專(zhuān)利名稱(chēng)：用重組耶爾森氏菌將蛋白質(zhì)送遞到真核生物細(xì)胞中的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組耶爾森氏菌及其將蛋白質(zhì)送遞到真核生物細(xì)胞中的用途。
耶爾森氏菌引發(fā)人和嚙齒類(lèi)動(dòng)物疾病，從腸炎和淋巴結(jié)炎到鼠疫。耶爾森氏菌屬包括3個(gè)種小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，其是人類(lèi)最盛行的耶爾森氏菌屬的種，并且其引起寬范圍腸胃綜合癥；假結(jié)核耶爾森氏菌，其引起腺炎和敗血癥；和鼠疫耶爾森氏菌，其是鼠疫的致病原。
除了感染途徑不同外，這三種耶爾森氏菌屬的種都具有人或嚙齒類(lèi)動(dòng)物宿主非特異性免疫應(yīng)答和在宿主淋巴組織中增生的抗性能力。病理解剖學(xué)檢查表明在感染動(dòng)物的炎癥或?qū)嵸|(zhì)細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有檢查到耶爾森氏菌(Simonet等，(1990)，感染、免疫(Infect.Immun.)58:841-845)。與體內(nèi)這些觀察相吻合，耶爾森氏菌是巨噬細(xì)胞和多形核白細(xì)胞體外吞噬作用抗性的。參見(jiàn)Cornelis等的綜述，(1997)，微生物分子學(xué)(Mol.Mierobiol).23(5):861-867。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌還具有進(jìn)入某些培養(yǎng)的上皮細(xì)胞的能力，這一過(guò)程通常稱(chēng)之為侵入(Miller等(1988)，感染、免疫(Infect.Immun.)56:1242-1248)。
遺傳學(xué)研究表明一種70kb質(zhì)粒(pYV)決定耶爾森氏菌的致病力，所述質(zhì)粒編碼和調(diào)控稱(chēng)之為Yops(對(duì)應(yīng))Yersinia outer proteins)的一組蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。這些Yops形成整合的抗宿主系統(tǒng)，該系統(tǒng)使得耶爾森氏菌與宿主細(xì)胞表面胞外粘著并且接著將一組毒性效應(yīng)子蛋白注入宿主細(xì)胞的細(xì)胞溶膠。近期的研究進(jìn)一步表明，這樣一種抗宿主系統(tǒng)，也稱(chēng)之為“耶爾森氏菌致病子(virulon)”，由下面4個(gè)元件組成(ⅰ)專(zhuān)用于從細(xì)菌細(xì)胞分泌Yop蛋白質(zhì)的稱(chēng)之為Ysc的接觸或Ⅲ型分泌系統(tǒng)；(ⅱ)由YopB,YopD和可能的其它蛋白質(zhì)例如LcrV組成的用于將效應(yīng)子蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到真核宿主細(xì)胞中的一組轉(zhuǎn)運(yùn)體；(ⅲ)控制元件和識(shí)別系統(tǒng)(YopN和YopG)；和(ⅳ)注入(或轉(zhuǎn)運(yùn))到真核宿主細(xì)胞并且破壞這樣的宿主細(xì)胞的功能的一組“效應(yīng)子蛋白”，包括YopE,YopH,YopO/YpkA,YopM和YopP/YopJ。這些基因的轉(zhuǎn)錄受溫度和與真核細(xì)胞接觸兩者的控制。參見(jiàn)Cornelis等(1997)的綜述。
效應(yīng)子蛋白以多種方式破壞宿主細(xì)胞的功能。23kd的YopE是破壞培養(yǎng)的海拉細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白-微絲結(jié)構(gòu)的細(xì)胞毒素(Rosquvist等，微生物分子學(xué)4(Mol.Microbiol.4),657-667)。Rosquvist等(1991)，感染、免疫59(Infect.Immun.59):4562-4569)。51kdYopH是對(duì)感染的巨噬細(xì)胞的酪氨酸-磷酸化蛋白起作用的與真核生物的PTP酶相關(guān)的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化酶(PTP酶)(Hartland等(1994)感染、免疫62(Infect.Immun.62):4445-4453)。可能是這種作用的后果，YopH通過(guò)抑制培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞細(xì)菌攝入和氧化裂解(Rosquvist等(1988)，感染、免疫56(Infect.Immun.56):2139-2143；Bliska等(1995)，感染.免疫63(Infect.Immun.63):681-685)。YopO(或YpkA)是定向真核生物細(xì)胞的質(zhì)膜內(nèi)表面的并且可能與真核生物細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相互作用的81kd絲氨酸/蘇氨酸激酶(Hakansson等(1996)，微生物分子學(xué)20(Mol.Microbiol.20)，593-603)。YopM是具有12個(gè)富亮氨酸重復(fù)基序的酸性41kd蛋白質(zhì)，提示YopM可能結(jié)合凝血酶并且與干擾感染反應(yīng)的血小板介導(dǎo)作用(Leung等(1989)，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacterial.)171:4623-4632).YopP涉及巨噬細(xì)胞程序死亡的誘導(dǎo)(Mills等(1997)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Acad.Natl.Sci.USA)94:12638-12643)。
研究了這些效應(yīng)子蛋白的分子結(jié)構(gòu)來(lái)確定其分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)所需要的每一個(gè)效應(yīng)子蛋白中的元件。為了該目的，通過(guò)融合用某些報(bào)道分子酶例如百日咳博德特氏桿菌(Borderella pertussis)環(huán)細(xì)胞溶素的鈣調(diào)蛋白-激活的腺苷酸環(huán)化酶區(qū)(或Cya)截短的不同長(zhǎng)度的Yop效應(yīng)子蛋白基因工程方法制備了雜合蛋白，通過(guò)以報(bào)道分子蛋白的酶活性為基礎(chǔ)的測(cè)試可以檢測(cè)成功的分泌和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。通過(guò)應(yīng)用這一研究，Sory等公開(kāi)了小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的YopE和YopH是由三個(gè)區(qū)組成的模塊分子，即分泌所需要的N-末端區(qū)，轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中所需要的轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)，和是毒性效應(yīng)子活性原因的C-末端催化區(qū)(Sory等，(1995)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Acad.Natl.Sci.USA)92:11998-12002)。對(duì)于小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的YopM證實(shí)了相同的區(qū)組構(gòu)(Boland等，(1996),EMBOJ.15:5191-5201)。
本發(fā)明提供用于將蛋白質(zhì)安全地運(yùn)送到真核生物細(xì)胞中的重組耶爾森氏菌。這樣的耶爾森氏菌在功能效應(yīng)子蛋白的產(chǎn)生力方面不強(qiáng)，但是被賦與了功能分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。本發(fā)明進(jìn)一步提供與這樣的用于將期望的蛋白質(zhì)安全而有效地運(yùn)送到真核生物細(xì)胞中的突變體耶爾森氏菌相關(guān)使用的表達(dá)載體。該項(xiàng)研究不僅用于研究給定蛋白質(zhì)的功能，而且還用于設(shè)計(jì)治療方案。例如，可以使用本發(fā)明的重組耶爾森氏菌將病原體蛋白質(zhì)例如腫瘤相關(guān)蛋白，寄生蟲(chóng)抗原或者病毒抗原送遞到呈遞抗原細(xì)胞以誘導(dǎo)對(duì)于這樣一種蛋白質(zhì)特異性的免疫應(yīng)答。
大多數(shù)進(jìn)行性生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞可能表達(dá)免疫原性腫瘤相關(guān)抗原(TAAs)，也稱(chēng)之為排斥抗原(TRAs)。TRAs和其它抗原表位一樣通過(guò)MHC分子存在于腫瘤細(xì)胞的表面，并且在體內(nèi)和體外表現(xiàn)出誘導(dǎo)CTL應(yīng)答。參見(jiàn)，例如，Bruggen等，(1991)Science254:1643-1647。但是，這種表達(dá)TRA的腫瘤細(xì)胞不激發(fā)體內(nèi)可靠的能控制惡性細(xì)胞生長(zhǎng)的抗腫瘤免疫應(yīng)答。Boon等(1992)癌癥研究(Cancer Surveys)13:23-37；T.Boon(1993)Int.J.Cancer54:177-180；T.Boon(1992)癌癥研究進(jìn)展(Advances Cancer Res.58:177-209)。
鑒定了多種編碼腫瘤排斥抗原前體(或TRAPs)基因，它們?cè)谀[瘤細(xì)胞中被加工為T(mén)RAs。這樣的編碼TRAP的基因包括下面成員MAGE家族，BAGE家族，DAGE/Prame家族，GAGE家族，RAGE家族，SMAGE家族，NAG，酪氨酸酶，Melan-A/MART-1,gp100,MUC-1,TAG-72,CA125，突變的原癌基因例如p21ras，突變的腫瘤抑制蛋白基因例如p53，腫瘤相關(guān)病毒抗原例如HPV16 E7。參見(jiàn)，例如Eynde和Bruggen(1997)的綜述，Curr.Opin.Immunol.9:684-693,Sahin等(1997)Curr.Opin.Immunol.9:709-716，和Shawler等(1997)藥物學(xué)進(jìn)展(Advances in Pharmacology)40:309-337,Academic Press,Inc.:San Diego.California。這些基因的鑒定使重組產(chǎn)生TRAs或TRAPs，它們可以接下來(lái)用作治療各種各樣的癌癥的疫苗。
本發(fā)明涉及重組耶爾森氏菌將期望的蛋白質(zhì)送遞到真核生物細(xì)胞中的用途。特別地，本發(fā)明的重組耶爾森氏菌用于將蛋白質(zhì)或者其衍生物送遞給呈遞抗原細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，呈遞抗原細(xì)胞在接受送遞后存在能被T細(xì)胞識(shí)別的抗原表位。因此，本發(fā)明的重組耶爾森氏菌可以應(yīng)用在各種各樣的免疫診斷或治療方法中。
本發(fā)明通過(guò)下面的公開(kāi)進(jìn)一步詳細(xì)闡述。
本發(fā)明涉及重組耶爾森氏菌及其將蛋白質(zhì)送遞到真核生物細(xì)胞中的用途。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供功能效應(yīng)子蛋白產(chǎn)生力不強(qiáng)的突變耶爾森氏菌菌株。本發(fā)明優(yōu)選的突變耶爾森氏菌菌株是指定為yopEHMOP的五重突變體菌株。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供用于將異源蛋白質(zhì)送遞給真核生物細(xì)胞的表達(dá)載體。根據(jù)本發(fā)明，這樣一種表達(dá)載體特征在于(自5’至3’方向)一個(gè)啟動(dòng)子，編碼送遞信號(hào)的第一核酸序列，融合在第一核酸序列上的編碼要送遞的異源蛋白質(zhì)的第二核酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的該實(shí)施方案，所述啟動(dòng)子優(yōu)選是選自耶爾森氏菌致病子基因；更優(yōu)選地，是編碼效應(yīng)子的基因；更優(yōu)選地，是YopE基因。送遞信號(hào)是選自耶爾森氏菌效應(yīng)子的多肽序列，包括YopE,YopH,YopO/YpkA,YopM和YopP/YopJ。這樣的送遞信號(hào)可以由耶爾森氏菌的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)識(shí)別。本發(fā)明的異源蛋白質(zhì)包括天然存在的蛋白質(zhì)或者其部分，例如腫瘤相關(guān)蛋白或者病原體的已知抗原。本發(fā)明的異源蛋白質(zhì)還包括人工設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)，例如蛋白質(zhì)的符合讀框地的融合或者蛋白質(zhì)的部分。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供重組耶爾森氏菌，即用本發(fā)明的表達(dá)載體進(jìn)一步轉(zhuǎn)化的上述突變體菌株耶爾森氏菌。這樣的重組耶爾森氏菌優(yōu)選用于將異源蛋白質(zhì)送遞到真核生物細(xì)胞中。優(yōu)選的真核生物細(xì)胞是能呈遞免疫原性表位的呈遞抗原細(xì)胞，所述免疫原性表位自送遞的異源蛋白質(zhì)衍生。
本發(fā)明的另一方面，用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(細(xì)胞免疫應(yīng)答，或者體液免疫應(yīng)答，或者兩者的組合)的免疫原性組合物和方法中涉及這樣的重組耶爾森氏菌。
本發(fā)明的另一方面，在用于評(píng)價(jià)接種方案的有效性的體外方案中可以使用本發(fā)明的重組耶爾森氏菌。本發(fā)明的重組耶爾森氏菌還可以在來(lái)自體內(nèi)的方案中使用以產(chǎn)生特異性CTLs和以使用這樣的CTLs用于治療各種病癥，例如腫瘤或者病原體感染。本發(fā)明的重組耶爾森氏菌還可以在體內(nèi)方案中使用，即作為重組疫苗，來(lái)治療患病(例如腫瘤或病原體感染)的患者。


圖1圖示了表達(dá)載體pMS111-MAGE-1(YopE130-MAGE1)的質(zhì)粒圖。
圖2(A)圖示用與重組耶爾森氏菌混合的EBV-轉(zhuǎn)化的人B細(xì)胞(HLA-A1)刺激CTL82/30的過(guò)程；(B)圖示激活的CTLs釋放的IFN-γ的量。
圖3圖示小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌YopM基因的序列。
圖4圖示小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌YopE基因的序列。
圖5圖示小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌YopH基因的序列。
圖6圖示小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌YopP基因的序列。
圖7圖示小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌YopP基因的序列。
本發(fā)明涉及重組耶爾森氏菌及其將蛋白質(zhì)送遞到真核生物細(xì)胞中的用途。
特別地，本發(fā)明提供功能效應(yīng)子蛋白產(chǎn)生力不強(qiáng)的突變耶爾森氏菌菌株。本發(fā)明進(jìn)一步提供表達(dá)載體，當(dāng)轉(zhuǎn)化到上述突變體菌株耶爾森氏菌中時(shí)，其允許將期望的蛋白質(zhì)，例如MAGE-1蛋白質(zhì)，送遞到真核生物細(xì)胞例如EBV-轉(zhuǎn)化的人B細(xì)胞中。本發(fā)明公開(kāi)了當(dāng)接受送遞的蛋白質(zhì)后，呈遞抗原細(xì)胞處理送遞的蛋白質(zhì)，并且在MHC分子引發(fā)對(duì)于送遞的蛋白質(zhì)特異性的免疫應(yīng)答的情況下，遞呈抗原性表位。例如，從本發(fā)明重組耶爾森氏菌攝取MAGE-1蛋白質(zhì)后，人B細(xì)胞被對(duì)于MAGE-1表位特異性的CTL克隆所識(shí)別。因此，本發(fā)明提供對(duì)于將期望的蛋白質(zhì)送遞到真核生物細(xì)胞中具有減小的毒性的有效重組耶爾森氏菌系統(tǒng)。
這里所使用的術(shù)語(yǔ)“耶爾森氏菌”指耶爾森氏菌屬的所有的種，包括小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，假結(jié)核耶爾森氏菌和鼠疫耶爾森氏菌。
為了本發(fā)明的目的，這里所使用的術(shù)語(yǔ)“重組耶爾森氏菌”指用本發(fā)明表達(dá)載體基因工程轉(zhuǎn)化的耶爾森氏菌。
這里所使用的術(shù)語(yǔ)“送遞”指將來(lái)自耶爾森氏菌的蛋白質(zhì)運(yùn)送給真核生物細(xì)胞，包括在耶爾森氏菌中表達(dá)蛋白質(zhì)，從這樣的耶爾森氏菌分泌表達(dá)的蛋白質(zhì)和通過(guò)這樣的耶爾森氏菌將分泌的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到真核生物細(xì)胞的細(xì)胞溶膠中。因此，“送遞信號(hào)”指耶爾森氏菌的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可以識(shí)別的多肽序列并且指將蛋白質(zhì)從耶爾森氏菌送遞給真核生物細(xì)胞。
如這里所使用的，蛋白質(zhì)的“分泌”指這樣的蛋白質(zhì)向外通過(guò)耶爾森氏菌的細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。蛋白質(zhì)的“轉(zhuǎn)運(yùn)”指這樣的蛋白質(zhì)跨躍真核生物細(xì)胞的質(zhì)膜送遞到這樣的真核生物細(xì)胞的細(xì)胞溶膠中。
這里所使用的“真核生物細(xì)胞”，耶爾森氏菌所粘附的表面，也稱(chēng)之為“靶細(xì)胞”或“靶真核生物細(xì)胞”。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了功能效應(yīng)子蛋白產(chǎn)生力不強(qiáng)的突變體耶爾森氏菌菌株。
耶爾森氏菌的效應(yīng)子蛋白，即通常轉(zhuǎn)運(yùn)到靶真核生物細(xì)胞的細(xì)胞溶膠中的耶爾森氏菌致病子蛋白對(duì)于靶細(xì)胞是有毒性的。因此，“功能效應(yīng)子蛋白”指具有確定的催化活性并且能激發(fā)對(duì)于靶細(xì)胞的特異性毒性的效應(yīng)子蛋白。
因此，本發(fā)明的突變體耶爾森氏菌用于以減小的毒性，即不完全廢除或殺死靶細(xì)胞的毒性，將蛋白質(zhì)送遞給真核生物細(xì)胞。為了送遞蛋白質(zhì)的目的，本發(fā)明的突變體耶爾森氏菌的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)需要是完整的。
從小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌克隆了5個(gè)效應(yīng)子基因，它們是YopE,YopH,YopO,YopM和YopP(圖3-7)。從假結(jié)核耶爾森氏菌克隆了等價(jià)效應(yīng)子基因，分別命名為YopE,YopH,YpKA,YopM和YopJ。從鼠疫耶爾森氏菌克隆了一些效應(yīng)子基因。這些Yop基因的核酸序列對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是可以得到的，例如從Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)得到。
為了本發(fā)明的目的，用斜體字字母表示編碼效應(yīng)子的基因以區(qū)別于效應(yīng)子蛋白。用小寫(xiě)字母表示突變體效應(yīng)子基因。例如YopE指YopE基因編碼的效應(yīng)子蛋白。YopE代表野生型基因，而YopE代表具有突變的基因。
根據(jù)本發(fā)明，突變體耶爾森氏菌菌株可以通過(guò)在至少一個(gè)效應(yīng)子編碼基因中誘導(dǎo)至少一個(gè)突變而產(chǎn)生。優(yōu)選地，這樣的效應(yīng)子編碼基因包括YopE,YopH,YopH/YpkA,YopM和YopP/YopJ。專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員可以使用任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在這些Yop基因中產(chǎn)生突變。Sambrook等，描述了一般的這樣的技術(shù)。參見(jiàn)Sambrook等，(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版冷泉港，紐約。
術(shù)語(yǔ)“突變”在這里用作一般術(shù)語(yǔ)并且包括單一堿基對(duì)和多個(gè)堿基對(duì)的變化。這樣的突變可以包括取代，移碼突變，缺失和截短。
根據(jù)本發(fā)明，在效應(yīng)子編碼基因的啟動(dòng)子區(qū)中可以產(chǎn)生突變，這樣消除所述效應(yīng)子基因的表達(dá)。
在效應(yīng)子編碼基因的編碼區(qū)中也可以產(chǎn)生突變，這樣消除編碼的效應(yīng)子蛋白的催化活性。效應(yīng)子蛋白的“催化活性”指效應(yīng)子蛋白的抗靶細(xì)胞功能，即毒性。這樣的活性由效應(yīng)子蛋白的催化結(jié)構(gòu)區(qū)中的催化基序控制。效應(yīng)子蛋白的催化結(jié)構(gòu)區(qū)和/或催化基序的鑒定方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員知識(shí)范圍之內(nèi)。參見(jiàn)，例如，Sory等(1995),Boland等(1996)和Cornels等(1997)。
因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是缺失整個(gè)催化結(jié)構(gòu)區(qū)。另一種優(yōu)選的突變是效應(yīng)子編碼基因中的移碼突變，使得從這樣的“移碼”基因表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物中不存在催化結(jié)構(gòu)區(qū)。最優(yōu)選的突變是整個(gè)編碼區(qū)缺失的突變。
本發(fā)明還包括其它突變，例如小的缺失或堿基對(duì)的取代，這在效應(yīng)子蛋白的催化基序中產(chǎn)生，導(dǎo)致給定的效應(yīng)子蛋白的催化活性的破壞。
可用許多的方法將Yop基團(tuán)中產(chǎn)生的突變導(dǎo)入耶爾森氏菌。一種這樣的方法涉及將突變的Yop基因(即yop基因)克隆到“自發(fā)失活”載體中，其能通過(guò)等位變化將突變的yop基因?qū)胍疇柹暇＿@樣的“自發(fā)失活”載體描述于Kaniga等(1991)基因(Gene)109:137-141和Sarker等(1997)微生物分子學(xué)(Mol.Microbiol)23:409-411。在該方法中，多個(gè)yop基因產(chǎn)生的突變可以依次導(dǎo)入耶爾森氏菌，得到多突變重組耶爾森氏菌。這些突變的yop序列導(dǎo)入的順序不是重要的。
本發(fā)明優(yōu)選的突變體耶爾森氏菌菌株是五重突變型耶爾森氏菌菌株，其中所有的效應(yīng)子編碼基因是突變的，使得得到的耶爾森氏菌不再產(chǎn)生任何功能效應(yīng)子蛋白。對(duì)于小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，這樣的五重突變型耶爾森氏菌菌株標(biāo)記為yopEHOMP或者對(duì)于假結(jié)核耶爾森氏菌標(biāo)記為yopEHAM。這樣的yopEHOMP菌株的一個(gè)例子是小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌MRS40(pABL403)。
在一些條件下，可能期望只是一些而不是全部的效應(yīng)子yop基因突變。例如，當(dāng)送遞要指向巨噬細(xì)胞時(shí)，YopH優(yōu)選不突變，因?yàn)閅opH被認(rèn)為是通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞裂解作用。Rosqvist等(1988)和Rosqvist等(1989)。因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及五重突變型耶爾森氏菌之外的多突變耶爾森氏菌，例如雙重突變型，三重突變型和四重突變型耶爾森氏菌。
或者，其中在野生型YopH基因可以通過(guò)各種已知轉(zhuǎn)化方法(下文進(jìn)一步描述)導(dǎo)入五重突變型Y.yopEHOMP菌株情況下，五重突變型耶爾森氏菌菌株yopEHOMP仍然可以用于對(duì)巨噬細(xì)胞的送遞。在該方法中，可以產(chǎn)生多突變耶爾森氏菌菌株，其中期望的一組Yop基因發(fā)生突變，使得只有感興趣的蛋白質(zhì)送遞到靶細(xì)胞中。
本發(fā)明的另一方面涉及與本發(fā)明突變體耶爾森氏菌菌株組合使用用于將期望的蛋白質(zhì)送遞到真核生物細(xì)胞中的表達(dá)載體。根據(jù)本發(fā)明，這樣一種載體特征在于(自5’至3’方向)一個(gè)啟動(dòng)子，編碼送遞信號(hào)的第一核酸序列，融合到第一核酸序列上的編碼要送遞的異源蛋白質(zhì)的第二核酸序列。
根據(jù)本發(fā)明，表達(dá)載體的啟動(dòng)子優(yōu)選選自耶爾森氏菌致病子基因。“耶爾森氏菌致病子基因”指耶爾森氏菌pYV質(zhì)粒上的基因，其表達(dá)受溫度和與靶細(xì)胞接觸兩者的控制。參見(jiàn)Cornelis等(1997)綜述。這樣的基因包括分泌機(jī)制元件的編碼基因(Ysc基因)，轉(zhuǎn)運(yùn)體編碼基因(YopB,YopD和LcrV)，調(diào)控元件的編碼基因(YopN和LcrG)和效應(yīng)子編碼基因(YopE,YopH,YopO/YpKA,YopM和YopP/YopJ)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子來(lái)自效應(yīng)子編碼基因，選自YopE,YopH,YopO/YpKA,YopM和YopP/YopJ之一。更優(yōu)選地，啟動(dòng)子來(lái)自YopE。
進(jìn)一步根據(jù)本發(fā)明，編碼送遞信號(hào)的第一DNA序列與所述啟動(dòng)子操作連接。
上文描述的“送遞信號(hào)”指可以被耶爾森氏菌的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)識(shí)別從而指導(dǎo)蛋白質(zhì)分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)到真核生物細(xì)胞中的多肽。
根據(jù)本發(fā)明，這樣一種多肽選自效應(yīng)子蛋白。所述效應(yīng)子蛋白包括YopE,YopH,YopO/YpkA,YopM和YopP/YopJ。優(yōu)選地，效應(yīng)子蛋白是YopE。更優(yōu)選地，效應(yīng)子蛋白是小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的YopE。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉能送遞一種蛋白質(zhì)的效應(yīng)子蛋白的多肽序列的鑒定方法。例如，Sory等(1994)描述了這樣一種方法。簡(jiǎn)要地說(shuō)，來(lái)自Yop蛋白的不同部分的多肽序列可以符合讀框地融合到報(bào)道分子酶上，例如百日咳博德特氏桿菌(Bordetella pertussis)環(huán)細(xì)胞溶素的鈣調(diào)蛋白-激活的腺苷酸環(huán)化酶區(qū)(或Cya)。通過(guò)在感染的真核生物細(xì)胞中出現(xiàn)導(dǎo)致cAMP蓄積的環(huán)化酶活性指示將Yop-Cya雜合蛋白送遞到真核生物細(xì)胞的細(xì)胞溶膠中。這樣的送遞信號(hào)多肽的例子包括來(lái)自小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌YopE130(YopE的N-末端130個(gè)氨基酸)，YopE50,YopM100和YopH71。
通過(guò)應(yīng)用這項(xiàng)研究，如果期望，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定要求的最小序列，即長(zhǎng)度最短的能送遞一種蛋白質(zhì)的連續(xù)氨基酸序列。參見(jiàn)，例如，Sory等(1994)。因此，本發(fā)明優(yōu)選的送遞信號(hào)由至少能送遞一種蛋白質(zhì)的Yop效應(yīng)子蛋白的氨基酸最小序列組成。
進(jìn)一步根據(jù)本發(fā)明，編碼異源蛋白質(zhì)的第二DNA序列與本發(fā)明載體中的第一DNA序列符合讀框地融合，以送遞到真核生物細(xì)胞中。
這里所使用的術(shù)語(yǔ)“異源蛋白質(zhì)”指一種不是耶爾森氏菌Yop蛋白的蛋白質(zhì)。“Yop蛋白”指分泌的耶爾森氏菌致病子蛋白質(zhì)，包括轉(zhuǎn)運(yùn)體和效應(yīng)子。
根據(jù)本發(fā)明，“一種異源蛋白質(zhì)”包括天然存在的蛋白質(zhì)或者其部分。術(shù)語(yǔ)“一種蛋白質(zhì)的部分”包括長(zhǎng)度足以是抗原性的一種蛋白質(zhì)的肽或多肽片段。優(yōu)選地，這樣一個(gè)片段由一種蛋白質(zhì)的至少8個(gè)或9個(gè)氨基酸組成。本發(fā)明中使用的“一種異源蛋白質(zhì)”也包括基因工程制備的蛋白質(zhì)或者其片段，例如兩種或多種天然存在的蛋白質(zhì)或者其部分，多表位(兩種或多種肽表位的符合讀框地的融合體)的融合體，如Thompson等(1995)在美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊92:5845-5849所例示的。
融合的第一和第二DNA序列表達(dá)的蛋白質(zhì)也稱(chēng)之為“融合蛋白”或者“雜合蛋白”，即耶爾森氏菌送遞信號(hào)和一種異源蛋白的雜合體。
對(duì)于可以送遞的異源蛋白沒(méi)有特殊限定。本發(fā)明特別涉及蛋白質(zhì)，例如已知的腫瘤相關(guān)蛋白，已知的病原體抗原和細(xì)胞因子。
“腫瘤相關(guān)蛋白”指在腫瘤中特異性表達(dá)的一種蛋白質(zhì)或者相對(duì)于正常組織在腫瘤中異常水平表達(dá)的一種蛋白質(zhì)。這樣的腫瘤相關(guān)蛋白包括但不限于下面的成員MAGE家族，BAGE家族(例如BAGE-1),DAGE/Prame家族(例如DAGE-1),GAGE家族，RAGE家族(例如RAGE-1),SMAGE家族，NAG，酪氨酸酶，Melan-A/MART-1,gp100,MUC-1,TAG-72,CA125，突變的原癌基因例如p21ras，突變的腫瘤抑制蛋白基因例如p53，腫瘤相關(guān)病毒抗原(例如HPV16 E7),HOM-MEL-40,HOM-MEL-55,NY-COL-2,HOM-HD-397,HOM-RCC-1.14,HOM-HD-21,HOM-NSCLC-11,HOM-MEL-2.4,和HOM-TES-11。MAGE家族的成員包括但不限于MAGE-1,MAGE-2,MAGE-11。GAGE家族的成員包括但不限于GAGE-1,GAGE-6。參見(jiàn)，例如Van den Eynde和Van denBruggen(1997)的綜述，Curr.Opin.Immunol.9:684-693,Sahin等(1997)Curr.Opin.Immunol.9:709-716，和Shawler等(1997)。這些蛋白質(zhì)表現(xiàn)出與某些腫瘤相關(guān)，例如黑素瘤，肺癌，前列腺癌，乳腺癌，結(jié)腸癌和其它癌癥。
根據(jù)本發(fā)明也可以使用自病原體衍生的多種已知抗原。本發(fā)明涉及的病原體包括病毒，細(xì)菌，寄生蟲(chóng)和真菌。致病原的特征抗原的具體例子包括流感病毒核蛋白(殘基218-226，根據(jù)F.等(1997)J.Virol.71:2715-2721)，來(lái)自副流感病毒和淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒的抗原(參見(jiàn)An等(1997)J.Virol.71:2292-2302)，丙肝病毒的B1蛋白(Bruna-Romero等(1997)Hepatology25:470-477),HIV的包膜糖蛋白gp160(Achour等(1996)J.Virol.70:6741-6750),Plasmodium berghei的第252-260位氨基酸或者環(huán)子孢子蛋白(Allsopp等(1996)歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)26:1951-1958),A型流感病毒核蛋白(殘基366-374,Nomura等(1996)免疫學(xué)方法雜志(J.Immunol.Methods)193:4149)，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌的李斯特菌溶胞素O蛋白(殘基91-99,An等(1996)感染.免疫(Infect.Immun.)64:1685-1693)，人16型乳頭瘤病毒E6蛋白(殘基131-140,Gao等(1995)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)155:5519-5526)和人16型乳頭瘤病毒E7蛋白(殘基21-28和48-55,Bauer等(1995)Scand.J.Immunol.42:317-323)，呼吸道合胞病毒(殘基82-90和81-95,Hsu等(1995)免疫學(xué)(Immunology)85:347-350)，單純皰疹病毒1型核糖核苷酸還原酶(參見(jiàn)Salvucci等(1995)J.Gen.Virol.69:1122-1131)和輪狀病毒VP7蛋白(參見(jiàn)Franco等(1993)J.Gen.Virol.74:2579-2586),P.falciparum抗原(引起瘧疾)和乙肝表面抗原(Gilbert等(1997)自然生物技術(shù)(Nature Biotech)15:1280-1283)。
因此可以將上述蛋白質(zhì)的編碼序列克隆到本發(fā)明表達(dá)載體中用于送遞。
本發(fā)明中也可以使用多種小的抗原性肽的編碼序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定產(chǎn)生免疫原性肽所要求的片段的長(zhǎng)度?；蛘?，技術(shù)人員也可以使用已知激發(fā)特異性T細(xì)胞應(yīng)答的肽的編碼序列，例如根據(jù)美國(guó)專(zhuān)利5462871，美國(guó)專(zhuān)利5558995，美國(guó)專(zhuān)利5554724，美國(guó)專(zhuān)利5585461，美國(guó)專(zhuān)利5591430，美國(guó)專(zhuān)利5554506，美國(guó)專(zhuān)利5487974，美國(guó)專(zhuān)利5530096，美國(guó)專(zhuān)利5519117公開(kāi)的腫瘤相關(guān)抗原性肽(TRAs)。表1中提供了TRAs的例子。也參見(jiàn)Eynde和Bruggen(1997)和Shawler等(1997)的綜述。也可以使用致病原的抗原性肽，例如Gilbert等(1997)公開(kāi)的那些。
根據(jù)上文所述，全長(zhǎng)天然存在的蛋白質(zhì)的編碼序列，天然存在的蛋白質(zhì)的一部分，或者天然存在的蛋白質(zhì)的部分的組合，或者不同的天然存在的蛋白質(zhì)或者來(lái)自不同蛋白質(zhì)的部分的組合的編碼序列都可以在本發(fā)明中使用。例如，可以使用多表位的編碼序列，例如Thomson等(1995)描述的那些。優(yōu)選地，本發(fā)明表達(dá)載體的第二DNA序列編碼一種蛋白質(zhì)的至少一個(gè)表位?！氨砦弧敝钢辽?個(gè)或9個(gè)氨基酸的肽。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉編碼一種蛋白質(zhì)的一部分的DNA片段的制備技術(shù)，或者在讀框內(nèi)將一種蛋白質(zhì)的一部分的編碼DNA序列與另一種蛋白質(zhì)的一部分的編碼DNA序列連接的技術(shù)等等。
本發(fā)明的載體可以包括其它序列元件，例如3’末端序列(包括終止密碼子和聚腺苷酸序列)，或者賦與藥物抗性從而選擇了本發(fā)明載體的耶爾森氏菌轉(zhuǎn)化體的基因。
本發(fā)明的表達(dá)載體可以用多種已知方法轉(zhuǎn)化到耶爾森氏菌中。為了本發(fā)明目的，導(dǎo)入表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化方法包括但不限于電穿孔，磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，接合，或者它們的組合。例如，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)電穿孔技術(shù)將載體轉(zhuǎn)化到第一細(xì)菌菌株中。隨后，通過(guò)接合(也稱(chēng)之為“轉(zhuǎn)移”的方法)將這樣一種載體從第一細(xì)菌菌株轉(zhuǎn)移到耶爾森氏菌中?？梢岳缬每股剡x擇耶爾森氏菌轉(zhuǎn)化體(即吸收了所述載體的耶爾森氏菌)。這些技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。參見(jiàn)，例如，Sory等(1994)。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及用用于將上述異源蛋白送遞到真核生物細(xì)胞中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的上述突變體耶爾森氏菌菌株的耶爾森氏菌。
因此，本發(fā)明涉及將上述異源蛋白送遞到真核生物細(xì)胞中的方法。
本發(fā)明涉及可以被本發(fā)明重組耶爾森氏菌定向的寬范圍的真核生物細(xì)胞。
“定向”指耶爾森氏菌與真核生物細(xì)胞的胞外粘著。
特別地，本發(fā)明涉及呈遞抗原細(xì)胞?！俺蔬f抗原細(xì)胞”在這里表示至少一個(gè)Ⅰ類(lèi)或Ⅱ類(lèi)MHC決定簇，并且可以包括已知為專(zhuān)職性(professianal)呈遞抗原細(xì)胞的那些細(xì)胞，例如巨噬細(xì)胞，樹(shù)突細(xì)胞和B細(xì)胞。其它專(zhuān)職性呈遞抗原細(xì)胞包括單核細(xì)胞，邊緣區(qū)Kupffer細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞，朗氏細(xì)胞，交錯(cuò)樹(shù)突細(xì)胞，小結(jié)樹(shù)突細(xì)胞和T細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明也可以使用兼性呈遞抗原細(xì)胞。兼性呈遞抗原細(xì)胞的例子包括星形膠質(zhì)細(xì)胞，濾泡細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞濾如這里所使用的，“呈遞抗原細(xì)胞”包括專(zhuān)職性型和兼性型呈遞抗原細(xì)胞兩者。
也可以從自哺乳動(dòng)物例如人或嚙齒類(lèi)獲得的組織或者血液(含有外周血單核細(xì)胞)樣品分離呈遞抗原細(xì)胞。也可以使用從這樣的樣品建立的細(xì)胞系。建立細(xì)胞系的方法是本領(lǐng)域公知的。也可以從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，12301Parklawn Drive,Rockville,Maryland,20852-1776直接獲得一些細(xì)胞系?？梢允褂谜：蛺盒约?xì)胞兩者。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，呈遞抗原細(xì)胞表達(dá)的MHC決定簇與所涉及的哺乳動(dòng)物表達(dá)的那些相容，并且這些MHC決定簇至少之一能呈遞一個(gè)或多個(gè)自送遞的蛋白質(zhì)衍生的抗原表位。
本領(lǐng)域技術(shù)人員還熟悉確定呈遞抗原細(xì)胞表達(dá)的MHC分子是否與所涉及的哺乳動(dòng)物受試者相容的方法，例如公知的HLA-型方法。參見(jiàn)Coligan等人的教導(dǎo)(1994),Current Protocols in Immunology JohnWiley & Sons Inc紐約市，紐約州。
技術(shù)人員通過(guò)本領(lǐng)域大量的教導(dǎo)能確定呈遞特殊抗原的MHC分子，例如美國(guó)專(zhuān)利5405940教導(dǎo)確定HLA-A1作為MAGE-1肽，EADPTGHSY的呈遞分子；美國(guó)專(zhuān)利5558995教導(dǎo)確定HLA-Cw1601用于呈遞另一種MAGE-1肽，SAYGEPRKL；美國(guó)專(zhuān)利5530096教導(dǎo)確定HLA-A2作為酪氨酸酶肽，MLLAVLYCL的呈遞分子。在定向的真核生物細(xì)胞沒(méi)有表達(dá)期望的HLA或MHC分子的情況下，編碼該分子的基因可以通過(guò)公知的轉(zhuǎn)化方法或轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)入真核生物細(xì)胞。
進(jìn)一步根據(jù)本發(fā)明，可以通過(guò)使真核生物細(xì)胞在合適的條件下接觸重組耶爾森氏菌來(lái)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的送遞?？紤]到致病子基因的誘導(dǎo)表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)的條件，各種各樣的參考和技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是常規(guī)上可得到的，所述條件包括期望的溫度，Ca++濃度，耶爾森氏菌和靶細(xì)胞混合的方式等等。參見(jiàn)，例如，Cornelis,Cross talk betweenYersinia and eukaryotic cells,Society for GeneralMicrobiology Symposium,55；MoCRAE,SAUNDERS,SMYTH,STOW(編),宿主病原體相互作用的分子學(xué)方面(Molecular aspects of host-pathoge interactions)劍橋大學(xué)出版社，1997。條件可以根據(jù)要定向的真核生物細(xì)胞的類(lèi)型而變化，例如用于定向人上皮癌海拉細(xì)胞的條件(Sory等(1994))；用于定向小鼠胸腺瘤或黑素瘤細(xì)胞的條件(Starnbach等(1994)免疫學(xué)雜志(J,Immunol.)153:1603)；用于定向小鼠巨噬細(xì)胞的條件(Boland等(1996))。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)技術(shù)可以確定這樣的變化。
本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以使用確定融合蛋白的送遞是否成功的多種測(cè)試。例如，可以用同位素或者免疫熒光素標(biāo)記融合蛋白，或者通過(guò)免疫熒光素接合的抗體檢測(cè)，如Rosqvist等(1994)EMBO J.13:964公開(kāi)的。測(cè)定也可以以送遞的蛋白質(zhì)的酶活性為基礎(chǔ)，例如，Sory等(1994)描述的測(cè)試。測(cè)定也可以以送遞的蛋白質(zhì)的抗原性為基礎(chǔ)。例如，通過(guò)對(duì)MAGE-1表位特異性的CTL細(xì)胞對(duì)這樣的定向B細(xì)胞的識(shí)別可以測(cè)定MAGE-1蛋白送遞到EBV-轉(zhuǎn)化的人B細(xì)胞中。接著通過(guò)多種測(cè)試，包括測(cè)試IFN-γ自激活的CTLs分泌或者自溶解的靶細(xì)胞釋放Cr51，可以測(cè)定這樣的CTL識(shí)別。對(duì)于這樣的測(cè)定也可以使用象使用抗送遞蛋白質(zhì)的特異性抗體的蛋白質(zhì)印跡分析，PCR原位雜交，或者ELISPOT(MabtechAB,Sweden)這樣的方法。參見(jiàn)，例如，W.Herr等(1997)免疫學(xué)方法雜志(J.Immunol.Methods)203:141-152和W.Herr等(1996)免疫學(xué)方法雜志(J.Immunol.Methods)191:131-142。
在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，對(duì)于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答使用能將蛋白質(zhì)送遞給呈遞抗原細(xì)胞的重組耶爾森氏菌。因此，本發(fā)明涉及使用上述本發(fā)明重組耶爾森氏菌誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的免疫原性組合物和方法。
本發(fā)明涉及的免疫應(yīng)答包括細(xì)胞免疫應(yīng)答(主要由T細(xì)胞介導(dǎo))和體液免疫應(yīng)答(主要由抗體介導(dǎo))。Janeway和Travers一般性教導(dǎo)這些免疫應(yīng)答(Janeway和Travers(1996)免疫學(xué)(Immunology)，健康和疾病中的免疫系統(tǒng)(Immune System in Health and Disease)，第二版，Garland出版有限公司紐約州紐約市和英國(guó)倫敦)(也參見(jiàn)Tureci等(1997)Molecular Medicine Today3(8):342-349)。
根據(jù)本發(fā)明的該方面，可以在多種治療方案或者治療用途中使用重組耶爾森氏菌誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。例如，可以在用于監(jiān)測(cè)哺乳動(dòng)物例如人或嚙齒類(lèi)接種治療的有效性的體外方法中使用重組耶爾森氏菌。在該方案中，從接種免疫原性組合物例如特定抗原的受者得到某些呈遞抗原細(xì)胞(例如樹(shù)突細(xì)胞)。然后將該呈遞抗原細(xì)胞與能送遞用于接種的抗原的重組耶爾森氏菌接觸。接著，向呈遞抗原細(xì)胞和耶爾森氏菌的混合物加入從相同的受者得到外周血淋巴細(xì)胞(即自體PBLs)，所述從相同的受者得到外周血淋巴細(xì)胞優(yōu)選與細(xì)胞因子例如IL-2組合。接觸抗原和接著依次加強(qiáng)免疫后通過(guò)CTLs或者對(duì)于相關(guān)抗原特異性的抗體的存在來(lái)評(píng)價(jià)接種的有效性。使用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試，例如Cr51釋放測(cè)試或者γ-IFN分泌測(cè)試，抗原測(cè)定特異性CTLs的存在。通過(guò)象使用固定在培養(yǎng)板上的抗原的ELISA這樣的測(cè)試或者用于T-輔助細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)增生測(cè)試，可以測(cè)定特異性抗體的存在。
在用于誘導(dǎo)對(duì)于一種蛋白質(zhì)是特異性的CTLs的來(lái)自體內(nèi)的方案中也可以使用重組耶爾森氏菌。體外產(chǎn)生這樣的特異性CTLs的方法是本領(lǐng)域公知的，例如如美國(guó)專(zhuān)利5342774所公開(kāi)的。簡(jiǎn)要地說(shuō)，從哺乳動(dòng)物取得含有T細(xì)胞前體的血樣。從該血樣純化PBLs并且與表達(dá)MHC中的抗原性表位的刺激物細(xì)胞一起溫育。通過(guò)例如Cr51釋放測(cè)試或者γ-IFN分泌測(cè)試，可以檢測(cè)產(chǎn)生的該表位特異性CTLs。
根據(jù)本發(fā)明，重組耶爾森氏菌和呈遞抗原細(xì)胞的混合物可以在用于產(chǎn)生待送遞的蛋白質(zhì)特異性CTLs的體外方法中用作“刺激物細(xì)胞”。所使用的呈遞抗原細(xì)胞表達(dá)的MHC決定簇與從中分離PBLs的哺乳動(dòng)物所表達(dá)的MHC決定簇相容，并且這些MHC分子的至少一個(gè)能呈遞給T細(xì)胞，一個(gè)或多個(gè)自蛋白質(zhì)衍生的表位被送遞。這樣產(chǎn)生的CTL細(xì)胞可以以過(guò)繼轉(zhuǎn)移的治療方案施加給患有特征在于送遞系統(tǒng)中使用的蛋白質(zhì)異常表達(dá)的癥狀的哺乳動(dòng)物。對(duì)于過(guò)繼轉(zhuǎn)移，參見(jiàn)下面的教導(dǎo)Greenberg(1986)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)136(5):1917；Riddel等，(1992)Science257:238；Lynch等(1991)歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)21:1403；和Kast等(1989)細(xì)胞(Cell)59:603。CTLs通過(guò)溶解異常表達(dá)該抗原的細(xì)胞，可以減輕或治療病癥，例如腫瘤，寄生蟲(chóng)感染或病毒感染。
因此，本發(fā)明涉及治療病癥的方法和組合物。本發(fā)明涉及的病癥包括腫瘤和病原體例如細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、真菌或病毒感染。
“治療”指減輕或抑制病癥，例如抑制腫瘤生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移，減小腫瘤大小，或者減輕病原體感染癥狀。
本發(fā)明的重組耶爾森氏菌也可以在體內(nèi)使用，即將重組耶爾森氏菌引入哺乳動(dòng)物例如人或嚙齒類(lèi)受者體內(nèi)。
對(duì)于體內(nèi)使用重組耶爾森氏菌，可以在使用前在動(dòng)物中測(cè)試安全性。在這種情況下，可以口服或者直接服入胃中對(duì)動(dòng)物施用重組耶爾森氏菌。施用重組耶爾森氏菌后幾天(1-3天)可以殺死動(dòng)物。洗腸并且對(duì)淋巴集結(jié)或排泄物檢查存活的耶爾森氏菌屬。參見(jiàn)，例如Sory等(1992)感染。免疫.(Infect.Immun.)60:3830-3836。還可以通過(guò)腹膜內(nèi)注射對(duì)動(dòng)物施用重組耶爾森氏菌?？梢詫?duì)殺死的動(dòng)物的組織例如腎和肝檢查細(xì)胞內(nèi)耶爾森氏菌的存在，這是不足夠安全性的指征?？梢酝ㄟ^(guò)例如在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)細(xì)胞抽提物來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)耶爾森氏菌。參見(jiàn)Sory等(1988)Microb.Pathogen4:431-442.
可以在免疫原性組合物中使用安全的重組耶爾森氏菌來(lái)誘導(dǎo)治療哺乳動(dòng)物各種病癥的免疫應(yīng)答。本發(fā)明涉及的病癥包括腫瘤和病原體感染，如這里所公開(kāi)的。
所述免疫原性組合物除了重組耶爾森氏菌外可以包括其它物質(zhì)，例如細(xì)胞因子，佐劑和藥學(xué)可接受載體。例如這樣的免疫原性組合物中也可以包括細(xì)胞因子，使用能送遞細(xì)胞因子的本發(fā)明另外的重組耶爾森氏菌。
這些免疫原性組合物可以以任何常規(guī)方式施用給受者，例如口服，腹膜內(nèi)，靜脈內(nèi)或者皮下。這樣的組合物誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答可以導(dǎo)致CTL-介導(dǎo)的或抗體-介導(dǎo)的殺傷病原體或者相關(guān)抗原異常表達(dá)的細(xì)胞，這樣減輕相關(guān)的病癥。
本發(fā)明通過(guò)下面的實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述。
本說(shuō)明書(shū)中提到的所有公開(kāi)物在這里引作參考。本說(shuō)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)和表達(dá)用作描述的術(shù)語(yǔ)而不是限制，不意味著使用這樣的術(shù)語(yǔ)和表達(dá)排除所示或所描述的性質(zhì)的等價(jià)物或者其部分，要理解在本發(fā)明范圍內(nèi)各種各樣的改變是可能的。
實(shí)施例1細(xì)菌菌株，質(zhì)粒和生長(zhǎng)條件使用小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌屬E40(pYV40)(參見(jiàn)，M.P.Sory等(1995)“使用cyaA基因融合方法，鑒定分泌和內(nèi)在化到巨噬細(xì)胞溶膠中所要求的YopE和YopH區(qū)”美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊92:11998-12002)，其同基因敏感衍生物MRS40(pYV40)(參見(jiàn)M.R.Sarker等)，和它們的各種非極性突變體。表1中列出了質(zhì)粒。細(xì)胞在腦心浸液(BHI)(Difco,Destroit,Michigan)中培養(yǎng)。過(guò)夜預(yù)培養(yǎng)后，用新鮮的BHI稀釋1/20細(xì)菌，使在室溫下生長(zhǎng)30分鐘，并且在感染前在37℃下孵育150分鐘誘導(dǎo)Yop致病子的合成。
表1舉例的抗原
實(shí)施例2多突變菌株的構(gòu)建為了構(gòu)建yopHOPEM多突變菌株，通過(guò)使用自發(fā)失活載體pMRS101和pKNG101在MRS40菌株中的等位基因交換依次剔除YopE,YopH,YopO,YopM和YopP基因(參見(jiàn)K.Kaniga等(1991)“用于提高革蘭氏陰性細(xì)菌中反向遺傳的寬宿主范圍的自發(fā)失活載體小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌屬的blaA基因的滅活”Gene109:137-141和M.R.Sarker等(1997)“用于革蘭氏陰性細(xì)菌中基因置換的自發(fā)失活載體pKNG101的改進(jìn)文本”微生物分子學(xué)(Mol.Microbiol.)23:409-411)。在“自發(fā)失活載體和增變基因”部分中的表2中描述了各種缺失。使用增變基因pPW52(參見(jiàn)P.Wattiau等(1993)“SycE,YopE的分泌中涉及的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌屬的類(lèi)陪伴分子蛋白””微生物分子學(xué)(Mol.Microbiol.)8:123-131)首先突變YopE基因，得到菌株MRS40(pAB4052)。用增變基因pAB31(參見(jiàn)，S.D.Mills等(1997)“通過(guò)功能Ⅲ型分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理所要求的并且涉及YopP的方法，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌屬誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中的編程性細(xì)胞死亡，假設(shè)作為效應(yīng)子蛋白起作用”美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊94:12638-12643)突變?cè)摼曛械腨opH基因，得到雙重yopEH突變體MRS40(pAB404)。然后用增變基因pAB34(參見(jiàn)，S.D.Mills等(1997))通過(guò)等位變化獲得三重yopEHO突變體MRS40(pAB405)。然后用增變基因pMSK7(參見(jiàn)，S.D.Mills等(1997))突變YopP基因，獲得yopEHOP突變體MRS40(pMSK46)。最后用YopM增變基因pAB38(參見(jiàn)，S.D.Mills等(l997))通過(guò)等位變化獲得yopHOPEM菌株MRS40(pABL403)。
表2質(zhì)粒
實(shí)施例3構(gòu)建編碼YopE130-MAGE-1的質(zhì)粒和將該質(zhì)粒導(dǎo)入耶爾森氏菌對(duì)編碼蛋白質(zhì)MAGE-1的序列符合讀框地插入編碼截短的含有YopE的頭130個(gè)氨基酸的YopE,YopE130的序列。這樣的質(zhì)粒在圖1中圖示給出。
使用pcDNAI/Amp(Invitrogen,Carlsbad,California)中克隆的MAGE-1cDNA作為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增MAGE-1的可讀框。上游引物，AAACTGCAGATGTCTCTTGAGCAGAGGAGTC，由位于PstⅠ位點(diǎn)之前的MAGE-1的可讀框的前核苷酸組成。下游引物，AAACTGCAGTCAGACTCCCTCTTCCTCCTC，由接著PstⅠ位點(diǎn)的MAGE-1的可讀框的后核苷酸互補(bǔ)的核苷酸組成。用PstⅠ消化PCR產(chǎn)物并且在載體pMS111的PstⅠ位點(diǎn)符合讀框地插入截短的YopE(參見(jiàn)，Sory等(1994)微生物分子學(xué)(Molecular Microbiology)14:583-594)。對(duì)細(xì)菌菌株DH5αF’IQ電穿孔導(dǎo)入pMS111-MAGE-1。從一些克隆抽提DNA并且對(duì)細(xì)菌菌株SM10電穿孔導(dǎo)入陽(yáng)性重組克隆的DNA。從耶爾森氏菌屬M(fèi)RS40的SM10(pABL403)轉(zhuǎn)移pMS111后，在補(bǔ)充有萘啶酮酸，亞砷酸鈉和氯霉素的含有瓊脂的培養(yǎng)基中選擇重組克隆。MRS40是對(duì)氨芐青霉素敏感的E40的等基因衍生物(參見(jiàn)Sory等(1995)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊92:11998-12002)。
實(shí)施例4定向EBV-轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞然后在28℃下在補(bǔ)充有萘啶酮酸，m-亞砷酸鈉和氯霉素的LB培養(yǎng)基中將含有pMS111-MAGE-1的耶爾森氏菌MSR40(pABL403)的一個(gè)克隆培養(yǎng)過(guò)夜。為了獲得0.2的OD(光密度)，在新鮮培養(yǎng)基中稀釋過(guò)夜培養(yǎng)物。新鮮培養(yǎng)物在28℃下擴(kuò)增大約2小時(shí)。細(xì)菌用0.9％NaCl沖洗并且再懸浮于0.9％NaCl中，使每毫升有108個(gè)細(xì)菌。50000EBV-轉(zhuǎn)化的HLA-Al+B細(xì)胞放置在微孔中(96圓底孔)并且離心成丸狀。棄除上清液，并且在100微升完全RPMI1640中加入細(xì)菌的各種稀釋物(培養(yǎng)基補(bǔ)充有10％FCS和補(bǔ)充有L-精氨酸(116毫克/毫升)，L-天冬酰胺(36毫克/毫升)，L-谷氨酰胺(216毫克/毫升))。感染2小時(shí)后，加入慶大霉素(30微克/毫升)保溫2小時(shí)，最后清洗細(xì)胞三次。
作為陰性對(duì)照，也用含有pMS621的耶爾森氏菌MRS40(pABL403)感染相同的細(xì)胞，pMS621是只編碼截短的YopE即YopE130的質(zhì)粒。
實(shí)施例5MZ2-CTL82/30對(duì)定向的B細(xì)胞的識(shí)別MZ2-CTL82/30對(duì)于HLA-A1呈遞的MAGE-1肽EADPTGHSY是特異性的(美國(guó)專(zhuān)利5342774)。在終體積100微升IScove’s完全培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10％人血清，L-精氨酸(116毫克/毫升)，L-天冬酰胺(36毫克/毫升)，L-谷氨酰胺(216毫克/毫升)，鏈霉素(0.1毫克/毫升)，青霉素(200U/毫升)，IL-2(25U/毫升)和慶大霉素(15微克/毫升))中含有耶爾森氏菌的每一個(gè)微孔中加入5000個(gè)MZ2-CTL82/30細(xì)胞。保溫過(guò)夜后，用標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)試(Biosource,Fleurus,Belgium)分析共培養(yǎng)物上清液中的γ-IFN的存在(激活時(shí)由CTL產(chǎn)生)。圖2A圖示這樣一種方法。
如圖2B所示，CTL82/30識(shí)別編碼YopE130-MAGE-1耶爾森氏菌感染的HLA-A1+B細(xì)胞，而用對(duì)照質(zhì)粒YopE130感染的相同的細(xì)胞則不然。細(xì)菌的最佳濃度是每微孔1000000個(gè)左右。
序列表<110>van der Bruggen,PierreCornelis,Guy R.<120>用重組耶爾森氏菌將蛋白質(zhì)送遞到真核生物細(xì)胞中<130>11154<140>US 09/036,582<141>1998-03-06<160>39<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>9<212>PRT<213>人MAGE-1肽<400>1Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr5<210>2<211>9<212>PRT<213>人MAGE-1肽<400>2Ser Ala Tyr Gly Glu pro Arg Lys Leu5<210>3<211>9<212>PRT<213>人MAGE-3肽<400>3Glu Val Asp pro Ile Gly His Leu Tyr5<210>4<211>9<212>PRT<213>人MAGE-3肽<400>4Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val5<210>5<211>10<212>PRT<213>人MAGE-3肽<400>5Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr5 10<210>6<211>9<212>PRT<213>人BAGE肽<400>6Ala Ala Arg Ala Val Phe Leu Ala Leu5<210>7<211>8<212>PRT<213>人GAGE-1,2肽<400>7Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr5<210>8<211>10<212>PRT<213>人RAGE肽<400>8Ser Pro Ser Ser Asn Arg Ile Arg Asn Thr5 10<210>9<211>10<212>PRT<213>人GnT-V肽<400>9Val Leu Pro Asp Val Phe Ile Arg Cys Val5 10<210>10<211>9<212>PRT<213>人MUM-1肽<400>10Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Leu Phe5<210>11<211>9<212>PRT<213>人MuM-1肽<400>11Glu Glu Lys Leu Ser Val Val Leu Phe5<210>12<211>10<212>PRT<213>人CDK4肽<400>12Ala Cys Asp Pro His Ser Gly His Phe Val5 10<210>13<211>10<212>PRT<213>人CDK4肽<400>13Ala Arg Asp Pro His Ser Gly His Phe Val5 10<210>14<211>9<212>PRT<213>人β-連環(huán)蛋白肽<400>14Ser Tyr Leu Asp Ser Gly Ile His Phe5<210>15<211>9<212>PRT<213>人β-連環(huán)蛋白肽<400>15Ser Tyr Leu Asp Ser Gly Ile His Ser5<210>16<211>9<212>PRT<213>人酪氨酸酶肽<400>16Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu5<210>17<211>9<212>PRT<213>人酪氨酸酶肽<400>17Tyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gln Val5<210>18<211>9<212>PRT<213>人酪氨酸酶肽<400>18Tyr Met Asp Gly Thr Met Ser Gln Val5<210>19<211>9<212>PRT<213>人酪氨酸酶肽<400>19Ala Phe Leu Pro Trp His Arg Leu Phe5<210>20<211>9<212>PRT<213>人酪氨酸酶肽<400>20Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe5<210>21<211>9<212>PRT<213>人酪氨酸酶肽<400>21Tyr Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe<210>22<211>15<212>PRT<213>人酪氨酸酶肽<400>22Gln Asn Ile Leu Leu Ser Asn Ala Pro Leu Gly Pro Gln Phe Pro5 10 15<210>23<211>15<212>PRT<213>人酪氨酸酶肽<400>23Asp Tyr Ser Tyr Leu Gln Asp Ser Asp Pro Asp Ser Phe Gln Asp5 10 15<210>24<211>10<212>PRT<213>人Melan-AMART-1肽<400>24Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val5 10<210>25<211>9<212>PRT<213>人Melan-AMART-1肽<400>25Ile Leu Thr Val Ile Leu Gly Val Leu5<210>26<211>9<212>PRT<213>人gp100Pmell17肽<400>26Lys Thr Trp Gly Gln Tyr Trp Gln Val5<210>27<211>9<212>PRT<213>人gp100Pmell17肽<400>27Ile Thr Asp Gln Val Pro Phe Ser Val5<210>28<211>9<212>PRT<213>人gp100Pmell17肽<400>28Tyr Leu Glu Pro Gly Pro Val Thr Ala5<210>29<211>10<212>PRT<213>人gp100Pmell17肽<400>29Leu Leu Asp Gly Thr Ala Thr Leu Arg Leu5 10<210>30<211>10<212>PRT<213>人gp100Pmell17肽<400>30Val Leu Tyr Arg Tyr Gly Ser Phe Ser Val5 10<210>31<211>9<212>PRT<213>人DAGE肽<400>31Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Phe Leu5<210>32<211>12<212>PRT<213>人MAGE-6肽<400>32Lys Ile Ser Gly Gly Pro Arg Ile Ser Tyr Pro Leu5 10<210>33<211>1330<212>DNA<213>小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌<400>33AAAAATGGCC AAAAACTTTC AATGGTAGAA GAGCTAAATT TGGATAAGTA ACGCATAAAA 60ATTTTCGACG AAAAACTATA TATATATATA TATTTAATAT GTATGGTTTC ATTTGCAATG 120AAAAAACCGA TAATAAAGAT ATTTTCAGAA AGGCATTCAA TATGTTTATA AACCCAAGAA 180ATGTATCTAA TACTTTTTTG CAAGAACCAT TACGTCATTC TTCTGATTTA ACTGAGATGC 240CAGTTGAGGC AGAAAATGTT AAATCTAAGG CTGAATATTA TAATGCATGG TCGGAATGGG 300AACGAAATGC CCCTCCGGGG AATGGTGAAC AGAGGGGAAT GGCGGTTTCA AGGTTACGCG 360ATTGCCTGGA CCGACAAGCC CATGAGCTAG AACTAAATAA TCTGGGGCTG AGTTCTTTGC 420CGGAATTACC TCCGCATTTA GAGAGTTTAG TGGCGTCATG TAATTCTCTT ACAGAATTAC 480CGGAATTGCC GCAGAGCCTG AAATCACTTC AAGTTGATAA TAACAATCTC AAGGCATTAT 540CCGATTTACC TCCTTTACTG GAATATTTAG GTGCCGCTAA TAATCAGCTG GAAGAATTAC 600CAGAGTTGCA AAACTCGTCC TTCTTGACAT CTATTGATGT TGATAACAAT TCACTGAAAA 660CATTACCTGA TTTACCTCCT TCACTGGAAT TTCTTGCTGC TGGTAATAAT CAGCTGGAAG 720AATTGTCAGA GTTGCAAAAC TTGCCCTTCT TGACTGCGAT TTATGCTGAT AACAATTCAC 780TGAAAACATT ACCCGATTTA CCCCCTTCCC TGAAAACACT TAATGTCAGA GAAAATTATT 840TAACTGATCT GCCAGAATTA CCGCAGAGTT TAACCTTCTT AGATGTTTCT GATAATATTT 900TTTCTGGATT ATCGGAATTG CCACCAAACT TGTATAATCT CAATGCATCC AGCAATGAAA 960TAAGATCTTT ATGCGATTTA CCCCCTTCAC TGGTAGAACT TGATGTCAGA GATAATCAGT 1020TGATCGAACT GCCAGCGTTA CCTCCACGCT TAGAACGTTT AATCGCTTCA TTTAATCATC 1080TTGCTGAAGT ACCTGAATTG CCGCAAAACC TGAAACTGCT CCACGTAGAG TACAACGCTC 1140TGAGAGAGTT TCCCGATATA CCTGAGTCAG TGGAAGATCT TCGGATGGAC TCTGAACGTG 1200TAATTGATCC ATATGAATTT GCTCATGAGA CTATAGACAA ACTTGAAGAT GATGTATTTG 1260AGTAGTGCGC AAGAGCGTTC ATAATTCTGC GTCACGTTAA AATATCATTA CAACGTAATC 1320ACTTTATCGA 1330<210>34<211>1152<212>DNA<213>小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌<400>34GAATTCCCCA ACTTTGACAC CGATAACCGG TTCAATAGTA TCTGGAATAG ACAGCGAAAG 60TTGTTGAAAT AATTGAGTGA TAGCTTGTTC AAATGAATAC ATTTGATCTC CTAATAGTTA 120GATAAAATAT CAACTTAACC AAAGCACTCT CGGCAGACCA TCAATTTTAG CCTATAATTT 180TTAGTTTTTA TTTTGTCTAA TATAACAACA AAAACAGCAG CGGTTTTTTA TATAACCACC 240GGCTATTTTC CCACTAAGAT AACCTTGTTT TAATAGCCAA GGGAATAAAT AGTCATGAAA 300ATATCATCAT TTATTTCTAC ATCACTGCCC CTGCCGGCAT CAGTGTCAGG ATCTAGCAGC 360GTAGGAGAAA TGTCTGGGCG CTCAGTCTCA CAGCAAAAAA GTGATCAATA TGCAAACAAT 420CTGGCCGGGC GCACTGAAAG CCCTCAGGGT TCCAGCTTAG CCAGCCGTAT CATTGAGAGG 480TTATCATCAA TGGCCCACTC TGTGATTGGA TTTATCCAAC GCATGTTCTC GGAGGGGAGC 540CATAAACCGG TGGTGACACC AGCACTCACG CCTGCACAAA TGCCAAGCCC TACGTCTTTC 600AGTGATAGTA TCAAGCAACT TGCTGCTGAG ACGCTGCCAA AATACATGCA GCAGTTGAGT 660AGCTTGGATG CAGAGACGCT GCAGAAAAAT CATGACCAGT TCGCCACGGG CAGCGGCCCT 720CTTCGTGCCA GTATCACTCA ATGCCAAGGG CTGATGCAGT TTTGTGGTGG GGAATTGCAA 780GCTGAGGCCA GTGCCATTTT AAACACGCCT GTTTGTGGTA TTCCCTTCTC GCAGTGGGGA 840ACTGTTGGTG GGGCGGCCAG CGCGTACGTC GCCAGTGGCG TTGATCTAAC GCAGGCAGCA 900AATGAGATCA AAGGGCTGGG GCAACAGATG CAGCAATTAC TGTCATTGAT GTGATATGGA 960TAAAAACAAG GGGGTAGTGT TTCCCCCTTT TTCTATCAAT ATTGCGAATA TCTTCGTCCC 1020TGATCTTTCA GGGGCGAATC GTTTTTTAGC ATGCTCATTG TTAGAATTTC TGACTTATCT 1080CTCTTCTGTA TTACTACTCA TACTCTGGAA AATCCTGAGC ATTTATATCT ATGGATTGAT 1140GCAGCACTCG AG 1152<210>35<211>1990<212>DNA<213>小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌<400>35AGGGCATTGG AATTAAAAAT ATATTTATCT AAATGATGAT GAGTTTAAAT TACATTTGCC60TATTAAAATG AATAACGCAT TATTAACGTA TTACCATCTG TTCCCGCTTA ATTTTTTAAA 120AAATTTAAGG TAACAATGAG TATATATCTT ATGGGAAAAG CCAAAAAACT AACGAACACT 180ATAATAATTC GATTAACATC AATGAAAATA CACGGCTCAC CTATTATTAA AATAATACGA 240CTAGCATTAT AAGAAAAAAT ATTTTTTATG TTTATAGTAT AGGCGTGTAT TTAATTAGTT 300CTTAATTTAA TTAAGGAGGG AAGCATGAAC TTATCATTAA GCGATCTTCA TCGTCAGGTA 360TCTCGATTGG TGCAGCAAGA GAGCGGTGAT TGTACCGGGA AATTAAGAGG TAACGTTGCT 420GCCAATAAAG AAACTACCTT TCAAGGTTTG ACCATAGCCA GTGGTGCCAG AGAGTCAGAA 480AAAGTATTTG CTCAAACTGT ACTAAGCCAC GTAGCAAATA TTGTTCTAAC TCAAGAAGAT 540ACCGCTAAGC TATTGCAAAG CACGGTAAAG CATAATTTGA ATAATTATGA ATTAAGAAGT 600GTCGGCAATG GTAATAGTGT ACTTGTCAGT TTACGTAGTG ACCAAATGAC ACTACAAGAC 660GCCAAAGTGC TGTTGGAGGC TGCATTGCGA CAAGAGTCGG GAGCGAGGGG GCATGTATCA 720TCTCATTCAC ATTCAGTCCT TCACGCACCG GGAACCCCGG TGCGTGAAGG ACTGCGTTCA 780CATCTAGACC CCAGAACACC ACCGTTGCCA CCGCCTGAAC GACCACACAC TTCTGGCCAT 840CACGGGGCTG GCGAAGCCAG AGCCACCGCA CCAAGCACTG TTTCTCCTTA TGGCCCAGAA 900GCGCGCGCAG AACTCAGCAG CCGCCTCACC ACATTGCGCA ATACGCTGGC GCCAGCAACG 960AATGATCCGC GTTACTTACA AGCCTGCGGC GGTGAAAAGC TAAACCGATT TAGAGATATT 1020CAATGCTGTC GGCAAACCGC AGTACGCGCC GATCTTAATG CCAATTACAT CCAGGTCGGT 1080AACACTCGTA CCATAGCGTG CCAGTATCCG CTACAATCTC AACTTGAAAG CCATTTCCGT 1140ATGCTGGCAG AAAACCGAAC GCCAGTGTTG GCTGTTTTAG CGTCCAGTTC TGAGATAGCC 1200AATCAAAGAT TCGGTATGCC AGATTATTTC CGCCAGAGTC GTACCTATGG CAGTATCACT 1260GTAGAGTCTA AAATGACTCA GCAAGTTGGT CTCGGTGACG GGATTATGGC AGATATGTAT 1320ACTTTAACGA TTCGTGAAGC GGGTCAAAAA ACAATTTCTG TTCCTGTGGT TCATGTTGGC 1380AATTGGCCCG ATCAGACCGC AGTCAGCTCT GAAGTTACCA AGGCACTCGC TTCACTGGTA 1440GATCAAACAG CAGAAACAAA ACGCAATATG TATGAAAGCA AAGGAAGTTC AGCGGTAGCA 1500GATGACTCCA AATTACGGCC GGTAATACAT TGCCGTGCGG GTGTTGGCCG TACTGCGCAA 1560CTGATTGGCG CAATGTGCAT GAATGATAGT CGTAATAGTC AGTTAAGCGT AGAAGATATG 1620GTCAGCCAAA TGCGAGTACA AAGAAATGGT ATTATGGTAC AAAAAGATGA GCAACTTGAT 1680GTTCTGATTA AGTTGGCTGA AGGACAAGGG CGACCATTAT TAAATAGCTA ATGTAAATAT 1740TTATTCCTAT GAGTAAATAA AATTACTAAG AGATATACAC CACTTTGCCA ATCAAAGAAA 1800CTTTAAACCT CAACTAAAGT AAGCAATTAG TTGAGGTTTA TCTGCTATAG AATAATTATT 1860AACAAAAATA TAAACAACAA AATTAAAAGT TATGTGTCTA CTTTTACTTT ATGTAACCAA 1920ACCCATTAAT GGATACCGTA CGTTTTTCTT TTATAGAATT AAACCAGTAA ATGAGATGAT 1980GAAGGACGAT GATCATCGTC 1990<210>36<211>867<212>DNA<213>小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌<400>36ATGATTGGGC CAATATCACA AATAAACAGC TTCGGTGGCT TATCAGAAAA AGAGACCCGT60TCTTTAATCA GTAATGAAGA GCTTAAAAAT ATCATAATAC AGTTGGAAAC TGATATAGCG 120GATGGATCCT GGTTCCATAA AAATTATTCA CGCCTGGATA TAGAAGTCAT GCCCGCATTA 180GTAATTCAGG CGAACAATAA ATATCCGGAA ATGAATCTTA ATTTTGTTAC ATCTCCCCAG 240GACCTTTCGA TAGAAATAAA AAATGTCATA GAAAATGGAG TTGGATCTTC CCGCTTCATA 300ATTAACATGG GGGAGGGTGG AATACATTTC AGTGTAATTG ATTACAAACA TATAAATGGG 360AAAACATCTC TGATATTATT TGAACCAGTA AACTTTAATA GTATGGGGCC AGCGATACTG 420GCAATAAGTA CAAAAACGGC CATTGAACGT TATCAATTAC CTGATTGCCA TTTTTCCATG 480GTGGAAATGG ATATTCAGCG AAGCTCATCT GAATGTGGTA TTTTTAGTTT GGCACTGGCA 540AAAAAACTTT ACACCGAGAG AGATAGCCTG TTGAAAATAC ATGAAGATAA TATAAAAGGT 600ATATTAAGTG ATAGTGAAAA TCCTTTACCC CACAATAAGT TGGATCCGTA TCTCCCGGTA 660ACTTTTTACA AACATACTCA AGGTAAAAAA CGTCTTAATG AATATTTAAA TACTAACCCG 720CAGGGAGTTG GTACTGTTGT TAACAAAAAA AATGAAACCA TCTTTAATAG GTTTGATAAC 780AATAAATCCA TTATAGATGG AAAGGAATTA TCAGTTTCGG TACATAAAAA GAGAATAGCT 840GAATATAAAA CACTTCTCAA AGTATAA 867<210>37<211>2190<212>DNA<213>小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌<400>37ATGAAAATCA TGGGAACTAT GCCACCGTCG ATCTCCCTCG CCAAAGCTCA TGAGCGCATC 60AGCCAACATT GGCAAAATCC TGTCGGTGAG CTCAATATCG GAGGAAAACG GTATAGAATT120ATCGATAATC AAGTGCTGCG CTTGAACCCC CACAGTGGTT TTTCTCTCTT TCGAGAAGGG180GTTGGTAAGA TCTTTTCGGG GAAGATGTTT AACTTTTCAA TTGCTCGTAA CCTTACTGAG 240ACACTCCATG CAGCCCAGAA AACGACTTCG CAGGAGCTAA GGTCTGATAT CCCCAATGCT 300CTCAGTAATC TCTTTGGAGC CAAGCCACAG ACCGAACTGC CGCTGGGTTG GAAAGGGAAG 360CCTTTGTCAG GAGCTCCGGA TCTTGAAGGG ATGCGAGTGG CTGAAACCGA TAAGTTTGCC 420CAGCGCGAAA GCCATATTAG TATAATAGAA ACTAAGGATA ATCAGCGGTT CGTGGCTAAG 480ATTGAACGCT CCATTGCCGA GGGGCATTTG TTCCCAGAAC TGGAGGCTTA TAAACACATC 540TATAAAACCG CGGCCAAACA TCCTAATCTT GCCAATGTCC ATGGCATGGC TGTGGTGCCA 600TACGGTAACC GTAAGGAGGA AGCATTGCTG ATGGATGAGG TGGATGGTTC GCGTTCTTCT 660GACACACTAA GAAGCCTCCC CGATAGCTGG AAGCAACGAA ACATCAATAG TGAAGCCTAC 720TGGGGAACGA TCAAGTTTAT TGCCCATCGG CTATTAGATG TAACCAATCA CCTTGCCAAG 780GCAGGGATAG TACATAACGA TATCAAACCC GGTAATGTGG TATTTGACCG CGCTAGCGGA 840GAGCCCGTTG TCATTGATCT AGGATTACAC TCTCGTTCAG GGGAACAACC TAAGGGGTTT 900ACAGAATCCT TCAAAGCGCC GGAGCTTGGA GTAGGAAACC TAGGCGCATC AGAAAAGAGC 960GATGTTTTTC TCGTAGTTTC AACCCTTCTA CATGGTATCG AAGGTTTTGA GAAAGATCCG 1020GAGATAAAGC CTAATCAAGG ACTGAGATTC ATTACCTCAG AACCAGCGCA CGTAATGGAT 1080GAGAATGGTT ACCCAATCCA TCGACCTGGT ATAGCTGGAG TCGAGACAGC CTATACACGC 1140TTCATCACAG ACATCCTTGG CGTTTCCCCT GACTCAAGAC CTGATTCCAA CGAAGCCAGA 1200CTCCACGAGT TCTTGAGCGA CGGAACTATT GACGAGGAGT CGGCCAAGCA GATCCTAAAA 1260GATACTCTAA CCGGAGAAAT GAGCCCATTA TCTACTGATG TAAGGCGGAT AACACCCAAG 1320AAGCTTCGGG AGCTCTCTGA TTTGCTTAGG ACGCATTTGA GTAGTGCAGC AACTAAGCAA 1380TTGGATATGG GGGTGGTTTT GTCGGATCTT GATACCATGT TGGTGACACT CGACAAGGCC 1440GAACGCGAGG GGGGAGTAGA CAAGGATCAG TTGAAGAGTT TTAACAGTTT GATTCTGAAG 1500ACTTACAGCG TGATTGAAGA CTATGTCAAA GGCAGAGAAG GGGATACCAA GAGTTCCAGT 1560GCGGAAGTAT CCCCCTATCA TCGCAGTAAC TTTATGCTAT CGATCGCCGA ACCTTCACTG 1620CAGAGGATCC AAAAGCATCT GGACCAGACA CACTCTTTTT CTGATATCGG TTCACTAGTG 1680CGCGCACATA AGCACCTGGA AACGCTTTTA GAGGTCTTAG TCACCTTGTC ACCGCAAGGG 1740CAGCCCGTGT CCTCTGAAAC CTACAGCTTC CTGAATCGAT TAGCTGAGGC TAAGGTCACC 1800TTGTCGCAGC AATTGGATAC TCTCCAGCAG CAGCAGGAGA GTGCGAAACG GCAACTATCT 1860ATTCTGATTA ATCGTTCAGG TTCTTGGGCC GATGTTGCTC GTCAGTCCCT GCAGCGTTTT 1920GACAGTACCC GGCCTGTAGT GAAATTCGGC ACTGAGCAGT ATACCGCAAT TCACCGTCAG 1980ATGATGGCGG CCCATGCAGC CATTACGCTA CAGGAGGTAT CGGAGTTTAC TGATGATATG 2040CGAAACTTTA CAGCGGACTC TATTCCACTA CTGATTCGAC TTGGACGAAG CAGTTTAATA 2100GATGAGCATT TGGTTGAACA GAGAGAGAAG TTGCGAGACG TGACGACCAT CGCCGAGCGA 2160CTGAACCGGT TGGAGCGGGA ATGGATGTGA 2190<210>38<211>31<212>DNA<213>小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌<400)>38AAACTGCAGA TGTCTCTTGA GCAGAGGAGT C 31<210>39<211><212>DNA<213>小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌<400>39AAACTGCAGT CAGACTCCCT CTTCCTCCTC 30
權(quán)利要求
1．突變體耶爾森氏菌菌株，其在至少一個(gè)耶爾森氏菌效應(yīng)子-編碼基因中包括至少一個(gè)突變，從而所述突變體耶爾森氏菌菌株至少一個(gè)功能效應(yīng)子蛋白產(chǎn)生力不強(qiáng)。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的突變體耶爾森氏菌菌株，其中所述效應(yīng)子編碼基因選自小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的YopE,YopH,YopO,YopM和YopP；和假結(jié)核耶爾森氏菌的YopE,YopH,YpkA,YopM和YopJ。
3．根據(jù)權(quán)利要求1的突變體耶爾森氏菌菌株，其中所述突變是所述效應(yīng)子基因的啟動(dòng)子序列突變。
4．根據(jù)權(quán)利要求1的突變體耶爾森氏菌菌株，其中所述突變是所述效應(yīng)子基因的編碼序列突變。
5．五重突變體耶爾森氏菌菌株，具有小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌yopEHOMP或假結(jié)核耶爾森氏菌yopEHAOJ名稱(chēng)。
6．根據(jù)權(quán)利要求5的五重突變體耶爾森氏菌菌株，具有小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌MRS40(pABL403)的名稱(chēng)。
7．將異源蛋白送遞到真核生物細(xì)胞中的表達(dá)載體，其包括5’至3’方向的來(lái)自耶爾森氏菌致病子基因的啟動(dòng)子；與所述啟動(dòng)子操作連接的編碼來(lái)自耶爾森氏菌效應(yīng)子蛋白的送遞信號(hào)的第一DNA序列；和符合讀框的與所述第一DNA序列的3’末端融合的編碼所述異源蛋白的第二DNA序列。
8．權(quán)利要求7的表達(dá)載體，其中所述耶爾森氏菌致病子基因是耶爾森氏菌效應(yīng)子編碼基因。
9．權(quán)利要求8的表達(dá)載體，其中所述效應(yīng)子編碼基因選自小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的YopE,YopH,YopO,YopM和YopP；和假結(jié)核耶爾森氏菌的YopE,YopH,YpKA,YopM和YopJ。
10．權(quán)利要求9的表達(dá)載體，其中所述效應(yīng)子編碼基因是小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌YopE。
11．權(quán)利要求7的表達(dá)載體，其中所述效應(yīng)子蛋白選自小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的YopE,YopH,YopO,YopM和YopP；和假結(jié)核耶爾森氏菌的YopE,YopH,YpkA,YopM和YopJ。
12．權(quán)利要求11的表達(dá)載體，其中所述效應(yīng)子蛋白是小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌YopE或假結(jié)核耶爾森氏菌YopE之一。
13．權(quán)利要求7的表達(dá)載體，其中所述送遞信號(hào)是小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌YopE130。
14．權(quán)利要求7的表達(dá)載體，其中所述異源蛋白包括天然存在的蛋白質(zhì)的至少一個(gè)表位。
15．權(quán)利要求14的表達(dá)載體，其中所述天然存在的蛋白質(zhì)是腫瘤相關(guān)蛋白或者病原體抗原。
16．權(quán)利要求15的表達(dá)載體，其中所述腫瘤相關(guān)蛋白選自下面的成員MAGE家族，BAGE家族，DAGE/Prame家族，GAGE家族，RAGE家族，SMAGE家族，NAG，酪氨酸酶，Melan-A/MART-1,gp100,MUC-1,TAG-72,CA125,p21ras,p53,HPV16 E7,HOM-MEL-40,HOM-MEL-55,NY-COL-2,HOM-HD-397,HOM-RCC-1.14,HOM-HD-21,HOM-NSCLC-11,HOM-MEL-2.4，和HOM-TES-11。
17．權(quán)利要求16的表達(dá)載體，其中所述腫瘤相關(guān)蛋白是MAGE-1。
18．將異源蛋白送遞到真核生物細(xì)胞中的權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的耶爾森氏菌突變體菌株，其中用自5’至3’方向包括如下的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化所述耶爾森氏菌來(lái)自耶爾森氏菌致病子基因的啟動(dòng)子；與所述啟動(dòng)子操作連接的編碼來(lái)自耶爾森氏菌效應(yīng)子蛋白的送遞信號(hào)的第一DNA序列；和符合讀框的與所述第一DNA序列的3’末端融合的編碼所述異源蛋白的第二DNA序列。
19．根據(jù)權(quán)利要求18的耶爾森氏菌，其中所述耶爾森氏菌致病子基因是耶爾森氏菌效應(yīng)子編碼基因。
20．根據(jù)權(quán)利要求19的耶爾森氏菌，其中所述效應(yīng)子編碼基因選自小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的YopE,YopH,YopO,YopM和YopP；和假結(jié)核耶爾森氏菌的YopE,YopH,YpKA,YopM和YopJ。
21．根據(jù)權(quán)利要求20的耶爾森氏菌，其中所述效應(yīng)子編碼基因是小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌YopE。
22．根據(jù)權(quán)利要求18的耶爾森氏菌，其中所述效應(yīng)子蛋白選自小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的YopE,YopH,YopO,YopM和YopP；和假結(jié)核耶爾森氏菌的YopE,YopH,YpkA,YopM和YopJ。
23．根據(jù)權(quán)利要求22的耶爾森氏菌，其中所述效應(yīng)子蛋白是小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌YopE或假結(jié)核耶爾森氏菌YopE之一。
24．根據(jù)權(quán)利要求18的耶爾森氏菌，其中所述送遞信號(hào)是小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌YopE130。
25．根據(jù)權(quán)利要求18的耶爾森氏菌，其中所述異源蛋白包括天然存在的蛋白質(zhì)的至少一個(gè)表位。
26．根據(jù)權(quán)利要求25的耶爾森氏菌，其中所述天然存在的蛋白質(zhì)是腫瘤相關(guān)蛋白或者病原體抗原。
27．根據(jù)權(quán)利要求26的耶爾森氏菌，其中所述腫瘤相關(guān)蛋白選自下面的成員MAGE家族，BAGE家族，DAGE/Prame家族，GAGE家族，RAGE家族，SMAGE家族，NAG，酪氨酸酶，Melan-A/MART-1,gp100,MUC-1,TAG-72,CA125,p21ras,p53,HPV16 E7,HOM-MEL-40,HOM-MEL-55,NY-COL-2,HOM-HD-397,HOM-RCC-1.14,HOM-HD-21,HOM-NSCLC-11,HOM-MEL-2.4，和HOM-TES-11。
28．根據(jù)權(quán)利要求27的耶爾森氏菌，其中所述腫瘤相關(guān)蛋白是MAGE-1。
29．將異源蛋白送遞到真核生物細(xì)胞中的方法，包括用特征在于自5’至3’方向如下的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的權(quán)利要求1的突變體菌株耶爾森氏菌接觸所述真核生物細(xì)胞來(lái)自耶爾森氏菌致病子基因的啟動(dòng)子；與所述啟動(dòng)子操作連接的編碼來(lái)自耶爾森氏菌效應(yīng)子蛋白的送遞信號(hào)的第一DNA序列；和符合讀框的與所述第一DNA序列的3’末端融合的編碼所述異源蛋白的第二DNA序列。
30．權(quán)利要求29的方法，其中所述真核生物細(xì)胞是呈遞抗原細(xì)胞。
31．權(quán)利要求30的方法，其中所述呈遞抗原細(xì)胞選自B細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，樹(shù)突細(xì)胞，單核細(xì)胞，濾泡細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。
32．權(quán)利要求30的方法，其中所述呈遞抗原細(xì)胞表達(dá)能呈遞自所述異源蛋白衍生的一個(gè)或多個(gè)表位的MHC分子。
33．權(quán)利要求29的方法，其中所述效應(yīng)子蛋白選自小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的YopE,YopH,YopO,YopM和YopP；和假結(jié)核耶爾森氏菌的YopE,YopH,YpkA,YopM和YopJ。
34．權(quán)利要求33的方法，其中所述效應(yīng)子蛋白是小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌YopE或假結(jié)核耶爾森氏菌YopE之一。
35．權(quán)利要求29的方法，其中所述效應(yīng)子蛋白是小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌YopE130。
36．權(quán)利要求29的方法，其中所述異源蛋白包括天然存在的蛋白質(zhì)的至少一個(gè)表位。
37．根據(jù)權(quán)利要求36的耶爾森氏菌，其中所述天然存在的蛋白質(zhì)是腫瘤相關(guān)蛋白或者病原體抗原。
38．權(quán)利要求37的表達(dá)載體，其中所述腫瘤相關(guān)蛋白選白下面的成員MAGE家族，BAGE家族，DAGE/Prame家族，GAGE家族，RAGE家族，SMAGE家族，NAG，酪氨酸酶，Melan-A/MART-1,gp100,MUC-1,TAG-72,CA125,p21ras,p53,HPV16 E7,HOM-MEL-40,HOM-MEL-55,NY-COL-2,HOM-HD-397,HOM-RCC-1.14,HOM-HD-21,HOM-NSCLC-11,HOM-MEL-2.4，和HOM-TES-11。
39．權(quán)利要求38的方法，其中所述腫瘤相關(guān)蛋白是MAGE-1。
40．權(quán)利要求29的方法，其中所述耶爾森氏菌致病子基因是耶爾森氏菌效應(yīng)子編碼基因。
41．權(quán)利要求40的方法，其中所述效應(yīng)子編碼基因選自小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的YopE,YopH,YopO,YopM和YopP；和假結(jié)核耶爾森氏菌的YopE,YopH,YpKA,YopM和YopJ。
42．權(quán)利要求41的方法，其中所述效應(yīng)子編碼基因是小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的YopE。
43．誘導(dǎo)異源蛋白特異性免疫應(yīng)答的方法，包括下面步驟(a)選擇表達(dá)能呈遞所述異源蛋白至少一個(gè)表位的MHC分子的呈遞抗原細(xì)胞；(b)通過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的權(quán)利要求1的突變體耶爾森氏菌菌株接觸所述呈遞抗原細(xì)胞形成細(xì)胞混合物，從而將所述異源蛋白送遞到所述呈遞抗原細(xì)胞中，其中所述表達(dá)載體特征在于自5’至3’方向來(lái)自耶爾森氏菌致病子基因的啟動(dòng)子；與所述啟動(dòng)子操作連接的編碼來(lái)自耶爾森氏菌效應(yīng)子蛋白的送遞信號(hào)的第一DNA序列；和符合讀框的與所述第一DNA序列融合的3’末端的編碼所述異源蛋白的第二DNA序列；和(c)用步驟(b)中形成的細(xì)胞混合物接觸得自受者的含有外周血淋巴細(xì)胞的樣品，從而誘導(dǎo)對(duì)所述異源蛋白特異性的免疫應(yīng)答。
44．權(quán)利要求43的方法，其中所述表位來(lái)自腫瘤相關(guān)蛋白。
45．權(quán)利要求44的方法，其中所述腫瘤相關(guān)蛋白選自下面的成員MAGE家族，BAGE家族，DAGE/Prame家族，GAGE家族，RAGE家族，SMAGE家族，NAG，酪氨酸酶，Melan-A/MART-1,gp100,MUC-1,TAG-72,CA125,p21ras,p53,HPV16 E7,HOM-MEL-40,HOM-MEL-55,NY-COL-2,HOM-HD-397,HOM-RCC-1.14,HOM-HD-21,HOM-NSCLC-11,HOM-MEL-2.4，和HOM-TES-11。
46．權(quán)利要求45的方法，其中所述腫瘤相關(guān)蛋白是MAGE-1。
47．權(quán)利要求46的方法，其中所述表位來(lái)自MAGE-1并且所述MHC分子是HLA-A1。
48．一種免疫原性組合物，含有根據(jù)權(quán)利要求18的重組耶爾森氏菌。
49．在需要所述應(yīng)答的受者體內(nèi)誘導(dǎo)異源蛋白特異性CTL應(yīng)答的方法，包括下面的步驟(a)從所述受者獲得表達(dá)MHC分子的呈遞抗原細(xì)胞；(b)通過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的權(quán)利要求1的突變體耶爾森氏菌菌株接觸所述呈遞抗原細(xì)胞形成細(xì)胞混合物，其中所述表達(dá)載體特征在于自5’至3’方向的來(lái)自耶爾森氏菌致病子基因的啟動(dòng)子；與所述啟動(dòng)子操作連接的編碼來(lái)自耶爾森氏菌效應(yīng)子蛋白的送遞信號(hào)的第一DNA序列；和符合讀框的與所述第一DNA序列融合的3’末端的第二DNA序列，其中所述第二DNA序列編碼所述呈遞抗原細(xì)胞的所述MHC分子呈遞的所述異源蛋白的至少一個(gè)表位；和(c)用步驟(b)中形成的細(xì)胞混合物接觸得自受者的含有外周血淋巴細(xì)胞的樣品，從而產(chǎn)生對(duì)所述異源蛋白特異性的CTLs；和(d)對(duì)所述受者施用步驟(c)中產(chǎn)生的CTLs，從而誘導(dǎo)所述受者體內(nèi)對(duì)所述異源蛋白的特異性CTL應(yīng)答。
50．測(cè)定受者接種方案有效性的方法，其中用一種抗原對(duì)所述受者接種，包括下面的步驟(a)從所述受者獲得表達(dá)MHC分子的呈遞抗原細(xì)胞；(b)通過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的權(quán)利要求1的突變體耶爾森氏菌菌株接觸所述呈遞抗原細(xì)胞形成細(xì)胞混合物，其中所述表達(dá)載體特征在于自5’至3’方向的來(lái)自耶爾森氏菌致病子基因的啟動(dòng)子；與所述啟動(dòng)子操作連接的編碼來(lái)自耶爾森氏菌效應(yīng)子蛋白的送遞信號(hào)的第一DNA序列；和符合讀框的與所述第一DNA序列融合的3’末端的第二DNA序列，其中所述第二DNA序列編碼所述呈遞抗原細(xì)胞的所述MHC分子呈遞的所述抗原的至少一個(gè)表位；和(c)用步驟(b)中形成的細(xì)胞混合物接觸得自所述受者的含有外周血淋巴細(xì)胞的樣品，并且檢測(cè)所述抗原特異性免疫應(yīng)答的存在，從而確定所述接種方案的有效性。
51．一種治療患者病癥的方法，包括對(duì)所述患者施用權(quán)利要求18的耶爾森氏菌，其中異源蛋白激發(fā)對(duì)所述病癥特異性的免疫應(yīng)答。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組耶爾森氏菌及其將蛋白質(zhì)送遞到真核生物細(xì)胞中的用途,包括相關(guān)的組合物和治療方法和相關(guān)的分析。
文檔編號(hào)C12N15/74GK1304442SQ99805875
公開(kāi)日2001年7月18日 申請(qǐng)日期1999年3月3日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月6日
發(fā)明者皮埃爾B·范·德·布魯根, 蓋伊R·科尼利斯, 安妮M·博蘭德, 蒂爾利R·布恩－法勒 申請(qǐng)人:皮埃爾B·范·德·布魯根, 蓋伊R·科尼利斯, 安妮M·博蘭德, 蒂爾利R·布恩－法勒