專利名稱：用于食品發(fā)酵的新型枯草芽孢桿菌菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠發(fā)酵豆子的新型芽孢桿菌菌株，其基本上不產(chǎn)生任何的異-戊酸。本發(fā)明特別涉及新型納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto)的菌株，其中產(chǎn)生異-戊酸的生物合成途徑所涉及的一個或多個基因基本上是非-功能性的。
人類長期以來使用各種微生物，如酵母、真菌或細(xì)菌來生產(chǎn)食料，以便改良、制備或改變食品的性能/味道。這種微生物中的一種是屬于用于不同植物組織(如豆，例如大豆和(非洲)角豆莢，和種子，例如非洲油料豆的種子、棉花籽、瓜子等)發(fā)酵的枯草芽孢桿菌的土壤細(xì)菌。在發(fā)酵過程中，枯草芽孢桿菌降解含在起始原料中的纖維素或/和蛋白質(zhì)，從而產(chǎn)生可被進(jìn)一步加工或即可食用的發(fā)酵產(chǎn)品。
與枯草芽孢桿菌緊密相關(guān)的一種細(xì)菌被稱作納豆芽孢桿菌菌株，一種主要用于大豆發(fā)酵的食品級的、革蘭氏陽性的微生物，其發(fā)酵過程最終產(chǎn)生廉價和富含氨基酸的營養(yǎng)食品。術(shù)語納豆芽孢桿菌來源于商業(yè)生產(chǎn)和早餐上常吃的日本大豆發(fā)酵產(chǎn)品“納豆”(見K.H.Steinkraus等，Handbook of Indigenous Fermented Food,第9卷.(1983),530-547)。
采用用于食品生產(chǎn)的微生物進(jìn)行生物起始原料的發(fā)酵過程中存在的缺點(diǎn)是產(chǎn)生了多種不受消費(fèi)者歡迎的副產(chǎn)物，如味道差的或硬度不合適的產(chǎn)物。
為此，JP-08275772描述了特定枯草芽孢桿菌菌株用于降低終產(chǎn)物“納豆”中氨含量的用途。通過在發(fā)酵早期將蛋白酶活性保持在高水平，以使全部的大豆蛋白基本上被充分降解來達(dá)到此目的，而在發(fā)酵后期蛋白酶活性顯著下降以致于不會產(chǎn)生大量的最終破壞食品味道的氨。
在JP-09009903中描述了另外一種改進(jìn)了半纖維素的降解特性以致于增加了終產(chǎn)物柔軟度的枯草芽孢桿菌菌株。
然而，盡管微生物如枯草芽孢桿菌的發(fā)酵食品的性能在多方面得到了改進(jìn)，但仍需要進(jìn)一步改進(jìn)終產(chǎn)品的味道/氣味。
因此本發(fā)明的目的在于進(jìn)一步改進(jìn)通過采用枯草芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵所得到的食品的性能，尤其是改進(jìn)其味道。
通過提供一種新型的能夠發(fā)酵豆子，優(yōu)選地是發(fā)酵大豆的枯草芽孢桿菌的微生物菌株來解決上述目的，所述菌株不會產(chǎn)生大量的異-戊酸。
附圖中

圖1表示ywfL破裂產(chǎn)物的構(gòu)建流程圖。
圖2表示含有圖1中的ywfL破裂產(chǎn)物的重組載體pMZ66。
圖3表示由野生型納豆芽孢桿菌和ywfL破裂等基因衍生物產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物的色譜圖。
在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)通過采用枯草芽孢桿菌，尤其是采用納豆芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵所得到的產(chǎn)物香味受到繁殖期間由微生物產(chǎn)生的被稱作異-戊酸(2-甲基丁酸和3-甲基丁酸)的特殊化合物的不利影響，該化合物使得發(fā)酵產(chǎn)物粘稠、質(zhì)硬和具有刺激性的氣味。
已知在微生物中支鏈脂肪酸如異-戊酸的主要用途在于合成其中支鏈脂肪酸的組成大約為90％的細(xì)胞膜。細(xì)胞膜的合成是任何細(xì)胞的基本功能。由于用于形成細(xì)胞膜的任何脂肪酸的產(chǎn)量降低或甚至于全部耗盡而可能最終導(dǎo)致微生物在正常條件下不能成活或不能完成它們作為發(fā)酵劑的功能，因此，一種組分的生物合成所受到的影響預(yù)計是一項(xiàng)繁瑣的事情。
盡管不清楚枯草芽孢桿菌產(chǎn)生異-戊酸的確切生物合成途徑，但根據(jù)新近獲得的枯草芽孢桿菌的全部基因組信息設(shè)計了可能的合成途徑(Kunst,F.等的“完整的革蘭氏陽性細(xì)菌枯草芽孢桿菌的基因組序列”，自然390(1997),249-256)。
為此，還假設(shè)了在由細(xì)菌生產(chǎn)異-戊酸和類似支鏈脂肪酸的過程中，源自于基因ywfL的多肽可能起著重要的作用。
為了達(dá)到這一目的，異-戊酸合成的生物合成途徑所涉及的主題-枯草芽孢桿菌菌株的一個或多個基因基本上是以非功能狀態(tài)提供的，因此其各自的基因產(chǎn)物顯示了較低的活性或著本身可能就根本沒有被翻譯成基因產(chǎn)物。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，這可以通過例如修飾異-戊酸合成的生物合成途徑所涉及的主要枯草芽孢桿菌菌株的一個或多個基因來達(dá)到，優(yōu)選地ywfL基因(自然，出處同上)是這樣的方式即其基因產(chǎn)物僅顯示了降低的活性，優(yōu)選地強(qiáng)烈降低的活性或是非-功能性的。這些基因產(chǎn)物可含有在合成途徑中起著酶作用或起著異-戊酸生產(chǎn)調(diào)節(jié)劑作用的多肽。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，ywfL基因可能會從基因組中缺失或被修飾以致于基因不能被轉(zhuǎn)錄成功能蛋白質(zhì)。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，屬于枯草芽孢桿菌的修飾菌株是納豆芽孢桿菌，最優(yōu)選地是納豆芽孢桿菌BN10，其已遵照布達(dá)佩斯條約被保藏在巴斯德學(xué)院(Institute Pasteur)中，保藏號是I-2077。
使用新型枯草芽孢桿菌菌株的目的是用于食料，進(jìn)一步優(yōu)選在枯草芽孢桿菌中不含外源序列，如載體序列或編碼選擇標(biāo)記如抗生素抗性的基因。這同樣適用于存在這樣的序列如染色體外DNA或整合到染色體中的DNA的情況。
新型菌株可以通過已知技術(shù)如采用已知誘變劑誘變普通枯草芽孢桿菌菌株并選擇所需要的特征，即在發(fā)酵過程中異-戊酸合成低或缺陷。使用的誘變劑和技術(shù)是本技術(shù)領(lǐng)域已知的并且非限制性的實(shí)例是例如DMSO(二甲亞砜)、MNNG(N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍)、甲胺或放射性處理等。
而且，目的枯草芽孢桿菌菌株還可通過重組基因技術(shù)獲得，優(yōu)選地沒有任何外源DNA插入其中，這將在下文中詳細(xì)描述。
本發(fā)明的新型枯草芽孢桿菌菌株可被用于植物原料的發(fā)酵來最終由此生產(chǎn)出食料、食用香料，或更優(yōu)選地為納豆。
下文中，新型和穩(wěn)定的、食品級、遺傳修飾的生物體-納豆芽孢桿菌的構(gòu)建被描述為包括一個染色體ywfL基因的等基因缺失。這一缺失被發(fā)現(xiàn)是穩(wěn)定的和不含有不需要的DNA序列，如用于構(gòu)建的載體序列或抗生素抗性標(biāo)記。而且，通過缺失ywfL基因所獲得的微生物顯示了與已知納豆芽孢桿菌菌株相同的功能，表明新型菌株的發(fā)酵特性并沒有因ywfL基因產(chǎn)物的缺失而受損。
除非另外說明，全部技術(shù)、條件和培養(yǎng)基都如Sambrook等在《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第二版》(1992)，冷泉港實(shí)驗(yàn)出版社，紐約中所描述的。
質(zhì)粒、細(xì)菌菌株和培養(yǎng)基在大腸桿菌菌株BZ234中進(jìn)行(重組)大腸桿菌載體pBSSK(+)(Stratagene，產(chǎn)品號212205)的DNA擴(kuò)增(Mollet,B.等“嗜熱鏈球菌中直接的基因組整合、基因置換和整合基因的表達(dá)”，細(xì)菌學(xué)雜志175(14)(1993),4315-4324)而通過抗生素氨芐青霉素Boehringer Mannheim、產(chǎn)品號835242)的手段來選擇重組菌株。重組質(zhì)粒采用X-gal(5-溴-4氯-3-吲哆-β-D-吡喃半乳糖苷，Boehringer Mannheim，產(chǎn)品號1680293)和IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，Boehringer Mannheim，產(chǎn)品號1411446)來鑒定。
質(zhì)粒pG+host9(Maguin,E.等“在乳球菌和其它革蘭氏-陽性細(xì)菌中的有效插入誘變”細(xì)菌學(xué)雜志178(3)(1996),931-935)是一種含有抗生素紅霉素(Fluka，產(chǎn)品號E6376)抗性基因和溫度敏感性質(zhì)粒復(fù)制蛋白質(zhì)的革蘭氏-陽性/革蘭氏陰性穿梭載體。pG+host9在大腸桿菌EC101中進(jìn)行繁殖(Law,J.等“在乳酸乳球菌中發(fā)生突變的系統(tǒng)允許進(jìn)行定向基因的快速分析”，細(xì)菌學(xué)雜志177(24)(1995),7011-7018)，提供了為了適于保留和擴(kuò)增質(zhì)粒而整合在基因組中的非溫度敏感性復(fù)制蛋白。
這項(xiàng)工作中使用的納豆芽孢桿菌菌株(稱作BN1)是從市場上購買的發(fā)酵納豆中分離出來的。
生長培養(yǎng)基是LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)大腸桿菌的溫度是37℃，培養(yǎng)納豆芽孢桿菌的溫度是28℃或37℃，同時進(jìn)行攪拌。培養(yǎng)大腸桿菌時加入紅霉素的量是150μg/ml，培養(yǎng)納豆芽孢桿菌時加入紅霉素的量是2-4μg/ml。
納豆芽孢桿菌染色體DNA的提取進(jìn)行用于PCR的納豆芽孢桿菌染色體DNA的提取，并且對在根據(jù)需要加入或沒有加入抗生素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時的培養(yǎng)物進(jìn)行DNA印跡分析。在6000rpm的條件下離心培養(yǎng)物8分鐘來沉淀細(xì)菌。將沉淀物懸浮在500μl的50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl pH8.0、10mM EDTA加上500μg/ml的溶菌酶(Boehringer Mannheim,1243004)中并在37℃下溫育30分鐘。變?nèi)芫?Fluka,M9901)被加到1μg/ml并繼續(xù)在37℃下溫育30分鐘。蛋白酶K(Fluka,P6556)被加到20μg/ml,EDTA加到2.5mM并且最后通過加入0.1％SDS(Serva,20763)將細(xì)胞進(jìn)行裂解。將該溶液在60℃條件下溫育1小時并且用等體積的苯酚-氯仿再一次對裂解物進(jìn)行提取?；旌衔镌?4000rpm下離心8分鐘來分相。小心除去水相并通過加入2體積的95％的乙醇(Fluka,02860)來沉淀染色體DNA。用滅菌牙簽纏繞DNA沉淀，將收集到的DNA沉淀轉(zhuǎn)移到400μl的10mM Tris-HCl pH8.0、10mM EDTA和50μg/ml RNA酶(Boehringer,109169)中并在60℃條件下溫育1小時。用苯酚-氯仿提取溶液。將DNA進(jìn)行沉淀，纏繞并最終懸浮在200μl的TE緩沖液中(10mM Tris-HCl PH8.0,1mMEDTA)。
ywfL缺失質(zhì)粒pMZ66的構(gòu)建ywfL基因側(cè)翼的DNA片段由納豆芽孢桿菌菌株BNl進(jìn)行擴(kuò)增并最終通過其摻入同源物的引物結(jié)合在一起(Fusion Cycle PCR)以便創(chuàng)建一種適于這種細(xì)菌中的ywfL基因破裂的DNA片段。這在圖1中進(jìn)行了圖示說明。
采用從Microsynth、Balgach、瑞士獲得的寡核苷酸6624(SEQ.ID.NO.1)和6626(SEQ.ID.NO.2)擴(kuò)增5’側(cè)翼區(qū)，其中所述的6624在ywfL基因起始端的上游大約950bp處引入了一個BamHⅠ限制性酶切位點(diǎn)，而所述的6626為一種含有離ywfL基因的起始端50bp區(qū)域的22bp的序列和離ywfL基因的末端100bp區(qū)域的22bp的組合寡核苷酸。該寡核苷酸序列限定了缺失的區(qū)域，即組合引物兩個區(qū)段間刪除的序列。寡核苷酸6626的第二個區(qū)段還被設(shè)計成引進(jìn)了兩個TGA終止密碼子以便終止截斷的ywfL基因的翻譯。
采用寡核苷酸6625(SEQ.ID.NO.3)和6627(SEQ.ID.N0.4)擴(kuò)增3’側(cè)翼區(qū)，其中所述的6625在ywfL基因末端的下游大約1000bp處引進(jìn)了一個EcoRⅠ限制性酶切位點(diǎn)，而所述的6627為第二種基本上是寡核苷酸6626(SEQ.ID.NO.2)之反向-互補(bǔ)序列的組合寡核苷酸。這些互補(bǔ)的寡核苷酸序列提供了5’和3’片段間的同源性，所述5’和3’片段被用于無引物、Pwo指導(dǎo)的延伸反應(yīng)中來完成第二條鏈。最終加入了所述兩種寡核苷酸6626和6625并且特別擴(kuò)增了正確的缺失片段。
PCR反應(yīng)按如下方式進(jìn)行。將500ng的染色體DNA和100μl體積的含有80μl無菌水、6μl 2mM dNTPs、10μl Pwo聚合酶反應(yīng)緩沖溶液、2μl的大約100nM的每種寡核苷酸和0.5μl的Pwo聚合酶(Boehringer Mannheim，產(chǎn)品號1644 947)進(jìn)行混合。采用一種Perkin Elmer DNA熱循環(huán)儀擴(kuò)增所要的片段，擴(kuò)增條件是95℃、1分鐘，40℃、1分鐘，72℃、2分鐘和最終維持在4℃，循環(huán)20次。在100μl體積的含有80μl無菌水、6μl 2mM dNTPs、10μl Pwo聚合酶反應(yīng)緩沖溶液和0.5μl的Pwo聚合酶(不含任何寡核苷酸)中制備來源于每一PCR反應(yīng)的1μl樣品。在上述熱循環(huán)儀中，將這種對照反應(yīng)循環(huán)兩次來延伸同源誘導(dǎo)的寡核苷酸。最后，加入2μl的大約100nM的每一寡核苷酸6624和6625并繼續(xù)進(jìn)行20次循環(huán)的PCR反應(yīng)。
采用一種QIAquikPCR純化試劑盒(Qiagen，產(chǎn)品號28104)來純化最終PCR產(chǎn)物。用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ消化樣品并在1％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。從凝膠上切下相應(yīng)的2kb片段并利用QIAquik凝膠提取試劑盒(Qiagen，產(chǎn)品號28704)洗脫DNA。獲得的DNA片段用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ消化后與相應(yīng)預(yù)處理過的大腸桿菌載體pBS SK+(用EcoRⅠ/BamHⅠ消化并去磷酸化)進(jìn)行連接。連接混合物被電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株BZ234中并且在補(bǔ)充了100μg/ml氨芐青霉素、Xgal和IPTG的LB平板上選擇轉(zhuǎn)化子。通過限制性分析由此分離的質(zhì)粒(Sambrook，出處同上)篩選出潛在陽性的、白色菌落。測定陽性克隆插入片段的DNA序列以便證實(shí)PCR的構(gòu)建。用限制酶EcoRⅠ和SpeⅠ消化這一質(zhì)粒并且在1％的瓊脂糖凝膠上分離片段。從凝膠上切下相應(yīng)的2kb片段并利用QIAquick凝膠提取試劑盒洗脫DNA。
用限制酶EcoRⅠ和SpeⅠ消化復(fù)制-溫度敏感載體pG+Host9并且通過采用蝦堿性磷酸酶(USB，產(chǎn)品號70092)來去除末端磷酸。ywfL缺失片段與如此預(yù)處理的pG+Host9載體混合并由此進(jìn)行連接。連接混合物被電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主EC101中。通過分離質(zhì)粒的限制性分析來篩選菌落。一個陽性質(zhì)粒被命名為pMZ66(圖2)。
為了轉(zhuǎn)化到BN1中，用Jetstar Maxi制備試劑盒(Genomed,220010)分離大量的pMZ66。
納豆芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化根據(jù)以下方案進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)溶液培養(yǎng)基Ⅰ:Spizizen的鹽5x,2ml；葡萄糖50％,0.1ml；酪蛋白氨基酸20％,0.01ml；酵母抽提物5％,0.02ml；硫酸鎂1M 0.05ml；用蒸餾水調(diào)到10ml。
培養(yǎng)基Ⅱ:Spizizen的鹽5x,2ml；葡萄糖50％,0.1ml；酪蛋白氨基酸20％,0.005ml；硫酸鎂1M 0.05ml；用蒸餾水調(diào)到10ml。
Spizizen的鹽5x:(NH4)2SO410g,K2HPO470g,KH2PO430g,檸檬酸三鈉·2H2O 5g，硫酸鎂·7H2O 1g，添加蒸餾水到1升。
納豆芽孢桿菌的天然感受態(tài)將37℃培養(yǎng)過夜的LB平板上的2-3個菌落重新懸浮到2.5ml的培養(yǎng)基Ⅰ中并在10ml無菌玻璃試管中在37℃下通氣(240rpm)培養(yǎng)4至5小時。
納豆芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化在加入了質(zhì)粒DNA(在最多50μl中5至10μg)的培養(yǎng)基Ⅱ(0.45ml中0.05ml)中進(jìn)行10倍稀釋。在30℃下通氣(240rpm)培養(yǎng)過夜。然后將等分試樣或全部體積平鋪在選擇培養(yǎng)基上(具有4μg/ml紅霉素的用于pG+Host9的LB)并在28℃下培養(yǎng)兩天。
以分離的兩個步驟進(jìn)行納豆芽孢桿菌ywfL基因的缺失。在第一個步驟(環(huán)入)中，選擇了通過同源重組(由側(cè)翼DNA同源性定向)的pMZ66的整合。在第二個步驟(環(huán)出)中，利用了便于基因組切除的質(zhì)粒復(fù)制并鑒定了所需要的細(xì)菌克隆。
pMZ66的環(huán)入用質(zhì)粒pMZ66轉(zhuǎn)化的納豆芽孢桿菌菌株BN1被接種到補(bǔ)充了2μg/ml紅霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中并在42℃下培養(yǎng)16小時。將培養(yǎng)物進(jìn)行稀釋并平鋪到補(bǔ)充了2μg/ml紅霉素的LB平板上并在42℃下進(jìn)行培養(yǎng)。在這一溫度下，pG+Host9質(zhì)粒復(fù)制蛋白不再具有活性。因此，那些選擇的細(xì)菌極少在ywfL基因上發(fā)生質(zhì)粒整合。這一整合由與ywfL缺失片段同源的DNA序列來定位并在5’或3’同源區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。采用特別設(shè)計的PCR引物、在小規(guī)模的整合體培養(yǎng)物上測定5’或3’整合的發(fā)生(42℃)。這說明大多數(shù)染色體整合的事件發(fā)生在ywfL基因的5’區(qū)，只有約1096的整合發(fā)生在3’端。通過DNA印跡分析確定這些克隆。
pMZ66的環(huán)出在ywfL基因的5’端整合了pMZ66的陽性克隆以1％的接種量接種到含有2μg/ml紅霉素的LB培養(yǎng)基中并在42℃下培養(yǎng)16小時。然后將這一培養(yǎng)物以1％的量接種到LB培養(yǎng)基的新鮮培養(yǎng)物上并在28℃下培養(yǎng)16小時。稀釋培養(yǎng)物，平鋪到LB平板上，然后在42℃下培養(yǎng)。
過程的論據(jù)如下在28℃下，pG+Host9質(zhì)粒復(fù)制蛋白又有活性了并且復(fù)制的恢復(fù)增強(qiáng)了從基因組中切除質(zhì)粒的能力，而最終的鋪平板和在42℃下的培養(yǎng)再次切除了引起任意復(fù)制質(zhì)粒丟失的pG+Host9質(zhì)粒復(fù)制蛋白(非紅霉素選擇)。
當(dāng)在環(huán)入反應(yīng)中，質(zhì)粒pMZ66被認(rèn)為對通過兩個不同途徑的環(huán)出具有兩個選擇ⅰ)在相同5’側(cè)翼DNA中通過重組，如通過整合，而返回到最初的親本BN1，或ⅱ)在3’側(cè)翼DNA中通過重組，就是通過將缺失片段摻入到基因組中并除去pG+Host9載體的染色體ywfL基因。
在42℃下培養(yǎng)產(chǎn)生的菌落主要顯示了大菌落中有一些較小菌落存在。劃在LB平板和補(bǔ)充了2μg/ml紅霉素的LB平板上的復(fù)制物確定了所有的小菌落和一些檢測的大菌落是紅霉素敏感型。
采用被設(shè)計成通過缺失點(diǎn)擴(kuò)增的引物的PCR擴(kuò)增被用來測定所有的大菌落攜帶野生型-BN1 ywfL基因，而小菌落全部含有所設(shè)計ywfL基因的缺失。
通過測定在ywfL基因缺失點(diǎn)的DNA的序列來確定PCR結(jié)果，其顯示了構(gòu)建體的預(yù)測序列。通過DNA印跡雜交確定ywfL基因周圍區(qū)域的排列并通過與其質(zhì)粒雜交測得沒有pG+Host9載體序列存在。從獨(dú)立實(shí)驗(yàn)鑒定出五種這樣的ywfL缺失菌株并命名為BN10(I-2077)到BN14。
ywfL缺失菌株的HPLC分析將獲得的納豆芽孢桿菌菌株BN1和5ywfL缺失菌株(BN10到BN14)在LB培養(yǎng)基中、37℃下培養(yǎng)16小時。通過0.2微米的過濾器(Schleicher & Schuell.FP030/3)過濾來除去該細(xì)菌并通過HPLC分析脂肪酸的組成。HPLC是通過HPLC Hewlett Packard系列1100儀器進(jìn)行的，該儀器采用了在40℃下進(jìn)行穩(wěn)定的和用10mM H2SO4以1ml/分鐘的流速進(jìn)行洗脫的Aminex快速酸100×7.5mm柱(Bio-Rad，產(chǎn)品號125-0100)。采用也是在40℃下進(jìn)行穩(wěn)定的HP1047A折射計(Hewlett Packard)獲得了檢測結(jié)果。
所述結(jié)果見表1，從中可明顯看出異戊酸是通過納豆芽孢桿菌的發(fā)酵產(chǎn)生的，而ywfL基因的缺失將該發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)生降低到最低值。
表1通過BN1和5ywfL缺失衍生物BN10-BN14產(chǎn)生異戊酸的水平測定
下列實(shí)施例是來說明本發(fā)明的而不是用來限制所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1立方體的制備根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域已知的技術(shù)，將大豆粉碎、煮熟并接種納豆芽孢桿菌菌株BN10(I-2077)的孢子，接著在30-50℃下進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵(曲型發(fā)酵)2-5天。向得到的發(fā)酵混合物中加入鹽水(NaCl飽和溶液)。將產(chǎn)物進(jìn)行干燥，壓成立方體或以粉末的形式使用，例如用作湯產(chǎn)品。最終的產(chǎn)品不具有含異戊酸的普通產(chǎn)品的味道。
因此與通常使用的枯草芽孢桿菌相比，新型枯草芽孢桿菌在大豆發(fā)酵過程中同樣進(jìn)行得很好。
實(shí)施例2重復(fù)與實(shí)施例1相同的過程，其條件是接種的是野生型納豆芽孢桿菌(BN1)。得到的產(chǎn)品具有含異戊酸的產(chǎn)品的典型味道。
序列表(1)總體信息(ⅰ)申請人Societe des Produits Nestlé,S.A.
P.O.Box353CH-1800 Vevey發(fā)明人B.MolletR.D.PridmoreM.-C-Zwahlen(ⅱ)發(fā)明名稱用于食品發(fā)酵的新型枯草芽孢桿菌菌株(ⅲ)序列的數(shù)目4(ⅳ)地址(A)地址Kirschner & Kurig(B)街道Sollnerstr.38(C)城市慕尼黑(D)州Bavaria(E)國家德國(F)區(qū)號81479(ⅴ)計算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機(jī)IBMPC兼容機(jī)(C)系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patentin公布Nr.1，版本Nr.1,25(ⅵ)申請的信息(A)申請?zhí)栆勋@得(B)申請日同此(C)分類(ⅶ)優(yōu)先權(quán)日無(ⅷ)代理人/代理機(jī)構(gòu)信息(A)姓名Straus,Alexander(B)注冊號85880(C)案卷號80,032(ⅸ)電訊(A)電話(089)749858-0(B)電傳(089)749858-11(2)序列1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度30核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列1GCGGCGGATCCGCTGATGATCTCCCACCCC 30(3)序列2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度44核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列2CTCAAATTCCATTTCCTCATCAGGACATGCATAGCGTATCATCC44(3)序列3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度31核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列3GGGGTCGAATTCCACGAGATATCrAACTGCC 31(4)序列4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度44核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列4GGATGATACGCTATGCATGTCCTGATGAGGAAATGGAATTTGAG4權(quán)利要求
1．一種能夠發(fā)酵豆子的枯草芽孢桿菌的細(xì)菌菌株，其不產(chǎn)生大量的異戊酸。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌菌株，其為納豆芽孢桿菌。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的枯草芽孢桿菌菌株，其中一種或多種源自于異-戊酸生物合成過程中所涉及的基因的基因產(chǎn)物具有降低的活性，基本上是非-功能性的或缺失的。
4．根據(jù)權(quán)利要求3所述的枯草芽孢桿菌菌株，其中活性降低的、基本上是非-功能性的或缺失的基因產(chǎn)物源自于ywfl基因。
5．根據(jù)前面任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的枯草芽孢桿菌菌株，其不含外源DNA序列。
6．根據(jù)前面任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的枯草芽孢桿菌菌株，其通過重組基因技術(shù)來制備。
7．根據(jù)權(quán)利要求1至5中的任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的枯草芽孢桿菌，其通過誘變和選擇來制備。
8．根據(jù)權(quán)利要求6所述的枯草芽孢桿菌菌株，其為納豆芽孢桿菌I-2077。
9．前面任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的枯草芽孢桿菌用于發(fā)酵植物原料的用途。
10．根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其用于食品的制備。
11．根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其用于香料化合物的制備。
12．根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其用于納豆的制備。
全文摘要
本發(fā)明涉及能夠發(fā)酵豆子的新型枯草芽孢桿菌菌株,其基本上不產(chǎn)生任何的異－戊酸。本發(fā)明特別涉及新型納豆芽孢桿菌菌株,其中產(chǎn)生異－戊酸的生物合成途徑中所涉及的一個或多個基因基本上是非－功能性的。
文檔編號A23L1/20GK1321192SQ99811687
公開日2001年11月7日 申請日期1999年9月15日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月2日
發(fā)明者B·莫萊特, R·D·普里德莫雷, M·C·茲瓦倫 申請人:雀巢制品公司