專利名稱：突變的5-烯醇丙酮酰莽草酸－3－磷酸合酶,編碼此蛋白的基因以及含有此基因的轉化的植物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，它對那些在EPSPS活性中作為磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)競爭性抑制劑的除草劑表現出增強的抗性。這種抗性更強的EPSP合酶至少含有一個“異亮氨酸對蘇氨酸”的置換。本發(fā)明也涉及編碼這一蛋白的基因，涉及由含此基因的嵌合基因構建體轉化的植物細胞，涉及由這些細胞再生的植株以及使用這些轉化植株雜交產生的植株。
草甘膦，sulfosate和fosametine是屬于膦酰甲基甘氨酸(phosphonomethylglycine)家族的廣譜內吸除草劑。它們主要作為5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EC 2.5.1.19.)或EPSPS的競爭性抑制劑，競爭PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)。把它們施用到植株后，它們在植株內運輸并積累到快速生長的部位，特別是莖和根尖，造成損傷直至破壞敏感植株的程度。
質體EPSPS，這些產品的主要靶目標，是芳香族氨基酸生物合成途徑的一種酶，它由一個或多個核基因編碼并以胞質前體的形式合成，然后輸入到質體并以成熟形式積累。
植株對草甘膦及其同族產品的耐受性是通過向它們的基因組穩(wěn)定引入EPSPS基因獲得，基因是植物或細菌來源的，相對于草甘膦抑制該基因產物的特征是突變的或者不同的。鑒于草甘膦的作用方式和使用基因的產物對草甘膦的耐受程度，能夠表達該基因翻譯產物以在質體中積累到相當的量是十分便利的。
已知例如美國專利4,535,060，通過向植物基因組引入至少攜帶一個突變從而在酶定位到質體區(qū)后使此酶對它的競爭性抑制劑(草甘膦)更具抗性的一個編碼EPSPS的基因，可以給與植物對上述類型除草劑的抗性，特別是N-膦酰甲基甘氨酸(N-phosphonomethylglycine)或草甘膦。然而這些技術都需要改進，使這些植物在田間條件下使用時獲得更高的可靠性。
在本描述中，“植物”意味著任何能夠進行光合作用的分化的多細胞有機體，“植物細胞”意味著來源于植物并能夠形成未分化組織例如愈傷組織或分化的組織例如胚或植株部分或種子的任何細胞。
本發(fā)明的目的是通過含有耐受膦酰甲基甘氨酸族除草劑的基因的新嵌合基因轉化的細胞的再生，產生對此類除草劑具有增強耐受性的轉化植物。
本發(fā)明的另一個目的是能夠給與植物對以EPSPS作為靶的除草劑具增強耐受性的嵌合基因，在轉錄方向上包括一個啟動子區(qū)，任選的一個轉運肽區(qū)，編碼草甘膦耐受性酶基因和3′末端非翻譯的聚腺苷酸信號區(qū)的序列，特征是相對于其衍生的基因，草甘膦耐受性基因在“aroA”(EPSPS)區(qū)含有一個“異亮氨酸對102位蘇氨酸”的置換。優(yōu)選地，它在同一區(qū)域另外包括一個“絲氨酸對106位脯氨酸”的置換。這些置換可以引入到或存在于任何來源的EPSPS序列，特別是植物，細菌，藻類或真菌來源的。
可用于轉運肽區(qū)的本質已知的轉運肽可以是植物來源，例如來源于玉米，向日葵，豌豆，煙草或諸如此類。第一和第二個轉運肽可以相同，相似或不同。此外，它們可各自含有按照歐洲專利申請EPO 508 909的一個或多個轉運肽單位。此特征區(qū)的功能是允許成熟和天然的蛋白，特別是上述突變的EPSPS在質體區(qū)的最高效率的釋放。
依據本發(fā)明嵌合基因的啟動子區(qū)有利地由在植物中天然表達的至少一個基因啟動子或啟動子片段組成(微管蛋白，內含子，肌動蛋白，組蛋白)。
嵌合基因3′末端非翻譯的轉錄終止信號區(qū)可以是任何來源，例如細菌來源，諸如來自胭脂氨酸合酶基因，或植物來源，諸如來自依據歐洲專利申請(歐洲專利申請?zhí)?33 317)的擬南芥組蛋白H4A748基因。
除了上述基本部分之外，根據發(fā)明的嵌合基因可包括至少一個非翻譯中介(接頭)區(qū)，其位于上述不同轉錄區(qū)之間。此中介區(qū)可以是任何來源，例如細菌，病毒或植物來源。
分離編碼玉米EPSPS的cDNA下面敘述獲得用作引入兩個突變的基質的玉米EPSPS cDNA的不同步驟。下面描述的所有操作以實施例的形式提供，且對應于為達到同一結果從存在的不同方法中作出的一種選擇。這種選擇對結果的質量無影響，因而本技術領域熟練技術人員可使用任何合適的方法達到相同的結果。大多數DNA片段基因工程方法描述于“分子生物學通用方法(Current Protocols inMolecular Biology)”卷1和卷2，Ausubel F.M.等，Greene PublishingAssociates and Wiley-Interscience(1989)出版(下文中，對描述于此書中方法的參考文獻將命名為“ref.CPMB”)。根據此書中描述方法進行的有關DNA的操作主要如下DNA片段的連接，用klenow DNA聚合酶和T4DNA聚合酶處理，微量制備或大量制備質粒和噬菌體λDNA，以及分別依據Southem和Northern技術進行DNA和RNA檢測。也采用了描述于此書中的其它方法，并且只有對這些方法進行顯著修改或附加時才在下面予以描述。
實施例11.獲取擬南芥EPSPS片段a)根據擬南芥EPSPS基因序列(Klee H.J.等(1987)分子及普通遺傳學(Mol.Gen.Genet.)，210，437-442)合成的兩段20基體寡聚核苷酸，序列分別是5′-GCTCTGCTCATGTCTGCTCC-3′5′-GCCCGCCCTTGACAAAGAAA-3′這兩段寡聚核苷酸分別在公布序列的1523到1543位和1737到1717位，并且方向相反。
b)擬南芥(哥倫比亞變種)總DNA來自Clontech(目錄參考號6970-1)。
c)把50納克(ng)DNA與每種300ng寡聚核苷酸混合，使用Perkin-Elmer 9600儀器，在供應商建議的標準擴增介質條件下擴增35循環(huán)。產生的204-堿基對(bp)片段形成擬南芥EPSPS片段。
2.用BMS玉米細胞系構建cDNA文庫a)將5克過濾的細胞在液氮中研磨，總核酸的提取按照Shure等描述的方法進行并有以下修改-裂解緩沖液pH值調至pH9.0；-用異丙醇沉淀后，以水溶解沉淀并在溶解后調節(jié)至2.5M LiCl?！鏈赜?2小時后，在4℃ 30,000g離心15分鐘得到沉淀并重新溶解。然后重復LiCl沉淀步驟。重溶的沉淀含有總核酸的RNA組分。
b)按照“分子生物學通用方法(Current Protocols in Molecular Biology)”所述在寡聚脫氧胸腺苷酸-纖維素柱(oligo(dT)-cellulose column)上色譜法獲得RNA組分中的聚腺苷酸化RNA(poly(A)+RNA)組分。
c)具有合成的EcoRI末端的雙鏈cDNA的合成這一步驟按照合成所需的以試劑盒形式提供的各種試劑的供應商提供的方法進行“復制試劑盒(copy kit)”來自In Vitrogen公司。
將分別具有序列5′-AATTCCCGGG-3′5′-CCCGGG-3′(后者已磷酸化)的兩單鏈及其部分互補寡聚核苷酸與平頭末端的雙鏈cDNA連接。
銜接子的連接導致產生了結合到雙鏈cDNA的SmaI位點和在每一雙鏈cDNA末端粘性形式的EcoRI位點。
d)文庫的創(chuàng)建依照供應商New England Biolabs提供的方法將在其末端含有人工粘性EcoRI位點的cDNA與用EcoRI酶切并去磷酸化的噬菌體λgt10cDNA相連接。
按照供應商的說明書，使用叫作Gigapack Gold的包裝抽提物在體外包裝一份連接反應物；用細菌大腸桿菌C600hfl(E.coli C60ohfl)滴定文庫。由此獲得的文庫按照同一供應商的說明加以擴增和貯存，形成BMS玉米細胞懸液cDNA文庫。
3.使用擬南芥EPSP探針篩選BMS玉米細胞懸液cDNA文庫。
遵循“分子生物學通用方法(Current Protocols in Molecular Biology)”卷1和2，Ausubel F.M.等，Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(1989)(CPMB)中所述的方法。簡潔說明，大約106個重組噬菌體以平均密度100個噬菌體/平方厘米在LB平皿中鋪平板。裂解噬菌斑在Amersham公司Hybond N膜上雙份復制。
通過1600KJ紫外處理(Stratagene Stratalinker)把DNA固定于濾膜。濾膜在65℃下6×SSC/0.1％SDS/0.25脫脂乳中預雜交2小時。根據供應商建議(Pharmacia Ready to Go kit)使用自由引物方法將擬南芥EPSPS探針用[32P]dCTP標記。獲得的特異活性具有每微克片段108cpm的數量級。在100℃下變性5分鐘后，將探針加入到預雜交介質中并在55℃下繼續(xù)雜交14小時。使用KodakXAR5膠片和Amersham Hyperscreen RPN增感屏，將濾膜在-80℃下熒光自顯影48小時。對比濾膜上的陽性位點與它們來源的平皿，能夠從該平皿中篩選出相應于與擬介芥EPSPS探針顯示陽性雜交反應的噬菌體的區(qū)域。重復此鋪平板，轉化，雜交和再生的步驟，直到連續(xù)純化的噬菌體在平板上的全部位點在雜交時證實有100％陽性。然后，在稀釋的入培養(yǎng)基中(Tris-ClpH7.5；10mM MgSO4；0.1M NaCl；0.1％明膠)挑選噬菌體裂解的獨立噬菌斑；溶液中的這些噬菌體構成BMS玉米細胞懸液的EPSP-陽性克隆。
4.BMS玉米細胞懸液EPSP克隆DNA的制備和檢測將大約5×108噬菌體加到20毫升OD600nm值為2/毫升的C600hfl菌液中并在37℃下溫育15分鐘。然后將懸液稀釋到一個1升三角瓶中的200毫升細菌生長培養(yǎng)基中，并以250rpm的速度在旋轉攪拌器上攪拌。對應于混濁菌液的裂解，在攪拌大約4小時后，培養(yǎng)液澄清指示顯著裂解。然后按“分子生物學通用方法(Current Protocols in Molecular Biology)”中所述處理此清液。獲得的DNA對應于BMS玉米細胞懸液EPSP克隆。
用EcoRI酶切1到2微克此DNA并在0.8％LGTA/TBE瓊脂糖凝膠上分離(參考CPMB)。最終結論是發(fā)現純化的DNA確實與擬南芥EPSPS探針顯示雜交信號。電泳之后，按照描述于“分子生物學通用方法(Current Protocolsin Molecular Biology)”中的Southern方法將DNA片段轉移到AmershamHybond N膜。按照上述第3部分所述的條件將濾膜與擬南芥EPSPS探針雜交。顯示與擬南芥EPSPS探針雜交信號并含有最長EcoRI片段的克隆按凝膠帶估計具有大約1.7kbp的大小。
5.獲得克隆pRPA-ML-711用EcoRI消化10微克含有1.7kbp插入片段的噬菌體克隆并在0.8％LGTA/TBE瓊脂糖凝膠上分離(參考CPMB)。從BET染色的凝膠上切下含有1.7kbp插入片段的凝膠片段，并按照供應商New England Biolabs的方法用β-瓊脂糖酶處理該片段。按照描述于“分子生物學通用方法(Cwrrent Protocolsin Molecular Biology)”中的連接方法將1.7kbp片段純化DNA與用EcoRI酶切的質粒PUC19(New England Biolabs)DNA在12℃下連接14小時。兩微升上述連接混合物用于轉化等份的電感受態(tài)大腸桿菌(E.coli)DH10B；以電穿孔法進行轉化，使用下面條件將感受態(tài)細菌和連接液混合物引入到一個厚度0.2厘米的電穿孔室(Biorad)，預冷至0℃。使用Biorad制造的電穿孔儀，電穿孔的物理條件是2500伏特，25微法拉和200歐姆。在此條件下，電容器(Condenser)的平均放電時間在4.2毫秒的數量級。然后將細菌溶解于1毫升SOC培養(yǎng)基(ref.CPMB)并于15毫升角狀管(coring tubes)中在旋轉攪拌器上在200rpm攪拌1小時。按照描述于“分子生物學通用方法”(Current Protocols inMolecular Biology)”中的方法，在補充有100微克/毫升的羧芐青霉素的LB/瓊脂培養(yǎng)基上鋪平板后，產生了在37℃下生長一夜的微制備的細菌克隆。用EcoRI消化DNA并在0.8％LGTA/TBE瓊脂糖凝膠上電泳分離后(ref.CPMB)，保留含有1.7-kbp插入片段的克隆。最終結論是發(fā)現純化的DNA確實顯示與擬南芥EPSPS探針的雜交信號。電泳之后，按照描述于“分子生物學通用方法(Current Protocols in Molecular Biology)”中的Southem方法將DNA片段轉移到Amersham Hybond N膜。按照描述于上述第3部分的條件將濾膜與擬南芥EPSPS探針雜交。大量制備含有1.7kbp插入片段并與擬南芥EPSPS探針雜交的質粒克隆，并將細菌裂解產生的DNA按“分子生物學通用方法(Current Protocols in Molecular Biology)”中所述用氯化銫梯度純化。純化的DNA使用Pharmacia試劑盒按照供應商的說明并用定購于同一供應商M13正向和反向通用引物作為引物進行部分測序。產生的部分序列大約有0.5kbp。衍生的在成熟蛋白區(qū)的氨基酸序列(大約50氨基酸殘基)與描述于美國專利USP4,971,908中的成熟玉米EPSPS的相應氨基酸序列顯示100％同源性。命名這一相應于BMS玉米細胞懸浮EPSPS DNA的1.7kbp EcoRI片段的克隆為pRPA-ML-711。使用Pharmacia試劑盒方法確定了此克隆每鏈的全序列并且合成互補寡核苷酸及其相反方向寡核苷酸各大約250bp。獲得的此1713bp克隆的全序列顯示于序列1。
6.獲得克隆pRPA-ML-715克隆pRPA-ML-711序列的檢測，特別是將衍生的氨基酸序列與玉米的相比較，顯示在編碼玉米EPSPS(美國專利USP4,971,908)成熟部分N末端丙氨酸的GCG密碼子上游有一段92bp的序列延伸。相似地，觀察到在編碼玉米EPSPS(美國專利USP4,971,908)成熟部分C末端天冬酰胺的AAT密碼子下游有一段288bp的延伸。這兩個部分可能是，N端延伸對應于用于質體定位的轉運肽序列的一部分，C端延伸對應于非翻譯的cDNA3′區(qū)域。
為了獲得編碼玉米EPSPS cDNA成熟部分的cDNA，如USP4,971,908中所述，進行了以下操作a)除去非翻譯的3′區(qū)域構建pRPA-ML-712用限制性酶AseI切克隆pRPA-ML-711，并按照CPMB中所述方法使用DNA聚合酶I的Klenow片段把由此裂解產生的末端處理成鈍末端。然后用限制性酶SacII進行切割。由這些操作產生的DNA通過在1％LGTA/TBE瓊脂糖凝膠上電泳進行分離(ref.CPMB)。
從凝膠上切下含0.4-kbp“AseI-鈍末端/SacII”插入片段的膠片段并按照描述于上述第5部分的方法純化。用限制性酶HindIII在克隆載體PUC19多接頭的HindIII位點切割克隆pRPA-ML-711DNA，并用DNA聚合酶I的Klenow片段把此切割產生的末端處理成鈍末端。然后用限制性酶SacII切割處理。從這些操作產生的DNA在0.7％LGTA/TBE瓊脂糖凝膠上電泳分離(ref.CPMB)。
從凝膠上切下含有大約3.7kbp HindIII-鈍末端/SacII插入片段的膠片段并按照描述于上述第5部分的方法純化。
將兩插入片段連接，并用2微升連接混合物按照上述第5部分所述轉化大腸桿菌DH10B。
按照描述于pRDA-ML-711的步驟檢測不同克隆的質粒DNA內容。選擇的一個質?？寺『写蠹s1.45-kbp的EcoRI-HindIII插入片段。這一克隆的末端序列揭示插入片段的5′末端準確對應于pRPA-ML-711的相應末端，并且其3′末端具有下面序列“5′-… AATTAAGCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT-3′”。
劃線序列對應C末端氨基酸天冬酰胺的密碼子，下一個密碼子對應翻譯終止密碼子。下游的核苷酸對應PUC19多接頭的序列元素。此克隆包括pRPA-ML-711序列直至成熟玉米EPSPS的翻譯終止位點，其后的PUC19多接頭序列直至HindIIT位點命名為pRPA-ML-712。
b)pRPA-ML-7125′末端的修飾構建pRPA-ML-715用限制性酶PstI和HindIII切克隆pRPA-ML-712。將這些操作產生的DNA在0.8％LGTA/TBE瓊脂糖凝膠上電泳分離(參照CPMB)。從凝膠上切下含有1.3-kbp PstI-EcoRI插入片段的膠片段并按照上面第5部分所述的方法純化。此插入片段在等摩爾量的每種下面兩個部分互補寡核苷酸序列存在下寡核苷酸15′-GAGCCGAGCTCCATGGCCGGCGCCGAGGAGATCGTGCTGCA-3′寡核苷酸25′-GCACGATCTCCTCGGCGCCGGCCATGGAGCTCGGCTC-3′以及用限制性酶BamHI和HindIII消化的質粒PUC19DNA存在下連接。
使用2微升連接混合物按上面第5部分所述轉化大腸桿菌DH10B。按照描述于上面第5部分的步驟對不同克隆的質粒DNA內容檢測后，保留一個含有大約1.3-kbp插入片段的克隆用于下面的檢測。選擇的克隆5′末端序列揭示此區(qū)域的DNA序列如下PUC19多接頭從EcoRI到BamHI位點的序列，其后是用于克隆的寡核苷酸序列，最后是存在于pRPA-ML-712的殘余序列。此克隆命名為pRPA-ML-713。此克隆含有一個包括在成熟EPSP合酶N末端丙氨酸密碼子上游NcoI位點的甲硫氨酸ATG密碼子。此外，保留了N末端丙氨酸和甘氨酸密碼子，但修改了第三個可變堿基初始的GCGGGT修改為GCCGGC。
用限制性酶HindIII切克隆pRPA-ML-713，并用DNA聚合酶IKlenow片段把切割末端處理成鈍末端。然后用限制性酶SacI切割。由這些操作產生的DNA在0.8％LGTA/TBE瓊脂糖凝膠上電泳分離(ref.CPMB)。從凝膠上切下含有1.3-kbp“HindIII-鈍末端/SacI”插入片段的膠片段，并按上面第5部分所述的方法純化。此插入片段在用限制性酶XbaI消化并用DNA聚合酶I的Klenow片段將切割末端處理成鈍末端的質粒PUC19DNA存在下連接。然后用限制性酶SacI切割。兩微升連接混合物如上面第5部分所述用于轉化大腸桿菌DH10B。按照上面第5部分所述方法對不同克隆的質粒DNA內容檢測之后，保留一個含有大約1.3-kbp插入片段的克隆進一步檢測。選擇的克隆末端序列揭示DNA序列如下PUC19多接頭從EcoRI到SacI位點的序列，其后是用于克隆的寡核苷酸序列，其中缺失了上述寡核苷酸1的4bpGATCC，最后是存在于pRPA-ML-712直至HindIII位點的殘余序列以及PUC19多接頭從XbaI到HindIII的序列。此克隆命名為pRPA-ML-715。
7.獲得編碼突變的玉米EPSPS的cDNA所有的突變步驟都按照供應商說明使用Pharmacia U.S.E.突變發(fā)生試劑盒進行。此突變發(fā)生體系的原理如下熱變性質粒DNA并在一摩爾過量的一方面突變發(fā)生寡核苷酸，以及另一方面能夠消除存在于多接頭的特定限制性酶切位點的寡核苷酸存在下重締合。重締合步驟后，在提供的合適緩沖液中T4DNA連接酶和基因32蛋白存在下利用T4DNA聚合酶作用合成互補鏈。合成產物在假定其位點已通過突變除去的限制性酶存在下溫育。特別是含有mutS突變的大腸桿菌菌株用作此DNA轉化的宿主。在液體培養(yǎng)基中生長后，制備總質粒DNA并在前面使用的限制性酶存在下溫育。這些處理之后，使用大腸桿菌菌株DH10B作為轉化的宿主。制備分離克隆的質粒DNA，并通過測序證實引入突變的存在。
A)-基本上不影響玉米對作為EPSP合酶活性競爭性抑制劑的產品的EPSPS-抗性特征的位點或序列修飾從pRPA-ML-715除去一個內部NcoI位點通過把N末端丙氨酸密碼子GCC的第一個堿基置于1位對pRPA-ML-715序列人為編號。此序列在1217位含有一個NcoI位點。該位點修飾的寡核苷酸序列為5′-CCACAGGATGGCGATGGCCTTCTCC-3′。
按照上面提供的參考文獻測序后，突變后序列閱讀對應于所用的寡聚核苷酸。確實已除去了NcoI位點，并且此區(qū)域向氨基酸的翻譯保留了pRPA-ML-715中存在的初始序列。
此克隆命名為pRPA-ML-716。
此克隆的1340-bp序列存在于序列2和序列3。
B)-使玉米具有對作為EPSP合酶活性競爭性抑制劑的產品的EPSPS-抗性特征增強的序列修飾。
使用下列寡核苷酸a)突變蘇氨酸(Thr)102→異亮氨酸(Ile)。
5′-GAATGCTGGAATCGCAATGCGGCCATTGACAGC-3′b)突變脯氨酸(Pro)106→絲氨酸(Ser)。
5′-GAATGCTGGAACTGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3′c)突變甘氨酸(Gly)101→丙氨酸(Ala)和蘇氨酸(Thr)102→異亮氨酸(Ile)。
5′-CTTGGGGAATGCTGCCATCGCAATGCGGCCATTG-3′d)突變蘇氨酸(Thr)102→異亮氨酸(Ile)和脯氨酸(Pro)106→絲氨酸(Ser)。
5′-GGGGAATGCTGGAATCGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3′測序表明，三個突變片段突變后的序列閱讀除了對應于使用的突變產生寡核苷酸的突變產生區(qū)域之外，其余都與母本pRPA-ML-716DNA序列相同。命名這些克隆pRPA-ML-717對應突變Thr102→Ile，pRPA-ML-718對應突變Pro106→Ser，pRPA-ML-719對應突變Gly101→Ala和Thr102→Ile以及pRPA-ML-720對應突變Thr102→Ile和Pro106→Ser。
pRPA-ML-720的1340-bp序列存在于序列4和序列5。
1395-bp的NcoI-HindIII插入片段是所有構建體的基礎，這些構建體用于轉化植物以引入對那些作為EPSPS競爭性抑制劑的除草劑的抗性，特別是草甘膦抗性。此插入片段將在后面的描述“玉米EPSPS雙突變”中指明。
實施例2各種突變體的體外草甘膦耐受性2.a提取EPSP合酶將各種EPSP合酶基因以NcoI-HindIII盒形式引入用NcoI和HindIII酶切的質粒載體pTrc99a(Pharmacia，參照27-5007-01)。超量表達各種EPSP合酶的重組大腸桿菌DH10B在每10克沉淀細胞40毫升緩沖液中超聲波處理，并用加有1克聚乙烯吡咯烷酮的同種緩沖液(200 mM Tris-HClpH7.8，50mM巰基乙醇，5mM EDTA和1mM PMSF)洗滌。懸液在4℃下攪拌15分鐘，然后在4℃下27,000g離心20分鐘。
向上清液中加入硫酸銨使溶液達到40％的硫酸銨飽和度?；旌弦涸?℃下27,000g離心20分鐘。將硫酸銨加入新的上清液使溶液達到70％的硫酸銨飽和度。混合液在4℃下27,000g離心30分鐘。存在于此蛋白沉淀的EPSP合酶溶解于1毫升緩沖液(20mM Tris-HClpH7.8和50mM巰基乙醇)。將此溶液對兩升同種緩沖液在4℃下透析過夜。
2.b酶活性每種酶活性及其草甘膦抗性在下面的反應混合液中于37℃下10分鐘內體外測定100mM馬來酸pH5.6，1mM磷酸烯醇式丙酮酸，3mM莽草酸3-磷酸(按照Knowles P.F.和Sprinson D.B.1970酶學方法(Methods inEnzymol)17A，351-352制備，來自產氣氣桿菌(Aerobacter aerogenes)ATCC25597)和10mM氟化鉀。酶提取物在加入草甘膦后立即加入，終濃度為0到20mM。
按照Tausky H.A.和Shorr E.1953.生物化學雜志(J.Biol.Chem.)202，675-685中的技術通過測定釋放的磷酸鹽確定酶活性。
在這種情況下，野生型(WT)酶在草甘膦濃度為0.12mM時已有85％被抑制。在此濃度下，名為Ser106的突變酶只有50％抑制，并且另外三個突變體，Ile102，Ile102/Ser106和Ala101/Ile102表現極小的甚至沒有抑制。
為了產生對突變體酶Ile102 50％的抑制，必須把草甘膦濃度增大10倍，即1.2mM，而突變體Ile 102/Ser106，Ala/Ile和Ala仍不被抑制。
應當指出的是，直到草甘膦濃度為10mM時突變體Ala/Ile和Ala仍不被抑制，并且甚至草甘膦濃度加倍，即20mM時，突變體Ile102/Ser106活性仍無減少。
實施例3轉化的煙草植株的抗性1-1-轉化將載體pRPA-RD-173引入攜帶粘性pTVK291(Komari等.，1986)的根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA101(Hood等.，1987)。轉化技術基于Horsh等，(1985)的方法。
1-2-再生在含有30克/升蔗糖和200微克/毫升卡那霉素的Murashige和Skoog(Ms)基本培養(yǎng)基上從葉外植體(leaf explants)進行PBD6煙草(來自SEITA法國)的再生。葉外植體取自溫室培養(yǎng)或體外培養(yǎng)的植株，并按照葉盤法(leaf disctechnique)(科學(Science)，1985，卷227，PP1229-1231)通過三個連續(xù)步驟轉化第一步包括在補充有30克/升蔗糖包含0.05毫克/升萘乙酸(NAA)和2毫克/升芐基氨基嘌呤(BAP)的培養(yǎng)基上誘導苗15天。然后將運一步形成的苗通過在補充有30克/升蔗糖但不含任何激素的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)發(fā)育10天。隨后把發(fā)育的苗移到具有一半濃度鹽，維生素和蔗糖且不含任何激素的MS生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)。大約15天后，將生根的苗移至土壤。
1-3-草甘膦抗性二十株轉化植株得以再生并轉移到溫室用以構建pRPA-RD-173。這些植株在溫室中5葉期時用總計相應于每公頃0.8公斤的草甘膦活性物質的水懸液處理。
結果表示處理3星期后記錄的植物毒性指數。在這種情況下，發(fā)現用構建體pRPA-RD-173轉化的植株顯示良好的耐受性，而未轉化的對照植株完全被破壞。
運些結果清楚表明由于使用依據本發(fā)明的嵌合基因作為編碼草甘膦耐受性的同一基因帶來的改進。
實施例4轉化和選擇玉米細胞依據Klein等.1987年所述的原理和方法(Klein T.M.，Wolf E.D.，Wu R.和Sandford J.C.(1987)用于將核酸傳遞至活細胞的高速微投射(High Velocitymicroprojectiles for delivering nucleic acids into livng cells)，自然(NATURE)Vol.327 pp.70-73)用構建體pRPA-RD-130轟擊對數生長期的BMS(黑墨西哥甜(Black Mexican Sweet))玉米細胞。
轟擊兩天后，將細胞轉移至含有2mM N-(膦酰甲基)甘氨酸的同一培養(yǎng)基。
在此培養(yǎng)基上篩選8星期后，選擇發(fā)育的愈傷組織，然后用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增并檢測，清楚地揭示了嵌合的OTP-EPSPS基因的存在。
未被轟擊并在含有2mM N-(膦酰甲基)甘氨酸的相同培養(yǎng)基上生長的細胞被除草劑阻礙而不發(fā)育。
依據本發(fā)明的轉化植株可用作親本以獲得具有對應于引入的嵌合基因表達的表型特征的種系或雜種。
質粒構建體的描述pRPA-RD-124將一個“nos”聚腺苷酸化信號添加到pRPA-ML-720，并伴有包括玉米雙突變EPSPS基因(Thr 102→Ile和Pro106→Ser)的克隆盒的形成。用HindIII消化pRPA-RD-720并用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段處理形成鈍末端。用NcoI進行第二次消化，并純化EPSPS片段。然后將EPSPS基因與純化的pRPA-RD-12(含有胭脂氨酸合酶聚腺苷酸信號的一個克隆盒)相連接以形成pRPA-RD-124。為了獲得有效的純化載體pRPA-RD-12，必須預先用SalI消化后者，用KlenowDNA聚合酶處理然后用NcoI第二次消化。
pRPA-RD-125將一個最優(yōu)化轉運肽(OTP)添加到pRPA-RD-124，并伴有包含定向到質粒的EPSPS基因的克隆盒的形成。用SphI消化pRPA-RD-7(歐洲專利申請EP 65 2286)，用T4DNA聚合酶處理然后用SpeI消化，并純化OTP片段。將此OTP片段克隆到pRPA-RD-124中，它已預先用NcoI消化，用KlenowDNA聚合酶處理除去突出的3′部分然后用SpeI消化。然后對此克隆測序以保證OTP和EPSPS基因之間正確的翻譯融合。這樣獲得了pRPA-RD-125。
pRPA-RD-130將H3C4玉米組蛋白啟動子和pRPA-RD-123(專利申請EP 507698)的adh1內含子1序列添加到pRPA-RD-125，并伴有用于植物中表達單子葉植物組織中的雙突變EPSPS基因的表達盒的形成。用NcoI和SacI消化pRPA-RD-123(一個包含H3C4玉米組蛋白啟動子與adh1內含子1融合的盒)。然后純化含有來自pRPA-RD-123的啟動子的DNA片段，并與預先用NcoI和SacI消化的pRPA-RD-125連接。
pRPA-RD-159將H4A748擬南芥屬(Arabidopsis)組蛋白雙啟動子(專利申請EP 507698)添加到pRPA-RD-125，并伴有用于植物中表達雙子葉植物組織中的“OTP-雙突變EPSPS基因”的表達盒的形成。用NcoI和SacI消化pRPA-RD-132(一個含有H4A748雙啟動子的盒(專利申請EP507 698))。然后將純化的啟動子片段克隆到已用EcoI和SacI消化的pRPA-RD-125中。
pRPA-RD-173；將pRPA-RD-159的“H4A748啟動子-OTP-雙突變EPSPS基因”基因添加到質粒pRPA-BL-150A(歐洲專利申請508 909)，并伴有根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)轉化載體的形成。用NotI消化pRPA-RD-159并用Klenow聚合酶處理。然后將此片段用SmaI克隆到pRPA-BL-150A。
序列表(1)一般資料(i)申請人Lebrun.MichelSailland，AlainFreyssinet CeorgesDeqryse Eric(ii)發(fā)明名稱突變的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶，編碼此蛋白的基因以及含有此基因的轉化的植物(iii)序列數目5(iv)通訊地址(A)收信人(B)街道(C)城市(E)國家法國(F)郵編69263(v)計算機可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機IBM兼容PC(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release#1.0，#1.25版本(Vi)當前申請資料(A)申請?zhí)?8/945,144(B)申請日期(C)分類(viii)律師/代理人資料(A)姓名(ix)電訊資料(A)電話(33)72-29-26-46(B)傳真(33)72-29-28-43(2)序列資料1(i)序列特征(A)長度1713堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(vi)原始來源(A)生物zea mavs(B)品質黑墨西哥甜玉米(Black Mexicon Sweet)(E)組織類型愈傷組織(vii)直接來源(A)文庫lambda qc10(B)克隆pRPA-ML-711(xi)序列描述序列1AATCAATTTC ACACAGGAAA CACCTATCAC CATGATTACG AATTCGGGCC CGGGCGCGTG 60ATCCGGCGGC GGCAGCGGCG GCGGCGGTGC AGGCGGGTGC CGAGGAGATC GTGCTGCAGC 120CCATCAAGGA GATCTCCGGC ACCGTCAAGC TGCCGGGGTC CAAGTCGCTT TCCAACCGGA 180TCCTCCTACT CGCCGCCCTG TCCGAGGGGA CAACAGTCCT TCATAACCTG CTGAACAGTG 240AGGATGTCCA CTACATGCTC GGGGCCTTGA GGACTCTTGG TCTCTCTGTC GAAGCGGACA 300AAGCTGCCAA AAGAGCTGTA GTTGTTGGCT GTGGTGGAAA GTTCCCAGTT GAGGATGCTA 360AAGAGGAAGT GCAGCTCTTC TTGGGGAATG CTGGAACTGC AATGCGCCCA TTCACACCAG 420CTCTTACTGC TGCTGGTGGA AATGCAACTT ACGTGCTTGA TGGAGTACCA AGAATGAGGG 480AGAGACCCAT TGGCGACTTG GTTGTCGGAT TGAAGCAGCT TGGTGCAGAT GTTGATTGTT 540TCCTTGGCAC TGACTGCCCA CCTGTTCGTG TCAATGGAAT CGGAGGGCTA CCTGGTGGCA 600AGGTCAAGCT GTCTGGCTCC ATCACCACTC AGTACTTGAG TGCCTTGCTG ATGGCTGCTC 660CTTTGGCTCT TGGGGATGTG GAGATTGAAA TCATTGATAA ATTAATCTCC ATTCCGTACG 720TCGAAATGAC ATTGAGATTG 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AGAGTGGTTC1620GTTGCAATAA TAAGAATAAT AAATTACGTT TCAGTGAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA1680AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AACCCGGGAA TTC 1713(2)序列資料2(i)序列特征(A)長度1340堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(vi)原始來源(A)生物zea mays(B)品系黑墨西哥甜玉米(Black Mexicon Sweet)(vii)直接來源(B)克隆pRPA-ML-716(ix)特征(A)名字/關鍵詞CDS(B)位置6..1337(xi)序列描述序列2CCATG GCC GGC GCC GAG GAG ATC GTG CTG CAG CCC ATC AAG GAG ATC 47Ala Gly Ala Clu Clu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile1 5 10TCC GCC ACC GTC AAG CTG CCC CCC TCC AAG TCG CTT TCC AAC CGG ATC95Ser Gly Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile15 20 25 30CTC CTA CTC GCC GCC CTG TCC GAG GGG ACA ACA GTG GTT GAT AAC CTG 143Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu35 40 45CTG AAC AGT GAG GAT GTC CAC TAC ATG CTC GGG GCC TTG AGG ACT CTT191Leu Asn Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu50 55 60GGT CTC TCT GTC GAA GCG GAC AAA GCT GCC AAA AGA GCT CTA GTT GTT239Gly Leu Ser Val Glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val65 70 75GGC TGT GGT GGA 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CGG AAG ACC 1299Ala Glu Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr415 420 425 430TTC CCC GAC TAC TTC GAT GTG CTG AGC ACT TTC GTC AAG AAT 1337Phe Pro Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn435 440TAA 1340(2)序列資料3(i)序列特征(A)長度444氨基酸(B)類型氨基酸
(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(ix)序列描述序列3Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile Ser Gly1 5 10 15Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu20 25 30Lcu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu Asn35 40 45Ser Clu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu50 55 60ser Val Glu Ala Asp Lyc Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val Gly Cys65 70 75 80Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lyo Clu Clu Val Gln Leu Phe85 90 95Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala Val Thr100 105 110Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met115 120 125Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Cly Leu Lys Gln Leu Gly130 135 140Ala Asp Val Aep Cys Phe Leu Cly Thr Asp Cys Pro Pro Val Arg Val145 150 155 160Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser165 170 175Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala180 185 190Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser Ile Pro195 200 205Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val Lys Ala210 215 220Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gln Lys225 230 235 240Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala245 250 255Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Thr VAl260 265 270Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu275 280 285Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr Ser Val290 295 300Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arq Lys His Leu Lys305 310 315 320Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu335 330 335Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val340 345 350Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile Arg Thr355 360 365Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys370 375 380Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp Thr Tyr385 390 395 400Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Glu405 410 415Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro420 425430Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn435 440(2)序列資料4(i)序列特征(A)長度1340堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(vi)原始來源(A)生物zea mavs(B)品系黑墨西哥甜玉米(Black Mexicon Sweet)(vii)直接來源(B)克隆pRPA-ML-720(ix)特征(A)名字/關鍵詞CDS(B)位置6..1337(xi)序列描述序列4CCATG GCC GGC GCC GAG GAG ATC GTG CTG CAC CCC ATC AAG GAG ATC 47Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile1 5 10TCC GGC ACC GTC AAG CTG CCG GGG TCC AAG TCG CTT TCC AAC CGG ATC95Ger Gly Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile15 20 35 30CTC CTA CTC GCC GCC CTG TCC GAG GGG ACA ACA GTG GTT GAT AAC CTG143Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Acn Leu35 40 45CTG AAC AGT GAG GAT GTC CAC TAC ATG CTC GGG GCC TTG AGG ACT CTT191Leu Asn Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arq Thr Leu50 55 60GGT CTC TCT GTC GAA GCG GAC AAA GCT GCC AAA AGA GCT GTA GTT GTT239Gly Leu Ser Val Glu Ala Asp Lyo Ala Ala Lys Arg Ale Val Val Val65 70 75GGC TGT GGT GGA AAG TTC CCA GTT GAG GAT CCT AAA GAG GAA 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Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr415 420 425 430TTC CCC GAC TAC TTC GAT GTG CTG AGC ACT TTC GTC AAG AAT 1337Phe Pro Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn435 440TAA 1340(2)序列資料5(i)序列特征(A)長度444氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(ix)序列描述序列5Ala Gly Ala Glu Glu IleVal Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile Ser Gly1 5 10 15Thr Val Lys Leu Pro Gly Sel Lys Scr Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu20 35 30Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu Asn35 40 45Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu50 55 60Ser Val Clu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val Gly Cys65 70 75 80Gly Gly Lyo Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln Leu Phe85 90 95Leu Gly Asn Ala Cly Ile Ala Met Arg Sel Leu Thr Ala Ala Val Thr100 105 110Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met115 120 125Arg Glu Ars Pro Ile Cly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln Leu Gly130 135 140Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val Arg Val145 150 155 160Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Cly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser165 170 175Ue Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ale Pro Leu Ala180 185 190Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Acp Lyo Lcu Ile Ser Ile Pro195 200 205Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Cly Val Lys Ala210 215 220Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lye Gly Gly Cln Lys225 230 235 240Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala245 250 255Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Thr Val260 265 270Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gle Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu275 280 285Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr Ser Val290 295 300Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys Mis Leu Lys305 310 315 320Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu325 330 335Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val340 345 350Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile Arg Thr355 360 365Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys370 375 380Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp Thr Tyr385 390 395 400Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Glu405 410 415Val Pro Val Thr Ilc Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro420 425 430Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn435 440
權利要求
1.編碼突變的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的DNA基因，特征是它至少包括一個蘇氨酸102 →異亮氨酸的置換。
2.根據權利要求1所述的DNA基因，特征是它在EPSPS上另外至少包括一個不同于第一個突變的第二個突變。
3.根據權利要求2所述的DNA基因，特征是它另外包括一個由絲氨酸置換脯氨酸106的突變。
4.根據權利要求2所述的DNA基因，特征是它另外包括一個由丙氨酸置換甘氨酸101的突變。
5.根據權利要求1到4中一個所述的DNA基因，特征是它是細菌來源。
6.根據權利要求5所述的DNA基因，特征是它來源于一個來自鼠傷寒沙門氏桿菌所在屬的細菌。
7.根據權利要求1到4中一個所述的DNA基因，特征是它是植物來源。
8.根據權利要求7所述的DNA基因，特征是它是玉米來源。
9.突變的EPSPS蛋白，特征是它至少包括一個由異亮氨酸對蘇氨酸102的置換。
10.在5′和3′位置含有一個編碼序列和調節(jié)元件的，異源的并能在植物中起作用的嵌合基因，特征是它至少包括根據權利要求1到8的一個所述的序列作為編碼序列。
11.根據權利要求9所述的嵌合基因，特征是它含有一個植物病毒啟動子。
12.根據權利要求10所述的嵌合基因，特征是它含有一個植物啟動子(例如，α-微管蛋白，組蛋白，內含子，肌動蛋白，等等。)。
13.用于轉化植物的載體，特征是它至少含有根據權利要求10到12之一所述的一個基因。
14.植物細胞，特征是它至少含有根據權利要求10到12之一所述的一個基因。
15.植株，特征是它從根據權利要求14所述的細胞再生獲得。
16.對以EPSP合酶為靶的除草劑具有改進耐受性的植株產生的方法，特征是用根據權利要求1到8中的一個所述基因轉化植物細胞或原生質體，并且轉化的細胞用于再生。
17.用以EPSPS為靶的除草劑處理植株的方法，特征是將除草劑施加于根據權利要求15所述的植株。
18.根據權利要求17所述的方法，特征是使用草甘膦或一種草甘膦前體。
全文摘要
本專利公開了一種草甘膦抗性的,至少包括一個102位異亮氨酸置換蘇氨酸的5－烯醇丙酮酰莽草酸－3－磷酸合酶(EPSPS)突變基因,以及用于產生抗草甘膦的轉化的植物。
文檔編號C12N15/54GK1196088SQ96196889
公開日1998年10月14日 申請日期1996年7月18日 優(yōu)先權日1995年7月19日
發(fā)明者米歇爾·利布朗, 阿蘭·賽蘭德, 喬治斯·弗賴西耐特, 埃里克·德格里西 申請人:羅納-普朗克農業(yè)公司