專利名稱：氧化苦參堿在制備治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及氧化苦參堿的用途，尤其涉及氧化苦參堿在制藥領(lǐng)域中的用途。
1979年Ibragimov等(Chem Anal 1979；9020431-9)用X-射線衍射法研究了氧化苦參堿的結(jié)構(gòu)，其分子式為C15H24N2O2，其結(jié)構(gòu)式為 該化合物可通過常規(guī)的提取方法從豆科槐植物苦參(Sophora FlavescensAit)或苦豆子(Sophora alopecuroides L.)中提取，為一種白色水溶性固體。文獻(xiàn)“中藥化學(xué)成分提取分離手冊”，中國中醫(yī)藥出版社，1998年8月第1版詳細(xì)報道了所述化合物的提取方法。
氧化苦參堿是一種用途十分廣泛的氧化生物堿，中國專利96109782.5公開了氧化苦參堿在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用，而該化合物在制備治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用尚未見報道。
肝纖維化是一種病理狀態(tài)，臨床醫(yī)生常將此同肝病慢性化等同起來。1984年著名肝病學(xué)家Hans Popper曾提出肝纖維性增生疾病。臨床醫(yī)生如何把這種狀態(tài)與慢性肝病區(qū)別，對診斷、治療及預(yù)后的判斷將有很大的啟發(fā)。肝纖維化是慢性肝損傷的代償性修復(fù)反應(yīng)，肝臟內(nèi)結(jié)締組織呈異常增生。生物化學(xué)測定表明，每克正常肝組織濕重平均有5.5～6.5毫克的膠原，而肝硬化的肝臟高達(dá)20毫克以上。肝纖維化是慢性肝病進一步向肝硬化發(fā)展的主要中間環(huán)節(jié)，故阻止和逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)展，促進肝纖維化的逐步分解吸收，不僅能減輕肝臟損害程度，而且能防止肝硬化的發(fā)生。各種病因所引起的慢性肝病絕大多數(shù)都有肝纖維化，其中25％-40％最終發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。在過去的幾十年里，肝纖維化能否發(fā)生逆轉(zhuǎn)，一直是醫(yī)學(xué)界有爭議的問題，現(xiàn)已知肝纖維化是一個可逆性的病變，而肝硬化是不可逆性病變。
肝纖維化的治療應(yīng)包括祛除原發(fā)病因、抗肝纖維化及對癥治療三方面。最有效的治療是病因治療。然而這在臨床上有時不易做到，且不少病例病因治療后，主動性肝纖維化仍然繼續(xù)發(fā)展。因此抗肝纖維化治療是控制肝纖維化進展的重要途徑。近年來人們對肝纖維化發(fā)病機制有不少的新認(rèn)識和了解，目前認(rèn)為肝纖維化形成和發(fā)展中肝星狀細(xì)胞是主要效應(yīng)細(xì)胞，起中心環(huán)節(jié)作用，參與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)及細(xì)胞因子的調(diào)控，近來某些新干預(yù)研究已初步用于臨床。如Rockey等報道γ-干擾素是肝星狀細(xì)胞激活的強烈抑制劑；維甲酸也可能對肝星狀細(xì)胞激活有抑制作用；α和γ干擾素可抑制肝星狀細(xì)胞增生和基質(zhì)蛋白的合成和/或裝配；基質(zhì)金屬蛋白酶的活性受生理性抑制物如α2-巨球蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1和-2的抑制；多不飽和卵磷脂對狒狒的酒精性肝病發(fā)展為肝纖維化有明顯的保護作用；近來有人觀察到Relaxin可降低膠原合成、刺激膠原酶的表達(dá)而顯示抗肝纖維化作用；糖蛋白decorin可與TGFβ1結(jié)合，可抑制TGFβ1活性，有利于肝纖維化的改善；近年來國內(nèi)有報道中藥復(fù)方等有抗肝纖維化作用。盡管治療的藥物很多，但目前尚未發(fā)現(xiàn)對肝纖維化有特效的藥物。因此尋找確切有效的抗肝纖維化藥物是今后努力發(fā)展的方向。
本發(fā)明的目的在于提供氧化苦參堿的新用途，即在制藥中的新用途，根據(jù)氧化苦參堿可抑制肝星狀細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞增殖和活化的特性，提供氧化苦參堿在制備治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用。
為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，以下將用氧化苦參堿的毒性試驗、藥理試驗和臨床試驗的結(jié)果來說明其在制藥領(lǐng)域中的新用途。
氧化苦參堿是從苦參和苦豆子中提取的白色固體，其分子式為C15H24N2O2，采用文獻(xiàn)“中藥化學(xué)成分提取分離手冊”，中國中醫(yī)藥出版社，1998年8月第1版報道的方法提取氧化苦參堿，純度為98％以上，余量是槐定堿。用無熱源去離子的純凈蒸餾水將氧化苦參堿溶解，消毒配制成100mg/ml/支或200mg/2ml/支的注射劑備用。
具體實驗和臨床結(jié)果分述如下一.動物實驗1.小鼠口服氧化苦參堿急性毒性實驗昆明種小鼠一次灌胃，根據(jù)預(yù)試驗，最高劑量定為443mg/kg，以0.75的比例遞減，即為443、332、249、186.9、140.2 mg/kg 5個劑量組。連續(xù)觀察14天，大劑量組(443、332mg/kg)藥后5～10分鐘活動稍減少，20分鐘左右呈現(xiàn)雙耳發(fā)紅。各給藥組均出現(xiàn)大便濕軟，但成形。死亡發(fā)生在24小時內(nèi)，尸檢可見心臟淤血，其他各臟器未見明顯異常。存活者第15天全部解剖，肉眼檢查主要臟器未見明顯病變。死亡率用Bliss法求得LD50為234.55mg/kg；95％可信限為202.15～272.14mg/kg。2.氧化苦參堿小鼠肌肉注射急性毒性試驗對昆明種小鼠肌肉注射氧化苦參堿的急性毒性進行檢驗，用Bliss法計算，其LD50為452.24mg/kg，95％可信限為366.77～551.35mg/kg。死亡動物尸檢肉眼未見任何病變。
上述結(jié)果說明氧化苦參堿毒性非常低，臨床使用安全。二.體外實驗一).氧化苦參堿對NIH 3T3細(xì)胞增殖的影響(一)方法1.細(xì)胞種板采用市售的NIH 3T3細(xì)胞株(該細(xì)胞的制備方法為現(xiàn)有技術(shù)，有公開的文獻(xiàn)報道，也可購于中科院上海細(xì)胞生物所)，用含10％胎牛血清(上海浦東高橋獸醫(yī)站)的1640培養(yǎng)液(Giboco公司產(chǎn)品)進行培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿單層后，用0.1％胰酶消化，按1傳2進行傳代，培養(yǎng)于50ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。約24小時后，細(xì)胞處于對數(shù)生長期。取2瓶細(xì)胞，用0.1％胰酶進行消化，用培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為0.5×105個/ml。取4塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入100μl細(xì)胞懸液。留下6個孔不加細(xì)胞懸液，為空白對照。將細(xì)胞板放入濕盒內(nèi)保持濕潤并置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育。
2.藥物干預(yù)用含5％胎牛血清的1640培養(yǎng)液將氧化苦參堿注射液稀釋成一系列濃度。氧化苦參堿稀釋為8000、6000、4000、2000、1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6(μg/ml)共11個水平；將孵育24h的96孔板取出，吸盡各孔的培養(yǎng)上清液，每孔加入100μl藥液，每個藥物水平設(shè)6個復(fù)孔。取6個孔各加入100μl含5％胎牛血清的1640培養(yǎng)液，為正常對照孔。6個空白對照孔則不加任何液體。將96孔板放濕盒內(nèi)并置37℃、5％CO2溫箱中孵育。
3.加MTT藥物作用48小時后加入MTT(Fluka公司產(chǎn)品)。加入MTT之前觀察藥物的毒性作用并將細(xì)胞生長狀況在倒置顯微鏡拍照。MTT用PBS配成5mg/ml的濃度，每孔加入20μl MTT溶液?？瞻讓φ湛字胁患覯TT。繼續(xù)在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育4小時。
4.加入二甲基亞楓(DMSO)將作用4小時的96孔板取出，迅速吸盡每孔內(nèi)液體，棄掉。每孔各加入100μl PBS洗一次，將PBS吸盡棄掉。每孔各加入150μl DMSO溶液，包括6個空白對照孔。于搖床上搖勻作用20min后測吸光度。
5.測吸光度將96孔板置酶標(biāo)儀(型號為E-Liza Mat-3000，Beckman公司產(chǎn)品)在單波長570nm和雙波長570nm-630nm下分別測吸光度值(OD)。各孔的吸光度值減去6個空白對照孔吸光度值的平均值即為實際的吸光度值。
6.統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)以mean±SD表示，用SPSS軟件進行方差齊性檢驗及配對t檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
(二)結(jié)果1.氧化苦參堿對NIH 3T3細(xì)胞的毒性作用顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿濃度在8000、6000和4000μg/ml有毒性作用，表現(xiàn)為細(xì)胞壞死和裂解。
2.氧化苦參堿對NIH 3T3細(xì)胞的增殖抑制作用氧化苦參堿濃度在2000、1000、500、250、125和62.25μg/ml有抑制作用，與正常生長的細(xì)胞相比，表現(xiàn)為細(xì)胞的數(shù)量較少，形態(tài)基本正常。
3.氧化苦參堿對NIH 3T3細(xì)胞的增殖影響結(jié)果見表1，氧化苦參堿濃度在8000、6000和4000μg/ml有毒性作用；2000、1000、500、250、125和62.25μg/ml有抑制作用。
注與正常對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01表1氧化苦參堿對NIH 3T3細(xì)胞的增殖影響二)氧化苦參堿對大鼠肝星狀細(xì)胞增殖的影響(一)方法1.實驗試劑及儀器Nycodenz為美國Sigma產(chǎn)品，Pronase E為德國Merck產(chǎn)品，DMEM培養(yǎng)基為GIBCO公司產(chǎn)品，膠原酶粗制品為上海醫(yī)藥工業(yè)研究院產(chǎn)品，MTT為Fluka公司產(chǎn)品，CO2培養(yǎng)箱為Flow Laboratories公司產(chǎn)品，倒置和熒光顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品，離心機和酶標(biāo)儀(E-Liza Mat-3000)為Beckman產(chǎn)品.
2.試驗方法1).肝星狀細(xì)胞(HSC)分離Wistar雄性大鼠，體重400～450g，中國科學(xué)院上海實驗動物中心提供。大鼠經(jīng)1.5％戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，門靜脈插管輸入無Ca2+灌注液，同時剪斷下腔靜脈放血，灌注30min后，小心分離肝臟，待肝組織軟化后，剪碎，酶消化振蕩30min過200目網(wǎng)后，濾液離心450g 7min，棄上清，沉淀物以1∶2的體積與18％(W/V)的Nycodenz混勻，上覆少許DMEM培養(yǎng)液，行密度梯度離心，1450g，17min，離心后取界面處細(xì)胞，用DMEM清洗1次，450g 7min，取沉淀細(xì)胞懸浮于含20％小牛血清的DMEM中臺盼藍(lán)染色判斷存活率并計算產(chǎn)率；2).肝星狀細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞以每平方厘米1×105接種于培養(yǎng)皿(Coring公司產(chǎn)品)，置5％CO2，95％空氣培養(yǎng)箱中37℃，24小時細(xì)胞貼壁后換液，以后隔3-4天更換1次培養(yǎng)液；3).肝星狀細(xì)胞鑒定新分離的的肝星狀細(xì)胞懸液點涂片，置于熒光顯微鏡328nm波長紫外光照射下，細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)綠色自發(fā)熒光.兔抗人Desmin爬片作SP免疫組化染色示胞漿陽染者為肝星狀細(xì)胞；4).MTT比色法原代培養(yǎng)的細(xì)胞長滿單層后用胰酶消化后置20％DMEM培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×108個/l，以每孔100ul加入96孔Nunc培養(yǎng)板內(nèi)。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)培養(yǎng)72小時后，分為8組，一組為空白對照組，其余8組加入不同濃度(分別為0.25，0.5，1，2，4，8，16和32ug/ml)的氧化苦參堿，每組設(shè)6個復(fù)孔。48小時后，每孔加入5mg/ml的MTT液20ul，振蕩后37℃，5％CO2繼續(xù)孵育4小時后，用酶標(biāo)儀(E-Liza Mat-3000)雙波長測定其吸光度OD值，以O(shè)D值間接反映肝星狀細(xì)胞在培養(yǎng)孔中的增殖密度，OD值越低則說明肝星狀細(xì)胞的增殖越弱。測定波長為570nm，參考波長為630nm，酶標(biāo)儀所示OD值為OD570減去OD630，以消除非特異性光吸收效應(yīng)。
3.統(tǒng)計學(xué)方法用Student t檢驗，以P值＜0.05判斷有顯著性差異。(二)結(jié)果1.肝星狀細(xì)胞的得率和純度用本法分離的肝星狀細(xì)胞，其得率每肝為5×106-1×107，以0.4％臺盼蘭染色，細(xì)胞存活率在98％以上。原代培養(yǎng)的肝星狀細(xì)胞Desmin陽性在90％以上，傳代培養(yǎng)后肝星狀細(xì)胞Desmin陽性在98％以上。
2氧化苦參堿對大鼠肝星狀細(xì)胞增殖的影響見表2。組別 氧化苦參堿濃度 培養(yǎng)孔液OD值(ug/ml)X±SI 32 0.0731±0.0337**II16 0.0905±0.0081**III 80.1097±0.0199**IV40.1097±0.0310**V 20.1307±0.0247**VI10.1437±0.0326**VII 0.5 0.1307±0.0214**VIII 0.25 0.1677±0.0465正常對照 00.2033±0.0313注與正常對照組比較**p＜0.01表2不同濃度的氧化苦參堿對大鼠肝星狀細(xì)胞增殖的影響氧化苦參堿濃度≥0.5ug/ml之培養(yǎng)孔液OD值均低于0.25ug/ml孔，與正常對照組相比統(tǒng)計學(xué)有非常顯著意義(P＜0.01)。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿濃度在32ug/ml顯示毒性作用，表現(xiàn)為細(xì)胞裂解和壞死；氧化苦參堿濃度在16、8、4、2、1和0.5ug/ml有抑制作用，表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)基本正常。三)氧化苦參堿對體外培養(yǎng)肝星狀細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)的影響(一).材料與方法1.材料雄性Wistar大鼠，體重400～450g，清潔級，由中科院上海實驗動物中心提供；膠原酶粗制品購于上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，鏈酶蛋白酶E為德國Merck公司產(chǎn)品，Nycodenz為美國Sigma公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清購于上海浦東高橋獸醫(yī)站；兔抗人Desmin單克隆抗體為丹麥DAKO公司產(chǎn)品；III型前膠原氨基末端多肽(PIIINP)放免試劑盒為美國Biotech公司產(chǎn)品、透明質(zhì)酸(HA)和層粘素(LN)放免試劑盒為上海海軍醫(yī)學(xué)研究所產(chǎn)品、IV型膠原7S(IV 7S)ELISA檢測試劑盒為芬蘭Orien公司產(chǎn)品。采用上述的氧化苦參堿注射液，200毫克/2毫升/支。
2.方法1).HSC的分離與培養(yǎng)同前。
2).IV 7S、PIIINP、HA和LN含量的測定原代細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，調(diào)細(xì)胞數(shù)為1×105/ml，按每孔1ml種24孔板。48h后換含1、2、4ug/ml不同藥物濃度的培養(yǎng)液作用24h，棄掉上清，換無血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集上清液，-20℃保存待測。PIIINP、HA和LN的放免法檢測按試劑盒說明進行，各變量值均以ng/ml表示。
3).統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用t檢驗。(二)結(jié)果氧化苦參堿對HSC合成IV 7S、PIIINP、HA和LN能力的影響，結(jié)果見表3。組別N IV7s(ng/ml) PIIINP(ng/ml) HA(ng/ml) LN(ng/ml)正常對照組 6 158.4±24.4 129.3±10.6 280.2±25.9208.4±25.81ug/ml 6 125.5±15.9*109.6±8.6*180.4±16.4*110.1±16.6**2ug/ml 6 103.4±21.0*67.4±9.9**105.7±15.2*63.2±10.4**4ug/ml 6 64.7±14.8**48.4±5.6**40.2±8.5**42.8±14.4**注與正常對照組相比*P＜0.05，**P＜0.01
表3.氧化苦參堿對HSC培養(yǎng)上清中細(xì)胞外基質(zhì)水平的影響氧化苦參堿在1、2、4ug/ml濃度可顯著降低HSC培養(yǎng)上清液中IV 7S、PIIINP、HA、LN的水平(P＜0.05或P＜0.01)。三.體內(nèi)試驗一)氧化苦參堿對肝纖維化大鼠血清肝纖維化指標(biāo)水平的影響(一)材料與方法1.材料(1)動物清潔級雄性Wistar大鼠140只，體重230～250克，購于中科院上海實驗動物中心。
(2)藥物氧化苦參堿，規(guī)格為200mg/2ml；CCl4，分析純。
2.方法動物飼養(yǎng)自由進食與飲水，室溫24℃，相對濕度70％-80％。
動物分組140只大鼠隨機分為2組，正常對照組20只，CCl4肝纖維化模型組120只。CCl4用精制花生油配成40％(V/V)濃度。正常對照組不加任何處理。CCl4模型組每周2次皮下注射CCl4，劑量為0.3ml/100g體重。在CCl4注射12周后，肝纖維化模型成功，按95年全國慢性肝炎病理診斷標(biāo)準(zhǔn)全部處于肝纖維化S3期。停止CCl4攻擊，然后將肝纖維化模型組100只分成治療對照組40只、氧化苦參堿治療低劑量組20只、中劑量組20只、高劑量組20只，治療對照組不加任何處理，氧化苦參堿治療組肌肉注射氧化苦參堿，低、中、高劑量組劑量分別為20、40、80mg/kg體重，每日1次，直至剖殺。于治療第6、8、10周分批處死動物，剩余動物在第12周時剖殺。剖殺前經(jīng)腹主動脈采血，分離血清置-70℃保存待測。
(3)血清纖維化指標(biāo)檢測IV型膠原ELISA檢測試劑盒為美國Biotech公司產(chǎn)品，PIIINP放免檢測試劑盒為芬蘭Orien公司產(chǎn)品，HA和LN放免檢測試劑盒為上海海軍醫(yī)學(xué)研究所產(chǎn)品。
(4)統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用完全隨機設(shè)計多樣本均數(shù)的方差分析，P＜0.05時有統(tǒng)計學(xué)意義。
(二)結(jié)果治療6周后，除氧化苦參堿低劑量組血清IV型膠原水平與治療對照組相比未見顯著性差異(P＞0.05)外，氧化苦參堿治療其余各劑量組的血清纖維化指標(biāo)血清IV型膠原、PIIINP、HA、LN水平較治療對照組顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)。氧化苦參堿治療第12周的血清標(biāo)本檢測發(fā)現(xiàn)，除氧化苦參堿低劑量組血清IV型膠原、HA和LN水平與治療對照組相比未見顯著性差異(P＞0.05)外，氧化苦參堿治療其余各劑量組的血清纖維化指標(biāo)均較治療對照組顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)。本研究通過檢測氧化苦參堿治療各劑量組動物肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)的水平，證實氧化苦參堿對S3期肝纖維化有一定的逆轉(zhuǎn)作用，提示它可用于肝纖維化的治療，見表4和表5。
注與肝纖維化對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對照組比較，ΔP＜0.01表4.氧化苦參堿治療6周后肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)的改變
注與肝纖維化對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對照組比較，ΔP＜0.01表5.氧化苦參堿治療12周后肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)的改變二)氧化苦參堿抗肝纖維化的體內(nèi)實驗研究材料與方法1.材料(1)動物清潔級雄性Wister大鼠150只，體重230～250克，購于中科院上海實驗動物中心。
(2)藥物氧化苦參堿，200mg/2ml/支；CCl4，分析純。
2.方法
(1)動物飼養(yǎng)自由進食與飲水，室溫24℃，相對濕度70％-80％。
(2)動物分組150只大鼠隨機分為5組，正常對照組20只，CCl4模型對照組40只，氧化苦參堿預(yù)防低劑量組30只、中劑量組30只、高劑量組30只。CCl4用精制花生油配成40％(V/V)濃度。正常對照組不加任何處理。CCl4模型對照組每周2次皮下注射CCl4，劑量為0.3ml/100g體重，氧化苦參堿預(yù)防組在皮下注射CCl40.3ml/100g體重同時，肌肉注射氧化苦參堿，低、中、高劑量組劑量分別為20、40、80mg/kg體重，每日1次，直至剖殺。于造模第6、8、10周分批處死5只動物，剩余動物在第12周時剖殺。剖殺前經(jīng)腹主動脈采血，分離血清置-70℃保存待測。
(3)血清纖維化指標(biāo)檢測IV型膠原ELISA檢測試劑盒為Biotech公司產(chǎn)品，PIIINP放免檢測試劑盒為芬蘭Orien公司產(chǎn)品，HA和LN放免檢測試劑盒為上海海軍醫(yī)學(xué)研究所產(chǎn)品。
(4)肝組織學(xué)檢查在肝右上葉的相同位置取肝組織，用10％福爾馬林固定，制片后經(jīng)HE染色觀察肝細(xì)胞變性壞死和纖維化程度，采用95年全國肝纖維化分期標(biāo)準(zhǔn)進行評判。Masson三重膠原纖維染色和Gomori銀網(wǎng)狀纖維染色對膠原纖維和網(wǎng)狀纖維進行半定量。
(5)統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用完全隨機設(shè)計多樣本均數(shù)的方差分析，分級資料采用秩和檢驗，P＜0.05時有統(tǒng)計學(xué)意義。
(二)結(jié)果1.動物一般情況CCl4模型組死亡5只，氧化苦參堿預(yù)防低劑量組死亡2只，中劑量組3只，高劑量組死亡2只，正常對照組無動物死亡。各組死亡率未見顯著差異(P＜0.05)。
2.血清纖維化指標(biāo)比較第12周時，CCl4模型對照組血清纖維化指標(biāo)IV型膠原、PIIINP、HA、LN水平較正常對照組顯著升高(P均＜0.01)，氧化苦參堿預(yù)防各劑量組較CCl4模型對照組低，以中高劑量組最明顯(P＜0.01)。中高劑量組間除HA(P＜0.01)外，均無顯著性差異。見表5。
3.肝組織學(xué)觀察結(jié)果(表6)正常對照組肝臟呈紅褐色，質(zhì)軟，表面光滑，鏡下為正常結(jié)構(gòu)。CCl4對照組肝臟體積縮小，質(zhì)硬，色黃，肝表面呈細(xì)小結(jié)節(jié)狀，鏡下見肝組織正常結(jié)構(gòu)大部破壞，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，匯管區(qū)周圍纖維化明顯，沿肝板延伸形成纖維間隔，部分區(qū)域有橋樣間隔形成。氧化苦參堿預(yù)防低劑量組肝小葉結(jié)構(gòu)尚可見，匯管區(qū)周圍纖維化組織增生較明顯，增生的纖維間隔向小葉內(nèi)延伸形成纖維間隔，偶見橋樣間隔形成，纖維化程度較CCl4造模對照組減輕(P＜0.05)；中劑量組肝小葉結(jié)構(gòu)可見，纖維組織增生較對照組(P＜0.01)和低劑量組(P＜0.05)顯著減輕。高劑量組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰可見，未見明顯纖維間隔形成，纖維組織增生明顯輕于對照組(P＜0.01)和低劑量組(P＜0.01)，但與中劑量組間無顯著性差異(P＞0.05)。Masson和Gomori染色結(jié)果與HE染色結(jié)果基本一致。
組別 S0S1S2S3CCl4模型對照組00 1 9低劑量組(n＝10)00 5 4ΔΔ中劑量組(n＝10)05 5 0ΔΔ**高劑量組(n＝10)27 1 0ΔΔ**注與CCl4模型對照組比較，ΔΔp＜0.01；與預(yù)防低劑量組比較，**P＜0.01。
表6氧化苦參堿治療后肝纖維化組織學(xué)程度的比較三.臨床治療1.選擇216例慢性肝炎患者用氧化苦參堿進行治療，入選標(biāo)準(zhǔn)為1)年齡18--65歲，性別不限；2)對慢性乙型肝炎患者(1)篩選前血清HBsAg陽性并至少6個月；(2)篩選前血清HBeAg陽性并至少6個月；(3)篩選時血清HBV DNA陽性。3)對慢性丙型肝炎患者(1)篩選前血清HCV RNA陽性并至少6個月；(2)篩選前血清抗HCV陽性并至少6個月。4)篩選前6個月及6個月以上曾有兩次或兩次以上異常(ALT至少是正常值的1.5倍)，兩次試驗間隔在8周；篩選時ALT異常(ALT在正常上限1.5倍以上10倍以下)。5)簽署知情同意書。6)同意不服用其它觀察藥、不用全身抗病毒藥、細(xì)胞毒藥、激素、免疫調(diào)節(jié)劑、降酶退黃藥物和中藥(除非醫(yī)療上確實需要)。2.排除標(biāo)準(zhǔn)1)已知血清HIV陽性；2)失代償期肝病，有以下表現(xiàn)(1)血清膽紅素＞正常上限的2.5倍；(2)凝血酶原時間較正常對照延長3秒以上；(3)血清白蛋白在正常范圍之外(＜35g/L)；(4)有腹水、靜脈曲張破裂出血和肝性腦病病史者；3)有自身免疫性肝炎征象者(抗核抗體滴度＞1∶160)；4)骨髓抑制，有下列表現(xiàn)(1)血紅蛋白＜10g/dl；(2)白細(xì)胞＜4×109/L；(3)血小板＜80×109/L；5)血清肌酐＞正常上限1.5倍；6)合并研究者認(rèn)為影響本療法的嚴(yán)重疾病者，如不穩(wěn)定性糖尿病、腎功能不全、不穩(wěn)定性心絞痛、嗜酒(每天飲酒量＞40g)、癲癇、臨床有明顯的神經(jīng)病變、吸毒、精神病、胰腺炎、吸收不良及惡性疾病者；7)首劑前30天接受其它研究藥者；8)篩選前6個月內(nèi)接受全身抗病毒物、免疫調(diào)節(jié)劑、全身細(xì)胞毒藥物或全身激素治療者；9)對氧化苦參堿過敏者；10)妊娠及哺乳期；11)有受孕可能而未采取有效避孕措施者。3.病例數(shù)病例數(shù)共216例。氧化苦參堿膠囊組36例(比較治療組)，氧化苦參堿針劑組36例(比較對照組)，氧化苦參堿膠囊組72例(治療組)，空白對照組72例。4.藥品來源1)采用實施例3所制備的氧化苦參堿膠囊；規(guī)格100mg/囊；2)氧化苦參堿針劑采用實施例1提供的針劑，規(guī)格200mg/2ml/支。5.給藥方法1)氧化苦參堿膠囊組36例(比較治療組)劑量膠囊300mg一日三次口服；針劑400mg/天肌注；療程分二步前24周氧化苦參堿膠囊，以后改為氧化苦參堿針劑直至52周療程結(jié)束；給藥途徑前24周口服氧化苦參堿膠囊，以后改為肌注氧化苦參堿針劑直至52周療程結(jié)束。
2)氧化苦參堿針劑36例(比較對照組)劑量針劑400mg/天肌注 膠囊300mg一日三次口服；療程分二步前24周氧化苦參堿針劑，以后改為氧化苦參堿膠囊直至52周療程結(jié)束；給藥途徑前24周肌注氧化苦參堿針劑，以后改為口服氧化苦參堿膠囊直至52周療程結(jié)束。
3)氧化苦參堿膠囊組72例(治療組)劑量膠囊300mg一日三次口服；療程52周；給藥途徑口服。
4)空白對照組72例劑量維生素C 2粒一日三次口服復(fù)合維生素B 2粒一日三次口服；療程52周；給藥途徑口服。6.試驗方法在篩選評價完成后，合格的病人將按順序隨機分配到氧化苦參堿膠囊組(比較治療組)、氧化苦參堿針劑組(比較對照組)、氧化苦參堿膠囊組(治療組)及空白對照組(維生素C和復(fù)合維生素B)。完成52周后，所有病人于停藥后門診隨訪3個月。7.觀察項目和指標(biāo)1)血液學(xué)指標(biāo)血紅蛋白(Hb)、紅細(xì)胞計數(shù)(RBC)、白細(xì)胞計數(shù)(WBC)及分類、血小板計數(shù)。
2)生化指標(biāo)肌酐、尿素氮、總蛋白、白蛋白、A/G、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、總膽紅素(SB)、直接膽紅素(SB’)堿性磷酸酶(ALP)、凝血酶原時間(PT)、α2-巨球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白。
3)尿液檢查尿常規(guī)。
4)肝纖維化相關(guān)指標(biāo)檢測血清標(biāo)志物檢測透明質(zhì)酸(HA)、層粘素(LN)、III型前膠原肽(PIIIP)、IV型膠原-7S(IV-7S)。
5)病理學(xué)檢查所有入選病例均行肝穿刺活檢。8.結(jié)果(1)通過某醫(yī)院對216例肝病患者進行了臨床試驗，試驗結(jié)束后，實際病例199例，脫落17例，其中比較治療組33例，比較對照組34例，治療組67例，空白對照組65例。(2)一般情況至52周療程結(jié)束后，比較治療組、比較對照組和治療組患者對氧化苦參堿耐受性良好，納差、乏力肝區(qū)不適等癥狀有所好轉(zhuǎn)，但體格檢查肝臟和脾臟回縮不明顯，療程中未見發(fā)熱，皮疹等副反應(yīng)，但多數(shù)病例述說肌肉注射時局部疼痛較明顯，改為深部肌肉注射后有所減輕?？瞻讓φ战M患者52周內(nèi)病情未見明顯變化。氧化苦參堿比較治療組、比較對照組和治療組在治療前后均檢查外周血象、尿常規(guī)、腎功能等，均未見異常反應(yīng)。(3)血清ALT復(fù)常率空白對照組65例患者中血清ALT 52周后僅5例患者完全降至正常，ALT復(fù)常率為7.69％；氧化苦參堿治療組67例患者經(jīng)氧化苦參堿治療后，血清ALT均下降，52周后有37例患者降至正常，ALT復(fù)常率為55.22％，顯著高于空白對照組(P＜0.05)；氧化苦參堿比較治療組33例，52周后有22例患者降至正常，ALT復(fù)常率為66.67％，顯著高于空白對照組(P＜0.05)；氧化苦參堿比較對照組34例，52周后有21例患者降至正常，ALT復(fù)常率為61.76％，亦顯著高于空白對照組(P＜0.05)。ALT復(fù)常率在氧化苦參堿治療組、比較治療組和比較對照組之間未見差異(P＞0.05)，表明氧化苦參堿針劑和膠囊組之間無差異。(4)血清肝纖維化相關(guān)指標(biāo)檢測199例患者經(jīng)治療后其血清肝纖維化相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果見表8和9
注與治療前相比，*P＜0.05，**P＜0.01表8 199例患者經(jīng)治療后其血清透明質(zhì)酸和層粘素的變化
注與治療前相比，*P＜0.05，**P＜0.01表9 199例患者經(jīng)治療后其血清III型前膠原肽和IV型膠原的變化從上表可見，肝纖維化相關(guān)標(biāo)志物經(jīng)氧化苦參堿(針劑和膠囊)治療后均明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)，而在氧化苦參堿針劑和膠囊組之間未見差異。2)氧化苦參堿治療后肝組織學(xué)變化氧化苦參堿治療組、比較治療組和比較對照組經(jīng)氧化苦參堿治療后其組織學(xué)均較空白對照組有明顯的改善。而在氧化苦參堿治療組、比較治療組和比較對比組之間無差異。
由上述公開的毒性試驗、藥理試驗和臨床試驗可見(1)氧化苦參堿可明顯抑制肝星狀細(xì)胞和NIH 3T3細(xì)胞的增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的合成，體內(nèi)動物實驗顯示其有抗肝纖維化的作用；(2)臨床研究顯示，氧化苦參堿有較好的降酶效果，ALT復(fù)常率在55.22％～66.67％，肝纖維化血清相關(guān)標(biāo)志物及肝組織學(xué)均有明顯改善，且氧化苦參堿針劑和膠囊之間無明顯差異；(3)將氧化苦參堿用于制造治療肝纖維化藥物，能治療肝纖維化，改善臨床癥狀，效果明顯。
(4)氧化苦參堿毒性非常低，臨床使用安全、方便。
以下將通過實施例對本發(fā)明進行說明。
實施例1用1000ml無熱源去離子的純凈蒸餾水將100g氧化苦參堿溶解，混合均勻，消毒配制成200mg/2ml/支的注射劑，裝瓶制成品。
實施例2用1000ml無熱源去離子的純凈蒸餾水將100g氧化苦參堿溶解，混合均勻，消毒配制成100mg/1ml/支的注射劑，裝瓶制成品。
實施例3按本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備氧化苦參堿膠囊，以淀粉為填充劑，以8％淀粉漿為粘合劑，制成顆粒，然后裝膠囊，制成的膠囊規(guī)格為100mg/囊。配方如下氧化苦參堿100克淀粉 85克淀粉漿8％ 適量。
權(quán)利要求
1.氧化苦參堿在制備治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了氧化苦參堿在制備治療肝纖維化藥物中的新用途。該物質(zhì)具有較好的抗肝纖維化的作用,可明顯抑制肝星狀細(xì)胞和NIH 3T3細(xì)胞的增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的合成;其能明顯降低肝纖維化大鼠血清肝纖維化標(biāo)志物水平及減輕肝纖維化組織學(xué)變化;其對肝纖維化患者有較好的降酶效果,ALT復(fù)常率在55.22%～66.67%,肝纖維化血清標(biāo)志物及肝組織學(xué)有明顯的改善,且能夠改善肝纖維化患者的臨床癥狀;氧化苦參堿毒性低,臨床使用安全、方便。
文檔編號A61K31/4545GK1350849SQ0012589
公開日2002年5月29日 申請日期2000年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月31日
發(fā)明者王忠效, 吳同新, 陸倫根, 何志鋒 申請人:上海綠谷偉業(yè)生態(tài)工程有限公司