專利名稱：銀杏發(fā)根的轉(zhuǎn)化及其無性繁殖系的建立的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種銀杏發(fā)根的轉(zhuǎn)化及其無性繁殖系的建立，開辟了一個再生銀杏資源的新途徑，為用銀杏發(fā)根生產(chǎn)天然藥物提供了可能。本發(fā)明技術(shù)屬生物技術(shù)領(lǐng)域，也屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
銀杏(Ginkgo bilobaL.)是我國特有的、多用途的珍貴樹種。銀杏資源特別是銀杏葉片的開發(fā)國內(nèi)外均逐漸產(chǎn)業(yè)化，此乃是銀杏及其制劑有很高的藥用價值所致。如銀杏黃酮有抗自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，降血脂和增加腦血流量的作用；銀杏內(nèi)酯是特異的血小板活化因子(PFA)拮抗劑。銀杏葉片提取物制劑對于腦功能障礙，智力功能衰退，降低血清膽固醇，增加冠狀動脈血流量，改善腦營養(yǎng)，有很好的保健作用。在治療心血管，腦血管，抗衰老，抗癡呆等疾病中，具有目前其它藥物難于替代和難于達到的功效，而且無任何副作用。研究表明，銀杏內(nèi)酯在治療哮喘，內(nèi)毒素休克，器官移植排異反應(yīng)及多種炎癥方面均有潛在應(yīng)用價值；此外，還有白果內(nèi)酯，聚異戊烯醇等成分都是十分珍貴的藥用資源。銀杏提取物不僅可做藥品，還可制成保健品，食品及化妝品(劉桂霞等國外醫(yī)藥》。植物藥分冊，1994年第9卷第一期，10～14)。
目前，國內(nèi)外主要是從銀杏葉片中提取銀杏黃酮和銀杏苦內(nèi)酯等有效成分。但天然資源受氣候的影響，季節(jié)性強，病蟲害及霉變的侵?jǐn)_都會影響銀杏葉的產(chǎn)量和質(zhì)量；擴大銀杏種植，必定與糧爭地，而我國的土地資源十分有限；從提取工藝來說，銀杏葉的工藝提取環(huán)節(jié)多，費時費力成本高等，而且各地銀杏葉的品質(zhì)(即有效成分的含量)又有差異。
近些年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，韓國，日本，加拿大等國科學(xué)家開始了銀杏細胞懸浮培養(yǎng)的研究，有的還申請了專利(Hah-Dok Remedia Ind.Co.LTD.KR/KR，WO93/02204，1993.2.4.)。據(jù)悉這方面的研究已引起美國，澳大利亞，德國，法國等國科學(xué)家的重視。這是因為第一，天然銀杏資源畢竟有限，并有其固有的缺陷；第二，銀杏中含有無法替代的、特效的、高經(jīng)濟價值的藥用成分；第三，時至今日，將生物技術(shù)應(yīng)用于銀杏上是順理成章的事情。
本發(fā)明的目的是為了克服人工種植銀杏樹的局限性，如生長周期長、一年只能采收一次、受氣候及病蟲害影響大，質(zhì)量不穩(wěn)定以及提取工藝較復(fù)雜等為了克服培養(yǎng)細胞生長速度慢，遺傳上不夠穩(wěn)定及培養(yǎng)較復(fù)雜等；利用銀杏發(fā)根培養(yǎng)技術(shù)提取銀杏天然藥物。在多年研究工作積累的基礎(chǔ)上，考慮到生物技術(shù)作為二十一世紀(jì)高技術(shù)的核心地位，我們擬用Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化銀杏，目前國內(nèi)外均未見轉(zhuǎn)化銀杏發(fā)根成功的報道。
為實現(xiàn)本發(fā)明所采取的技術(shù)措施是本發(fā)明以銀杏葉片或根皮等外植體為材料，用活化了的發(fā)根農(nóng)桿菌進行轉(zhuǎn)化，使發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的T-DNA整合到銀杏外植體細胞核DNA中，表達形成毛狀根，也稱之為發(fā)根(hairy root)；每一根發(fā)根即為一個單克隆。經(jīng)過多次繼代培養(yǎng)及反復(fù)篩選，逐步建立起銀杏發(fā)根懸浮培養(yǎng)無性繁殖系。具體步驟如下1材料取新鮮、健康富含銀杏黃酮和銀杏內(nèi)酯的銀杏葉片或根皮和已有的發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)菌株pRil5834，pRiA4，R1000等。
2轉(zhuǎn)化(1)發(fā)根農(nóng)桿菌的活化將各菌株先后在酵母牛肉膏(YEB)固體或液體培養(yǎng)液中，26±1℃下，于暗中活化2～3次，每次培養(yǎng)16～24h；(2)外植體滅菌取當(dāng)年銀杏葉片或根皮，洗凈，切成0.5cm2小塊或0.5×1.0cm小段，用0.1％升汞滅菌10分鐘，無菌水沖洗三次，每次不少于5分鐘，然后吸干表面水分；(3)感染將滅菌后的銀杏葉片或根皮段外植體，浸入活化后的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液(1×107～10-8個/ml)內(nèi)，感染20min～2h。因銀杏是古老的裸子植物，在分類上單科單屬單種，遺傳上十分保守，不易為發(fā)根農(nóng)桿菌所感染，為提高感染和轉(zhuǎn)化頻率，我們附加了不包括銀杏的植物發(fā)根浸出液，及某些二價金屬離子等，感染畢，用無菌蒸餾水沖洗五次，以去除表面多余菌液，最后吸干表面水分。
(4)將感染后銀杏的葉片或根皮放入無激素含抗菌素的1/2～1/4MS(系用該培養(yǎng)基配方發(fā)明人Murashige和Skoog兩人名字字頭命名，國際通用)固體培養(yǎng)基上，25±1℃，暗中或散射光下培養(yǎng)。大約20～50天即可陸續(xù)誘導(dǎo)出發(fā)根。
3培養(yǎng)(1)切割下外植體上長出的發(fā)根，置于1/2～1/4MS無激素培養(yǎng)基上培養(yǎng)并繁殖3～5代，10～20天繼代一次；(2)擴大繁殖在100～1000ml三角瓶，100ml加30ml培養(yǎng)液，500ml三角瓶加150ml培養(yǎng)液，1000ml三角瓶加300ml培養(yǎng)液，30ml培養(yǎng)液中約加0.3克發(fā)根。
(3)銀杏發(fā)根培養(yǎng)無性系的建立經(jīng)3～5代液體懸浮適應(yīng)性培養(yǎng)后，按發(fā)根克隆來源分別建立不同的發(fā)根無性繁殖系。
與已有技術(shù)相比較，本發(fā)明已達到的技術(shù)效果與銀杏葉片比較銀杏發(fā)根為一運用生物技術(shù)產(chǎn)生的新的銀杏資源，它不需要占用耕地；不受自然條件(天氣、病蟲害等)的影響；不象葉片一年只采收1～2次，銀杏發(fā)根可望工業(yè)集約化生產(chǎn)，可以周年不斷地提供銀杏資源，并能保證質(zhì)量的穩(wěn)定。由于銀杏發(fā)根是在人工控制下的無菌培養(yǎng)，生長周期短，因此前處理工藝成本較低。
與銀杏培養(yǎng)細胞比較銀杏發(fā)根生長較其細胞快5～15倍；分化程度較高既利于次生代謝產(chǎn)物的合成，遺傳上又較穩(wěn)定；由于一條發(fā)根即是一個克隆，因此進行發(fā)根優(yōu)化篩選十分方便；銀杏細胞培養(yǎng)必需添加外源生長激素，而其發(fā)根培養(yǎng)可不必添加任何外源激素，因外源激素可能對人體有害；鑒于上述原因銀杏發(fā)根培養(yǎng)較銀杏細胞方便，其培養(yǎng)成本較低。
此外，運用本發(fā)明的銀杏發(fā)根產(chǎn)生的愈傷組織還可篩選出激素自主型銀杏細胞懸浮培養(yǎng)無性系。
銀杏發(fā)根具體生物學(xué)特征如下1 發(fā)根生長形態(tài)和農(nóng)桿堿的鑒定轉(zhuǎn)化的銀杏發(fā)根無向地性，隨機交叉‘無序’生長，多‘根毛’，多分枝，生長快，較銀杏培養(yǎng)細胞鮮重增長快五～十五倍，具有典型的轉(zhuǎn)化發(fā)根特征(見附圖)。
農(nóng)桿堿的鑒定表明Ri質(zhì)粒的確整合到銀杏細胞核DNA上，因為發(fā)根農(nóng)桿菌所含冠癭堿合成酶基因只能在真核生物中表達。
2 生長曲線為一典型S形曲線。在相同的條件下，銀杏發(fā)根較細胞早兩天進入對數(shù)生長期，14天可增長三十倍，而銀杏細胞18天僅增長十倍。
3 銀杏發(fā)根培養(yǎng)基的篩選在對常用的多種培養(yǎng)基進行比較的基礎(chǔ)上，對銀杏發(fā)根培養(yǎng)基進行了優(yōu)化篩選。發(fā)現(xiàn)銀杏發(fā)根在我們自行設(shè)計的銀杏發(fā)根培養(yǎng)基(YXFG1)上生長最好，較常用的1/2MS鮮重增加高80～200％。該培養(yǎng)基配方(mg/L)為KNO31200～3000；CaCl2·2H2O 100～500；MgSO4·7H2O 150～450；NH4NO3100～300；KH2PO4100～400；KI 0.5～1.5；H3BO32～8；MnSO4·H2O 5～25；ZnSO4·7H2O 1～10；Na2MoO4·2H2O 0.1～0.5；CuSO4·5H2O 0.01～0.4；CoCl2·6H2O 0.01～0.4；Na·EDTA 10～40；FeSO4·7H2O；肌醇50～1000；煙酸0.5～5；鹽酸硫胺素0.5～10；鹽酸吡哆醇0.25～2.0；蔗糖1～4％；pH 4.5～6.0 。
4 培養(yǎng)液pH對銀杏發(fā)根生長的影響銀杏培養(yǎng)發(fā)根對pH有較寬的適應(yīng)能力其最適范圍為pH4.5～6.0，對低pH(4.0以下)較敏感。
5 蔗糖濃度對銀杏發(fā)根生長的影響在發(fā)根培養(yǎng)中，蔗糖的作用有二一是作為碳源和能源，二是調(diào)節(jié)培養(yǎng)液滲透濃度。我們的研究表明，銀杏發(fā)根培養(yǎng)液最適蔗糖濃度在1.0％～40％。低于1.0％對銀杏發(fā)根生長不利。
6 外源激素對銀杏發(fā)根生長的影響銀杏發(fā)根在無激素培養(yǎng)液中完全可以正常生長。若為了某種需要加適量的IAA和GA對其生長和增殖有一定的促進作用；適量的NAA對銀杏發(fā)根的生長也有促進作用，鑒于NAA等外源激素對人體健康不利故不宜使用。
7 銀杏發(fā)根中的無機元素我們利用原子吸收光譜法分析了K、Na、Ca、Mg、Mn、Cu、Fe、Zn、Cr、sr、se、Li、Co、Ni、Ag、Cd、Pb和Hg等18種無機元素。發(fā)現(xiàn)銀杏發(fā)根對K、Na、Ca、Mg、Mn、Zn、Se等元素有較強的富集作用，一般較銀杏葉片中高2～20余倍，而Cd、pb、As、Hg等有害元素的含量均在影響人類健康水平以下。
8 銀杏發(fā)根次生代謝物質(zhì)我們先后用硅膠層析、聚酰胺薄層層析和HPLC對銀杏發(fā)根、銀杏細胞及銀杏葉片進行了對比分析。結(jié)果表明，銀杏發(fā)根保留了合成銀杏黃酮和銀杏內(nèi)酯的功能。
(1)銀杏黃酮銀杏發(fā)根中銀杏黃酮的含量為4.89～84.7×10-3％，銀杏細胞中為2.87～8.83×10-3％，銀杏葉片中為0.28～0.65％(均為干重)。
(2)銀杏內(nèi)酯銀杏發(fā)根中銀杏內(nèi)酯的含量為2.52～51.3×10-3％，銀杏細胞中為2.15～24.1×10-3％，銀杏葉片中為0.05～0.20％(均為干重)。
(3)抗菌試驗試驗表明銀杏發(fā)根的培養(yǎng)液和提取液都有很強的抗污染能力。


附圖是轉(zhuǎn)化銀杏發(fā)根培養(yǎng)的實物照片。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細敘述實施例取新鮮健康銀杏樹上的幼葉，洗凈。切成0.5cm2小塊，在0.1％HgCl2滅菌10分鐘，無菌水洗三次；然后放入已活化了的發(fā)根農(nóng)桿菌pRil5834菌液中(其中加入胡羅卜發(fā)根浸出液和Mn+2)，感染60分鐘，無菌水洗三次；將感染后的葉片放入含抗菌素(氨芐青霉素0.5g/L)無激素的1/2MS培養(yǎng)基上，25±1℃、黑暗或散射光下培養(yǎng)。大約20～50天即可陸續(xù)長出銀杏發(fā)根。將長發(fā)根切成1cm的小段，置于上述含抗菌素的無激素1/2MS固體培養(yǎng)基上進行除菌培養(yǎng)。然后在無抗菌素?zé)o激素1/2MS培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3～5代，再轉(zhuǎn)入無激素的1/2MS培養(yǎng)液中，繼代培養(yǎng)3～5次，經(jīng)過適當(dāng)篩選即可逐步建立起銀杏發(fā)根懸浮培養(yǎng)無性系。培養(yǎng)條件均為溫度25±1℃，自然散射光下。
權(quán)利要求
1.一種銀杏發(fā)根的轉(zhuǎn)化及其無性繁殖系的建立，其特征在于本發(fā)明是以包括銀杏葉片或根皮的外植體為材料，用活化了的發(fā)根農(nóng)桿菌進行轉(zhuǎn)化，使發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的T-DNA整合到銀杏外植體細胞核DNA中，表達形成毛狀根，也稱之為發(fā)根；每一根銀杏發(fā)根即為一個單克隆，經(jīng)過繼代培養(yǎng)和多次篩選，逐步建立起銀杏發(fā)根懸浮培養(yǎng)無性系。
2.按權(quán)利要求1所述銀杏發(fā)根的轉(zhuǎn)化及其無性繁殖系的建立，其特征在于滅菌后的銀杏葉片或根皮外植體的感染，是將外植體浸入活化了的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液(≥1×106個/ml到1×108個/ml)中，感染時間為20分鐘到2小時；并加入適量不包括銀杏的植物發(fā)根浸出液和二價金屬離子。
3.按權(quán)利要求1所述銀杏發(fā)根的轉(zhuǎn)化及其無性繁殖系的建立，其特征在于被感染的外植體培養(yǎng)在含抗菌素?zé)o激素≥0.25到0.5MS固體培養(yǎng)基上，在≥24℃到26℃，于暗中或散射光下，培養(yǎng)時間為≥20天到50天，誘導(dǎo)銀杏出發(fā)根。
4.按權(quán)利要求1所述銀杏發(fā)根的轉(zhuǎn)化及其無性繁殖系的建立，其特征在于誘導(dǎo)出的發(fā)根需繼代擴增，≥10到20天繼代一次；對各發(fā)根克隆進行反復(fù)比較選擇；并經(jīng)≥3～5代液體懸浮適應(yīng)性培養(yǎng)，再按銀杏發(fā)根克隆來源分別建立不同的發(fā)根無性繁殖系。
5.按權(quán)利要求1所述銀杏發(fā)根的轉(zhuǎn)化及其無性繁殖系的建立，其特征在于；篩選出新的銀杏發(fā)根培養(yǎng)基(YXFGl)配方，較MS培養(yǎng)基的效果好≥100～300％。YXFGl成分(mg/L)如下KNO31200～3000；CaCl2·2H2O100～500；MgSO4·7H2O150～450；NH4NO3100～300；KH2PO4100～400；KI0.5～1.5； H3BO32～8；MnSO4·H2O 5～25； ZnSO4·7H2O 1～10； Na2MoO4·2H2O 0.1～0.5；CuSO4·5H2O 0.01～0.4；CoCl2·6H2O 0.01～0.4；Na·EDTA 10～40；FeSO4·7H2O；肌醇50～1000；煙酸0.5～5；鹽酸硫胺素0.5～10；鹽酸吡哆醇0.25～2.0；蔗糖1～4％；pH4.5～6.0。
6.按權(quán)利要求1所述銀杏發(fā)根的轉(zhuǎn)化及其無性繁殖系建立的原理，運用銀杏發(fā)根產(chǎn)生愈傷組織可制備和篩選出激素自主型銀杏細胞懸浮培養(yǎng)無性系。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種銀杏發(fā)根的轉(zhuǎn)化及其無性繁殖系的建立，它是以銀杏葉片或根皮為材料，用活化了的發(fā)根農(nóng)桿菌進行轉(zhuǎn)化，使發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的T-DNA整合到銀杏細胞核DNA中，表達形成毛狀根，經(jīng)過多次繼代培養(yǎng)和篩選，逐步建立起銀杏發(fā)根懸浮培養(yǎng)無性系。銀杏發(fā)根做為一種新的銀杏資源，不僅可以克服人工種植銀杏樹生長周期長和培養(yǎng)細胞生長緩慢的局限性，銀杏發(fā)根培養(yǎng)還可以工業(yè)化生產(chǎn)，用于提取天然銀杏藥物。
文檔編號C12N15/82GK1167153SQ9710915
公開日1997年12月10日 申請日期1997年6月27日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月27日
發(fā)明者孫天恩 申請人:武漢大學(xué)