGCAACGAA GACTGCAACT TCAAAGAACT GATCCTGGAA 300AACCACTACA ACACCTACGC ATCTGCTAAA TGGACCCACA ACGGTGGTGA AATGTTCGTT 360GCTCTGAACC AGAAAGGTAT CCCGGTTCGT GGTAAAAAAA CCAAAAAAGA ACAGAAAACC 420GCTCACTTCC TGCCGATGGC AATCACTTAA 450(2)SEQ ID NO38的資料(i)序列特征(A)長度149個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO38Met Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly1 5 10 15Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu20 25 30Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn35 40 45Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala50 55 60Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly65 70 75 80Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu85 90 95Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr100 105 110His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro115 120 125Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr Ala His Phe Leu130 135 140Pro Met Ala Ile Thr145(2)SEQ ID NO39的資料(i)序列特征(A)長度426個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO39ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC120AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT180GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC240AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT300GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCG360GTTCGTGGTA AAAAAACCAA AAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC420ACTTAA 426(2)SEQ ID NO40的資料(i)序列特征(A)長度141個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO40Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu1 5 10 15Phe Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val20 25 30Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg35 40 45Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe50 55 60Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys65 70 75 80Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn85 90 95Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val100 105 110Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys115 120 125Glu Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr130 135 140(2)SEQ ID NO41的資料(i)序列特征(A)長度426個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO41ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC120AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT180GAATCTGAAT TCTATCTTGC AATGAACAAG GAAGGAAAAC TCTATGCAAA GAAAGAATGC240AATGAAGATT GTAACTTCAA AGAACTAATT CTGGAAAACC ATTACAACAC ATATGCATCT300GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT360GTTCAAGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC420ACTTAA 426(2)SEQ ID NO42的資料(i)序列特征(A)長度141個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述 SEQ ID NO42Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu1 5 10 15Phe Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val20 25 30Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg35 40 45Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe50 55 60Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys65 70 75 80Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn85 90 95Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val100 105 110Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val Gln Gly Lys Lys Thr Lys Lys115 120 125Glu Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr130 135 140(2)SEQ ID NO43的資料(i)序列特征(A)長度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO43GAGCTCACTA GTGTCGACCT GCAG24(2)SEQ ID NO44的資料(i)序列特征(A)長度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞 -(B)位置互補(bǔ)(1..24)(xi)序列描述SEQ ID NO44CTGCAGGTCG ACACTAGTGA GCTC 24(2)SEQ ID NO45的資料(i)序列特征(A)長度18個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO45 18CAATCTACAA TTCACAGA(2)SEQ ID NO46的資料(i)序列特征(A)長度18個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO46TTAAGTTATT GCCATAGG 18(2)SEQ ID NO47的資料(i)序列特征(A)長度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO47AACAAAGCTT CTACAATTCA CAGATAGGA29(2)SEQ ID NO48的資料(i)序列特征(A)長度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO48AACAAGATCT TAAGTTATTG CCATAGG27(2)SEQ ID NO49的資料(i)序列特征
(A)長度38個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO49CGGTCTAGAC CACCATGCAC AAATGGATAC TGACATGG38(2)SEQ ID NO50的資料(i)序列特征(A)長度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO50GCCGTCGACC TATTAAGTTA TTGCCATAGG AAG 33(2)SEQ ID NO51的資料(i)序列特征(A)長度16個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO51Xaa Asn Asp Met Thr Pro Glu Gln Met Ala Thr Asn Val Xaa Xaa Ser15 10 15(2)SEQ ID NO52的資料(i)序列特征(A)長度12個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO52Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val1 5 10
權(quán)利要求
1.一種純化角化細(xì)胞生長因子(KGF)的方法，其包括a)得到含KGF的溶液；b)將步驟(a)溶液中的KGF與陽離子交換樹脂結(jié)合；c)用洗脫溶液從陽離子交換樹脂上洗脫KGF；d)將步驟(c)的洗脫溶液通過合適的分子量排阻基質(zhì)；e)從分子量排阻基質(zhì)中回收KGF。
2.權(quán)利要求1的方法，其中KGF在原核細(xì)胞中生產(chǎn)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中KGF在大腸桿菌中生產(chǎn)。
4.權(quán)利要求1的方法，其中KGF在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)。
5.權(quán)利要求4的方法，其中KGF在中國倉鼠卵巢細(xì)胞中生產(chǎn)。
6.一種純化角化細(xì)胞生長因子(KGF)的方法，其包括a)得到含KGF的溶液；b)將步驟(a)溶液中的KGF與陽離子交換樹脂結(jié)合；c)用洗脫溶液從陽離子交換樹脂上洗脫KGF；d)對(duì)步驟(c)的洗脫溶液作斥水作用層析；e)從步驟(d)的斥水作用層析中回收KGF。
7.權(quán)利要求6的方法，其進(jìn)一步包括氧化KGF中的自由巰基。
8.權(quán)利要求6的方法，其中KGF在原核細(xì)胞中生產(chǎn)。
9.權(quán)利要求7的方法，其中KGF在大腸桿菌中生產(chǎn)。
10.權(quán)利要求6的方法，其中KGF在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)。
11.權(quán)利要求10的方法，其中KGF在中國倉鼠卵巢細(xì)胞中生產(chǎn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及角化細(xì)胞生長因子的純化。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1169734SQ95196795
公開日1998年1月7日 申請(qǐng)日期1995年10月12日 優(yōu)先權(quán)日1994年10月13日
發(fā)明者E·W·徐, W·C·肯尼, T·特雷塞爾 申請(qǐng)人:安姆根有限公司