專利名稱：脂質(zhì)體包封的dna口服疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包括陽離子脂質(zhì)體和結(jié)合或包裹于脂質(zhì)體中的核酸的口服疫苗，所述核酸是一種基因疫苗，它可有效地編碼誘發(fā)期望免疫反應(yīng)的抗原。
WO-A-9810748描述一種含有基因疫苗，它含有可有效地編碼誘發(fā)期望免疫反應(yīng)的抗原的核酸，所述核酸是包裹于脂質(zhì)體中的。其中脂質(zhì)體由包括陽離子類脂的組分所制得。該組合物據(jù)稱適于經(jīng)口服給藥，但是在其實(shí)施例卻采用了肌內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)途徑給藥。
該組合物與腸道中的淋巴系統(tǒng)作用，才能使口服給予的疫苗產(chǎn)生免疫應(yīng)答。因此，疫苗在胃腸道中必須穩(wěn)定，并且必須在被膽鹽破壞以前保持足夠的穩(wěn)定性以便與系統(tǒng)中的有關(guān)細(xì)胞作用。很明顯，口服給予疫苗比注射可取。本發(fā)明涉及適于口服給予疫苗的組合物、和經(jīng)口服給予疫苗而對人類或非人類動物進(jìn)行預(yù)防接種的方法。
首先，本發(fā)明提供了一種新型疫苗，其中包括結(jié)合和/或包裹于脂質(zhì)體中可有效地編碼抗原的核酸，所述脂質(zhì)體由包括以下物質(zhì)的組分所制得a)至少一種式I陽離子化合物，R1OCH2CH(OR2)CH2R5X1R6nI其中R1和R2相同或不同，選自式CH3(CH2)a(CH＝CH-CH2)b(CH2)c(CO)d-其中b為0-6，每一a和c選自0-23，(a+C+3b)為12-23，和d為0或1；R5為化學(xué)鍵或C1-8亞烷基(alkanediyl)C1-4烷氧基-C1-4烷基基團(tuán)，或C1-8氧-亞烷基基團(tuán)；X1為N、P或S；X1為N或P時(shí)n為3，X1為S時(shí)n為2；和基團(tuán)R6相同或不同，選自氫、C1-8烷基、C6-12芳香基或芳烷基，或者2或3個(gè)基團(tuán)R6與X1形成飽和或不飽和的5-7元雜環(huán)基團(tuán)；b)至少一種式II兩性離子型磷脂 其中R3和R4相同或不同，選自式CH3(CH2)e(CH＝CH-CH2)f(CH2)g-，其中f為0-6，每一e和g為0-23，和(e+g+3f)為12-23；R7為C1-8亞烷基基團(tuán)；Y為-O-或化學(xué)鍵；X2為N、P或S；X2為N或P時(shí)m為3，X2為S時(shí)m為2；和基團(tuán)R8相同或不同，選自氫、C1-8烷基、C6-11芳香基或芳烷基，或者2或3個(gè)基團(tuán)R8與X2可形成飽和或不飽和的5-7元雜環(huán)基團(tuán)；其條件是R1、R2、R3和R4中的至少一種基團(tuán)的b或f為0。
所述組合物優(yōu)選為口服疫苗，本發(fā)明還涉及經(jīng)口服給予疫苗的方法。該組合物可包括藥用稀釋劑，及可提高疫苗免疫原性能的組分例如常規(guī)佐劑。
在本發(fā)明中，條件是R1、R2、R3和R4中的至少一種基團(tuán)具有飽和長烷基鏈，這可使組合物具有相對高的相變溫度。這樣，可使脂質(zhì)體形成組分的混合物的相變溫度至少為37℃，優(yōu)選為38-50℃。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，基團(tuán)R1和R2可彼此相同，基團(tuán)R3和R4也彼此相同。我們發(fā)現(xiàn)，R1、R2為不飽和基團(tuán)而R3、R4是飽和基團(tuán)時(shí)是可取的，反之亦然。陽離子化合物包括單一的式I化合物。
在一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明脂質(zhì)體形成組分中采用了式II中不同結(jié)構(gòu)的兩種兩性離子型磷脂。
在一個(gè)實(shí)施方案，采用了這樣的化合物，其中第一種兩性離子型磷脂的基團(tuán)R3和R4相同，其中f為1，e+g為14-20、優(yōu)選14-18。優(yōu)選不飽和基團(tuán)位于R3或R4的中間，即e≈9，優(yōu)選e＝g＝7。烯鍵一般為順式。
在另一實(shí)施方案，混合物中的第一種磷脂采用了磷脂混合物，其中基團(tuán)R8相同且優(yōu)選均為氫。在式II的第二種磷脂中，基團(tuán)R8均為C1-4-烷基。在該實(shí)施方案中，兩種磷脂的f一般為0。
通常，在上述采用第一與第二磷脂混合物的兩個(gè)實(shí)施方案中，Y為0和X2為N。此外，R7優(yōu)選為C2-3-亞烷基。
在式I的陽離子化合物中，疏水基R1和R2可通過醚鍵(d＝0)或酯鍵(d＝1)與分子其他部分連接。優(yōu)選式I化合物中的R5為C1-4-亞烷基。優(yōu)選所述陽離子化合物主要為陽離子，即在似于體內(nèi)pH5-9的條件下基本上完全電離。優(yōu)選每個(gè)基團(tuán)R6不是氫而是C1-4-烷基，最優(yōu)選每個(gè)基團(tuán)R6為甲基。
R5優(yōu)選為化學(xué)鍵或亞甲基。
在一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物使用了式I所示的陽離子化合物(1，2-二(油酰氧基)-3-(三甲氨基)丙烷(DOTAP))，其中每個(gè)基團(tuán)R1和R2為油?；?，基團(tuán)R5為化學(xué)鍵，X1為N和每個(gè)基團(tuán)R6為甲基。另一陽離子化合物為其相似化合物，其中以油基取代疏水性油?；?，即用醚鍵而非酯鍵連接。含有飽和疏水基的適宜陽離子化合物為1，2-二(十六烷基氧基)-3-三甲銨丙烷(BisHOP)。
適宜的兩性離子型磷脂包括二油酰氧基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰氧基磷脂酰膽堿(DOPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二硬脂酰氧基磷脂酰膽堿(DSPC)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)及其混合物。兩性離子型磷脂混合物特別優(yōu)選包括二硬脂酰磷脂酰膽堿和二油酰磷脂酰乙醇胺。
兩種兩性離子型磷脂的混合物通常包括重量比為10∶1-1∶10、最優(yōu)選為5∶1-1∶5、更優(yōu)選2∶1-1∶2的兩種化合物。優(yōu)選混合物中飽和基團(tuán)R3和R4的比例至少為50％。
通常， 陽離子化合物與兩性離子型磷脂(總量)的比例為10∶1-1∶20、更優(yōu)選為5∶1-1∶10、更優(yōu)選為1∶1-1∶5。
本發(fā)明另一方面提供了一種口服疫苗，其中包括結(jié)合和/或包裹于脂質(zhì)體中可編碼抗原的核酸，所述脂質(zhì)體形成組分包括至少一種甘油類脂(glycerolipid)、至少一種陽離子化合物和至少一種兩性離子型磷脂，其特征在于所述甘油類脂為O，O’-二烷?；騉，O’-二烷基磷脂。優(yōu)選甘油類脂為上述式II化合物，其中R3和R4的f均為0。
在本發(fā)明所有方面中，聯(lián)用的脂質(zhì)體形成組分的相變溫度優(yōu)選至少為37℃。采用差示掃描量熱法測定相變溫度。
在這方面，本發(fā)明兩性離子型磷脂優(yōu)選包括類脂混合物，例如包括飽和與不飽和類脂的混合物，和/或磷脂酰膽堿與磷脂酰乙醇胺的混合物。
陽離子化合物優(yōu)選為2，3-二(酰氧基或烷氧基)取代的丙胺衍生物，例如具有式I結(jié)構(gòu)的化合物。另外，化合物可由簡單的陽離子兩親化合物例如單-或-硬脂胺或其他長鏈烷基胺，或其分別具有1、2或3個(gè)N-低級烷基(C1-4-烷基)取代基的仲、叔或季銨衍生物制得，例如二甲基雙十八鹵化銨。另一類適于摻入脂質(zhì)體中的兩親陽離子化合物，是與二(脂酰)甘油酯或N，N-二(C12-24)烷基酰基酰胺化合物結(jié)合的精胺共軛物、或者3β-[N-(N’，N’-二甲基氨基乙基)-氨基甲?；鵠膽固醇(DC-chol)。一些適宜的陽離子兩親化合物可參見KabanovA.V.等在BioconjugateChem.(1995)，6(1)，7-20中的描述，其公開內(nèi)容在此引入作為參考。
本發(fā)明另一方面提供了一種口服疫苗，其中包括結(jié)合和/或包裹于脂質(zhì)體中可編碼抗原的核酸，所述脂質(zhì)體形成組分包括至少一種陽離子化合物和至少一種兩性離子型磷脂，其特征在于所述脂質(zhì)體形成組分包括至少25摩爾％、優(yōu)選至少50摩爾％的獨(dú)立相變溫度高于40℃的化合物。
在這方面，本發(fā)明中具有高相變溫度的脂類化合物的含量相對較高，這樣就使脂質(zhì)體形成組分混合物的相變溫度高于37℃?；旌衔锏南嘧儨囟葢?yīng)接近于每種化合物相變溫度的均值。一般很容易測定每種化合物的相變溫度，并且許多化合物的相變溫度是已知的。高相變溫度的兩性離子型磷脂優(yōu)選為DPPC(Tc＝41.4℃)、DSPC(Tc＝55.1℃)、DPPE(Tc＝64℃)和DSPE(Tc＝74.2℃)。
在本發(fā)明脂質(zhì)體形成組分的混合物中，還可含有其他組分例如高達(dá)50％重量的膽固醇。優(yōu)選脂質(zhì)體形成組分中不含膽固醇。
優(yōu)選地，陽離化合物的用量占脂質(zhì)體形成組分總量的5-50％、優(yōu)選為10-25％摩爾。
通常，脂質(zhì)體組合物為水性混懸液例如生理緩沖液的形式，也可以是需進(jìn)一步再水合處理的干燥組合物形式。
可采用任何脂質(zhì)體制備技術(shù)制備本發(fā)明脂質(zhì)體。本發(fā)明脂質(zhì)體可以是多層或單層囊泡，可以是較大(囊泡直徑為300-2000nm，優(yōu)選其平均粒徑為500-1000nm)或者較小(囊泡直徑為100-400nm，優(yōu)選其平均粒徑為200-300nm)。優(yōu)選脂質(zhì)體的平均粒徑不超過1000nm，優(yōu)選基本上所有的直徑小于2000nm。最優(yōu)選平均粒徑為200-750nm。
在本發(fā)明新穎的組合物中，與脂質(zhì)體結(jié)合的核酸可復(fù)合于脂質(zhì)體的外部。但是，優(yōu)選至少部分核酸處于被包裹狀態(tài)。
優(yōu)選采用可形成囊泡的方法制備脂質(zhì)體，然后與待包裹的核酸混合，再脫水，優(yōu)選采用凍干法脫水，最后于水性組合物中再水化而形成干燥-再水化(dehydration-rehydration)囊泡(DRV’s)，所得的DRV’s可任選進(jìn)行微流化處理以降低其平均粒徑。但是，優(yōu)選DRV’s不進(jìn)行微流化處理，或僅進(jìn)行1或2個(gè)微流化循環(huán)。盡管以下步驟不是必須的，但仍優(yōu)選在再水合和/或微流化步驟后，采用離心或分子篩色譜法從脂質(zhì)體中除去未包裹的物質(zhì)。
另一發(fā)明，本發(fā)明提供了用脂質(zhì)體包裹多核苷酸的方法，包括以下步驟i)制備含有裸露多核苷酸和預(yù)制脂質(zhì)體的水性混懸液，其中多核苷酸可有效地編碼免疫原性多肽，該多肽可用于誘發(fā)人或動物受試者產(chǎn)生期望的免疫應(yīng)答，所述脂質(zhì)體采用上述新穎的化合物制得；ii)凍干或噴霧干燥混懸液；和iii)再水化步驟ii)的產(chǎn)品，得到干燥/再水化囊泡。
其他并非必要的步驟包括iv)將步驟iii)的干燥/再水化囊泡水性混懸液進(jìn)行微流化處理以控制其大?。缓?或v)任選將未包裹的多核苷酸從脂質(zhì)體中分離出來。
通常，步驟iv)對于干燥/再水化囊泡是不必要的。
最后步驟也是不必要的，因?yàn)橥獠亢怂峤Y(jié)合于陽離子脂質(zhì)體上，一定程度上可防止環(huán)境的破壞。
有關(guān)干燥-再水化法的步驟，大體上可參見Kirby和Gregoriadis在(1984)Biotechnology，2，979-984中的描述，其公開內(nèi)容在此引入作為參考。因此，步驟i)中的脂質(zhì)體優(yōu)選為小單層(SUV’s)(盡管其中也含有如2μm大小的MLV’s)，步驟iii)中所制得的脂質(zhì)體優(yōu)選為多層脂質(zhì)體(MLV’s)。步驟iii)制得的脂質(zhì)體產(chǎn)品通常稱為“干燥-再水化囊泡”(DRV’s)。
對DRV’s進(jìn)行微流化處理的方法，大體上可見WO-A-92/04009中的描述，其公開內(nèi)容在此引入作為參考，和Gregoriadis等在(1990)，Int.J.Pharm.65，235-242中的描述。如上所述，如果采用微流化處理，優(yōu)選不超過1或2個(gè)流化循環(huán)。
本發(fā)明無需通過對形成脂質(zhì)體成分進(jìn)行聚合處理來提高其相變溫度。聚合反應(yīng)是制備中不必要的附加步驟，而且有可能使活性物質(zhì)的傳遞效率下降。
采用上述DRV技術(shù)，在干燥步驟中可將水性混懸液中高達(dá)90％或甚至更高的多核苷酸包裹和/或結(jié)合于脂質(zhì)體中。包裹和/或結(jié)合于脂質(zhì)體組合物中的多核苷酸濃度優(yōu)選為0.05-100、優(yōu)選1-50、更優(yōu)選為5-50μg/微摩爾類酯。
研究表明，本發(fā)明脂質(zhì)體組合物具有抗膽鹽作用，可使之在胃腸道中保持穩(wěn)定。
核酸活性分子可以是RNA，例如在合成抗原時(shí)可直接轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯的RNA，或者是必須首先逆轉(zhuǎn)錄成供復(fù)制的DNA。核酸優(yōu)選為復(fù)制DNA，并可轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯成特異抗原。所述DNA優(yōu)選為雙鏈質(zhì)粒DNA。
本發(fā)明還包括所述脂質(zhì)體組合物或按本發(fā)明方法制備的組合物在制備用于治療或預(yù)防的組合物中的用途。例如，所述方法可以是對人類受治療者進(jìn)行免疫(接種疫苗)以抗微生物所致的感染。另外，用于免疫治療例如治療癌癥或其他疾病包括感染的基因產(chǎn)品也可用來產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
下面實(shí)施例將對本發(fā)明作進(jìn)一步說明實(shí)施例1方法學(xué)口服免疫實(shí)驗(yàn)1制備脂質(zhì)體采用下述組合物，用干燥-再水化法(DRV)制備脂質(zhì)體1)32微摩爾蛋黃磷脂酰膽堿(PC)，(二脂肪?；字Ｄ憠A的混合物，包括某些飽和基團(tuán))16微摩爾二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，8微摩爾二油酰三甲銨丙烷(DOTAP)。
2)32微摩爾二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)，16微摩爾DOPE，8微摩爾DOTAP。
3)32微摩爾DSPC，16摩爾膽固醇(CHOL)，8微摩爾DOTAP。
采用以下技術(shù)，將600μg可編碼乙型肝炎表面抗原S(小)區(qū)(HBsAg；ayw亞型)的pRc/CMV HBS質(zhì)粒DNA包裹于上述脂質(zhì)體制劑中。
采用干燥-再水化法(Kirby和Gregoriadis，(1984)op.Cit.)，將pRc/CMV HBS質(zhì)粒DNA摻入脂質(zhì)體中。簡言之，是將特定的脂質(zhì)體形成組分與質(zhì)粒DNA混合，于-20℃冷凍并凍干過夜，制得2ml小單層囊泡(SUV)。然后對脂質(zhì)體進(jìn)行控制再水合而形成多層干燥-再水化囊泡(DRV)(Gregoriadis等，(1993)Biochim.Biophys.Acta1147，185-193)。產(chǎn)品無需除掉未包封DNA的步驟，產(chǎn)品中可能含有結(jié)合于脂質(zhì)體外部的DNA。無需進(jìn)行微流化處理。
經(jīng)35S-dATP制得的35S-標(biāo)記DNA測得，每種組合物的包裹率/結(jié)合率為85-95％，DRV’s的平均直徑為550-750nm。
免疫采用以Roy，K.等(1999)NatureMedicine5(4)387-391為基礎(chǔ)的方法。
每組為4只雌性Balb/c小鼠(20-24g)，用連有1ml注射器的動物進(jìn)料針，經(jīng)口服給予“裸露(即未經(jīng)包裹的)”DNA(第4組)或脂質(zhì)體包裹的DNA(1-3組)進(jìn)行免疫。于第0、28和38天，給予每只小鼠500μl含有100μgDNA的磷酸緩沖鹽(PBS)。
免疫組1)PCDOPEDOTAP(100μgDNA)(本發(fā)明)2)DSPCDOPEDOTAP(100μgDNA)(本發(fā)明)3)DSPCCHOLDOTAP(100μgDNA)(本發(fā)明)4)“裸露”DNA(100μgDNA)(參考)5)對照品(不含DNA)從糞便沉淀物中提取IgA于第0、14、21、32、40、48、62、84、96和119天，從鼠籠中收集糞便(foecal)沉淀物。
將沉淀物混懸于PBS中，濃度為100mg/ml，離心后取上清液(含有IgA)用于分析。
ELISA測量對糞便提取物進(jìn)行ELISA分析，測定分泌的IgA。平皿用乙型肝炎表面抗原S(小)區(qū)(HBsAg；ayw亞型)包被，用1％BSA封閉以避免非特異性結(jié)合，然后將加入雙份沉淀物提取物(未稀釋)。加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗-鼠IgA，然后加入鄰苯二胺底物。于450nm處測定吸光度。結(jié)果見

圖1a-i，為每組小鼠兩次測定的均值。
實(shí)施例2方法學(xué)口服免疫實(shí)驗(yàn)2制備脂質(zhì)體采用下述組合物，用干燥-再水化(DRV)法制備脂質(zhì)體1)32微摩爾DSPC，16微摩爾DOPE，8微摩爾DOTAP。
2)32微摩爾DSPC，16微摩爾二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，8微摩爾DOTAP。
3)32微摩爾DSPC，16摩爾二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)，8微摩爾DOTAP。
4)32微摩爾DSPC，16微摩爾DOPE。
按實(shí)施例1方法，將pRc/CMV HBS質(zhì)粒DNA包裹于上述脂質(zhì)體制劑中。DRV組合物1、2和3包裹了85-95％所用的DNA。非陽離子DRV脂質(zhì)體(組合物4)的包裹率為45-55％(所用的DNA總量)。該DRV脂質(zhì)體的粒徑同實(shí)施例1。
免疫每組為4只雌性Balb/c小鼠(20-24g)，用連有1ml注射器的動物進(jìn)料針，經(jīng)口服給予“裸露”DNA(第6組)或脂質(zhì)體包裹的DNA(1-5組)進(jìn)行免疫。于第0和32天，給予每只小鼠500μl含有50μg(第5組)或100μg(1-4和6組)DNA的PBS。
免疫組1)DSPCDOPEDOTAP(100μgDNA)(本發(fā)明)2)DSPCDSPEDOTAP(100μgDNA)(本發(fā)明)3)DSPCDPPEDOTAP(100μgDNA)(本發(fā)明)4)DSPCDOPE(100μgDNA)(參考)5)DSPCDOPEDOTAP(50μgDNA)(本發(fā)明)6)“裸露”DNA(100μgDNA)7)對照品(不含DNA)從糞便沉淀物中提取IgA于第0、42、55、65和92天，從鼠籠中收集糞便沉淀物。將沉淀物混懸于PBS中，濃度為100mg/ml，離心后取上清液(含有IgA)用于分析。
ELISA測量對糞便提取物進(jìn)行ELISA分析，測定第一次口服免疫實(shí)驗(yàn)的分泌型IgA。結(jié)果見圖2a-d，為每組小鼠兩次測量的均值。
口服免疫實(shí)驗(yàn)3該實(shí)驗(yàn)研究了脂質(zhì)體組合物對脂質(zhì)體介導(dǎo)口服免疫的影響。對以下兩種因素進(jìn)行了測量1)磷脂酰膽堿和膽固醇組合處于雙層膜中的影響；2)用膽固醇3β-N-(二甲基氨基乙基)氨基甲?；?DC-Chol)代替陽離子二油酰三甲銨丙烷的影響。
方法學(xué)制備脂質(zhì)體按實(shí)施例1方法，采用下述組合物，用干燥-再水化(DRV)法制備脂質(zhì)體1)32微摩爾磷脂酰膽堿(PC)，16微摩爾二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，8微摩爾二油酰三甲銨丙烷(DOTAP)。
2)32微摩爾二硬脂酰磷脂膽堿(DSPC)，16微摩爾DOPE，8微摩爾DOTAP。
3)32微摩爾PC，16摩爾膽固醇(CHOL)，8微摩爾DOTAP。
4)32微摩爾DSPC，16微摩爾膽固醇(CHOL)，8微摩爾膽固醇3β-N-(二甲基氨基乙基)氨基甲?；?DC-Chol)。
將600μg可編碼乙型肝炎表面抗原S(小)區(qū)(HBsAg；ayw亞型)的pRc/CMV HBS質(zhì)粒DNA包裹于上述脂質(zhì)體制劑中。每組組合物的包裹率為85-95％。該DRV脂質(zhì)體的粒徑同實(shí)施例1。
免疫每組為4只雌性Balb/c小鼠(20-24g)，用連有1ml注射器的動物進(jìn)料針，經(jīng)口服給予“裸露”DNA(第4組)或脂質(zhì)體包裹的DNA(1-4組)進(jìn)行免疫。于第0、28和38天，給予每只小鼠500μl含有100μgDNA的PBS。
免疫組1)PCDOPEDOTAP(100μgDNA)2)DSPCDOPEDOTAP(100μgDNA)
3)PCCHOLDOTAP(1001ugDNA)4)DSPCDOPEDC-Chol(100μgDNA)5)“裸露”DNA(100μgDNA)從糞便沉淀物中提取IgA于第0、30、45、60和70天，從鼠籠中收集糞便沉淀物。將沉淀物混懸于PBS中，濃度為100mg/ml，離心后取上清液(含有IgA)用于分析。
ELISA測量對糞便提取物進(jìn)行ELISA分析，測定分泌型IgA。平皿用乙型肝炎表面抗原S(小)區(qū)(HBsAg；ayw亞型)包被，用1％BSA封閉以避免非特異性結(jié)合，然后加入雙份沉淀物提取物(未稀釋)。加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗-鼠IgA，然后加入鄰苯二胺底物。于450nm處測定吸光度。結(jié)果為每組小鼠兩次測定的均值。
結(jié)果分別于給予首劑量后的第60和70天測定分泌型IgA免疫應(yīng)答，結(jié)果如圖1和2所示。結(jié)果表明，含有DPSCDOPEDOTAP的DRV在上述時(shí)間點(diǎn)均加強(qiáng)了口服免疫小鼠最高應(yīng)答。用DC-CHOL代替陽離子類脂DOTAP而制備的脂質(zhì)體，經(jīng)包裹的DNA的抗-HBsAgIgA免疫應(yīng)答降低。另外，在介導(dǎo)免疫應(yīng)答方面，PCCHOLDOTAP脂質(zhì)體不如DPSCDOPEDOTAP有效。
結(jié)論從實(shí)施例1-3得出的結(jié)論是，上述實(shí)驗(yàn)是可重復(fù)的。另外，較低水平的包裹DNA即可提供足夠用于免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)染率(比較實(shí)施例2的1和5組)。飽和類酯制備的脂質(zhì)體似乎具有更好的性能。
實(shí)施例4口服施用后報(bào)告基因表達(dá)目標(biāo)口服給予小鼠裸露的或脂質(zhì)體包裹的可編碼熒光綠蛋白報(bào)道基因(pCMV.efgp)的質(zhì)粒DNA后，比較它們在鼠腸系膜淋巴結(jié)中的表達(dá)水平。如果報(bào)道基因被表達(dá)，則在收集的淋巴結(jié)中出現(xiàn)可見綠蛋白，這表明DNA達(dá)到腸系膜淋巴結(jié)，并被胞飲和表達(dá)?？乖岢始?xì)胞位于淋巴結(jié)，基因疫苗產(chǎn)生免疫應(yīng)答的靶。
方法學(xué)制備脂質(zhì)體按實(shí)施例1所述的干燥-再水化(DRV)方法，制備含有32微摩爾DSPC、16微摩爾DOPE、8微摩爾DOTAP的脂質(zhì)體，將600μg的pCMV.efgp質(zhì)粒DNA包裹于上述脂質(zhì)體中。
給藥和測定基因表達(dá)用連有1ml注射器的動物進(jìn)料針，將“裸露”DNA或脂質(zhì)體包裹的DNA經(jīng)口服給予2只雌性Balb/c小鼠(20-24g)。給予每只小鼠500μl含有100μgDNA的PBS。于給藥44小時(shí)后，取給藥小鼠和對照(幼)鼠采集腸系膜淋巴結(jié)。用Tissue-Teck(Miles公司，美國)，將收集的新鮮淋巴結(jié)置于恒冷切片機(jī)中，然后用液氮冷凍。用Slee恒冷切片機(jī)切成20μm切片。于Nikon微光顯微鏡下，用入射熒光和Kodakektachrome4000ASA拍攝圖像。
結(jié)果和結(jié)論與給予裸露pCMV.efgp的小鼠(圖3b)和幼鼠淋巴結(jié)切片中的本底水平(圖3c)相比，給予脂質(zhì)體包裹pCMV.efgp的小鼠腸系膜淋巴結(jié)中可觀察到較高水平質(zhì)粒編碼的熒光綠蛋白(圖4a)。由此可以推斷出，經(jīng)口服給予的DNA被清除(clear)到腸系膜淋巴結(jié)，并且用含有飽和類酯的陽離子脂質(zhì)體包裹可提高報(bào)告基因在腸系膜淋巴結(jié)中的表達(dá)率。這與用含有飽和類酯的陽離子脂質(zhì)體包裹可提高免疫應(yīng)答的結(jié)果相一致。
權(quán)利要求
1.一種口服疫苗，包括結(jié)合或包裹于脂質(zhì)體中可有效編碼抗原的核酸，其中脂質(zhì)體由包括以下物質(zhì)的組分所制得a)至少一種式I陽離子化合物，R1OCH2CH(OR2)CH2R5X1R6nI其中R1和R2相同或不同，選自式CH3(CH2)a(CH＝CH-CH2)b(CH2)c(CO)d-其中b為0-6，每一a和c選自0-23，(a+C+3b)為12-23，和d為0或1；R5為化學(xué)鍵或C1-8亞烷基基團(tuán)；X1為N、P或S；X1為N或P時(shí)n為3，X1為S時(shí)n為2；和基團(tuán)R6相同或不同，選自氫、C1-8烷基、C6-12芳香基或芳烷基，或者2或3個(gè)基團(tuán)R6與X1形成的飽和或不飽和5-7元雜環(huán)基團(tuán)；b)至少一種式II兩性離子型磷脂 其中R3和R4相同或不同，選自式CH3(CH2)e(CH＝CH-CH2)f(CH2)g-，其中f為0-6，每一e和g為0-23，和(e+g+3f)為12-23；R7為C1-8亞烷基基團(tuán)；Y為-O-或化學(xué)鍵；X2為N、P或S；X2為N或P時(shí)m為3，X2為S時(shí)m為2；和基團(tuán)R8相同或不同，選自氫、C1-8烷基、C6-11芳香基或芳烷基，或者2或3個(gè)基團(tuán)R8與X2可形成的飽和或不飽和5-7元雜環(huán)基團(tuán)；其條件是R1、R2、R3和R4中至少一種基團(tuán)的b或f為0。
2.如權(quán)利要求1的疫苗，其中R1＝R2和R3＝R4。
3.如權(quán)利要求2的疫苗，其中R1和R2代表與R3和R4不同的基團(tuán)。
4.如權(quán)利要求2和3的疫苗，其中R1和R2的b＝1和(a+C)為10-20。
5.如權(quán)利要求2-4之一的疫苗，其中d＝0。
6.如權(quán)利要求2-5之一的疫苗，其中f＝0。
7.如前述任一權(quán)利要求的疫苗，其中X1為N和R6均為C1-4烷基。
8.如前述任一權(quán)利要求的疫苗，包括式II的兩種兩性離子型磷脂，其中Y為O和X2為N，其中第一磷脂上的基團(tuán)R8均為氫和第二磷脂上的基團(tuán)R8均為C1-4烷基、優(yōu)選為甲基。
9.如權(quán)利要求8的疫苗，其中每一磷脂中的Y為O和R7為(CH2)h，其中h為2或3。
10.如權(quán)利要求8或9的疫苗，其中第一磷脂的基團(tuán)R3和R4相同，并且每個(gè)基團(tuán)中的f＝1和(e+g)為10-20、優(yōu)選12-14。
11.如權(quán)利要求8-10之一的疫苗，其中第二磷脂的基團(tuán)R3和R4相同，并且每個(gè)基團(tuán)中的f＝0和e+g為15-23、優(yōu)選15-17。
12.一種口服疫苗，包括結(jié)合或包裹于脂質(zhì)體中可有效編碼抗原的核酸，其中脂質(zhì)體形成組分包括至少一種甘油類脂，至少一種陽離子化合物和至少一種兩性離子型磷脂，其特征在于所述至少一種甘油類脂為O’O-二烷?；騉，O-二烷基磷脂。
13.如權(quán)利要求12的疫苗，所述甘油類脂為權(quán)利要求1所定義的式II化合物，其中R3和R4的f均為0。
14.一種口服疫苗，包括結(jié)合和/或包裹于脂質(zhì)體中可有效編碼抗原的核酸，其中脂質(zhì)體形成組分包括至少一種陽離子化合物和至少一種兩性離子型磷脂，其特征在于脂質(zhì)體形成組分包括至少25摩爾％、優(yōu)選至少50摩爾％的獨(dú)立相變溫度高于40℃的化合物。
15.如權(quán)利要求12-14之一的疫苗，其中兩性離子型磷脂選自二硬脂酰磷脂膽堿、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂膽堿、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺及它們的混合物。
16.如權(quán)利要求12-15之一的疫苗，其中陽離子化合物為 1所定義的式I化合物。
17.如權(quán)利要求12-15之一的疫苗，其中陽離子化合物DC-膽固醇。
18.用于人類或非人類動物預(yù)防接種的方法，包括經(jīng)口服給予如前述任一權(quán)利要求的疫苗，而產(chǎn)生針對編碼抗原的免疫應(yīng)答。
19.將多核苷酸包封到脂質(zhì)體的方法，包括i)制備含有裸露多核苷酸和預(yù)制脂質(zhì)體的水性混懸液，其中多核苷酸可有效地編碼用于誘導(dǎo)人或動物受治療者產(chǎn)生期望免疫應(yīng)答的免疫原性多肽，所述脂質(zhì)體由如權(quán)利要求1、12或14所定義的脂質(zhì)體形成組分制得，ii)凍干或噴霧干燥混懸液；和iii)水合步驟ii)的產(chǎn)品，得到干燥/再水化囊泡。
20.如權(quán)利要求19的方法，還包括iv)將步驟iii)的干燥/再水化囊泡水性混懸液進(jìn)行微流化處理以控制其大??；和v)任選從脂質(zhì)體中除去未包裹的多核苷酸。
全文摘要
一種口服疫苗,包括脂質(zhì)體和結(jié)合或優(yōu)選包裹于脂質(zhì)體中可有效編碼抗原的DNA,其中脂質(zhì)體由包括陽離子化合物和兩性離子型磷脂的組分所制得。所述脂質(zhì)體形成化合物中的疏水基必須包括至少一種飽和基團(tuán),這提高了化合物的相變溫度,使脂質(zhì)體在口服給藥中更加穩(wěn)定。研究表明,該組合物可提高分泌型免疫球蛋白IgA的水平,這對于實(shí)施有效的口服疫苗給藥是關(guān)鍵的。
文檔編號A61K47/18GK1376056SQ0081347
公開日2002年10月23日 申請日期2000年10月2日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月1日
發(fā)明者G·格雷格里亞迪斯, Y·佩里爾 申請人:利普森技術(shù)有限公司