專利名稱：轉(zhuǎn)基因合成紫穗槐－4,11－二烯的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一段DNA序列，該序列編碼的多肽，以及所述DNA序列和多肽在制備紫穗槐二烯(amorphadiene)中的應(yīng)用。
人類瘧疾是一種常見的發(fā)生較普遍的傳染病，85％的病例是由鐮刀形瘧原蟲(Plasmodium falciparum)引起。該寄生蟲導(dǎo)致最致命形式的瘧疾，熱帶瘧疾。每年，瘧疾引起的臨床疾病通常非常嚴(yán)重，超過1億人，其中100多萬人將最終死亡。大約40％的世界人口處在瘧疾感染的危險之中(據(jù)世界衛(wèi)生組織估計)。
傳統(tǒng)上治療瘧疾采用喹啉類物質(zhì)，如喹寧、氯喹、甲氟喹和伯氨喹，以及抗葉酸制劑。不幸的是，大部分鐮刀形瘧原蟲株已變得對氯喹耐藥，有些已經(jīng)發(fā)展到對甲氟喹和氯氟菲醇(halofantrine)耐藥。因此，急需耐藥寄生蟲敏感的新型抗瘧藥。本文青蒿素(artemisinin)及其半合成的衍生物就是很有前途的候選藥物。
青蒿素(artemisinin，

圖1),[3R-(3α,5αβ,6β,8αβ,9α,12β,12αR*)]-八氫-3,6,9-三甲基-3,12-環(huán)氧-12H-吡喃-[4,3-j]-1,2-苯并二氧庚英-10(3H)-酮；分子量282.35)，也叫arteannuin,qinghaosu或QHS)，是從植物黃花蒿(Arternisia annua L.)的地上部分提取的一種倍半萜內(nèi)酯內(nèi)過氧化物。
黃花蒿也叫青蒿(中文)，草蒿或香蒿，或香艾，一年生草本，原產(chǎn)于亞洲。青蒿屬菊科，屬于Asteroideae的Anthemideae群落，是一種常高達(dá)2m以上的大型藥草。通常單莖多分枝，葉芳香、深裂，長2.5～5cm。青蒿素作為次級代謝物，主要在葉片中生產(chǎn)，野生種群中濃度為干重的0.01～0.6％。青蒿素為植物青蒿所特有，可能的特例是邪蒿(A.apiacea L.)。本發(fā)明中所用的青蒿源自越南。
由于在植物中含量低，青蒿素是一種相對昂貴的藥用資源。因而，目前的研究旨在利用有機(jī)合成方法，較大規(guī)模生產(chǎn)青蒿素。但是，由于青蒿素由七個手性碳原子構(gòu)成，理論上可形成27=128種異構(gòu)體，其中只有一種與青蒿素相同。鑒于青蒿素如此復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，從商業(yè)觀點來看，利用有機(jī)合成生產(chǎn)該化合物并非有利可圖。
利用生物合成途徑的遺傳工程可能在植物中獲得高水平的青蒿素。為了能夠干預(yù)青蒿素的生物合成，必須完全或部分了解其生物合成途徑。為闡明其完整的生物合成途徑，已經(jīng)進(jìn)行了很多努力。不過到目前為止，準(zhǔn)確的途徑大多仍不為人知。
在導(dǎo)致本發(fā)明的研究中，發(fā)現(xiàn)了以前未見發(fā)表的一條獨特途徑。該途徑特別涉及到形成青蒿素前體紫穗槐-4,11-二烯(amorpha-4,11-diene)(1β,6β,7β,10αH-紫穗槐-4,11-二烯)以及二氫青蒿素酸(dihydroarteannuic acid)的過氧化氫化物。以前未見文獻(xiàn)報道在青蒿中發(fā)現(xiàn)這些前體。
從文獻(xiàn)可知，萜環(huán)化酶(合成酶)是一種枝點酶，可能在萜類的生物合成中具有重要作用。因此，本發(fā)明的工作假說是，過量表達(dá)這樣的枝點酶(萜環(huán)化酶)可以增加生物體中萜類的產(chǎn)量。就青蒿素而言，通往青蒿素的后續(xù)生物合成步驟的數(shù)目和本質(zhì)是可能影響該方法成功的因素。圖2所示為本發(fā)明者假定的青蒿素生物合成途徑。該途徑分為三個部分第Ⅰ部分(部分Ⅰ)代表萜類(類異戊二烯)途徑，屬常規(guī)途徑。例如，二磷酸法呢酯(焦磷酸法呢酯，F(xiàn)PP)存在于所有活的生物體中，是大量初級和次級代謝物的前體，已經(jīng)明確FPP是所有倍半萜的前體。因此，可以確定FPP是青蒿素的前體。
部分Ⅱ顯示普通前體FPP經(jīng)環(huán)化作用成為高特異性的前體紫穗槐-4,11-二烯(也稱為紫穗槐二烯)，是青蒿素的第一個特異性前體。紫穗槐二烯合成酶是該途徑的枝點酶，在青蒿素的生物合成途徑中處于關(guān)鍵地位。
部分Ⅲ，二氫青蒿素酸(dihydroarteannuic acid,DHAA)，也稱為dihydroartemisinic acid，通過光氧化作用轉(zhuǎn)化成其過氧化氫化物(DHAA-OOH)，該DHAA的過氧化氫化物將會自發(fā)地氧化成為青蒿素。這一途徑中不涉及酶，因而，不可能通過過量表達(dá)該途徑中涉及的基因，來改變青蒿素的產(chǎn)量。
在紫穗槐二烯轉(zhuǎn)化為DHAA，即部分Ⅱ和部分Ⅲ之間的過渡狀態(tài)中(見圖3)，很可能涉及烯酸還原酶(enoate reductase)以及多種受細(xì)胞色素P-450催化的酶。因為在植物中這部分途徑的中間體沒有發(fā)現(xiàn)，或以檢測不到的量存在(積累)(有一例外是青蒿素酸(arteannuic acid)，也稱為artermisinic acid，或4,11(13)-紫穗槐二烯-12-酸)，很可能這些前體被非常迅速地轉(zhuǎn)換成DHAA。該部分途徑不太可能有限速步驟。
綜合考慮這些因素，本發(fā)明者斷定，由紫穗槐二烯合成酶將FPP轉(zhuǎn)化(環(huán)化)為紫穗槐二烯，是可經(jīng)遺傳干預(yù)而改變的最合理的步驟。
因此本發(fā)明目的在于提供一種方法，其中通過至少部分是生物學(xué)的路線獲得青蒿素。
該目的通過提供一段DNA序列而達(dá)到，該序列與圖12所示序列至少70％同源，并編碼具有紫穗槐二烯合成酶生物活性的多肽。
紫穗槐二烯合成酶的生物活性涉及普通前體焦磷酸法呢酯(FPP)轉(zhuǎn)化為青蒿素特異性前體紫穗槐-4,11-二烯，后者在青蒿中被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為青蒿素。根據(jù)本發(fā)明，通過測試其基因表達(dá)產(chǎn)物將FPP轉(zhuǎn)化為紫穗槐-4,11-二烯的能力，可選擇適當(dāng)?shù)幕颉?br> 利用本發(fā)明的DNA序列轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，能夠增強(qiáng)焦磷酸法呢酯(FPP)到高特異性前體紫穗槐二烯的轉(zhuǎn)化，如果該生物體中天然不存在該轉(zhuǎn)化路線，則可誘導(dǎo)這種轉(zhuǎn)化。如果是后一種情況，生物體應(yīng)該含有，或能生產(chǎn)FPP。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞是例如細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞，酵母細(xì)胞如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)，特別是產(chǎn)油酵母，如Yarrowialipolytica，或者是植物細(xì)胞，如類似青蒿的那些植物。
有幾種植物能產(chǎn)生大量FPP，有可能成為生產(chǎn)紫穗槐二烯的生物體。
可能的產(chǎn)油酵母宿主細(xì)胞，例如，象Yarrowia lipolytica和Cryptococcus curvatus，能夠在含油小體中蓄積高達(dá)約50％(干重)的儲存碳水化合物，是引人注目的大量生產(chǎn)萜類的候選生物體。根據(jù)本發(fā)明，獲得高水平的萜蓄積的方法是，例如借助于新陳代謝流向的重定向，使有利于形成紫穗槐-4,11-二烯。
Shimada等人利用類異戊二烯途徑的代謝工程提高食物酵母產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)的類胡蘿卜素產(chǎn)量(應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(Appl.Environ.Microbiol.)64,2676-2680(1998))，與此類似，根據(jù)本發(fā)明，在這樣的酵母細(xì)胞中，目標(biāo)基因是乙酰輔酶A羧化酶(ACC，破壞)、羥基-甲基-戊二酰輔酶A還原酶(HMGR，過量表達(dá))和鯊烯合成酶(SQS，破壞)，以增加前體的供應(yīng)，以及過量表達(dá)紫穗槐-4,11-二烯合成酶以蓄積紫穗槐二烯。由文獻(xiàn)可知，幾種表達(dá)系統(tǒng)(例如Muller等人，酵母(Yeast)14,1267-1283(1998)；Park等人，生物化學(xué)雜志(The Journal of Biological Chemistry)272,6876-6881(1997)；Tharaud等人，基因(Gene)121,111-119(1992))和轉(zhuǎn)化系統(tǒng)(例如Chen等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.,48232-235(1997))適于Y.lipolytica，因此在Y.lipolytica中轉(zhuǎn)化和表達(dá)前述目標(biāo)基因是可能的，沒有大的技術(shù)難題。
把FPP加到其中含有本發(fā)明的酶(如按實施例1所述分離)或含有本發(fā)明DNA序列(如例3和例4所述)并表達(dá)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞如大腸桿菌的培養(yǎng)基中，可以將FPP轉(zhuǎn)化成紫穗槐二烯，然后作為生產(chǎn)青蒿素的原料。
因在其中表達(dá)本發(fā)明的紫穗槐二烯合成酶而生產(chǎn)紫穗槐二烯的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，既可以裂解形式(例如通過超聲處理)，也可以完整細(xì)胞，用作為紫穗槐二烯的來源。
萜環(huán)化酶據(jù)認(rèn)為是限速步驟，所以在青蒿中過量表達(dá)紫穗槐二烯合成酶編碼基因，將增加青蒿素產(chǎn)生。
本研究結(jié)果(假定的青蒿素的生物合成途徑)清楚表明，在紫穗槐二烯合成酶處存在唯一的主要限速步驟，在青蒿中過量表達(dá)紫穗槐二烯合成酶編碼基因，將增加青蒿素的生產(chǎn)。
FPP的環(huán)化產(chǎn)物是青蒿素的第一個特異性前體，其化學(xué)結(jié)構(gòu)文獻(xiàn)未見報道。迄今為止，沒有人在青蒿中檢測到這樣的化合物。不過，根據(jù)DHAA和青蒿素酸的結(jié)構(gòu)，預(yù)測該環(huán)化產(chǎn)物的大概結(jié)構(gòu)是可能的(圖3)。這種方式預(yù)測的結(jié)構(gòu)與文獻(xiàn)報道的化合物4,11-紫穗槐二烯一致(J.D.Connelly和R.A.Hill，萜類字典(Dictionary of terpenoids)，Chapmann和Hill，倫敦，英國)，如圖4所示。Bohlmann等人先前曾描述過從Viguiera oblongifolia中提取這種化合物，但將其錯誤命名為杜松-4,11-二烯(植物化學(xué)23(5)1183-1184(1984))。從青蒿素酸(從青蒿中提取)開始，能夠合成紫穗槐二烯。這樣獲得的紫穗槐二烯，其物理和化學(xué)性質(zhì)與Bohlmann等人描述的完全一致，該標(biāo)準(zhǔn)用來表明，在青蒿的萜提取物中存在紫穗槐二烯。
本發(fā)明的另一個目的在于，提供可按實施例1所述方法獲得的具有紫穗槐二烯合成酶生物活性的多肽。該多肽能用來將FPP轉(zhuǎn)化成紫穗槐二烯，進(jìn)而轉(zhuǎn)化成青蒿素。如果在含有把紫穗槐二烯進(jìn)一步轉(zhuǎn)換成青蒿素所需酶的植物內(nèi)表達(dá)紫穗槐二烯合成酶多肽，即能在植物體內(nèi)發(fā)生這種轉(zhuǎn)化?；蛘甙袴PP和所述多肽(分離形式或作為細(xì)胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)物)放在混合體系中溫育，也能在體外發(fā)生這種轉(zhuǎn)化。
在由本發(fā)明所述DNA序列轉(zhuǎn)化的適當(dāng)?shù)乃拗魃矬w中產(chǎn)生的紫穗槐二烯，隨后可以作為前體被化學(xué)轉(zhuǎn)化為二氫青蒿素酸。二氫青蒿素酸本身就能用來生產(chǎn)青蒿素。
紫穗槐二烯化學(xué)轉(zhuǎn)化為二氫青蒿素酸(圖15)，是從紫穗槐二烯和BH3的對映體、立體和區(qū)域選擇性(反馬科尼科夫規(guī)則)的硼氫化反應(yīng)開始，產(chǎn)生三烷基硼烷，隨后三烷基硼烷被NaOH/H2O2氧化，產(chǎn)生醇(高等有機(jī)化學(xué)(Advanced Organic Chemistry),Jerry March，第四版，Wiley,1992)。PDC(重鉻酸吡啶鎓)能使醇溫和氧化為酸，而不會攻擊第二個雙鍵(圖15)(有機(jī)合成(Organic Synthesis)，M.B.Smith，第一版，McGraw-Hill,1994)。
文獻(xiàn)報道，已克隆了很多編碼二磷酸法呢酯生物合成途徑相關(guān)酶的基因。例如，文獻(xiàn)報道了編碼青蒿中二磷酸法呢酯合成酶的基因序列(Y.Matsushita,W-K.Kang和V.Charlwood，基因(GENE)172(1996)207-209)。誘導(dǎo)或提高生物體產(chǎn)生紫穗槐二烯的另一條途徑是，將本發(fā)明的DNA序列與一種或多種二磷酸法呢酯生物合成相關(guān)基因同時轉(zhuǎn)化該生物體(如青蒿)，表達(dá)紫穗槐二烯合成酶和二磷酸法呢酯合成酶的融合蛋白就是一個實例。
(倍半)萜，如紫穗槐二烯，已知也是食品和香水工業(yè)的調(diào)料和香料化合物。另外，萜類在植物-昆蟲的互作中起作用，例如植物吸引或排斥昆蟲。再者，二氫青蒿素酸(青蒿中從紫穩(wěn)槐二烯到青蒿素代謝途徑的中間體)，能用做抗氧化劑。
由(過量)表達(dá)本發(fā)明的DNA序列或使用本發(fā)明的多肽(紫穗槐二烯合成酶)所得到的紫穗槐二烯，也能用于這些用途。
優(yōu)選地，可用于本發(fā)明的植物是已能產(chǎn)生青蒿素的植物。青蒿是最好的實例，它含有通向青蒿素的其余途徑。不過，本發(fā)明也可用于在植物中產(chǎn)生紫穗槐二烯，其如前所述可用做調(diào)料、香料或殺蟲劑，或者通過化學(xué)方法或利用微生物、酵母、植物細(xì)胞的生物方法轉(zhuǎn)化為青蒿素。
優(yōu)選地，用于產(chǎn)生紫穗槐二烯的植物是已有基本途徑和儲藏區(qū)室而能產(chǎn)生倍半萜的植物，或者是能夠受激發(fā)誘導(dǎo)生物合成倍半萜類的植物。本發(fā)明所述方法易于通過常規(guī)技術(shù)用于許多植物，例如包括來自田莧蒿屬(Carum)、菊苣屬(Cichorium)、胡蘿卜屬、刺柏屬(Juniperus)、春黃菊屬(Chamomilla)、萵苣屬(Lactuca)、廣藿香屬(Pogostemon)和香根草屬(Vetiveria)的物種，以及來自可(通過激發(fā))誘導(dǎo)產(chǎn)生倍半萜類植物抗毒素的屬-辣椒屬、棉屬、番茄屬、煙草屬、梯牧草屬、茄屬和榆屬的物種。不過，象大豆、向日葵和油菜籽(rapeseed)那樣的常見農(nóng)作物也是引人注意的候選對象。
本發(fā)明將由以下實施例作進(jìn)一步闡明，但將不僅局限于此。在實施例中圖注如下圖1青蒿素的結(jié)構(gòu)式。
圖2青蒿中假定的青蒿素生物合成途徑。
圖3圖2中部分Ⅱ和部分Ⅲ間的轉(zhuǎn)化假定的青蒿中紫穗槐二烯到二氫青蒿素酸的轉(zhuǎn)化。
圖4紫穗槐-4,11-二烯的結(jié)構(gòu)式。
圖5[3H]-FPP分析的放射氣相色譜圖(Radio-GC)。A．紫穗槐二烯的火焰電離檢測器(FID)信號(參照)。B．3H標(biāo)記的分析產(chǎn)物紫穗槐二烯(保留時間14分鐘)和法呢醇(非特異性磷酸水解酶活性產(chǎn)物，保留時間28分鐘)的放射信號，其得自粗酶提取物。C．3H標(biāo)記的分析產(chǎn)物紫穗槐二烯的放射信號，其得自Mono Q純化的酶提取物。
圖6紫穗槐二烯作參照的質(zhì)譜，與采用從青蒿中純化的萜環(huán)化酶(合成酶)的FPP分析的質(zhì)譜比較。該比較得到質(zhì)量評分為99％，對應(yīng)同一性的最大評分。
圖7PCR制備探針，克隆到pGEM 7Zf+。
圖8探針的核苷酸序列以及推測的氨基酸序列，該探針(538bp)由使用引物A和B的PCR制備。
圖9從受誘導(dǎo)青蒿的cDNA文庫中分離得到的一個陽性克隆的質(zhì)粒。
圖10從受誘導(dǎo)青蒿的cDNA文庫中分離得到的一個陽性克隆(紫穗槐二烯合成酶編碼基因)的核苷酸序列以及推測的氨基酸序列，序列側(cè)翼為EcoRⅠ(NotⅠ)銜接頭(Gibco BRL)。
圖11紫穗槐二烯合成酶編碼基因起始和終止密碼子之間的部分(兩端分別為NcoⅠ和BamHⅠ位點)，克隆于表達(dá)載體pET11d的NcoⅠ/BamHⅠ位點。
圖12由使用引物C和D的PCR制備的紫穗槐二烯合成酶編碼基因起始和終止密碼子之間(兩端分別為NcoⅠ和BamHⅠ位點)的核苷酸序列以及推測的氨基酸序列。
圖13SDS-PAGE凝膠泳道1和2分別表示pET11d的菌體和上清(陰性對照)；泳道3和4分別表示含有煙草5-表-馬兜鈴堿合成酶(tobacco 5-epi-aristolochene synthase,TEAS)基因的pET11d的菌體和上清(陽性對照)；泳道5,7,9和6,8,10分別表示含有紫穗槐二烯合成酶的pET11d的菌體和上清。所有構(gòu)建體都在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)。含有TEAS的pET11d(陽性對照)和含有紫穗槐二烯合成酶的pET11d的菌體成分的泳道都顯示明顯的條帶，在pET11d陰性對照中則沒有。Mw是低分子量標(biāo)準(zhǔn)(PharmaciaBiotech)。
圖14A．紫穗槐-4,11-二烯和法呢醇的火焰電離檢測器(FID)信號(參照)；B．用完整BL21(DE3)細(xì)胞做的[3H]-FPP分析的放射氣相色譜，該細(xì)胞由含有紫穗槐二烯合成酶編碼基因的pET11d表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而來；C．用超聲破碎的BL21(DE3)細(xì)胞上清做的[3H]-FPP分析的放射氣相色譜，該細(xì)胞由含有紫穗槐二烯合成酶編碼基因的pET11d表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而來。
圖15假定的以紫穗槐-4,11-二烯為前體，化學(xué)合成二氫青蒿素酸。該反應(yīng)包括紫穗槐二烯和BH3的對映體、立體和區(qū)域選擇性(反馬科尼科夫規(guī)則)的硼氫化反應(yīng)，形成的三烷基硼烷隨后被NaOH/H2O2氧化，產(chǎn)生醇。PDC(重鉻酸吡啶鎓)使醇溫和氧化為酸，而不會攻擊第二個雙鍵。
圖16利用分子排阻層析(凝膠過濾)測定紫穗槐-4,11-二烯的分子量。-*-是活性曲線；-▲-是分子量標(biāo)準(zhǔn)；-是分子量校準(zhǔn)線。
實施例實施例1通過紫穗槐二烯合成酶將焦磷酸法呢酯轉(zhuǎn)換為紫穗槐二烯A．從青蒿中分離、部分純化和鑒定紫穗槐二烯合成酶本分析中分離與制備酶的全部操作均在冰上或4℃進(jìn)行。將10g采自溫室培養(yǎng)的青蒿的嫩葉冷凍，在預(yù)冷的研缽中搗碎，于40ml預(yù)冷的含25mM MES(pH5.5),20％(v/v)甘油，25mM抗壞血酸鈉，25mMNaHSO3,10mM MgCl2和5mM DTT的緩沖液(緩沖液A)中研磨，所述緩沖液中加入1g聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)和一勺純凈海沙攪成漿狀。加入10g聚苯乙烯樹脂(Amberlite XAD-4,Serva)，小心攪拌漿液10分鐘，然后用干酪布過濾。濾液于20,000g離心20分鐘(棄沉淀)，然后100,000g離心90分鐘。取3ml上清樣品用含15mMMOPSO(pH7.0),10％(v/v)甘油，1mM抗壞血酸鈉，10mM MgCl2和2mM DTT的緩沖液(緩沖液B)脫鹽，用作酶分析/產(chǎn)品鑒定(參見下述“B”)。
將12.5g DEAE陰離子交換樹脂(Whatman DE-52)用緩沖液A漂洗數(shù)次，加入剩余上清中，小心攪拌10分鐘，18,000g離心20分鐘，移出上清，丟棄DE-52沉淀。加入(NH4)2SO4至70％終濃度，小心攪拌30分鐘，20,000g離心10分鐘，以沉淀上清中蛋白。產(chǎn)生的沉淀重溶于6ml緩沖液A，用緩沖液B脫鹽。在加入甘油多至30％(v/v)后，可以將酶制劑在液氮中冷凍，-80℃保存而不失活。預(yù)先用含0.1％Tween-20、不含抗壞血酸鈉的緩沖液B平衡Mono-Q FPLC柱(HR5/5,Pharmacia Biotech)，將該酶制劑0.5ml上樣，用0-2.0M KCl梯度的相同緩沖液洗脫該酶。為測定酶活性，取0.75-ml洗脫組分的50ul，在Eppendorf管中用緩沖液B稀釋2倍，加入20uM[3H]FPP。反應(yīng)混合物覆蓋1ml己烷，封閉揮發(fā)性產(chǎn)物和各混合成分。30℃溫育30分鐘后，劇烈混合，短暫離心，使其分相。己烷相部分(750ul)移入一個新Eppendorf管，其中含有40mg硅膠(0.035-0.07mm，孔徑6nm，Janssen Chimica)，用以結(jié)合磷酸水解酶產(chǎn)生的萜烯醇?；靹虿㈦x心后，取500ul己烷層液體，加入4.5ml Ultima Gold cocktail(Packard)中，用于液體閃爍計數(shù)。合并各活性組分，分析產(chǎn)物同一性(參見下文)。在Mono-Q步驟之后，該酶與所有其它FPP轉(zhuǎn)化活性被分離開來(圖5C)。用該酶制劑測定其酶學(xué)特性，如分子量和Km。利用分子排阻層析測定其分子量。將200ul Mono-Q洗脫組分上樣到Superdex 75(H/R10/30,Pharmacia Biotech)，用與Mono-Q相同的緩沖液洗脫。同Mono-Q所述一樣測定0.5ml組分中的酶活，只是不用稀釋洗脫液。柱子用細(xì)胞色素C、核糖核酸酶A、α-胰凝乳蛋白酶原、卵清蛋白以及BSA(均自Sigma)校準(zhǔn)，估計分子量為56kDa(圖16)。利用5倍和10倍稀釋的Mono-Q洗脫酶制劑，以及0.25-100uM濃度的[3H]-FPP測定酶的動力學(xué)。紫穗槐二烯合成酶的Km值為0.6uM。
B．測定產(chǎn)物同一性為測定產(chǎn)物同一性，將20uM[3H]-FPP(Amersham；用于放射氣相色譜分析)或50uM未標(biāo)記的FPP(Sigma；用于氣相色譜-質(zhì)譜分析)加入1ml酶制劑中，管中覆蓋1ml重蒸戊烷，以封閉揮發(fā)物，然后小心混合管內(nèi)成分，30℃溫育1小時。用煮沸的樣品作對照。隨后，劇烈混勻各管，移出有機(jī)層，通過一覆蓋無水MgSO4的氧化鋁小柱，用1ml二乙醚過柱提取，再用1.5ml二乙醚洗柱。合并的戊烷/二乙醚混合物在氮氣流中緩慢濃縮，用于氣相色譜分析。
用裝有RAGA-90放射性探測器(Raytest,Straubenhardt，德國)的Carlo-Erba 4160系列氣相色譜儀進(jìn)行放射氣液色譜分析。在放射性測定前，經(jīng)過一個800℃的裝滿鉑片的轉(zhuǎn)換反應(yīng)器，定量還原柱洗脫組分。以冷的在柱方式注入1ul樣品。柱子是一根融合的二氧化硅毛細(xì)管(30m×0.32mm i.d.)，包被有一層0.25um的聚乙二醇(EconoCap EC-WAX,Alltech Associates)薄膜，并在氦流速為1.2mlmin-1下操作。爐溫設(shè)定程序為70℃5分鐘，然后以5℃min-1升到210℃，最后5分鐘。為通過放射性與參照標(biāo)準(zhǔn)的共洗脫測定保留時間和峰的同一性，通過可調(diào)分流器，約20％的柱流出液被分流到FID(溫度270℃)，余者引到轉(zhuǎn)化反應(yīng)器和放射性探測器。在反應(yīng)器之前以3mlmin-1通氫氣，在放射性探測器(5ml計數(shù)管)之前通甲烷作為淬滅氣體，總流速為36ml min-1。主要的[3H]標(biāo)記物與紫穗槐二烯參照標(biāo)準(zhǔn)(保留時間為14分鐘)共洗脫(圖5B)。第二個放射性標(biāo)記物是作為非特異性磷酸水解酶活性的產(chǎn)物的法呢醇。在Mono-Q步驟之后，該酶與所有其它FPP轉(zhuǎn)化活性被分離開來(圖5C)。該酶制劑用來測定諸如Km和分子量等酶學(xué)特性。
氣相色譜-質(zhì)譜分析使用配有HP-5MS或HP-Innowax柱(均為30m×0.25mm i.d.,0.25um df)的HP 5890 seriesⅡ氣相色譜儀和HP5972A質(zhì)量選擇性檢測器(Hewlett-Packard)進(jìn)行。爐溫設(shè)定程序為起始溫度70℃1分鐘，然后以5℃min-1升到210℃，最后5分鐘。注入口(非分流方式)、界面和質(zhì)譜源溫度分別為175,290和180℃，由電子壓力控制器控制氦入口壓力，使恒定流速為1.0ml min-1。電離電壓設(shè)為70eV，并從30-250amu進(jìn)行掃描。(NH4)2SO4沉淀的酶制劑不含內(nèi)源性倍半萜類，利用該酶制劑從FPP生成倍半萜產(chǎn)物，用兩個不同的氣相色譜柱對這些產(chǎn)物進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析表明，主要產(chǎn)物的質(zhì)譜和保留時間與半合成的紫穗槐二烯相同(圖6)。
實施例2紫穗槐二烯合成酶編碼基因的分離和鑒定A．轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)如圖2中部分Ⅲ所示，DHAA通過光氧化作用轉(zhuǎn)換成DHAA-OOH。該反應(yīng)中將活性氧(單線態(tài)O2)的形式加到DHAA上。DHAA有抗氧化劑作用，是各種形式活性氧的清除劑。在保有活性氧的反應(yīng)中，穩(wěn)定的終產(chǎn)物是青蒿素。植物在壓力條件(如光壓力、霜、干旱或機(jī)械損傷)下產(chǎn)生活性氧，對此植物一般產(chǎn)生抗氧化劑來響應(yīng)。青蒿很可能產(chǎn)生DHAA作為抗氧化劑來對這種活性氧釋放進(jìn)行響應(yīng)。將青蒿置于壓力條件下，將能誘導(dǎo)紫穗槐二烯合成酶編碼基因的轉(zhuǎn)錄。為達(dá)此目的，將室內(nèi)氣候條件下(23℃,90％濕度，3000LUX)生長的青蒿置于30℃、約30％濕度(干旱壓力)和6000LUX(光壓力)的壓力條件下1小時。
B．總RNA提取利用Verwoerd等人的方法(核酸研究(Nucleic Acids Research)17(6),2362(1989))，從受壓力誘導(dǎo)植物(據(jù)實施例2A)的嫩葉中提取總RNA，用DNaseⅠ(脫氧核糖核酸酶Ⅰ，無RNase)從RNA提取物中去除DNA，然后在70℃處理15分鐘滅活DNaseⅠ。
C.cDNA合成在含有5ug總RNA,0.2ug oligo(dT)12,dATP、dTTP、dCTP和dGTP各0.5mM,10mM DTT,2U核糖核酸酶抑制劑(Gibco BRL)，第一鏈合成緩沖液(Promega)并用200U無RNase H的Moloney鼠白血病病毒(M-MLV)反轉(zhuǎn)錄酶(Promega)催化的20ul體系中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。37℃反應(yīng)1小時后，將反應(yīng)混合物在-20℃保存，以終止反應(yīng)。
D.PCR探針制備在比較萜類合成酶序列的基礎(chǔ)上，針對2個保守區(qū)設(shè)計兩條簡并引物。有義引物(引物A)序列為5′-GA(C/T)GA(G/A)AA(C/T)GGIAA(G/A)TT(C/T)AA(G/A)GA-3′，反義引物(引物B)序列為5′-CC(G/A)TA IGC(G/A)TC(G/A)AA IGT(G/A)TC(G/A)TC-3′。PCR反應(yīng)總體積為100ul，其中含有每種引物各0.5uM，每種dNTP各0.2mM,1USuper Taq聚合酶/lx PCR緩沖液(HT Biotechnology LTD，劍橋，英國)以及2ul cDNA。在熱循環(huán)儀(PTC 150 MJ-research)中進(jìn)行反應(yīng)，其中95℃變性1分鐘，40℃退火1分鐘，72℃延伸1分15秒，共40個循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳顯示一條約550bp(538bp)的單一特異性PCR產(chǎn)物，只有使用從受壓力誘導(dǎo)植物中提取的RNA制備的cDNA，才能獲得該特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow)平端化、凝膠純化，亞克隆到SmaⅠ酶切的pGEM7Zf(+)(Stratagene)中(圖7)，然后用該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化Ecoli DH5α(GibcoBRL)。對8個獨立轉(zhuǎn)化子的插入片段測序，均具有如圖8所示的相同序列。
E.cDNA文庫構(gòu)建利用類似RiboClonecDNA合成系統(tǒng)(Promega)的方法，合成cDNA第二鏈。將雙鏈DNA與序列如下的EcoRⅠ(NotⅠ)銜接頭(Gibco BRL)連接后，5′-pGTCGACGCGGCCGCG-3′3 ′-CAGCTGCGCCGGCGCTTAA-OH-5′再連接到λExcell EcoRⅠ/CIP(Pharmacia Biotech)。cDNA文庫的包裝和鋪板使用Ready-To-GoLambda包裝試劑盒(PharmaciaBiotech)，未擴(kuò)增文庫的滴度為1.2×106噬斑形成單位。
F．文庫篩選為篩選文庫，200ng PCR擴(kuò)增探針(圖8)經(jīng)凝膠純化，根據(jù)制造商推薦程序進(jìn)行[α-32P]dCTP隨機(jī)標(biāo)記(隨機(jī)引發(fā)的DNA標(biāo)記試劑盒，Boehringer Mannheim Biochemica)，用于篩選鋪于大腸桿菌NM522的cDNA文庫104個噬斑的復(fù)制膜。在68℃,1M NaCl,1％SDS和10％PEG(5000-7000)中雜交16小時，然后在50℃，含0.1％SDS的2xSSC中洗膜兩次，各10分鐘，用Fuji X光片于-70℃爆光16小時。通過第二輪、第三輪雜交分離陽性克隆。將陽性克隆轉(zhuǎn)染大腸桿菌NP66(Pharmacia Biotech)，根據(jù)制造商說明書(PharmaciaBiotech)獲得釋放的質(zhì)粒(圖9)。將這些陽性克隆測序，得到如圖10所示序列。
實施例3在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)紫穗槐二烯合成酶編碼基因?qū)DNA克隆符合讀框地亞克隆到表達(dá)載體pET11d(Stratagene)，以進(jìn)行功能性表達(dá)。為引入合適的亞克隆酶切位點，使用PCR擴(kuò)增該基因，其中有義引物(引物C)為5′-GTCGACAAACCATGGCACTTACAGAA G-3′(在起始密碼ATG處引入NcoⅠ位點)，反義引物(引物D)為5′-GGATGGATCCTCATATACTCATAGGATAAACG-3′(在終止密碼TGA后引入BamHⅠ位點)。PCR反應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行。PCR產(chǎn)物(圖12)和表達(dá)載體pET11d經(jīng)BamHⅠ和NcoⅠ酶切、凝膠純化、連接，得到如圖11所示的構(gòu)建體。
為了獲得表達(dá)，將該基因構(gòu)建體(圖11)、作為陰性對照的無插入基因的pET11d，以及作為陽性對照的帶有煙草5-表-馬兜鈴堿合成酶(TEAS)基因(Back等人，生物化學(xué)和生物物理進(jìn)展(Archives ofBiochemistry and Biophysics)315(2)527-532(1994)；Facchini和Chappell，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89,11088-11092(1992)；Back和Chappell，生物化學(xué)雜志(The Journal ofBiological Chemistry)270,7375-7381(1995))的pET11d轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(Stratagene)，在補(bǔ)加氨芐青霉素的LB瓊脂平板上37℃培養(yǎng)過夜。將這些過夜培養(yǎng)物接種到50ml補(bǔ)加氨芐青霉素(100ug/ml)和0.25mM異丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至A600=0.5，然后在27℃培養(yǎng)3小時。2000g離心8分鐘收集細(xì)胞，重懸于2ml分析緩沖液中。重懸細(xì)胞1ml于冰上超聲4次，每次5秒鐘，間隔30秒，然后用微量離心機(jī)(13,000轉(zhuǎn)/分)4℃離心5分鐘，上清用于環(huán)化酶活性測定和SDS-PAGE凝膠電泳。
在大腸桿菌BL21(DE3)中紫穗槐二烯合成酶基因-pET11d構(gòu)建體(圖11)的表達(dá)，產(chǎn)生一種約50-60kDa的蛋白質(zhì)，如圖13中泳道5-10所示，與從青蒿中分離的測定為56kDa的紫穗槐二烯合成酶(圖16)的大小非常一致。
實施例4通過大腸桿菌中表達(dá)的紫穗槐二烯合成酶將FPP轉(zhuǎn)化為紫穗槐二烯。
除超聲處理細(xì)胞的上清以外，完整的細(xì)胞也被用于FPP分析。同前所述進(jìn)行FPP分析、放射氣相色譜分析(GC-RAGA)和氣相色譜-質(zhì)譜分析(GC-MS)。圖14和14A分別表示用完整的轉(zhuǎn)化細(xì)胞和超聲處理的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的上清進(jìn)行分析的放射氣相色譜的色譜圖。兩個分析中均生成了紫穗槐二烯。這些分析產(chǎn)物經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜鑒定，得到的質(zhì)譜與參照的紫穗槐二烯相同，質(zhì)量評分為99％(最大評分)，質(zhì)譜圖與圖6所示相同。用陽性和陰性對照進(jìn)行的分析中未發(fā)現(xiàn)紫穗槐二烯。
實施例5在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)紫穗槐-4,11-二烯合成酶把DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞有很多方法，適當(dāng)?shù)姆椒òㄍ寥罈U菌感染或者直接轉(zhuǎn)移DNA，例如通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Omirulleh等人，植物分子生物學(xué)(Plant Molecular Biology)21,415-428(1993))或電穿孔，以及通過DNA包裹微球加速(例如微球轟擊)的顯微注射等。
由于已有文獻(xiàn)報道根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)的倍半萜環(huán)化酶基因轉(zhuǎn)化青蒿和煙草(Vergauwe等人，植物細(xì)胞報告(Plant Cell Reports)15,929-933(1996)；Hohn和Ohlrogge，植物物理學(xué)(Plant Physiol)97,460-462(1991))，由土壤桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)移含有紫穗槐二烯合成酶編碼基因的表達(dá)單位(盒)，似乎是合理的途徑。
有幾種二元載體系統(tǒng)，適于將組裝在表達(dá)盒中位于合適的啟動子(例如花椰菜花葉病毒(cauliflower mosaic virus,CaMV)35S啟動子)之后、合適的終止子(例如胭脂堿合成酶轉(zhuǎn)錄終止子(nopaline synthasetranscription terminator,nos-tail))上游的紫穗槐二烯合成酶編碼基因轉(zhuǎn)移到煙草和/或青蒿中。
與實施例3類似，用PCR引入適合亞克隆的酶切位點，其中有義引物(引物G)為5′-GA GGA TCC ATG TCA CTT ACA GAA-3′(在起始密碼子ATG前引入BamHI位點)，反義引物(引物H)為5′-ATGGA TCC TCA TAT ACT CAT AGG A-3′(在終止密碼子TGA后引入BamHⅠ位點)。PCR產(chǎn)物和植物表達(dá)盒pLV399經(jīng)BamHⅠ酶切、凝膠純化和連接，得到帶有花椰菜花葉病毒35S啟動子和胭脂堿合成酶轉(zhuǎn)錄終止子的紫穗槐二烯合成酶編碼基因。植物表達(dá)盒pLV399是一個pUC19載體(Yanisch-Perron C.等人，基因33,103-119(1985))，其多克隆位點(多接頭)由在BamHl位點融合了nos-tail(終止子)的CaMV 35S啟動子替換，在啟動子下游的單一酶切位點有EcoRⅠ,KpnⅠ,XhoⅠ和HindⅢ，在終止子上游的單一酶切位點有EcoRⅠ,XhoⅠ,PstⅠ,SphⅠ,KpnⅠ,HindⅢ。通過PstⅠ和NdeⅠ的限制性酶切分析，檢查紫穗槐-4,11-二烯編碼基因在pLV399中的方向。用KpnⅠ部分酶切該構(gòu)建體后，將旁側(cè)為35S啟動子和nos終止子的紫穗槐-4,11-二烯編碼基因連接進(jìn)KpnⅠ酶切的二元載體pCGN1548。
為了將該重組二元載體轉(zhuǎn)移進(jìn)入根瘤土壤桿菌LBA4404(GibcoBRL,Life Technologies)，利用了三親株雜交程序，其中使用攜帶重組二元載體的大腸桿菌(DH5α)和攜帶質(zhì)粒pRK2013的輔助大腸桿菌以將該重組二元載體轉(zhuǎn)移進(jìn)入根瘤土壤桿菌LBA4404。
利用轉(zhuǎn)化的土壤桿菌菌株轉(zhuǎn)化目標(biāo)植株的外植體。只有攜帶抗性標(biāo)志(卡那霉素抗性，位于二元質(zhì)粒T-DNA邊界序列之間)的轉(zhuǎn)化組織才能在選擇性(含卡那霉素)再生培養(yǎng)基中再生(據(jù)Rogers SG,Horsch RB,Fraley RT，酶學(xué)方法(Methods Enzymol),(1986)118627-640)。
從轉(zhuǎn)化組織中再生的植物表達(dá)紫穗槐二烯合成酶基因，結(jié)論得至氣相色譜-質(zhì)譜分析證實存在紫穗槐二烯。
實施例6通過青蒿由紫穗槐二烯轉(zhuǎn)換為青蒿素(DHAA)采用與Koepp等人(生物化學(xué)雜志270,8686-8690(1995))描述的類似分析方法進(jìn)行分析。將放射性([3H]標(biāo)記)的紫穗槐二烯供給青蒿葉片。為使紫穗槐二烯滲進(jìn)青蒿葉片，可將放射性的紫穗槐二烯制成水溶性，例如與環(huán)糊精復(fù)合。利用轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞(攜帶克隆的青蒿紫穗槐二烯合成酶基因)進(jìn)行FPP分析，得到放射性的紫穗槐二烯。分析中產(chǎn)生的物質(zhì)通過放射性氣相色譜鑒定。預(yù)期的中間體青蒿素酸(AA)、二氫青蒿素酸(DHAA)及終產(chǎn)物青蒿素都用作參照。
按5∶5∶5∶1的摩爾比制備α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精以及3H部分標(biāo)記的紫穗槐-4,11-二烯(20uM)的混合物。將青蒿葉片在該混合物中溫育。溫育120小時后，采用與實施例1中B部分類似的放射氣相色譜方法，檢測青蒿素酸和二氫青蒿素酸。
實施例7在轉(zhuǎn)基因青蒿中表達(dá)紫穗槐-4,11-二烯合成酶及產(chǎn)生青蒿素如實施例5所示制備青蒿素轉(zhuǎn)化植株。
為再生青蒿，誘導(dǎo)愈傷組織、發(fā)芽、生根的培養(yǎng)基由Murashige和Skoog微量和主要元素組成，其中包括改性的維生素(DuchefaBiochemie,Haarlem,The Netherlands),4％(w/v)蔗糖，0.1mg/L吲哚-3-乙酸(IAA),0.1mg/L 6-芐氨基嘌呤(BAP)以及0.8％(w/v)瓊脂(植物瓊脂，Duchefa Biochemie，哈勒姆，荷蘭)。加瓊脂之前用NaOH調(diào)節(jié)pH至5.7，培養(yǎng)基于1磅高壓滅菌20分鐘。在該培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)化的外植體再生為完全的再生植株。
發(fā)現(xiàn)紫穗槐-4,11-二烯合成酶在再生的植株中過量表達(dá)，使產(chǎn)生的青蒿素酸、二氫青蒿素酸以及青蒿素的水平超過未轉(zhuǎn)化植株的天然水平。
實施例8在釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母中表達(dá)紫穗槐-4,11-二烯合成酶基因?qū)⒃揷DNA亞克隆到誘導(dǎo)型表達(dá)載體pYES2(附加體型載體，Invitrogen)以及組成型表達(dá)載體(將基因構(gòu)建體整合到基因組中)pGAPZ A(Invitrogen)中，進(jìn)行功能性表達(dá)。為引入適合亞克隆的酶切位點，用PCR擴(kuò)增該基因，其中使用有義引物(引物E)為5′-CGA GAATTC ATG TCA CTT ACA G-3′(在起始密碼子ATG前引入EcoRⅠ位點)，反義引物(引物F)為5′-GGAT CTC GAG TCA TAT ACT CAT-3′(直接在終止密碼子TGA后引入BamHⅠ位點)。采用與實施例3類似的方法將PCR產(chǎn)物亞克隆進(jìn)pYES2和pGAPZ A。
將獲得的基因構(gòu)建體分別經(jīng)釀酒酵母EasycompTM轉(zhuǎn)化試劑盒(Invitrogen)轉(zhuǎn)化釀酒酵母，經(jīng)畢赤酵母EasycompTM轉(zhuǎn)化試劑盒(Invitrogen)轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母。所有轉(zhuǎn)化都根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行，生長、選擇和誘導(dǎo)也根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行。酵母細(xì)胞的收集和超聲處理采用與實施例3所述類似的方法進(jìn)行。
表達(dá)紫穗槐-4,11-二烯合成酶基因的酵母細(xì)胞，其提取物的FPP分析得到了與實施例4相同的放射氣相色譜圖和氣相色譜-質(zhì)譜圖。
權(quán)利要求
1．分離的DNA序列，該序列編碼具有紫穗槐-4,11-二烯合成酶生物活性的多肽。
2．如權(quán)利要求1所述的DNA序列，該序列與圖12所示序列或其互補(bǔ)鏈有至少70％同源性，并編碼具有紫穗槐二烯合成酶生物活性的多肽。
3．如權(quán)利要求2所述的DNA序列，其與圖12所示序列至少80％，優(yōu)選地至少90％，更優(yōu)選地至少95％同源。
4．如權(quán)利要求1-3所述的DNA序列，其具有圖12所示序列。
5．如權(quán)利要求1-4所述的DNA序列，其特征在于是從產(chǎn)生紫穗槐-4,11-二烯的植物，例如青蒿和V.oblongifolia中分離得到。
6．如權(quán)利要求1-5所述的DNA序列在轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞中的用途。
7．包含如權(quán)利要求1-5所述的DNA序列以及與之可操作連接的合適的轉(zhuǎn)錄起始及終止序列的核酸構(gòu)建體。
8．包含如權(quán)利要求1-5所述的DNA序列或權(quán)利要求7所述核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。
9．如權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，其中該細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，特別是大腸桿菌細(xì)胞。
10．如權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，其中該細(xì)胞是植物細(xì)胞。
11．如權(quán)利要求10所述的宿主細(xì)胞，其中該細(xì)胞源于自身可生成倍半萜類的植物。
12．如權(quán)利要求11所述的宿主細(xì)胞，其中該細(xì)胞是青蒿或V.oblongifolia細(xì)胞。
13．如權(quán)利要求11所述的宿主細(xì)胞，其中該細(xì)胞源于選自田莧蒿屬、菊苣屬、胡蘿卜屬、刺柏屬、春黃菊屬、萵苣屬、廣藿香屬和香根草屬的植物。
14．如權(quán)利要求10所述的宿主細(xì)胞，其中該細(xì)胞源于一種可受激發(fā)誘導(dǎo)而生物合成倍半萜類的植物。
15．如權(quán)利要求14所述的宿主細(xì)胞，其中該細(xì)胞源于選自辣椒屬、棉屬、番茄屬、煙草屬、梯牧草屬、茄屬和榆屬的植物。
16．如權(quán)利要求10所述的宿主細(xì)胞，其中該細(xì)胞源于選自大豆、向日葵和油菜籽的植物。
17．如權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，其中該細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
18．如權(quán)利要求17所述的宿主細(xì)胞，其中該酵母細(xì)胞是釀酒酵母或巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。
19．如權(quán)利要求17所述的宿主細(xì)胞，其中該細(xì)胞是一種含油酵母細(xì)胞。
20．如權(quán)利要求19所述的宿主細(xì)胞，其中該含油酵母細(xì)胞是Yarrowia Lipolytica細(xì)胞。
21．如權(quán)利要求8和10-16所述的宿主細(xì)胞，其中該細(xì)胞是組織或生物體的一部分。
22．轉(zhuǎn)基因組織，其包含至少部分如權(quán)利要求8和10-16所述的宿主細(xì)胞。
23．轉(zhuǎn)基因生物體，其包含至少部分如權(quán)利要求8和10-16所述的宿主細(xì)胞。
24．分離形式的具有紫穗槐二烯合成酶生物活性的多肽，其可通過實施例1所述方法從青蒿或V.oblongifolia中分離得到。
25．具有紫穗槐二烯合成酶生物活性的重組多肽，其可通過在如權(quán)利要求8-20所述的適當(dāng)宿主細(xì)胞中表達(dá)如權(quán)利要求1-5所述的DNA序列得到。
26．制備紫穗槐二烯的方法，包括a)在適當(dāng)?shù)臏囟群瓦m當(dāng)?shù)臅r間里，將如權(quán)利要求24或25所述的多肽在有焦磷酸法呢酯(FPP)存在下在溫育溶液中溫育；并且b)任選地分離所形成的紫穗槐二烯。
27．制備紫穗槐二烯的方法，包含如下步驟a)將如權(quán)利要求1-5所述的DNA序列或如權(quán)利要求7所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞；b)在焦磷酸法呢酯(FPP)存在下表達(dá)該DNA序列，以形成紫穗槐二烯；并且c)任選地分離所形成的紫穗槐二烯，其中在含有內(nèi)源性該DNA序列的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞、組織或生物體中的紫穗槐二烯合成酶的表達(dá)水平，高于非轉(zhuǎn)基因的宿主細(xì)胞、組織或生物體。
28．制備青蒿素的方法，包含a)在適當(dāng)?shù)臏囟群瓦m當(dāng)?shù)臅r間里，將如權(quán)利要求24或25所述的多肽在有焦磷酸法呢酯(FPP)以及能進(jìn)一步將紫穗槐-4,11-二烯轉(zhuǎn)換成青蒿素的酶存在下在溫育溶液中溫育；并且b)任選地分離所形成的青蒿素。
29．制備青蒿素的方法，包含a)將如權(quán)利要求1-5所述的DNA序列或如權(quán)利要求7所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞、組織或生物體，獲得轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞、組織或生物體；b)在焦磷酸法呢酯(FPP)存在下表達(dá)該DNA序列；以及c)任選地分離所形成的紫穗槐-4,11-二烯，其中轉(zhuǎn)基因的宿主細(xì)胞、組織或生物體含有編碼可進(jìn)一步將紫穗槐-4,11-二烯轉(zhuǎn)化成青蒿素的酶的遺傳信息，并且其中紫穗槐-4,11-二烯合成酶在含有內(nèi)源性該DNA序列的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞、組織或生物體中的表達(dá)水平，高于非轉(zhuǎn)基因的宿主細(xì)胞、組織或生物體。
30．青蒿素來源，其中包含攜帶如權(quán)利要求1-5所述DNA序列以及編碼可進(jìn)一步將紫穗槐-4,11-二烯轉(zhuǎn)化成青蒿素的酶的遺傳信息的宿主細(xì)胞、組織或生物體，該宿主細(xì)胞、組織或生物體表達(dá)所述的DNA序列。
31．如權(quán)利要求30所述的來源，其中細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或植物細(xì)胞。
32．如權(quán)利要求30所述的來源，其中細(xì)胞為被裂解的細(xì)胞。
33．轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、組織或生物體，在其基因組中帶有如權(quán)利要求1-5所述的DNA序列，其拷貝數(shù)多于在相應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、組織或生物體中的拷貝數(shù)。
34．如權(quán)利要求33所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，該細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。
35．如權(quán)利要求33所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，該細(xì)胞為釀酒酵母細(xì)胞。
36．如權(quán)利要求33所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，該細(xì)胞為含油酵母細(xì)胞，特別是Yarrowia lipolytica細(xì)胞。
37．如權(quán)利要求33所述的轉(zhuǎn)基因生物體，該生物體為自身產(chǎn)生倍半萜類的植物。
38．如權(quán)利要求37所述的轉(zhuǎn)基因生物體，該生物體為青蒿或V.oblongifolia。
39．如權(quán)利要求37所述的轉(zhuǎn)基因生物體，該生物體為選自田莧蒿屬、菊苣屬、胡蘿卜屬、刺柏屬、春黃菊屬、萵苣屬、廣藿香屬和香根草屬的植物。
40．如權(quán)利要求33所述的轉(zhuǎn)基因生物體，該生物體為一種可受激發(fā)誘導(dǎo)而生物合成倍半萜類的植物。
41．如權(quán)利要求40所述的轉(zhuǎn)基因生物體，該生物體為選自辣椒屬、棉屬、番茄屬、煙草屬、梯牧草屬、茄屬和榆屬的植物。
42．如權(quán)利要求33所述的轉(zhuǎn)基因生物體，該生物體為選自大豆、向日葵和油菜籽的植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一段分離的DNA序列,該序列編碼具有紫穗槐－4,11－二烯合成酶生物活性的多肽。該DNA序列可以轉(zhuǎn)化細(xì)菌、酵母和植物,用來在相應(yīng)生物體內(nèi)制備青蒿素合成過程中的特殊前體紫穗槐－4,11－二烯。本發(fā)明也涉及這些生物體。
文檔編號C12R1/91GK1321194SQ99811714
公開日2001年11月7日 申請日期1999年8月27日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月27日
發(fā)明者T·E·瓦拉特, H·J·鮑密斯特 申請人:吉諾克里普生物技術(shù)有限公司