納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共生培養(yǎng)制備豌豆乳的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物工程與發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種納豆芽抱桿菌與干酪乳桿菌共 生培養(yǎng)制備魏豆乳的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 納豆由大豆經(jīng)納豆芽抱桿菌炬acillus natto)發(fā)酵而成，具有多重生理功效：
[0003] ①納豆對(duì)也血管系統(tǒng)的作用：納豆中一種標(biāo)志性生理活性物質(zhì)納豆激酶 (化ttokinase，NK)是能夠溶解血栓的蛋白質(zhì)，由275個(gè)氨基酸殘基組成，分子量27邸左右， 無毒、無副作用，是一種絲氨酸蛋白酶，其溶栓效果甚至超過溶栓制劑尿激酶。納豆激酶除 具有直接溶栓作用外，還具有促進(jìn)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生纖維蛋白溶酶原激活劑的能力，從而 間接表現(xiàn)其溶栓活性。納豆中亞油酸占全脂質(zhì)的50%，亞油酸能夠降低血漿中膽固醇含量， 有預(yù)防動(dòng)脈硬化、也臟病和高血壓的功效，具有血栓溶解作用；
[0004] ②納豆對(duì)消化系統(tǒng)的作用；大豆蛋白質(zhì)經(jīng)納豆酶的作用轉(zhuǎn)化成可溶性多膚和氨 基酸，有利于人體吸收。Ig納豆中含有10億個(gè)W上納豆菌，納豆菌繁殖快，能消耗腸道中 的氧，可W抑制引起腸內(nèi)異常發(fā)酵的癡疾桿菌等腐敗菌，促進(jìn)乳酸菌繁殖，調(diào)節(jié)腸內(nèi)細(xì)菌平 衡，預(yù)防癡疾、腸炎和便秘等。大豆經(jīng)過納豆菌發(fā)酵蓄積了大量蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、醋 酶、纖維素酶和脈酶等酶群，該些生物酶在消化系統(tǒng)中能夠有效調(diào)理促進(jìn)消化吸收。納豆芽 抱桿菌在通過分解利用大豆蛋白進(jìn)行繁殖的過程中，可W產(chǎn)生大量酵素、維生素、多聚谷氨 酸和多聚果糖等粘性物質(zhì)，其被覆在胃腸粘膜表面起到保護(hù)作用，飲酒時(shí)可緩解酒醉。納豆 菌還能殺死腸道出血性大腸桿菌；
[0005] ③納豆對(duì)免疫系統(tǒng)的作用；通過接種納豆菌的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，納豆可W提高機(jī)體 抵抗力，排除侵入的葡萄球菌，還可W誘發(fā)機(jī)體干擾素生成，增強(qiáng)機(jī)體免疫力；納豆中含有 活性物質(zhì)如皂草式、維生素B2、維生素E等，每天食用可除去體內(nèi)致癌物質(zhì)，預(yù)防癌癥發(fā)生， 并可軟化血管，促進(jìn)肌膚光滑；
[0006] ④促進(jìn)骨骼發(fā)育；維生素K2可促進(jìn)巧與蛋白質(zhì)結(jié)合從而促進(jìn)骨骼形成，在骨骼形 成過程中起著重要作用，而納豆中維生素K,含量是其他發(fā)酵食品的數(shù)百倍，有預(yù)防骨質(zhì)疏 松、腰痛等老年病的功效。
[0007] 近年發(fā)現(xiàn)納豆還具有其它更豐富廣泛的生理功效，源于其另一種標(biāo)志性生理活性 物質(zhì)-化咯唾晰釀（pyrroloquinoline quinone，PQ曲，它是繼黃素核巧酸和煙醜胺核巧 酸之后在細(xì)菌脫氨酶中發(fā)現(xiàn)的第H種輔基，化學(xué)名稱為4, 5-二氨-4, 5-二氧化-1-氨化咯 (2, 3f)釀-2, 7, 9-H駿酸，又名Methaxatin。雖然自然條件下僅少數(shù)細(xì)菌如Meth}dovo;rus、 Deinococcus radiodurans、Gluconobacter oxydans、Klebsiella pneumoniae 等會(huì)長夠合成 PQQ，但在各種植物、動(dòng)物W及人體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)含有微量PQQ。日本科學(xué)家測定了 26種常見食 物中的PQQ含量，發(fā)現(xiàn)1克食物中PQQ含量在3. 65-61納克不等，例如，蔬菜中的歐芹、青椒， 水果中的奇異果、木瓜，飲品中的綠茶、烏龍茶，W及人們常吃的豆腐。值得注意的是，日本 傳統(tǒng)食物納豆當(dāng)中PQQ含量最高，達(dá)到61納克/克。
[0008] PQQ作為一種普遍存在于動(dòng)物和植物組織中的氧化還原酶輔基，雖然含量非常低， 但作用重要，不僅是一種新發(fā)現(xiàn)的線粒體呼吸鏈組分，參與催化生物體內(nèi)氧化還原反應(yīng)，還 具有非常多樣的生物活性，缺乏時(shí)會(huì)引起哺乳動(dòng)物諸多代謝障礙，被認(rèn)為是一種新型維生 素。PQQ對(duì)哺乳動(dòng)物的主要生理作用有：
[0009] ①全面提高人體免疫功能；PQQ作為人類發(fā)育的必要因子，能刺激人體細(xì)胞生長， 尤其是激活人體B細(xì)胞、T細(xì)胞，提高人體免疫功能；
[0010] ②防治肝損傷；PQQ能顯著降低血清膽紅素和谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平，調(diào)理肝損傷，對(duì)肝 臟疾病有極好療效；
[0011] ③減少自由基對(duì)人體的傷害；PQQ是一種氧化還原酶輔基，參與生物體內(nèi)氧化還 原反應(yīng)，能有效清除體內(nèi)自由基，減少自由基對(duì)人體傷害所引發(fā)的各種疾病，如也臟病、癌 癥W及各類炎癥；
[0012] ④調(diào)理各種神經(jīng)系統(tǒng)疾?。籔QQ在體內(nèi)能促進(jìn)神經(jīng)因子合成，調(diào)理各種神經(jīng)系統(tǒng) 疾病；
[0013] ⑥促進(jìn)氨基酸吸收；PQQ是釀蛋白酶的輔基，參與呼吸鏈電子傳遞，在人體內(nèi)能促 進(jìn)氨基酸吸收；
[0014] ⑧促進(jìn)生長因子合成：生長因子是人類生長的激素，PQQ能刺激人體細(xì)胞生長，增 加細(xì)胞密度，微量PQQ就能提高生物體組織的代謝能力和生長機(jī)能；
[0015] ⑦防治老年癡呆癥；PQQ具有修復(fù)神經(jīng)纖維、活化神經(jīng)元、激活休眠神經(jīng)細(xì)胞的能 力，能有效防治老年癡呆癥和改善記憶力；
[0016] ⑨促進(jìn)谷脫甘膚合成；谷脫甘膚具有重要抗氧化作用和整合解毒作用，PQQ能促 進(jìn)機(jī)體谷脫甘膚合成，防止白內(nèi)障發(fā)生和肝臟膽紅素積累；
[0017] ⑨極強(qiáng)的抗癌功能；PQQ激活自然殺傷細(xì)胞（NK)細(xì)胞為ANK細(xì)胞，使其具有殺腫 瘤作用；使NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞聚集，更有效地殺滅腫瘤細(xì)胞；封閉腫瘤細(xì)胞載鐵蛋白受體， 阻斷其功能，抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移；破壞腫瘤細(xì)胞脂質(zhì)雙層，使腫瘤細(xì)胞溶解死亡；阻止腫 瘤細(xì)胞DNA復(fù)制，促其調(diào)亡。
[0018] 在天然食品中，納豆獨(dú)有NK，并且PQQ含量最豐富。納豆中的NK和PQQ由納豆芽 抱桿菌產(chǎn)生。納豆是日常健康食品，納豆芽抱桿菌是公認(rèn)安全的食品級(jí)微生物（GRAS微生 物），對(duì)納豆芽抱桿菌進(jìn)行定向選育，然后與乳酸菌共發(fā)酵，制備富含NK和PQQ的食品，對(duì)于 人們?cè)谌粘ｏ嬍持醒a(bǔ)充NK和PQQ、充分發(fā)揮NK和PQQ的生理調(diào)理作用具有重要意義。
[0019] 魏豆（Pisum sativum L.)營養(yǎng)豐富，每lOOg魏豆含有；蛋白質(zhì)7. 4克、脂肪0. 3 克、碳水化合物21. 2克、葉酸82. 6微克、膳食纖維3克、維生素A37微克、胡蘿h素220微 克、硫胺素0. 43毫克、核黃素0. 09毫克、煙酸2. 3毫克、維生素C14毫克、維生素E1. 21毫 克、巧21毫克、磯127毫克、鐘332毫克、軸1. 2毫克、楓0. 9微克、鎮(zhèn)43毫克、鐵1. 7毫克、 鋒1. 29毫克、砸1. 74微克、銅0. 22毫克、猛0. 65毫克。魏豆味甘、性平，歸脾、胃經(jīng)，具有 益中氣、止瀉癡、調(diào)營衛(wèi)、利小便、消痛腫、解乳石毒之功效，對(duì)腳氣、痛腫、乳汁不通、脾胃不 適、呢逆嘔吐、也腹脹痛、口渴泄癡等病癥有一定食療作用。魏豆乳是用浸泡后的魏豆高溫 研磨加工而成的飲品，保留了魏豆?fàn)I養(yǎng)成分，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，將進(jìn)一步形成乳酸菌素、活 性脂肪酸、W乳酸為主的有機(jī)酸等諸多食療物質(zhì)。
[0020] 乳酸菌發(fā)酵除能產(chǎn)生諸多食療成分外，還能賦予怡人的甜酸口感。納豆芽抱桿菌 發(fā)酵則能產(chǎn)生NK和PQQ。本發(fā)明通過選育納豆芽抱桿菌和干酪乳桿菌及其共發(fā)酵，開發(fā)出 富含NK和PQQ的食療發(fā)酵魏豆乳。但如果干酪乳桿菌與納豆芽抱桿菌在同一體系中生長 不平衡會(huì)導(dǎo)致一種菌在競爭中排斥另一種，共發(fā)酵無法順利進(jìn)行。關(guān)于生理特性，即使在野 生狀態(tài)下，乳酸菌胞壁蛋白酶PrtS也只有少數(shù)菌株具有且活力不高，分解蛋白質(zhì)獲得必需 氨基酸的能力不足，而納豆芽抱桿菌具有較強(qiáng)蛋白酶活力，其分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基酸和膚 可滿足乳酸菌對(duì)氨基酸的需求。納豆芽抱桿菌兼性厭氧，通過消耗氧氣也促進(jìn)乳酸菌生長 和產(chǎn)酸。在本發(fā)明中，除了納豆芽抱桿菌和干酪乳桿菌兩者之間存在不嚴(yán)格偏利共生關(guān)系 夕F，更通過選育手段使干酪乳桿菌因形成甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷（Mef)而與納豆芽抱桿菌形成 嚴(yán)格偏利共生關(guān)系，從而保證了干酪乳桿菌與納豆芽抱桿菌的共發(fā)酵順利進(jìn)行。
[0021] 納豆芽抱桿菌合成NK和PQQ的代謝途徑迄今尚未完全明了，從而無法通過理性優(yōu) 化手段提高納豆芽抱桿菌合成NK和PQQ的產(chǎn)率。而且由于糖、氨基酸、脂類、核巧酸四大有 機(jī)物代謝之間的相通和密切關(guān)聯(lián)，使得微生物細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)既顯示出剛性巧igidity)又 顯示出柔性（Plasticity),處于嚴(yán)格控制之中，剛性表現(xiàn)為牽一發(fā)而動(dòng)全身，從而在許多情 形下，即使明了代謝途徑，定點(diǎn)理性突變也并不能獲得理想表型，而柔性表現(xiàn)為對(duì)整個(gè)代謝 網(wǎng)絡(luò)中處于不同節(jié)點(diǎn)但又相關(guān)的途徑進(jìn)行協(xié)同突變后，會(huì)表現(xiàn)出新的代謝屬性。欲提高納 豆芽抱桿菌合成NK和PQQ的產(chǎn)率，不明了其代謝途徑并不成為不可逾越的障礙，只要有合 適的非理性優(yōu)化手段（Unrational optimization technique),對(duì)所有可能與NK和PQQ合 成有關(guān)的主流及旁支途徑統(tǒng)籌優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)協(xié)同突變，并通過高通量篩選使多位點(diǎn)協(xié) 同突變的表型從突變庫中凸顯，即可實(shí)現(xiàn)提高納豆芽抱桿菌合成NK和PQQ產(chǎn)率的目標(biāo)。
[0022] 隨機(jī)突變是最常見的非理性優(yōu)化手段，雖然它能夠產(chǎn)生突變位點(diǎn)數(shù)量足夠大的突 變庫，但在突變庫中，各突變位點(diǎn)往往是分散獨(dú)立于單個(gè)細(xì)胞中，相互之間無法優(yōu)化組合， 而且大多不產(chǎn)生可見表型，從而使得絕大多數(shù)突變隱沒于突變庫中而不能得到篩選。
[0023] 基因組重排佑enome化uffling)是在隨機(jī)突變的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型誘變育 種技術(shù)。它是在通過隨機(jī)突變產(chǎn)生突變位點(diǎn)數(shù)量足夠大的突變庫的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過 細(xì)胞融合使各突變位點(diǎn)優(yōu)化組合，從而使突變指數(shù)級(jí)上升特別是增加大量表型可見突變。 基因組重排為利用微生物代謝網(wǎng)絡(luò)該種柔性進(jìn)行多點(diǎn)協(xié)同突變的菌種選育提供了技術(shù)支 撐?；痑ng等（2002)首先W傳統(tǒng)誘變方法獲得一個(gè)突變庫，篩選出若干個(gè)正向突變株作為