專利名稱：用于產(chǎn)朊假絲酵母轉(zhuǎn)化的方法和材料的制作方法
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明涉及基因工程和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及用于酵母菌產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)的遺傳轉(zhuǎn)化的一種宿主載體系統(tǒng)的建立，該系統(tǒng)允許異源蛋白質(zhì)在該酵母菌中表達(dá)和分泌，其還可用于多種目的。
現(xiàn)有技術(shù)基因工程和生物技術(shù)已經(jīng)使許多用于醫(yī)學(xué)、營養(yǎng)學(xué)或工業(yè)目的之目標(biāo)蛋白質(zhì)的生產(chǎn)獲得了未曾預(yù)料到的進(jìn)展，據(jù)報(bào)道獲得了很好的效益。
基于對大腸桿菌遺傳學(xué)的了解、它的易操作性和它們的高密度培養(yǎng)系統(tǒng)，大腸桿菌已經(jīng)被許多生物技術(shù)公司作為用于這些目的的最常用的微生物。
但是，期望的該微生物產(chǎn)生的目標(biāo)蛋白質(zhì)的產(chǎn)量受到多種因素的影響。首先，當(dāng)試圖將所獲產(chǎn)物作為人用藥品或食物時，大腸桿菌細(xì)胞壁上的熱原和毒性化合物限制了其的應(yīng)用。另外，在大腸桿菌中過度表達(dá)的蛋白質(zhì)通常是以一種不能被分泌的不溶解的形式存在。另一方面，轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后修飾的機(jī)理不同于真核系統(tǒng)，導(dǎo)致重組蛋白質(zhì)在特定的方面不同于天然來源的蛋白質(zhì)。
在真核系統(tǒng)如酵母菌中表達(dá)異源蛋白質(zhì)的可行性相對于原核表達(dá)系統(tǒng)有一些優(yōu)勢。其中涉及生長至高細(xì)胞密度的能力以及調(diào)整它們以適合于連續(xù)系統(tǒng)培養(yǎng)的可能性。而且，與大腸桿菌相比酵母菌可將相當(dāng)大的量的蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中，而且用于培養(yǎng)酵母菌的培養(yǎng)基比培養(yǎng)細(xì)菌所用的培養(yǎng)基更經(jīng)濟(jì)(Lemoine,Y.,1988.酵母菌中的異源表達(dá)(Heterologous espression in yeast)第八屆國際生物技術(shù)研討會(8thInternational Biotechnology Syposium,)Paris,July 17-22)而且，這些系統(tǒng)能夠進(jìn)行其它的轉(zhuǎn)錄后修飾，如細(xì)菌系統(tǒng)不具備的糖基化作用(Fiers,W.,1988.微生物中外源基因的最大工程化表達(dá)(EngineeringMaximal Expression of Heterologous Gene in Microorganism.)第八屆國際生物技術(shù)研討會(8th International Biotechnology Symposium,)Paris,7月17-22)。另外，這些系統(tǒng)一般優(yōu)選使用與更高等的真核系統(tǒng)所用的相同密碼子(Kigsman,S.M.等人，1990.釀酒酵母中的異源基因表達(dá)(Heterologous Gene Expression in Saccharomyces cerevisiae)生物技術(shù)與基因工程回顧(Biotechnology & Genetic Engineering Reviews),3,G.E.Russell編)。
所有這些導(dǎo)致了新的真核轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的發(fā)展和普及，并且尤其令人感興趣的是在酵母菌中，最先被描述是酵母屬(Saccharomyces)的一些種，特別強(qiáng)調(diào)的是在釀酒酵母中。但是，酵母屬中的蛋白質(zhì)表達(dá)面臨一些問題，即用它們的同源啟動子得到的表達(dá)水平以及分泌到培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)的過度糖基化現(xiàn)象。這就是過去幾年加強(qiáng)尋找非常規(guī)的酵母菌以用于表達(dá)異源蛋白質(zhì)的主要原因。
隨著在其它非酵母屬酵母菌中轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的發(fā)展，象多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)，巴斯德畢氏酵母(Pichia pastoris)和克魯維酵母屬的酵母菌(Sudbery,E,1994.酵母菌(Yeast)10:1707-1726)已經(jīng)在這些系統(tǒng)的發(fā)展和了解方面有了很快的進(jìn)展，并且用這些系統(tǒng)表達(dá)的用于疫苗、診斷和工業(yè)目的的外源蛋白質(zhì)的種類也不斷增長。
而且，已經(jīng)報(bào)道了假絲酵母屬中的幾種轉(zhuǎn)化和表達(dá)系統(tǒng)，包括熱帶假絲酵母，博伊丁假絲酵母(Candida boidiini),Candida glabrata，近平滑假絲酵母，Candida maltosa和白假絲酵母，這些菌種都有明顯的醫(yī)學(xué)方面的用途，因?yàn)槠渲械暮芏喾N有可能是人類疾病的病因。
因?yàn)榧俳z酵母屬中產(chǎn)朊假絲酵母具有特別的特征，對它有著特殊的興趣。首先，產(chǎn)朊假絲酵母可利用種類繁多的廉價(jià)碳源如木糖、蔗糖和麥芽糖等。另一有趣的特點(diǎn)是在連續(xù)的培養(yǎng)體系中它可有效地產(chǎn)生大量的細(xì)胞。而且，產(chǎn)朊假絲酵母和釀酒酵母以及乳酸克魯維酵母作為安全的食物材料的來源已經(jīng)被FDA(食品及藥物管理局)認(rèn)可。此外，產(chǎn)朊假絲酵母已經(jīng)被用于L-谷氨酰胺、etil乙酸鹽和轉(zhuǎn)化酶以及其它產(chǎn)品的工業(yè)生產(chǎn)中。
一種用于產(chǎn)朊假絲酵母的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的初步系統(tǒng)已經(jīng)被Ho,I.等人，1984，(生物技術(shù)與生物工程研討會(Biotechnology and BioengineeringSvmp.)14:295-301)描述。這篇報(bào)道是不完全的，因?yàn)榭顾幮詷?biāo)記的存在和轉(zhuǎn)化過程的直接證據(jù)還未公開。最近，Kondo,K.等人，1995，(細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)177:7171-7177)報(bào)道了一種涉及產(chǎn)朊假絲酵母的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的新策略。他們通過使用包含一個核糖體蛋白L41的突變體的標(biāo)記基因得到了放線菌酮抗性(CYH)的轉(zhuǎn)化子，該基因可賦予抗藥性并且以核糖體DNA(rDNA)片段作為質(zhì)粒整合的多拷貝靶點(diǎn)，因?yàn)闉榱撕Y選CHY抗性轉(zhuǎn)化子，標(biāo)記需要以多拷貝的形式存在。
已經(jīng)做了許多用產(chǎn)朊假絲酵母作為宿主來表達(dá)異源蛋白質(zhì)的嘗試，然而，利用營養(yǎng)缺陷型突變株進(jìn)行產(chǎn)朊假絲酵母的轉(zhuǎn)化的步驟至今還沒有建立。
如果注意到產(chǎn)朊假絲酵母在工業(yè)上的應(yīng)用和它的遺傳的新穎性，產(chǎn)朊假絲酵母因其作為異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)用于商業(yè)應(yīng)用可以被視為一種具有吸引力的微生物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供用于酵母菌產(chǎn)朊假絲酵母轉(zhuǎn)化的方法和材料，以用來在此酵母菌中有效地表達(dá)外源蛋白質(zhì)，這是基于得到了該菌種的營養(yǎng)缺陷型突變株，并且從基因組文庫中分離了與該營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)的不同的基因。
這里所述的轉(zhuǎn)化方法提供了將DNA片段或序列插入產(chǎn)朊假絲酵母宿主細(xì)胞的方法并且容許將產(chǎn)朊假絲酵母作為基因表達(dá)和蛋白質(zhì)制備的宿主系統(tǒng)。
而且，利用本發(fā)明中的所述方法也可以鑒定和篩選轉(zhuǎn)化的酵母菌細(xì)胞。提供了新的產(chǎn)朊假絲酵母菌株、載體和亞克隆。新的酵母菌菌株被用作導(dǎo)入重組DNA片段的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及DNA在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化和保持，其中標(biāo)記可以同源性地整合到酵母菌的基因組中。
具體而言，本發(fā)明由用于酵母菌產(chǎn)朊假絲酵母的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)組成，該系統(tǒng)用從所述酵母菌的菌株NRRL Y-1084中分離出的新的營養(yǎng)缺陷型突變株作為宿主。這些突變株缺失了尿嘧啶生物合成途徑中的乳清酸核苷5′-磷酸脫羧酶或組氨酸生物合成途徑中的咪唑甘油磷酸脫水酶，并且是用現(xiàn)有技術(shù)中(Sherman,F.等人，1986.實(shí)驗(yàn)室操作酵母菌遺傳學(xué)手冊(Laboratory course:Manual for methods in yeast genetics.)ColdSpring Harbor Laboratory Press,NY)的以紫外線(UV)和亞硝基胍(NTG)為誘變劑的傳統(tǒng)誘變方法得到的。這些突變株具有高度的穩(wěn)定性(回復(fù)突變率約為10-8)而且可用本發(fā)明所述步驟有效地進(jìn)行轉(zhuǎn)化。另外，編碼乳清酸核苷5′-磷酸脫羧酶的URA3基因和編碼咪唑甘油磷酸脫水酶的HIS3基因可以作為產(chǎn)朊假絲酵母突變株的選擇性標(biāo)記被分離出來，這兩個基因是從pUC19中的產(chǎn)朊假絲酵母的基因文庫中分離出的，并分別在大腸桿菌MC1066中用pyrF和hisb463突變的互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行鑒定。相類似，釀酒酵母菌株SEY2202的ura3突變也被用來鑒定來自產(chǎn)朊假絲酵母的這種基因。測定了這些基因的全部序列并且推導(dǎo)出的氨基酸序列與其它酵母菌和真菌的相同基因具有高度相似性。
該轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中應(yīng)用的一些載體是包含URA3基因的質(zhì)粒pURA5和包含URA3基因的pUREC3，它們可以通過同源重組整合到產(chǎn)朊假絲酵母突變體宿主的同源位點(diǎn)上。
本發(fā)明也提供了基于前面所述的一系列質(zhì)粒，它們可用于從產(chǎn)朊假絲酵母分離的突變株的轉(zhuǎn)化以獲得異源蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)用從產(chǎn)朊假絲酵母的菌株NRRL Y-1084得到的新的營養(yǎng)缺陷型突變株作為宿主，這些營養(yǎng)缺陷型突變株主要是在尿嘧啶和組氨酸合成途徑中有缺陷，根據(jù)它們的特征從中篩選出突變株CUT-35(ura-)和突變株TMN-3(his-)。
實(shí)施例實(shí)施例1產(chǎn)朊假絲酵母的誘變建立一種微生物的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)通常需要三個要素1)一種用于選擇轉(zhuǎn)化子的標(biāo)記，它可以是一種營養(yǎng)缺陷型的或一種顯性標(biāo)記，2)一種用于篩選的突變株或適合的宿主，以及3)一種以有效的形式將核外DNA可復(fù)制地導(dǎo)入宿主的方法。
為了滿足第二要素，需要對產(chǎn)朊假絲酵母進(jìn)行傳統(tǒng)誘變。將選出的酵母菌株(NRRL Y-1084)的培養(yǎng)物接種到100ml YPG培養(yǎng)基(酵母提取物1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％)中，30℃振蕩培養(yǎng)10-20小時。取50ml培養(yǎng)物3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。然后將細(xì)胞用0.1M(pH5.5)無菌的檸檬酸緩沖液洗兩次并重懸浮于50ml同樣的緩沖液中。然后，取10ml該懸浮液與終濃度為50mg/ml的NTG溶液共同培養(yǎng)。懸浮液30℃靜置培養(yǎng)30分鐘。
將懸浮液用蒸餾水洗兩遍以去除NTG。將細(xì)胞懸浮于50ml的YPG培養(yǎng)基中然后再轉(zhuǎn)移至裝有100ml YPG的錐形瓶中，突變細(xì)胞的培養(yǎng)物于30℃培養(yǎng)48小時。制霉菌素富集培養(yǎng)將大約5ml經(jīng)48小時YPG培養(yǎng)的培養(yǎng)物接種到100ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，用于抗生素富集培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(YNB，酵母氮基質(zhì))其中不能補(bǔ)充在所尋找的缺陷型的生物合成途徑所產(chǎn)生的該代謝物。例如，為了分離尿嘧啶的營養(yǎng)缺陷型突變株，培養(yǎng)基中不加尿嘧啶。
持續(xù)培養(yǎng)一直到培養(yǎng)物的光密度(OD)達(dá)到最初OD值的20-30％。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到所需OD值時，用25單位/毫升的制霉菌素溶液處理細(xì)胞懸液。將含抗生素的溶液在30℃無攪拌培養(yǎng)30分鐘。將細(xì)胞懸液用蒸餾水洗兩遍以去除培養(yǎng)基中的制霉菌素，然后將細(xì)胞重懸浮于合適體積中以使每個平板得到150-200個菌落。篩選和選擇將含有根據(jù)實(shí)施例1誘變過的菌落的平板上的菌落接種于含有尿嘧啶和不含尿嘧啶的YNB培養(yǎng)基上。在無尿嘧啶的培養(yǎng)基上不能生長的菌落被用于進(jìn)一步的分析。
特別是為了鑒定ura3和ura5突變株的存在，在5-氟乳清酸(5FOA)存在下培養(yǎng)細(xì)胞?？剐跃渥鳛閡ra3和ura5樣突變株被挑選出來。實(shí)施例2:ura3突變株的分離制霉菌素富集培養(yǎng)后將培養(yǎng)物用蒸餾水洗兩遍并直接涂布于含0.75μg/ml的5-FOA(5-氟乳清酸，F(xiàn)luka)和40μg/ml的尿嘧啶的平板上。平板培養(yǎng)四天后分析長出的菌落以檢測ura-表型。在經(jīng)過制霉菌素富集培養(yǎng)后的4×104個活細(xì)胞中有79個菌落表現(xiàn)出對5-FOA的抗性。這些菌落可能是ura3、ura5或僅是5-FOA抗性株。為了證實(shí)尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型的存在，將假定的突變株涂在YPG培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)48小時后再涂布于含尿嘧啶和無尿嘧啶的YNB培養(yǎng)基上。共有67個菌落在無尿嘧啶的YNB培養(yǎng)基上不能生長，表現(xiàn)出ura-表型。
測定所有這些突變株的回復(fù)突變率，特別突出的是回復(fù)突變率數(shù)量級為10-8的一組23個突變株，表明它們確實(shí)穩(wěn)定，可作為轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的宿主。
用Yoshimoto等人，1978(酶學(xué)方法(Methods Enzymol)51:74-79)的方法測定所有尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型突變株的乳清酸核苷-5′-單磷酸脫羧酶(ODCase)的活性，并確定其生長條件，結(jié)果見表1。表1更為明顯的ura3突變株的特征概述名稱 回復(fù)突變率乳清酸核苷-5’-單磷酸脫羧酶活性生長CUT35＜5×10-7- +++CUT43＜1×10-7- +++CUT61＜1×10-8- +++CUT65＜1×10-8- ++CUT70＜1×104- +CUT88＜7×10-7- +++CUT931×10-8- +++CUT166 6×10-8- +++實(shí)施例3不同于ura3-表型的其它突變株的分離為了得到不同于尿嘧啶缺陷型的多種營養(yǎng)缺陷型突變株，將按照制霉菌素富集培養(yǎng)獲得的細(xì)胞懸液涂布于YPG培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)50小時。然后將YPG平板上的菌落再復(fù)制于含有YNB培養(yǎng)基的平板上30℃培養(yǎng)48小時。在YNB平板上不能生長的菌落被用于進(jìn)一步分析。
篩選大約2411個菌落，結(jié)果2％的菌落表現(xiàn)為營養(yǎng)缺陷型突變株。這些突變株用Holiday和Finchan檢測加以驗(yàn)證。結(jié)果90％為his-突變株，2％表現(xiàn)出lys-表型，1％表現(xiàn)出leu-表型，1％表現(xiàn)出met-表型，1％表現(xiàn)出ade-表型，而5％未表現(xiàn)單一的營養(yǎng)缺陷型(Naa)。
挑選回復(fù)突變率在10-7～10-8之間的突變株做進(jìn)一步分析(表2)。表2名稱 表型 回復(fù)突變率TMN3 his-1×10-8TMN31 his-1×10-8TMN64 his-1×10-8TMN9 his-4×10-7TMN12 his-5×10-7TMN13 his-2.5×10-7TMN62 his-8×10-7TMN74 his-2×10-7TMN78 his-2×10-7TMN45 lys-8×10-6TMN71 his-2×10-6TMN82 Naa 2×10-6實(shí)施例4產(chǎn)朊假絲酵母基因組文庫的構(gòu)建用Sau3A酶部分酶解從產(chǎn)朊假絲酵母NRRL Y-1084中提取的染色體DNA，用低熔點(diǎn)(LGT)瓊脂糖凝膠電泳分離出大小在6-9kb的片段。這些片段被連接到預(yù)先用BamHⅠ酶解并用堿性磷酸酶處理過的pUC19載體上。連接體被轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌MC 1066(F’,D Lac x74,hsr,hsm,rpsl,galU,galK,trip C 9030F,leuB,pyrF∷tn5)菌株。從基因組文庫得到大約95％的重組子。實(shí)施例5產(chǎn)朊假絲酵母中URA3基因的分離作為產(chǎn)朊假絲酵母ura3宿主轉(zhuǎn)化的標(biāo)記，分離且表征了產(chǎn)朊假絲酵母中的URA3基因。通過可互補(bǔ)大腸桿菌pyrF突變的能力，包含產(chǎn)朊假絲酵母URA3基因的DNA片段被從產(chǎn)朊假絲酵母pUC19基因組文庫中分離出來，其考慮到獲自釀酒酵母的URA3基因與大腸桿菌的pyrF突變互補(bǔ)，使用大腸桿菌的恰巧的啟動子活性。將此文庫涂布于缺乏尿嘧啶的培養(yǎng)基上后，分離出12個單獨(dú)的pyrF+的克隆。通過用HindⅢ和EcoRⅠ限制性酶解將DNA插入pUC-19中，其中插入的兩個克隆(pURA-2和pURA-5)具有相同的2.6kb的產(chǎn)朊假絲酵母基因組片段。來自這兩個質(zhì)粒的DNA可以高頻地將大腸桿菌MC1066轉(zhuǎn)化為Ura+表型。其中的一個產(chǎn)朊假絲酵母URA3基因-pUC19重組質(zhì)粒(pURA-5)的圖譜見

圖1。該質(zhì)粒被用于進(jìn)一步的互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)和序列分析。實(shí)施例6產(chǎn)朊假絲酵母URA3基因的分界和序列分析用幾種限制性酶酶切質(zhì)粒pURA5。將EcoR1酶切片段(1.9kb),HincⅡ酶切片段(1.3kb),SacⅠ酶切片段(1.1kb)亞克隆至pBluescript SK(+)，分別得到質(zhì)粒pUREc-3,pURHinc-1,pURSac-4。質(zhì)粒pURSac-4的片段不能與大腸桿菌的pyrF突變相互補(bǔ)(圖2)。
用Sanger等人(1977，美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc.Natl.Acad.SciUSA)74:5463-5467)的方法可將含有產(chǎn)朊假絲酵母URA3基因的1.9kb的EcoRⅠ酶切片段(pUREc-3，圖3)雙鏈序列全部測定。
最后，應(yīng)用M13mp/pUC系列的通用寡聚核苷酸和衍生自該序列的內(nèi)在寡聚核苷酸。EcoRⅠ酶切片段的全部1179個堿基的序列見圖4(SEQ.ID.NO.1、2)。此片段包含一個800堿基的開放讀框(266個密碼子)。產(chǎn)朊假絲酵母URA3基因編碼一個理論分子量為29436道爾頓的蛋白質(zhì)。ATG起始密碼子旁側(cè)的核苷酸序列(GAAAATG)與Cigan yDonehue.1987(基因(Gene)59:1-18)報(bào)道的酵母菌中的(A/YAA/YAATG)具有很好的一致性。3′-非翻譯區(qū)包含一個推定的多聚腺苷酸位點(diǎn)(TATAAAA，共有序列AATAAAA)，該序列存在于大多數(shù)的真核生物基因3′末端(Guo,Z y Sherman,E.,1995.分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)15:5983-5990)。實(shí)施例7釀酒酵母的互補(bǔ)分析為了證明克隆片段與產(chǎn)朊假絲酵母URA3基因一致而不是一個有抑制子活性的DNA片段，將pURA5質(zhì)粒的2.8kb的KpbⅠ/XbaⅠ片段克隆到pBR332衍生載體(pBSARTR-3)中。pBSARTR-3載體具有均來自釀酒酵母一個自主復(fù)制序列(ARS1)和一個TRP1基因選擇性標(biāo)記。因此，得到質(zhì)粒pUT64(圖5)并將其用于按照Ito.等人，1983(細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)153:163-168)先前報(bào)道的醋酸鋰方法轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌株SEY2202(ura3-52-,leu2-112,his3)。
轉(zhuǎn)化后48小時得到轉(zhuǎn)化子。用原位雜交和Southern印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證復(fù)制型質(zhì)粒的存在。
所獲得的轉(zhuǎn)化頻率(2-5×102轉(zhuǎn)化子/毫克)與文獻(xiàn)報(bào)道的其他酵母菌的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記的轉(zhuǎn)化頻率一致。因而，證明了產(chǎn)朊假絲酵母的URA3基因能與釀酒酵母的URA3突變互補(bǔ)。實(shí)施例8用醋酸鋰方法以質(zhì)粒pURA5和pUCURA3轉(zhuǎn)化產(chǎn)朊假絲酵母NRRL Y-1084CTU35以已經(jīng)從產(chǎn)朊假絲酵母分離出的URA3基因作為選擇性標(biāo)記，用Ito.等人,1983(細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)153:163-168)報(bào)道的醋酸鋰方法轉(zhuǎn)化釀酒酵母CUT35的ura3突變株(保藏號待定)。設(shè)計(jì)將用于轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的載體(pURA5和pUCURA3)用同源重組的方法直接整合到產(chǎn)朊假絲酵母突變株的同源基因座上。通過將產(chǎn)朊假絲酵母URA3基因的1.8kb的EcoRⅠ片段克隆到pUC19載體的相應(yīng)位點(diǎn)得到了質(zhì)粒pUCURA3(圖6)。在轉(zhuǎn)化步驟之前，兩種質(zhì)粒均在位于結(jié)構(gòu)基因5′末端的位點(diǎn)被XhoⅠ酶解。質(zhì)粒的線性化有利于基因組位點(diǎn)的同源整合。
轉(zhuǎn)化步驟依據(jù)Ito等人先前所述的用于釀酒酵母的方法進(jìn)行，用堿性金屬陽離子接觸酵母。不同之處是對于醋酸鋰轉(zhuǎn)化步驟，所用醋酸鋰濃度在此是50mM而不是100mM。
轉(zhuǎn)化子的篩選在無尿嘧啶的YNB基礎(chǔ)培養(yǎng)基上進(jìn)行。由于是同源整合的機(jī)制，轉(zhuǎn)化子的分裂穩(wěn)定性很高。轉(zhuǎn)化頻率與報(bào)道的用整合型載體的釀酒酵母和其它非常規(guī)酵母菌的轉(zhuǎn)化頻率一致(表3)。實(shí)施例9用電穿孔法以質(zhì)粒pURA5和pUCURA3轉(zhuǎn)化產(chǎn)朊假絲酵母CUT35根據(jù)Kondo,K.等A,1995,(細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)177:7171-7177)報(bào)道的電穿孔方法用已分離的產(chǎn)朊假絲酵母的URA3基因作為選擇性標(biāo)記轉(zhuǎn)化產(chǎn)朊假絲酵母CUT35的ura3突變株。將用于轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的載體(pURA5和pUCURA3)設(shè)計(jì)用同源重組的方法直接整合到產(chǎn)朊假絲酵母突變株的同源基因座上。
所采用步驟是基于用電場處理完整的酵母菌細(xì)胞。應(yīng)用如下條件0.7kV(3.5kV/cm)的脈沖電壓，800Ω的電阻和25μF的電容。
轉(zhuǎn)化步驟之前，兩種質(zhì)粒均在位于結(jié)構(gòu)基因5′端的位點(diǎn)被XhoⅠ酶解，以利于基因座的同源整合。
轉(zhuǎn)化子的篩選在無尿嘧啶的YNB基礎(chǔ)培養(yǎng)基上進(jìn)行。
用pURA5和pUCURA3進(jìn)行轉(zhuǎn)化的頻率均依賴于質(zhì)粒的濃度。兩種方法(醋酸鋰法與電穿孔法)的比較見表3。
表3載體 DNA濃度(μg) 轉(zhuǎn)化頻率(轉(zhuǎn)化率/μg)LiAc電穿孔pUCURA-3 0.1 - 70-900.5 - 6403.0 22 -pURA-5 0.1 - 40-500.5 - 6703.0 21 -由于是同源整合的機(jī)制，轉(zhuǎn)化子的分裂穩(wěn)定性很高。轉(zhuǎn)化頻率與報(bào)道的用整合型質(zhì)粒的釀酒酵母和其它非常規(guī)酵母菌的轉(zhuǎn)化頻率一致。
圖7中列出了產(chǎn)朊假絲酵母基因組的可能的整合情況的略圖和一些轉(zhuǎn)化子的Southern印跡結(jié)果。實(shí)施例10產(chǎn)朊假絲酵母HIS3基因的分離從前面實(shí)施例4所述的文庫中分離產(chǎn)朊假絲酵母的HIS3基因并進(jìn)行表征。根據(jù)包含產(chǎn)朊假絲酵母HIS3基因的DNA片段能與大腸桿菌KC8的his463突變型(hsd,hisB463,leuB6,pyrF∷ Tn5 Kmr,trp(9830(lact YA),stm,galU,gal)互補(bǔ)的能力，可將它從產(chǎn)朊假絲酵母基因組文庫中分離出來，其考慮到獲自釀酒酵母的URA3基因與大腸桿菌的hisb463突變互補(bǔ)，使用大腸桿菌的恰巧的啟動子活性。
為了分離HIS3基因，將105的細(xì)胞涂布在補(bǔ)充了尿嘧啶、色氨酸、亮氨酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上。從能在這種培養(yǎng)基上生長的并因而能與大腸桿菌KC8突變菌株的hisb463突變互補(bǔ)的菌落中提取質(zhì)粒DNA。用分離出的質(zhì)粒DNA再轉(zhuǎn)化大腸桿菌KC8突變株。所有能夠補(bǔ)充突變菌株所需組氨酸的質(zhì)粒被命名為pHCU。為了證實(shí)his+克隆包含產(chǎn)朊假絲酵母的HIS3基因并且不是具有抑制子活性的DNA片段，將兩個獲自His+轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒(pHCU37、pHCU40)進(jìn)行PCR反應(yīng)。應(yīng)用來自于真菌和酵母菌的五個IGPDasas序列的兩個高度保守區(qū)的兩段簡并性寡聚核苷酸。圖8中列出了簡并的寡聚核苷酸的序列和其編碼的氨基酸序列。
擴(kuò)增了與獲自產(chǎn)朊假絲酵母的HIS3基因的編碼序列相應(yīng)的一個大約500bp的PCR條帶。用Southern印跡可顯示出這一大約500bp的PCR片段能與產(chǎn)朊假絲酵母基因組DNA雜交，將此片段克隆到T-載體(pMOSBLUE,Amershan)上，推導(dǎo)出的此序列翻譯的氨基酸序列與其他酵母菌和真菌中的His3p高度一致。質(zhì)粒pHCU37(圖9)被用于產(chǎn)朊假絲酵母的HIS3基因的全序列測定。實(shí)施例11產(chǎn)朊假絲酵母的HIS3基因的序列測定用Sanger等人(1977)的方法對產(chǎn)朊假絲酵母的HIS3基因進(jìn)行全部雙鏈序列測定。應(yīng)用通用的M13mp/pUC系列的寡聚核苷酸。獲自PCR片段的引物被用于起始全基因的序列測定。測定了pHCU37的全部1190bp的序列。獲自產(chǎn)朊假絲酵母的HIS3全序列見圖10(SEQ.ID.NO.5,6)。
該片段包含了一個210個密碼子的開放讀框。產(chǎn)朊假絲酵母的HIS3基因編碼一個理論分子量為24518道爾頓的蛋白質(zhì)。實(shí)施例12編碼產(chǎn)朊假絲酵母的轉(zhuǎn)化酶的INV1基因的分離為了分離編碼產(chǎn)朊假絲酵母中轉(zhuǎn)化酶的INV1基因，利用此酶在不同物種之間高度保守的本區(qū)域的有利事實(shí)，與來自酵母的呋喃果糖苷酶的序列加以比較。根據(jù)產(chǎn)朊假絲酵母中所用的密碼子設(shè)計(jì)用于該P(yáng)CR中的兩個簡并的寡核苷酸。圖11顯示了多肽序列以及簡并性寡核苷酸。
將PCR產(chǎn)生的417bp條帶亞克隆至T-載體(pMOBLue，Amersham)。將該條帶完全測序，該DNA片段的翻譯證實(shí)存在共有區(qū)域以及文獻(xiàn)中報(bào)道的轉(zhuǎn)化酶高度同源區(qū)。這證明所分離的片段屬于INV1基因，其編碼產(chǎn)朊酵母中的此酶。用此片段作為探針從產(chǎn)朊假絲酵母分離INV1基因。
在檢索產(chǎn)朊假絲酵母文庫之后，分離到6個具有INV1基因的克隆。根據(jù)大小選擇其中的兩個用于測序(pCI-6和pCI-12)，利用前述PCR步驟的寡核苷酸。這些寡核苷酸用于從屬于質(zhì)粒pCI-6的兩條鏈開始完整的序列。實(shí)施例13產(chǎn)朊假絲酵母INV1基因的測序用Sanger等(1977)的方法將含有編碼產(chǎn)朊假絲酵母的INV1基因的克隆pCI-6的全部2607bp進(jìn)行測序，采用屬于M13mp/pUC系列的通用寡核苷酸及衍生自該序列的內(nèi)部寡核苷酸。全部2607bp序列示于圖12(SEQ.ID.NO.5,6)。該片段含有1602bp(534密碼子)的開放讀框。產(chǎn)朊假絲酵母的INV1基因編碼理論分子量60703Da的蛋白質(zhì)。
鑒于產(chǎn)朊假絲酵母中的轉(zhuǎn)化酶是一種周質(zhì)酶，其N-端應(yīng)有一個信號肽。分析至該基因序列的5’端，發(fā)現(xiàn)兩個ATG密碼子(ATG1和ATG2，圖12)，其產(chǎn)生編碼僅與其N端不同的蛋白質(zhì)之開放讀框的空間。利用vonHeiine氏規(guī)則(1986，核酸研究，14:4683-4690)以推測從兩個ATG產(chǎn)生的成熟蛋白質(zhì)的肽酶信號之限制性位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)兩種情況的限制性位點(diǎn)分別位于殘基S39和S40之間(對于ATG1)和殘基S26和S27之間(對于ATG2)。這產(chǎn)生長度分別為39和26個氨基酸的信號肽?？紤]到酵母中所用信號肽的平均大小(估計(jì)約20個殘基)，可以推斷INV1基因的起始密碼子為第二個ATG。
根據(jù)N-X-T/S通用規(guī)則，在成熟蛋白質(zhì)序列位置40、88、141、187、245、277、344、348、365、373、379和399的天冬氨酸是11個可能的N-糖基化位點(diǎn)。
5’-非翻譯區(qū)顯示兩個可能的TATA盒(共有序列TATAA)，位于-81至-14區(qū)域和-212至-208區(qū)域，也發(fā)現(xiàn)多個可能的抑制子Mig1單位(共有序列SYGGRG)的位點(diǎn)。
附圖簡述圖1．通過大腸桿菌MC1066 pyrF釀酒酵母SEY 2202 ura3突變互補(bǔ)，從產(chǎn)朊假絲酵母基因組文庫中得到的質(zhì)粒pURA5。
圖2．產(chǎn)朊假絲酵母URA3基因的限制性酶切圖譜、測序策略和互補(bǔ)分析。
圖3．質(zhì)粒pURA5的1.9kb的EcoRⅠ片段克隆到pBLUESCRIPTSK(+)得到的質(zhì)粒pUREC3。
圖4．由URA3基因的DNA序列推導(dǎo)出的氨基酸序列和編碼此序列的DNA的DNA序列。
圖5．由釀酒酵母ura3突變株的互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)得到的質(zhì)粒pUT64。
圖6．用于產(chǎn)朊假絲酵母轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的質(zhì)粒pUCURA3。
圖7.(A)通過同源重組整合到URA3基因座的載體DNA的預(yù)計(jì)的排列。
(B)一些轉(zhuǎn)化子的基因組DNA的DNA印跡雜交。
圖8．用于分離HIS3基因的引物之DNA序列以及推導(dǎo)出的其編碼氨基酸序列。
圖9．通過大腸桿菌KC8 his463突變的互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)從產(chǎn)朊假絲酵母基因組文庫中得到的質(zhì)粒pHCU37。
圖10．由HIS3基因的DNA序列推導(dǎo)出的氨基酸序列和編碼此序列的DNA序列。
圖11．用于分離產(chǎn)朊假絲酵母INVI基因的PCR中的寡核苷酸之氨基酸序列和相應(yīng)的DNA序列。
圖12．相應(yīng)于含有產(chǎn)朊假絲酵母INVI基因的片段之DNA序列。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(A)姓名CENTRO DE INGENIERIA GENETICA YBIOTECNOLOGIA(B)街道AVE.31 ENTRE 18 Y 190,CUBANACAN,PLAYA(C)城市CIYDAD DE LA HABANA(E)國家古巴(F)郵政編碼(ZIP):12100(G)電話537216013(H)傳真537336008(ⅱ)發(fā)明名稱用于產(chǎn)朊假絲酵母轉(zhuǎn)化的材料和方法(ⅲ)序列數(shù)目6(ⅳ)計(jì)算機(jī)可讀信息(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,Version#1.30(EPO)(ⅵ)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?2/96(B)遞交日1996年10月3日(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1179個堿基對(B)類型核酸(C)線性單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)
(ⅲ)假設(shè)非(ⅳ)反義非(ⅵ)初始來源(A)生物產(chǎn)朊假絲酵母(B)菌株NRRL Y-1084(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞mat-peptide(B)位置1..1179(D)其它信息/產(chǎn)物=“酶乳清酸核苷-5-磷酸脫羧酶”/基因=“URA3”(ⅹⅰ) SEQ ID NO:1的序列描述CAAATAGCTC TCTACTTGCT TCTGCTCAAC AAGCTGCTGG AACTGCTGCT GCTCTTTTGG60GTTCAATTGG TCCATCCTTG CTACTTTTCC GCCTAGTTTC GATTCCGATT CTGATAGAGA 120AGCCCAGCTA TGAATGGAAG AAATTTTTCA CTTTTGTATG TCCTTTTTTT CACGCTTCGT 180TGCTTCGGAC AAAAAAATAG TGGAGGCACT CGGTGGAGGG AAGCTATCCT CGAGATGAAA 240AATTTCAAGC TCATCTCATC GTCCAAGTGG GACAGCAAGC TGAGGCTTCT GAAGAGGTTG 300AGGAAAATGG TCACCACGTT ATCGTACACA GAGAGGGCAT CGCACCCTTC GCCACTTGCT 360AAGCGTCTGT TTTCGCTTAT GGAGTCCAAG AAGACGAACC TGTGTGCCAG TGTCGATGTT 420CGTACCACAG AGGAGTTGCT CAAGCTCGTT GATACGCTTG GTCCTTATAT CTGTCTGTTG 480AAGACGCATA TTGATATCAT TGATGACTTC TCTATGGAGT CTACTGTGGC TCCACTGTTG 540GAGCTTTCAA AAGAGCACAA TTTCCTCATC TTTGAGGACC GTAAGTTTGC TGATATCGGC 600AACACCGTCA AGGCACAGTA CGCCGGTGGT GCGTTCAAGA TTGCACAATG GGCAGACATC 660ACCAACGCCC ACGGTGTCAC CGGTCGAGGT ATCGTCAAGG GGTTGAAGGA GGCTGCACAG 720GAAACCACGG ATGAGCCAAG AGGGCTGTTG ATGCTTGCTG AGCTAAGCTC CAAGGGCTCC 780TTCGCTCACG GGACATATAC CGAGGAGACC GTGGAGATTG CCAAAACTGA TAAGGACTTT 840TGTATTGGAT TCATCGCACA GAGAGACATG GGTGGCAGAG AAGATGGGTT CGACTGGATC 900ATCATGACAC CAGGCGTGGG ACTCGACGAT AAGGGCGACT CCCTGGGCCA ACAGTACAGA 960ACTGTCGATG AGGTTGTCAG TGGTGGCTGT GACATCATCA TCGTTGGTAG AGGCTTGTTT 1020GGAAAGGGAA GAGATCCAAC AGTGGAAGGT GAGCGTTATA GAAAAGCAGG CTGGGATGCT 1080TATCTCAAGA GATACTCAGC TCAATAAACG TTGAGCTCTG GCTTGTATAG GTTCACTTGT 1140ATAAAATGTT CATTACTGTT TTCGGAAGTT GTAGATTGC 1179(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度266個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假設(shè)非(ⅳ)反義非(ⅵ)初始來源(A)生物產(chǎn)朊假絲酵母(B)菌株NRRL Y-1084(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1..266(ⅹⅰ)SEQ ID NO:2的序列描述Met Val Thr Thr Leu Ser Tyr Thr Glu Arg Ala Ser His Pro Ser Pro1 5 10 15Leu Ala Lys Arg Leu Phe Ser Leu Met Glu Ser Lys Lys Thr Asn Leu20 25 30Cys Ala Ser Val Asp Val Arg Thr Thr Glu Glu Leu Leu Lys Leu Val35 40 45Asp Thr Leu Gly Pro Tyr Ile Cys Leu Leu Lys Thr His Ile Asp Ile50 55 60Ile Asp Asp Phe Ser Met Glu Ser Thr Val Ala Pro Leu Leu Glu Leu65 70 75 80Ser Lys Glu His Asn Phe Leu Ile Phe Glu Asp Arg Lys Phe Ala Asp85 90 95Ile Gly Asn Thr Val Lys Ala Gln Tyr Ala Gly Gly Ala Phe Lys Ile100 105 110Ala Gln Trp Ala Asp Ile Thr Asn Ala His Gly Val Thr Gly Arg Gly115 120 125Ile Val Lys Gly Leu Lys Glu Ala Ala Gln Glu Thr Thr Asp Glu Pro130 135 140Arg Gly Leu Leu Met Leu Ala Glu Leu Ser Ser Lys Gly Ser Phe Ala145 150 155 160His Gly Thr Tyr Thr Glu Glu Thr Val Glu Ile Ala Lys Thr Asp Lys165 170 175Asp Phe Cys Ile Gly Phe Ile Ala Gln Arg Asp Met Gly Gly Arg Glu180 185 190Asp Gly Phe Asp Trp Ile Ile Met Thr Pro Gly Val Gly Leu Asp Asp195 200 205Lys Gly Asp Ser Leu Gly Gln Gln Tyr Arg Thr Val Asp Glu Val Val210 215 220Ser Gly Gly Cys Asp Ile Ile Ile Val Gly Arg Gly Leu Phe Gly Lys225 230 235 240Gly Arg Asp Pro Thr Val Glu Gly Glu Arg Tyr Arg Lys Ala Gly Trp245 250 255Asp Ala Tyr Leu Lys Arg Tyr Ser Ala Gln260 265(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1190個堿基對(B)類型核酸(C)線性單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假設(shè)非(ⅳ)反義非(ⅵ)初始來源(A)生物產(chǎn)朊假絲酵母(B)菌株NRRL Y-1084(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞mat-peptide(B)位置1..1190(D)其它信息/產(chǎn)物=“酶咪唑甘油磷酸脫水酶”/基因=“HIS3”(ⅹⅰ)SEQ ID NO:3的序列描述ACCTCCCAAT CGCACAGGCA ACGATACAAA TTCAACGAGT ATTAACCATC TTGTGTGCTA60AAAAGAGTCG AAGAACAACA GTGCGCCAAA AAAAAAACTC CGGACCGCAC ACGACTCATC 120GCTCTCGGAA TATCCCTCGG AATGCGCCAC TTCCGGGTGC GTGGCCATCG GAAGAGCGAA 180GAGTCATCAC CATCGTACTT TAACGACTTA CTATTCTCAT TGAGTATTGA GAAGAAGGAT 240AGAGAAATGG CTGAACGAAC GGTGAAACCC CAGAGAAGAG CTCTTGTGAA TCGTACAACA 300AACGAAACGA AGATCCAGAT TTCCTTGAGT TTGGATGGTG GATACGTAAC GGTTCCGGAG 360TCAATCTTCA AGGATAAGAA GTACGACGAT GCTACTCAAG TCACCTCTTC TCAGGTGATT 420TCAATCAACA CGGGCGTTGG ATTCCTGGAC CACATGATCC ATGCTCTTGC GAAGCATGGT 480GGGTGGAGTT TGATTGTGGA GTGTATTGGT GATTTGCACA TTGACGACCA CCACACCACC 540GAGGACGTTG GTATTGCGCT GGGAGACGCC GTCAAGGAGG CCTTGGCATA TAGAGGTGTC 600AAGAGATTTG GTAGCGGGTT TGCTCCATTG GACGAGGCTC TGAGCAGAGC CGTTGTTGAT 660CTGAGTAACC GTCCGTTTGC CGTTGTTGAG CTGGGACTCA AGAGGGAAAA GATCGGTGAC 720TTGTCATGTG AGATGATTCC TCACTTCTTG GAGAGTTTTG CCCAAGCAGC TCATATCACG 780ATGCATGTTG ACTGTTTGAG AGGCTTCAAC GACCATCACA GAGCTGAATC CGCATTCAAG 840GCCCTGGCAG TCGCCATTAA GGAATCCATC TCCAGTAACG GCACCAATGA TGTTCCCTCA 900ACAAAGGGTG TTTTGTTCTA GATAGCAGTC TTTCTGTCTC TCTATTTATT CGATAAATAA 960GAACTATGTA TATCTTTCTC TTTTAATTGT ATATGTACAT GCACAGCTGA CTTCATCAAC 1020GGAAGATGTT ATTGAGTGCA GCCATTGTCT GACTGTCGTT ATCCTTCTTT GCGGATTTAC 1080CAAGGACTCT ACGACCACTG GTGGCTTTGA TATGATTTCC TGCCAGTACT TGTAAGAGGT 1140GCAACGTCAA TGGAAACGGC ACCGTTAGCC TTGATGGTTG CACGGGTAGG 1190(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度210個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假設(shè)非(ⅳ)反義非(ⅵ)初始來源(A)生物產(chǎn)朊假絲酵母(B)菌株NRRL Y-1084(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)
(B)位置1..210(ⅹⅰ)SEQ ID NO:4的序列描述Met Ala Glu Arg Thr Val Lys Pro Gln Arg Arg Ala Leu Val Asn Arg1 5 10 15Thr Thr Asn Glu Thr Lys Ile Gln Ile Ser Leu Ser Leu Asp Gly Gly20 25 30Tyr Val Thr Val Pro Glu Ser Ile Phe Lys Asp Lys Lys Tyr Asp Asp35 40 45Ala Thr Gln Val Thr Ser Ser Gln Val Ile Ser Ile Asn Thr Gly Val50 55 60Gly Phe Leu Asp His Met Ile His Ala Leu Ala Lys His Gly Gly Trp65 70 75 80Ser Leu Ile Val Glu Cys Ile Gly Asp Leu His Ile Asp Asp His His85 90 95Thr Thr Glu Asp Val Gly Ile Ala Leu Gly Asp Ala Val Lys Glu Ala100 105 110Leu Ala Tyr Arg Giy Val Lys Arg Phe Gly Ser Gly Phe Ala Pro Leu115 120 125Asp Glu Ala Leu Ser Arg Ala Val Val Asp Leu Ser Asn Arg Pro Phe130 135 140Ala Val Val Glu Leu Gly Leu Lys Arg Glu Lys Ile Gly Asp Leu Ser145 150 155 160Cys Glu Met Ile Pro His Phe Leu Glu Ser Phe Ala Gln Ala Ala His165 170 175Ile Thr Met His Val Asp Cys Leu Arg Gly Phe Asn Asp His His Arg180 185 190Ala Glu Ser Ala Phe Lys Ala Leu Ala Val Ala Ile Lys Glu Ser Ile195 200 205Ser Ser210(2)SEQ ID NO:5的信言息(ⅰ)序列特征(A)長度2607個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假設(shè)非(ⅳ)反義非(ⅵ)初始來源(A)生物產(chǎn)朊假絲酵母(B)菌株NRRL Y-1084(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞mat-peptide(B)位置1..2607(D)其它信息/產(chǎn)物=“酶轉(zhuǎn)化酶(β-果糖呋喃糖苷酶)/基因=“INV1”(ⅹⅰ)SEQ ID NO:5的序列描述ATCGGCACAG AAGCGACACT GATGTCCTCC GTCTAAAACT CATCGTTTAA TAACTTCTGC60ATTGGCAGCT CCGGAGCACA CTCAATTGGG ACTAAAAGAA GTAACATTTG TACTACAATG 120AGTCGTATAG AGTCATGTAT AAGAAGAACA GCAAGAAAAG AAAATATTGG TGCAGAATTC 180AACAGCTTCT GAGATCGTAA GAACAGCCAA TCATTTACCG GAATTCATTA TGATACCTAT 240AGAAAGACAC AAATTGTTGG GTAAAACAAC AGAACATACC TGTATAGGGG TTTATACGAG 300AATTTTCTTA GACGTCTCCC CCAGTGTCCG CCAAAGCAAC TTACATGTGG AGTTTGAATT 360TGGATGCGCC TTTTCCTTTA AACGGTCACC TGAGGTCTGA ATCTCAATGC AAATATCATT 420ACACCAATAA TAAAGGTGCA TATAACCCCA TAACCTGTAC ATAAAGAACG GCACATGATC 480CAATTTATCG ACGTTATGCC TTGTCAGACC ATCGTCGTGA ACTTTTCTAA ACCGGATAAA 540CTCTCGCACG GATTATAACG TGCGTCTGTG ATATGCACTC CGGAAAAAAC CCCCGTGGAG 600AAGTGAAGCG GCCACCTGTG GAGCAGAAAT TTCGATCGAC GTTTCAAGTT CAAATGGTTT 660CCTGTTGTCA AAGGGCTTGA GATTTACCAC TTGAGCATTT GTGCTCAGAA TTCGGAGAGC 720ATTCCCATGA GTGGTGTCCA AAAACACTAT AAAAGCAGCA CAGGGATGTC GTTGACAAAA 780GATGCCTCAG AGGACCAAGA AGACATCAAG AGTCTCACGA TGAACACTAG TTTAGTTGAT 840TCCAGCATTT ACAGACCATT AGTCCATCTA ACGCCACCAG TGGGGTGGAT GAACGACCCT 900AATGGTCTCT TCTACGATTC ATCTGAATCT ACTTACCATG TGTACTACCA ATACAACCCA 960AACGATACGA TTTGGGGATT GCCTCTATAT TGGGGACATG CCACCTCTGA TGATTTGTTA 1020ACGTGGGACC ACCATGCGCC TGCAATTGGA CCTGAGAATG ATGATGAGGG TATTTACTCT 1080GGATCTATAG TCATAGACTA CGATAATACC TCAGGGTTCT TTGACGATTC AACAAGACCA 1140GAACAGAGAA TCGTTGCCAT TTATACCAAT AACTTACCAG ATGTCGAGAC GCAAGACATT 1200GCCTATTCCA CGGACGGTGG TTATACTTTC GAAAAGTATG AAAACAACCC AGTTATAGAC 1260GTCAATTCGA CCCAATTTAG GGATCCGAAG GTGATTTGGT ATGAGGAAAC TGAACAATGG 1320GTCATGACTG TGGCAAAGAG TCAAGAGTAC AAGATCCAGA TTTACACCTC TGACAATTTG 1380AAAGACTGGA GTTTGGCCTC GAATTTCTCA ACCAAGGGTT ATGTTGGTTA TCAGTATGAA 1440TGTCCAGGTC TATTCGAAGC CACTATTGAA AACCCAAAGA GTGGTGACCC AGAGAAGAAA 1500TGGGTTATGG TCTTAGCAAT CAATCCAGGC TCACCTCTTG GTGGTTCCAT AAATGAATAC 1560TTTGTTGGTG ATTTCAACGG TACTGAATTC ATTCCAGATG ATGACGCTAC AAGATTTATG 1620GATACTGGTA AGGACTTCTA TGCCTTCCAA GCGTTCTTCA ATGCACCGGA GAATCGGTCA 1680ATTGGAGTTG CCTGGTCATC GAACTGGCAG TATTCCAACC AGGTTCCGGA TCCTGATGGA 1740TATAGAAGCT CCATGTCATC AATCAGAGAG TACACTCTGA GATATGTCAG TACGAATCCA 1800GAATCTGAAC AGTTGATCCT TTGTCAAAAA CCATTCTTTG TGAACGAGAC AGACTTGAAG 1860GTGGTTGAAG AGTACAAGGT TTCAAACAGT TCTTTGACCG TGGACCACAC GTTTGGAAGT 1920AGCTTTGCAA ACTCCAACAC CACTGGACTG TTGGATTTCA ACATGACTTT CACGGTTAAC 1980GGTACAACTG ACGTTACGCA GAAGGACTCC GTCACCTTTG AGCTCAGAAT CAAATCTAAC 2040CAAAGCGACG AGGCAATTGC GCTTGGTTAC GATTACAACA ACGAGCAATT CTACATCAAC 2100AGAGCCACAG AGAGCTACTT CCAGAGAACC AACCAGTTCT TCCAGGAGAG ATGGTCCACG 2160TACGTTCAGC CTCTCACAAT CACCGAATCT GGTGATAAAC AGTACCAGCT CTACGGATTG 2220GTTGATAACA ACATCCTTGA GTTGTACTTC AACGACGGGG CATTCACATC CACAAACACC 2280TTCTTCTTGG AGAAGGGCAA GCCATCAAAC GTCGATATCG TGGCAAGCTC CTCCAAGGAG 2340GCTTACCACC GTGGACCAGC TGACTGAGAC GTCTCACTGT TTGACGAATA CGCACGTGAA 2400AGCTATATAA GGGATCACGT GGTCTAGCCA CCCCAGTCTA AAAGCTTCAG CAAACCGCCA 2460CTATATAAAC AGACAGGTTT GTCACTTTTC AACAAAACAA ATATCTTCTT CTTTTACCCT 2520TCAGAGTAGT TTGTACGAGT GCTTTTTTCA ATTATATATA CAACAACGTG AGCTGCCTTT 2580GGATATGCAA TCAACAGCGC TCTCTTT 2607(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度533個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假設(shè)非(ⅳ)反義非(ⅵ)初始來源(A)生物產(chǎn)朊假絲酵母(B)菌株NRRL Y-1084(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1..533(ⅹⅰ)SEQ ID NO:6的序列描述Met Ser Leu Thr Lys Asp Ala Ser Glu Asp Gln Glu Asp Ile Lys Ser1 5 10 15Leu Thr Met Asn Thr Ser Leu Val Asp Ser Ser Ile Tyr Arg Pro Leu20 25 30Val His Leu Thr Pro Pro Val Gly Trp Met Asn Asp Pro Asn Gly Leu35 40 45Phe Tyr Asp Ser Ser Glu Ser Thr Tyr His Val Tyr Tyr Gln Tyr Asn50 55 60Pro Asn Asp Thr Ile Trp Gly Leu Pro Leu Tyr Trp Gly His Ala Thr65 70 75 80Ser Asp Asp Leu Leu Thr Trp Asp His His Ala Pro Ala Ile Gly Pro85 90 95Glu Asn Asp Asp Glu Gly Ile Tyr Ser Gly Ser Ile Val Ile Asp Tyr100 105 110Asp Asn Thr Ser Gly Phe Phe Asp Asp Ser Thr Arg Pro Glu Gln Arg115 120 125Ile Val Ala Ile Tyr Thr Asn Asn Leu Pro Asp Val Glu Thr Gln Asp130 135 140Ile Ala Tyr Ser Thr Asp Gly Gly Tyr Thr Phe Glu Lys Tyr Glu Asn145 150 155 160Asn Pro Val Ile Asp Val Asn Ser Thr Gln Phe Arg Asp Pro Lys Val165 170 175Ile Trp Tyr Glu Glu Thr Glu Gln Trp Val Met Thr Val Ala Lys Ser180 185 190Gln Glu Tyr Lys Ile Gln Ile Tyr Thr Ser Asp Asn Leu Lys Asp Trp195 200 205Ser Leu Ala Ser Asn Phe Ser Thr Lys Gly Tyr Val Gly Tyr Gln Tyr210 215 220Glu Cys Pro Gly Leu Phe Glu Ala Thr Ile Glu Asn Pro Lys Ser Gly225 230 235 240Asp Pro Glu Lys Lys Trp Val Met Val Leu Ala Ile Asn Pro Gly Ser245 250 255Pro Leu Gly Gly Ser Ile Asn Glu Tyr Phe Val Gly Asp Phe Asn Gly260 265 270Thr Glu Phe Ile Pro Asp Asp Asp Ala Thr Arg Phe Met Asp Thr Gly275 280 285Lys Asp Phe Tyr Ala Phe Gln Ala Phe Phe Asn Ala Pro Glu Asn Arg290 295 300Ser Ile Gly Val Ala Trp Ser Ser Asn Trp Gln Tyr Ser Asn Gln Val305 310 315 320Pro Asp Pro Asp Gly Tyr Arg Ser Ser Met Ser Ser Ile Arg Glu Tyr325 330 335Thr Leu Arg Tyr Val Ser Thr Asn Pro Glu Ser Glu Gln Leu Ile Leu340 345 350Cys Gln Lys Pro Phe Phe Val Asn Glu Thr Asp Leu Lys Val Val Glu355 360 365Glu Tyr Lys Val Ser Asn Ser Ser Leu Thr Val Asp His Thr Phe Gly370 375 380Ser Ser Phe Ala Asn Ser Asn Thr Thr Gly Leu Leu Asp Phe Asn Met385 390 395 400Thr Phe Thr Val Asn Gly Thr Thr Asp Val Thr Gln Lys Asp Ser Val405 410 415Thr Phe Glu Leu Arg Ile Lys Ser Asn Gln Ser Asp Glu Ala Ile Ala420 425 430Leu Gly Tyr Asp Tyr Asn Asn Glu Gln Phe Tyr Ile Asn Arg Ala Thr435 440 445Glu Ser Tyr Phe Gln Arg Thr Asn Gln Phe Phe Gln Glu Arg Trp Ser450 455 460Thr Tyr Val Gln Pro Leu Thr Ile Thr Glu Ser Gly Asp Lys Gln Tyr465 470 475 480Gln Leu Tyr Gly Leu Val Asp Asn Asn Ile Leu Glu Leu Tyr Phe Asn485 490 495Asp Gly Ala Phe Thr Ser Thr Asn Thr Phe Phe Leu Glu Lys Gly Lys500 505 510Pro Ser Asn Val Asp Ile Val Ala Ser Ser Ser Lys Glu Ala Tyr His515 520 525Arg Gly Pro Ala Asp530
權(quán)利要求
1．一種用于產(chǎn)朊假絲酵母的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，其中所用的宿主酵母細(xì)胞能被重組DNA轉(zhuǎn)化，并且該宿主細(xì)胞至少有一種生物合成途徑的缺陷。
2．一種權(quán)利要求1的用于產(chǎn)朊假絲酵母的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，其中宿主酵母細(xì)胞至少在一種氨基酸的生物合成途徑中有缺陷。
3．一種權(quán)利要求2的用于產(chǎn)朊假絲酵母的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，其中所述宿主酵母細(xì)胞在尿嘧啶生物合成途徑中有缺陷。
4．一種權(quán)利要求3的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，其中所述宿主酵母細(xì)胞的乳清酸核苷5′-磷酸脫羧酶的酶活性有缺陷。
5．一種權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，其中所述宿主酵母細(xì)胞是產(chǎn)朊假絲酵母NRRL Y-1084CUT35(保藏號待定)。
6．一種權(quán)利要求2的用于產(chǎn)朊假絲酵母的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，其中所用的宿主酵母細(xì)胞至少在組氨酸生物合成途徑中有缺陷。
7．一種權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，其中該宿主酵母細(xì)胞的咪唑甘油磷酸脫水酶的酶活性有缺陷。
8．一種權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，其中所述宿主酵母細(xì)胞是產(chǎn)朊假絲酵母Y-1084TMN3。
9．一種權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，其中的重組DNA包含一種能互補(bǔ)宿主的生物合成途徑缺陷的功能基因。
10．一種權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，其中所述功能基因是產(chǎn)朊假絲酵母的URA3基因。
11．一種權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，其中所述重組DNA是質(zhì)粒pURA5和pUCURA3。
12．一種權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，其中所述功能基因是產(chǎn)朊假絲酵母的HIS3基因。
13．一種權(quán)利要求12的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，其中的重組DNA是質(zhì)粒pHCU37和pHCU40。
14．一種能用重組DNA轉(zhuǎn)化的產(chǎn)朊假絲酵母宿主細(xì)胞，其中所述宿主至少有一種生物合成途徑的缺陷。
15．一種權(quán)利要求14的酵母宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞至少有一種氨基酸生物合成途徑的缺陷。
16．一種權(quán)利要求15的酵母宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞至少在尿嘧啶生物合成途徑有缺陷。
17．一種權(quán)利要求16的酵母宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞的乳清酸核苷5′-磷酸脫羧酶的酶活性有缺陷。
18．一種權(quán)利要求17的酵母宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是產(chǎn)朊假絲酵母NRRL Y-1084CUT35(保藏號待定)。
19．一種權(quán)利要求15的酵母宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞在組氨酸生物合成途徑有缺陷。
20．一種權(quán)利要求19的酵母宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞的咪唑甘油磷酸脫水酶的酶活性有缺陷。
21．一種權(quán)利要求20的酵母宿主細(xì)胞，其中它是產(chǎn)朊假絲酵母(NRRL Y-1084)菌株TMN3。
22．一種能轉(zhuǎn)化產(chǎn)朊假絲酵母的酵母宿主細(xì)胞的重組DNA材料，其中所述重組DNA材料包含一種能互補(bǔ)宿主的生物合成途徑缺陷的功能基因。
23．一種權(quán)利要求22的重組DNA材料，其中的功能基因是產(chǎn)朊假絲酵母的URA3基因。
24．一種權(quán)利要求23的重組DNA材料，其中重組DNA材料是質(zhì)粒pURA5以及pUCURA3。
25．一種權(quán)利要求22的重組DNA材料，其中的功能基因是產(chǎn)朊假絲酵母的HIS3基因。
26．一種權(quán)利要求25的重組DNA材料，其中的重組DNA材料是質(zhì)粒pHCU37和pHCU40。
27．一種用于產(chǎn)朊假絲酵母轉(zhuǎn)化的方法，其包括(a)用堿金屬鹽處理產(chǎn)朊假絲酵母宿主菌株；(b)在適于轉(zhuǎn)化的條件下用重組DNA材料接觸步驟(a)的細(xì)胞產(chǎn)物；(c)在合適的條件下進(jìn)行酵母菌宿主菌株的電穿孔；(d)在選擇性的條件下將步驟(c)中的細(xì)胞產(chǎn)物接種于培養(yǎng)基。
28．如權(quán)利要求27的方法，其中步驟(a)中所用的堿金屬鹽是濃度為50mM的醋酸鋰。
29．如權(quán)利要求27的方法，其中，適于步驟(b)的轉(zhuǎn)化的條件包括-用70％聚乙二醇(PEG)與經(jīng)醋酸鋰和重組DNA處理過的等體積細(xì)胞懸液混合；-在30℃溫育60分鐘；-將混合物在42℃處理5分鐘進(jìn)行熱休克刺激；-冰上冷卻5分鐘。
30．如權(quán)利要求27的方法，其中適于步驟(c)的酵母宿主菌株的電穿孔條件為-電場3.5kV/cm；-電阻800Ω，且-電容25μF。
31．如權(quán)利要求27的用于產(chǎn)朊假絲酵母轉(zhuǎn)化的方法，其中它利用了能由重組DNA材料轉(zhuǎn)化的酵母宿主細(xì)胞，所述宿主在至少一種生物合成途徑中有缺陷。
32．如權(quán)利要求31的方法，其中它利用了在至少一種氨基酸生物合成途徑中有缺陷的酵母宿主細(xì)胞。
33．如權(quán)利要求32的方法，其中它利用了在尿嘧啶生物合成途徑中有缺陷的酵母宿主細(xì)胞。
34．如權(quán)利要求33的方法，其中所述酵母宿主細(xì)胞在乳清酸核苷-5-磷酸脫羧酶活性中有缺陷。
35．如權(quán)利要求34的方法，其中所述宿主酵母細(xì)胞是產(chǎn)朊假絲酵母NRRL Y-1084CUT35(保藏號待定)。
36．如權(quán)利要求32的方法，其中它利用了至少在組氨酸生物合成途徑中有缺陷的酵母宿主細(xì)胞。
37．如權(quán)利要求36的方法，其中所述酵母宿主細(xì)胞在咪唑甘油磷酸脫水酶活性中有缺陷。
38．如權(quán)利要求37的方法，其中所述宿主酵母細(xì)胞是產(chǎn)朊假絲酵母NRRL Y-1084 TMN3。
39．如權(quán)利要求31的方法，其中所述重組DNA材料包含一種能互補(bǔ)宿主的生物合成途徑缺陷的功能基因。
40．如權(quán)利要求39的方法，其中所述功能基因是產(chǎn)朊假絲酵母的URA3基因。
41．如權(quán)利要求40的方法，其中所述重組DNA材料是質(zhì)粒pURA5以及質(zhì)粒pUCURA3。
42．如權(quán)利要求39的方法，其中的功能基因是產(chǎn)朊假絲酵母的HIS3基因。
43．如權(quán)利要求42的方法，其中所述重組DNA材料是質(zhì)粒pHCU37和質(zhì)粒pHCU40。
44．一種編碼產(chǎn)朊假絲酵母URA3基因的DNA序列(Seq.Id.No.1)。
45．一種編碼產(chǎn)朊假絲酵母HIS3基因的DNA序列(Seq.Id.No.3)。
46．一種編碼產(chǎn)朊假絲酵母INV1基因的DNA序列(Seq.Id.No.5)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于在酵母菌產(chǎn)朊假絲酵母中表達(dá)外源蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng),該系統(tǒng)的建立是基于得到了該菌的營養(yǎng)缺陷型突變株以及從基因組文庫中分離出能互補(bǔ)所述營養(yǎng)缺陷型突變的不同的基因。此轉(zhuǎn)化系統(tǒng)用從產(chǎn)朊假絲酵母NRRLY－1084菌株得到的新的營養(yǎng)缺陷型突變株作為宿主,該突變株主要在尿嘧啶和組氨酸途徑中有缺陷,并用包含作為選擇性標(biāo)記的上述酵母菌的URA和HIS基因的質(zhì)粒來轉(zhuǎn)化。
文檔編號C12N9/24GK1237208SQ97199610
公開日1999年12月1日 申請日期1997年10月3日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月3日
發(fā)明者L·羅德里古茨密挪卡爾, F·P·薩威斯艾斯比挪薩, M·E·科薩雷茨馬丁尼斯, T·里威羅巴易薩, L·比薩比圖羅, E·帕菲雷儀斯, J·M·德加多伯阿達(dá) 申請人:基因工程和生物技術(shù)中心