專利名稱：從大腸桿菌中獲得眼鏡蛇毒神經(jīng)多肽菌株及其獲得方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一種從大腸桿菌中直接表達獲得眼鏡蛇毒神經(jīng)多肽菌株-WY-2的方法。
背基技術(shù)現(xiàn)有的獲得眼鏡蛇毒神經(jīng)多肽的方法均為從天然蛇毒中提取，經(jīng)分離純化獲得，也有采用基因工程的手段從酵母菌中表達獲得，但表達量相對低(為8mg/L)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能替代天然眼鏡蛇毒神經(jīng)多肽的、效果理想的合成眼鏡蛇毒神經(jīng)多肽菌株及其獲得方法，此法與酵母方法相比，具有直接表達、分離純化工藝簡便、活性高等特點。
本發(fā)明從大腸桿菌中獲得眼鏡蛇毒神經(jīng)多肽菌株，其特征在于含有T7啟動子和lac I操縱子基因，其表達如下WY-2以CCTCC No.M202024進行描述。其獲得方法為，根據(jù)從天然眼鏡蛇毒中分離純化得到的神經(jīng)毒多肽所測定的一級結(jié)構(gòu)及表達載體pET21b的酶切位點，設(shè)計引物，并用所設(shè)計的引物從已經(jīng)建好的基因庫進行篩選，篩選結(jié)果為Nde I切點CATATGCTGGAATGCCACAACCAGCAGTCTTCTCAGACCCCGACCACCACCCGTTGCTCTGGTGGTGAAACCAACTGCTACAAAAAACGTTGGCGTGACCACCGTGGTTACCGTACCGAACGTGGTTGCGGTTGCCCGTCTGTTAAAAACGGTATCGAAATCAACTGCTGCACCACCGACCGTTGCAACAACTAATAAGAATTCEcoR I切點連接到PMD18-T，然后用Nde I和EcoR I雙酶切PMD18-T-Cbt，用pET21b作載體，通過T4DNA連接酶連接，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET21b-Cbt，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，將pET21b-Cbt菌株接種于LB(Amp抗性)中，35～37℃振蕩培養(yǎng)至600nm下光吸收值為0.6左右，加入IPTG至終濃度為1mM并在25～37℃下進行誘導(dǎo)表達，獲得了眼鏡蛇毒神經(jīng)多肽在大腸桿菌中的高效表達菌株(pET21b-Cbt)，表達量為10mg/L。然后用溶菌酶和超聲波破碎的方法破碎菌體，經(jīng)分子篩和離子交換即可得到表達的神經(jīng)多肽純品，電泳一條帶，并且具有明顯的天然眼鏡蛇毒神經(jīng)多肽活性，比酵母菌表達產(chǎn)物活性高10％而且容易純化。
本發(fā)明的效果是，通過本發(fā)明獲得的神經(jīng)多肽是一種具有天然活性的神經(jīng)多肽(與天然眼鏡蛇毒神經(jīng)多肽具有同樣的結(jié)構(gòu)及活性)，可替代天然眼鏡蛇毒神經(jīng)多肽，可以滿足逐漸增加的市場需求，又能保護蛇資源，是一種有應(yīng)用前景的菌株。


圖1為重組質(zhì)粒pET21b-Cbt的構(gòu)建圖。
具體實施例方式實施例1、本實施例從大腸桿菌中獲得眼鏡蛇毒神經(jīng)多肽菌株，其特征在于含有T7啟動子和lac I操縱子基因，其表達如下WY-2以CCTCC No.M202024進行描述。其獲得方法為，根據(jù)從天然眼鏡蛇毒中分離純化得到的神經(jīng)毒多肽所測定的一級結(jié)構(gòu)及表達載體pET21b的酶切位點，設(shè)計引物，并用所設(shè)計的引物從已經(jīng)建好的基因庫進行篩選，篩選結(jié)果為Nde I切點CATATGCTGGAATGCCACAACCAGCAGTCTTCTCAGACCCCGACCACCACCCGTTGCTCTGGTGGTGAAACCAACTGCTACAAAAAACGTTGGCGTGACCACCGTGGTTACCGTACCGAACGTGGTTGCGGTTGCCCGTCTGTTAAAAACGGTATCGAAATCAACTGCTGCACCACCGACCGTTGCAACAACTAATAAGAATTCEcoR I切點連接到PMD18-T，然后用Nde I和EcoR I雙酶切PMD18-T-Cbt，用pET21b作載體，通過T4DNA連接酶連接，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET21b-Cbt，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，將pET21b-Cbt菌株接種于LB(Amp抗性)中，35～37℃振蕩培養(yǎng)至600nm下光吸收值為0.6左右，加入IPTG至終濃度為1mM并在25～37℃下進行誘導(dǎo)表達，獲得了眼鏡蛇毒神經(jīng)多肽在大腸桿菌中的高效表達菌株(pET21b-Cbt)，表達量為10mg/L。然后用溶菌酶和超聲波破碎的方法破碎菌體，經(jīng)分子篩和離子交換即可得到表達的神經(jīng)多肽純品，電泳一條帶，并且具有明顯的天然眼鏡蛇毒神經(jīng)多肽活性，比酵母菌表達產(chǎn)物活性高10％而且容易純化。
權(quán)利要求
1.一種從大腸桿菌中獲得眼鏡蛇毒神經(jīng)多肽菌株，其特征是含有T7啟動子和lac I操縱子基因的WY-2以(CCTCC No.M202024)進行描述。
2.如權(quán)利要求1所述的菌株的獲得方法，其特征在于根據(jù)從天然眼鏡蛇毒中分離純化得到的神經(jīng)多肽所測定的一級結(jié)構(gòu)及表達載體pET21b的酶切位點，設(shè)計引物，并用所設(shè)計的引物從已經(jīng)建好的基因庫進行篩選，篩選結(jié)果Nde I切點CATATGCTGGAATGCCACAACCAGCAGTCTTCTCAGACCCCGACCACCACCCGTTGCTCTGGTGGTGAAACCAACTGCTACAAAAAACGTTGGCGTGACCACCGTGGTTACCGTACCGAACGTGGTTGCGGTTGCCCGTCTGTTAAAAACGGTATCGAAATCAACTGCTGCACCACCGACCGTTGCAACAACTAATAAGAATTCEcoR I切點連接到PMD18-T，然后用Nde I和EcoR I雙酶切PMD18-T-Cbt，用pET21b作載體，通過T4DNA連接酶連接，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET21b-Cbt，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，將pET21b-Cbt菌株接種于LB(Amp抗性)中，35～37℃振蕩培養(yǎng)至600nm下光吸收值為0.6左右，加入IPTG至終濃度為1mM并在25～37℃下進行誘導(dǎo)表達，獲得了眼鏡蛇毒神經(jīng)多肽在大腸桿菌中的高效表達菌株(pET21b-Cbt)，表達量為10mg/L。
全文摘要
本發(fā)明為一種從大腸桿菌中獲得眼鏡蛇毒神經(jīng)多肽菌株及其獲得方法，主要是通過從天然眼鏡蛇毒神經(jīng)多肽所測定的一級結(jié)構(gòu)，利用基因載體pET21b，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET21b－Cbt，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，而獲得能高效表達眼鏡蛇毒神經(jīng)多肽的菌株。該方法具有直接表達、分離純化工藝簡便、活性高等特點。該菌株的表達產(chǎn)物和天然眼鏡蛇毒神經(jīng)多肽有同樣的結(jié)構(gòu)和活性，可以替代天然眼鏡蛇毒神經(jīng)多肽，可以滿足逐漸增加的市場需求，又能保護蛇資源，是一種有應(yīng)用前景的表達菌株。
文檔編號C12N15/70GK1464048SQ0213331
公開日2003年12月31日 申請日期2002年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月18日
發(fā)明者王婉瑜, 熊郁良, 陳潤強, 金揚 申請人:中國科學(xué)院昆明動物研究所