專利名稱：吡咯并[2,3－d]嘧啶核苷類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域是核苷類似物。
背景技術(shù)：
核苷類似物長期以來一直作為抗代謝物用于癌癥和病毒感染的治療。進入細胞后，核苷類似物經(jīng)常被核苷補救途徑所磷酸化，其中這些類似物通常被磷酸化為對應(yīng)的單-、二-與三-磷酸鹽。在其他細胞內(nèi)目標(biāo)中，三磷酸化的核苷類似物常常用作DNA或RNA聚合酶的底物，所以被摻入DNA或RNA中。三磷酸化的核苷類似物是強烈的聚合酶抑制劑，不過它們可以誘導(dǎo)初生核酸分子的過早終止。若三磷酸化的核苷類似物被摻入核酸復(fù)制物或轉(zhuǎn)錄物中，可以導(dǎo)致基因表達或功能的破壞。
在更高程度的細胞水平上，核苷類似物還能夠干擾細胞周期，尤其可取的核苷類似物作用包括誘導(dǎo)癌細胞的細胞編程性死亡。此外，還已知核苷類似物調(diào)制某些免疫應(yīng)答。
本領(lǐng)域已知各種具有相對有力的抗癌活性的核苷類似物。例如，已知的藥物包括胸苷酸合成酶抑制劑，如5-氟尿苷，腺苷脫氨酶抑制劑，包括2-氯腺苷，和瓶菌素A，它是S-腺苷基高半胱氨酸水解酶的抑制劑。不過，所有或幾乎所有已知的核苷類似物也賦予正常哺乳動物細胞以威脅，主要因為這些核苷類似物缺乏正常細胞與腫瘤細胞之間的適當(dāng)選擇性。不幸的是，適當(dāng)選擇性的缺乏經(jīng)常與嚴重的副作用有關(guān)，因此常常限制這類類似物治療劑的潛力。
盡管本領(lǐng)域有各種已知的核苷類似物，不過所有或幾乎所有它們面臨一種或多種缺點。因此，仍然需要提供關(guān)于核苷類似物的改進方法和組合物。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及核苷類似物，在吡咯并[2，3-d]嘧啶核苷類似物的糖部分上具有修飾，它們能夠顯著減少核苷類似物對哺乳動物細胞的毒性，同時它們還提供顯著的對癌細胞的細胞毒性。這些修飾包括但不限于呋喃核糖部分的C4’與C5’位取代。本發(fā)明還證明，某些吡咯并[2，3-d]嘧啶核苷類似物具有所需的免疫調(diào)制作用，包括1型細胞因子、例如IL-2的強化和2型細胞因子、例如IL-4的抑制。這些免疫調(diào)制性質(zhì)能夠用于抗癌、抗病毒和自體免疫疾病，治療炎癥和預(yù)防移植排斥。
在一方面發(fā)明主題中，核苷類似物是具有根據(jù)式(I)結(jié)構(gòu)的吡咯并[2，3]嘧啶核苷 其中A是O、S或CH 2；X是H、NH2或OH；Y是H、鹵素或NH2；Z選自由H、鹵素、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、CN、C(O)NH2、COOH、COOR、CH2NH2、C(＝NOH)NH2和C(＝NH)NH2組成的組，其中的R是烷基、烯基、炔基或芳烷基；R2和R3獨立地選自由H、F和OH組成的組；R4選自由氫、烷基、烯基、炔基和芳烷基組成的組，其中R4可選地具有至少一個雜原子和官能團；R5是H、OH、OP(O)(OH)2、P(O)(OH)2、OP(O)(OR’)2或P(O)(OR’)2，其中的R’是掩蔽基團；R5’選自由烷基、烯基、炔基和芳烷基組成的組，其中R5’具有至少兩個碳原子，并且可選地具有至少一個雜原子和官能團。
在另一方面發(fā)明主題中，核苷類似物是具有根據(jù)式(II)結(jié)構(gòu)的吡咯并[2，3-d]嘧啶核苷 其中Z是CN、C(O)NH2、C(＝NH)NH2或C(＝NOH)NH2，R4和R5’獨立地選自由氫、烷基、烯基、炔基和芳烷基組成的組，其中R4和R5’獨立地和可選地含有至少一個雜原子和官能團；其條件是R4和R5’不同時為氫。
在另外一方面發(fā)明主題中，所涉及的化合物用于抑制腫瘤生長或調(diào)制1型與2型細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生。
本發(fā)明的各種目的、特征、方面和優(yōu)點將因發(fā)明優(yōu)選實施方式的下列詳細說明以及附圖而變得更加明顯。
圖面的簡要說明

圖1是反應(yīng)的第一種示范性合成圖，這些反應(yīng)包括在根據(jù)發(fā)明主題的化合物的制備中。
圖2是反應(yīng)的第二種示范性合成圖，這些反應(yīng)包括在根據(jù)發(fā)明主題的化合物的制備中。
圖3是反應(yīng)的第三種示范性合成圖，這些反應(yīng)包括在根據(jù)發(fā)明主題的化合物的制備中。
圖4是反應(yīng)的第四種示范性合成圖，這些反應(yīng)包括在根據(jù)發(fā)明主題的化合物的制備中。
圖5是反應(yīng)的第五種示范性合成圖，這些反應(yīng)包括在根據(jù)發(fā)明主題的化合物的制備中。
圖6是反應(yīng)的第六種示范性合成圖，這些反應(yīng)包括在根據(jù)發(fā)明主題的化合物的制備中。
圖7描繪根據(jù)發(fā)明主題的示范性化合物。
圖8A和8B是代表根據(jù)發(fā)明主題的化合物分別對1型與2型細胞因子表達的作用圖。
圖9是說明根據(jù)發(fā)明主題的不同化合物的細胞毒性的表格。
圖10是說明細胞內(nèi)DNA合成率的表格，這些細胞用根據(jù)發(fā)明主題的不同化合物處理過。
圖11描繪用根據(jù)發(fā)明主題的化合物處理后，VEGF從人前列腺癌細胞釋放的抑制作用。
圖12描繪用根據(jù)發(fā)明主題的化合物處理后，IL-8從人前列腺癌細胞釋放的抑制作用。
詳細說明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)根據(jù)通式(I)和(II)的吡咯并[2，3-d]嘧啶核苷類似物對正常和過度增殖的細胞具有不同的生物作用。 其中A是O、S或CH2；X是H、NH2或OH；Y是H、鹵素或NH2；Z選自由H、鹵素、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、CN、C(O)NH2、COOH、COOR、CH2NH2、C(＝NOH)NH2和C(＝NH)NH2組成的組，其中的R是烷基、烯基、炔基或芳烷基；R2和R3獨立地選自由H、F和OH組成的組；R4選自由氫、烷基、烯基、炔基和芳烷基組成的組，其中R4可選地具有至少一個雜原子和官能團；R5是H、OH、OP(O)(OH)2、P(O)(OH)2、OP(O)(OR’)2或P(O)(OR’)2，其中的R’是掩蔽基團；R5’選自由烷基、烯基、炔基和芳烷基組成的組，其中R5’具有至少兩個碳原子，并且可選地具有至少一個雜原子和官能團。
尤其應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會的是，本文所用的術(shù)語“烷基”、“烯基”、“炔基”和“芳烷基”既指直鏈，也指支鏈。關(guān)于取代基R2和R3，應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會的是，R2和R3都可以獨立地指向α-或β-平面。此外，若C5’上的取代基是不相同的，則C5上的取代可以導(dǎo)致R-或S-手性中心。本文所用的術(shù)語“雜原子”指有機分子中的非碳原子，特別涉及包括鹵素、氮、氧和硫在內(nèi)的雜原子。本文所用的術(shù)語“官能團”指反應(yīng)性鍵(例如雙鍵或叁鍵)或反應(yīng)性基團(例如-OH、-SH、-NH2、-N3、-CN、COOH、-CHO、-CONH2等)。
特別涉及的吡咯并[2，3-d]嘧啶核苷類似物是根據(jù)式(I)的那些，其中Z是CN、C(O)NH2或C(＝NH)NH2，其中R5’具有至少兩個碳原子，選自由烷基、烯基、炔基和芳烷基組成的組。
根據(jù)式(II)的吡咯并[2，3-d]嘧啶核苷類似物具有下列結(jié)構(gòu) 其中Z是CN、C(O)NH2、C(＝NH)NH2或C(＝NOH)NH2，R4和R5’獨立地選自由氫、烷基、烯基、炔基和芳烷基組成的組，其中R4和R5’獨立地和可選地含有至少一個雜原子和官能團；其條件是R4和R5’不同時為氫；其中其余取代基是如式(I)所定義的。
不過應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會的是，根據(jù)發(fā)明主題的化合物還可以是前述以外的形式和制劑，尤其涉及包括前體藥物形式或其他修飾形式在內(nèi)的形式，其中所涉及的分子經(jīng)過化學(xué)和/或酶學(xué)修飾，改進藥理學(xué)和/或藥動學(xué)性質(zhì)，包括對靶器官、細胞或亞細胞區(qū)室的特異性更高和生物體內(nèi)的半衰期更長。
例如，可以生成膽固醇加合物，以增加對肝臟的靶特異性，或者可以生成脂蛋白加合物，以增強所修飾的藥物穿透血腦屏障入腦。在另一種實例中，可以合成受體配體復(fù)合物，以定向所修飾的藥物于表達配體特異性受體的特定細胞。或者，可以生成抗體或抗體片段復(fù)合物，以增加所修飾的藥物向亞細胞位置的選擇性釋放。本領(lǐng)域有很多已知的前體藥物和修飾形式，特別涉及的前體藥物形式包括于04/17/00提交的美國臨時申請60/216418所述前體藥物，引用在此作為參考文獻。在更進一步的實例中，可以向所涉及的分子加入帶電或不帶電的基團、親脂性或極性基團，以延長在血清或其他靶器官和/或細胞內(nèi)的半衰期。在進一步的實例中，應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會的是所涉及的C5原子磷酸化化合物還可以是二-或三-磷酸化的，或者結(jié)合有硫代磷酸酯。
盡管一般優(yōu)選的是所涉及的化合物具有D-構(gòu)型的糖部分，不過也涉及化合物可以具有L-構(gòu)型的糖部分。進一步的立體化學(xué)方面尤其包括適當(dāng)時在C5原子上的R與S構(gòu)型，應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會的是所涉及化合物中的取代可以指向α或β相位。
還應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會的是所涉及的化合物可以配制成各種制劑，包括液體、糖漿或凝膠劑型(例如用于注射、攝食或局部給藥)和固體劑型(例如用于攝食、注射或沉積在體腔內(nèi))。例如，當(dāng)所涉及的是根據(jù)發(fā)明主題的化合物在胃環(huán)境中不穩(wěn)定時，特別涉及優(yōu)選為等滲溶液的注射?；蛘撸后w劑型的鼻內(nèi)用藥或吸入可以適合于避免酸的降解。另一方面，若所涉及的化合物已知耐受消化性降解，則所涉及的給藥劑型可以是糖漿劑或片劑。根據(jù)特定的用途，所涉及的化合物還可以配制成局部或透皮用藥的劑型。本領(lǐng)域有很多已知的制劑，所有它們都適合于本文所述發(fā)明主題，特別涉及的制劑描述在“Drug Productsfor Clinical TrialsAn Intl.Guide to Formulation，Production，Quality Control”by Donald C.Monkhouse and Christopher T.Rhodes(Editors)；ISBN082479852X中。
應(yīng)當(dāng)更進一步領(lǐng)會的是所涉及的化合物和制劑可以包括功能性與非功能性添加劑。例如，在需要經(jīng)皮的藥物釋放時，可以加入皮膚滲透增強劑?；蛘?，可以加入藥物，包括抑制細胞生長、抗病毒或免疫調(diào)制劑，以協(xié)同或附加地改進所涉及化合物的功能。非功能性添加劑的實例包括填充劑、抗氧化劑、矯味劑或著色劑，以提高所涉及化合物的特定質(zhì)量。
關(guān)于所涉及化合物的濃度，優(yōu)選的是在作用部位測量的濃度在大約1μM至約100μM范圍內(nèi)。不過，特別是當(dāng)所涉及化合物的親和性低于1μM時，適當(dāng)?shù)臐舛冗€可以在999nM至10nM范圍內(nèi)和以下。另一方面，若所涉及的化合物表現(xiàn)相對短的半衰期，或者具有高的周轉(zhuǎn)率，則所涉及的濃度可以是0.1mM和100mM和以上。所以，所涉及化合物的劑量可以顯著不同，但是適當(dāng)?shù)膭┝磕軌蛟隗w外或動物實驗中容易地確定。
在5’-與4’-修飾的吡咯并嘧啶核苷類似物的各種生物作用中，特別顯著的生物作用包括1型與2型細胞因子產(chǎn)生的調(diào)制、瘤性條件的控制(也就是DNA合成的減少或細胞生長的減少)和趨化因子與生長因子釋放的減少，如下所述。
所以，所涉及的改變細胞因子從細胞分泌的方法可以包含提供根據(jù)式(I)的化合物的步驟，并且具有進一步的步驟，其中向細胞呈遞根據(jù)式(I)的化合物，其濃度有效改變細胞因子的分泌。盡管在一般意義上涉及式(I)中所有可能的取代基組合，不過特別涉及的化合物是根據(jù)式(I)的這樣的化合物，其中R4和R5’獨立地選自由氫、烷基、烯基、炔基和芳烷基組成的組，并且其中R4和R5’獨立地和可選地含有至少一個雜原子和官能團，其余取代基是如上式(I)所定義的。在可供替代選擇的方面，用于改變細胞因子從細胞分泌的化合物還可以是根據(jù)下列結(jié)構(gòu)的化合物 其中Z是CN、C(O)NH2、C(＝NH)NH2、C(＝NNH2)NH2或C(＝NOH)NH2，其中R5是H、OH、OP(O)(OH)2、P(O)(OH)2、OP(O)(OR’)2或P(O)(OR’)2，其中的R’是掩蔽基團。
所涉及的細胞因子特別包括1型(例如IFNγ)與2型(例如IL-4)細胞因子。關(guān)于細胞，所涉及的是所有已知產(chǎn)生和/或分泌細胞因子的細胞都是適合的，不過尤其涉及的細胞包括淋巴細胞和癌細胞(例如前列腺癌細胞，見下)。
在發(fā)明主題的進一步方面中，減少過度增殖性細胞生長的方法可以包含提供根據(jù)式(I)的化合物的步驟，和另一個步驟，其中向過度增殖性細胞呈遞該化合物，其濃度有效減少過度增殖性細胞的生長。特別優(yōu)選的化合物包括根據(jù)式(I)的這樣的化合物，其中R4選自由氫、烷基、烯基、炔基和芳烷基組成的組，其中R4可選地含有至少一個雜原子和官能團，其中R5’選自由氫、烷基、烯基、炔基和芳烷基組成的組，其中R5’具有至少兩個碳原子，并且可選地含有至少一個雜原子和官能團，其條件是R4和R5’不同時為氫，其余取代基是如上式(I)所定義的。
特別涉及的過度增殖性細胞包括癌細胞，尤其涉及的癌細胞是前列腺癌細胞。盡管不希望拘泥于特定的理論，不過所涉及的是生長的減少包含DNA合成的減少。
在發(fā)明主題的更進一步方面，所涉及的是減少生長因子從細胞釋放的方法具有提供根據(jù)式(I)的化合物的步驟，和另一個步驟，其中向細胞呈遞該化合物，其濃度有效減少生長因子的釋放。所涉及的是各種生長因子的釋放都可以被本文所述方法所減少，不過尤其涉及的是VEGF釋放的減少。類似地，盡管關(guān)于本文所述方法所涉及的是所有已知分泌生長因子的細胞，不過特別涉及的細胞包括癌細胞，尤其是前列腺癌細胞。
關(guān)于所涉及化合物的合成，應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會的是根據(jù)發(fā)明主題的吡咯并[2，3-d]嘧啶核苷類似物可以經(jīng)由各種合成途徑合成，提供下列程序僅供例證。
C5’-修飾的吡咯并[2，3-d]嘧啶核苷類似物的合成從吡咯并[2，3-d]堿與適當(dāng)保護的5’-取代的呋喃核糖的縮合作用制備5’-取代的核苷類似物。如圖1所示，將按照已公開的程序制備的化合物1(Jones等，Methods in carbohydrate Chemistry(碳水化合物化學(xué)方法)(Whistler和Moffat編)，vol.VI，pp315-322，Academic Press，New York，(1972))用各種親核試劑處理，例如格利雅試劑，得到化合物2，后者被苯甲?；S后用三氟乙酸處理，得到化合物4。進行苯甲酰基化，然后在硫酸的存在下用乙酸酐/乙酸處理，用于與吡咯并[2，3-d]嘧啶堿縮合。
按照已公開的程序制備的化合物7(Jones等，Methods incarbohydrate Chemistry(碳水化合物化學(xué)方法)(Whistler和Moffat編)，vol.VI，pp 315-322，Academic Press，New York，(1972))轉(zhuǎn)化為甲苯磺酸酯衍生物，將后者用氫化鋰鋁還原，得到化合物8。通過圖1所示類似程序，化合物8轉(zhuǎn)化為化合物9。9與吡咯并[2，3-d]嘧啶19縮合，隨后如流程2所示轉(zhuǎn)化，得到化合物10-15，如圖2所述。
如圖3所示，化合物2轉(zhuǎn)化為磺酸酯16，后者進行親核取代，得到構(gòu)型相反的化合物17。亞異丙基的去保護和隨后的乙酰化得到四乙酸酯18。5-C-取代的保護的呋喃核糖與核苷堿基的縮合描繪在圖4中。按照已公開的程序制備的5-氰基吡咯并[2，3-d]嘧啶19(Tolman等，J.Org.Chem.(有機化學(xué)雜志)1969，91，2102-2108)轉(zhuǎn)化為三甲基甲硅烷基衍生物，然后在三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯的存在下與化合物6縮合，程序類似于關(guān)于豐加霉素所述(Sharma等，Nucleosides Nucleotides(核苷與核苷酸)1993，12，643-648)。所得偶聯(lián)產(chǎn)物通過氫化作用脫溴，得到化合物20。在無水甲醇中將20用氨處理，得到化合物21和23?；衔?1氧化得到化合物22?；衔?3轉(zhuǎn)化為甲酰胺衍生物24?；衔?3和24氧化得到化合物25。將化合物25用羥胺處理，得到化合物26，后者經(jīng)過阮內(nèi)鎳氫化得到27。或者，在加壓容器內(nèi)加熱化合物25與氨，也可制備化合物27。
C4’-修飾的吡咯并[2，3-d]嘧啶核苷類似物的合成圖5中，在含水氫氧化鈉中將化合物1用甲醛處理，得到4’-羥甲基衍生物28，后者被選擇性保護得到化合物29。隨后用DMT保護和除去TBS，得到化合物31，后者可以轉(zhuǎn)化為各種取代基。4-C-取代的衍生物進行類似于5-C-取代的呋喃核糖(流程1)的轉(zhuǎn)化，可以轉(zhuǎn)化為化合物35，后者用于與核苷堿基縮合。
類似于C5’-取代的吡咯并嘧啶核苷類似物，通過化合物35與化合物19的縮合作用可以得到4’-取代的類似物36，如圖6所述。隨后的轉(zhuǎn)化作用可以得到4’-C-取代的吡咯并嘧啶核苷37-42。
2’-修飾的和其他吡咯并[2，3-d]嘧啶核苷類似物的合成合成下列吡咯并嘧啶核苷類似物用于生物試驗，它們有些是已公開的(稱為已知化合物)，如圖7所示。已知化合物43、44、52-55和57是按照已公開的程序制備的(Hinshaw等，J.Org.Chem.(有機化學(xué)雜志)1970，92，236-241)。通過化合物52的氫化作用制備化合物56。將已知化合物49(Krawczyk等，Nucleosides Nucleotides(核苷與核苷酸)1989，8，97-115)用亞硝酸鈉處理，得到化合物50。已知化合物45和48是按照已公開的程序制備的(Ramasamy等，J.Heterocyclic Chem.(雜環(huán)化學(xué)雜志)1988，25，1043-1046)。將化合物45用氨-甲醇處理，得到化合物46，氫化得到化合物47。通過類似于化合物52-57所用的程序從化合物45制備化合物58-63。已知化合物64(Krawczyk等，Nucleosides Nucleotides(核苷與核苷酸)1989，8，97-115)轉(zhuǎn)化為化合物65-67。已知化合物68(Ramasamy等，Tetrahedron(四面體)1986，42，5869-5878)轉(zhuǎn)化為化合物69和70。
人T細胞的制備和體外活化通過密度梯度離心從健康供體分離外周血液單核細胞，然后利用Lymphokwik(One Lambda，Canoga Park CA)富集T細胞。通過塑料粘著除去污染性單核細胞。已純化的T細胞是＞99％CD2+、＜1％HLA-DR+和＜5％CD25+，供養(yǎng)在RPMI-AP5中(RPMI 1640培養(yǎng)基，含有5％自體血漿、1％L-谷氨酰胺、1％青霉素/鏈霉素和0.05％2-巰基乙醇)。關(guān)于細胞因子蛋白水平的測定，加入2ng佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸鹽加0.1mg伊屋諾霉素(PMA-ION，均來自Calbiochem，San Diego，CA)激活T細胞(0.2ml體積內(nèi)0.2×106個細胞)，在0或10μM各種鳥苷核苷的存在下在37℃96孔平板中培養(yǎng)48小時?；罨?，分析上清液的由細胞產(chǎn)生的細胞因子。
細胞外細胞因子分析適當(dāng)稀釋后，利用IFNγ與IL-4特異性ELISA試劑盒(Biosource，Camarillo，CA)測定細胞上清液中的人細胞因子水平。全部ELISA結(jié)果以pg/ml表示。
吡咯并[2，3-d]嘧啶核苷類似物對活化人T細胞中的細胞外細胞因子水平的作用圖8A和8B顯示關(guān)于5名人供體的0與10μM吡咯并[2，3-d]嘧啶核苷類似物對PMA/伊屋諾霉素刺激的1型細胞因子IFNγ和2型細胞因子IL-4的T細胞表達的作用。通過ELISA法測定不含細胞的上清液中的細胞因子水平。利用7-b-D-呋喃核糖基-4-氧代吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-甲脒觀察到最有力的作用。這種化合物提高活化IL-4的產(chǎn)生達498％±83，抑制IFNγ達43％±4，相對每種細胞因子的活化對照水平而言。數(shù)據(jù)以活化對照值的百分比表示，即，在供試核苷的存在下的活化T細胞的細胞因子水平相對未處理的活化T細胞的細胞因子水平之比×100％。若供試核苷對細胞因子水平的作用為零，則相對活化對照值的百分比為100％。PMA-ION-誘導(dǎo)的細胞因子分泌的絕對水平(pg/ml±標(biāo)準(zhǔn)偏差)，關(guān)于IFNγ是22954±3391，關(guān)于IL-4是162±40。關(guān)于全部所試驗的細胞因子，靜息水平為＜30pg/ml。
吡咯并[2，3-d]嘧啶核苷類似物的體外細胞毒性本發(fā)明的吡咯并[2，3-d]嘧啶核苷類似物是生物活性的，因為它們顯示一定水平的體外細胞毒性。在這些研究中，將供試化合物施用于正常人成纖維細胞、人前列腺癌細胞81、人黑素瘤癌細胞140、人肺癌細胞177和人卵巢癌細胞R與NR(全部可從ATCC獲得)的細胞培養(yǎng)物。在這些實驗中，平板接種細胞的密度是2000個細胞每200μl培養(yǎng)基每孔(96孔平板)。細胞的平板接種之后即對小孔施用供試化合物一次，濃度范圍為0.78-100μM。處理72小時后進行比色細胞毒性測定MTS。根據(jù)所收集的讀數(shù)計算EC50，列在圖9中。若干化合物顯示在低于100μM濃度下缺乏細胞毒性。在這樣的情況下，EC50標(biāo)注為＞100。在其他情況下，EC50表示損害50％細胞群落所需的供試化合物濃度。
吡咯并[2，3-d]嘧啶核苷類似物以劑量依賴性方式體外抑制所培養(yǎng)的細胞內(nèi)的DNA合成DNA水平測量證明，吡咯并[2，3-d]嘧啶核苷的類似物體外抑制所培養(yǎng)的人細胞的生長。實驗設(shè)置與上述相同?；衔锝o藥一次，72小時后測量DNA水平。在那時從培養(yǎng)孔除去半數(shù)培養(yǎng)基，用純水代替。此后，將細胞冷卻至-70℃達至少12小時。下一步，將細胞從-70℃恢復(fù)至室溫，向每孔內(nèi)加入1μM Hoechst 33342。培養(yǎng)2小時后，測量熒光信號(360-530nm)。按照這種方法，由于所生成的DNA-Hoechst33342復(fù)合物的存在，熒光強度與DNA的量成正比。結(jié)果列在圖10中。數(shù)字表示DNA量比實驗開始時(細胞平板接種后2小時)增加的倍數(shù)。在未處理的前列腺癌細胞和正常細胞中，DNA水平在72小時培養(yǎng)期間分別增加5.78和4.47倍。
化合物23a(5’-R)和23a(5’-S)體外抑制VEGF從人前列腺癌分泌化合物23a(5’-R)和23a(5’-S)有力地抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)從人前列腺癌細胞HTB81分泌。VEGF被視為血管生成的標(biāo)志，因為這種分子是體內(nèi)內(nèi)皮細胞移行與生長和微血管生成的關(guān)鍵。為了證實這一點，在直徑10cm的陪替氏培養(yǎng)皿內(nèi)將0.5×105個細胞平板接種在5ml培養(yǎng)基中。平板接種后即施用化合物達72小時。此后，收集培養(yǎng)基，利用VEGF Elisa測定法(R&D Systems)測量VEGF的水平，以每ml培養(yǎng)基的VEGF pg數(shù)表示。結(jié)果列在圖11中。根據(jù)這些結(jié)果，兩種化合物都以劑量依賴性方式抑制VEGF的分泌。
化合物23a(5’-R)和23a(5’-S)體外抑制IL-8從所培養(yǎng)的人前列腺癌細胞釋放化合物23a(5’-R)和23a(5’-S)對白介素-8(IL-8)從人前列腺癌細胞HTB81分泌顯示抑制作用。IL-8屬于化學(xué)吸引性趨化因子類(α型)，它們由于嗜中性白細胞的吸引而參與炎癥過程。趨化因子一般已知是由各種類型的癌癥產(chǎn)生的。若干研究證明，抑制癌細胞產(chǎn)生趨化因子對宿主來說是有益的。為了證實這兩種化合物抑制IL-8從前列腺癌細胞分泌的效力，將前列腺癌細胞HTB81體外用5’-R與5’-S構(gòu)型的化合物23a處理，濃度如圖所示。利用來自R&D Systems的IL-8Elisa測定法分析從培養(yǎng)物收集的培養(yǎng)基的IL-8水平。根據(jù)所收集的結(jié)果，兩種化合物都能以劑量依賴性方式抑制IL-8的分泌，如圖12所示。
不過應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會的是，所涉及化合物的生物作用不必限于上述特定作用。特別是所涉及的是根據(jù)發(fā)明主題的化合物一般在各種過度增殖性障礙中表現(xiàn)抑制細胞生長的作用，包括局限性和/或轉(zhuǎn)移性癌癥(例如淋巴瘤和癌)、良性前列腺增生和角化病。盡管本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了對IL-4(2型細胞因子)和IFNγ(1型細胞因子)的實質(zhì)性生物作用，不過一般認為是根據(jù)發(fā)明主題的化合物在除IL-4和IFN-γ以外的細胞因子調(diào)制中是生物學(xué)活性的。尤其涉及的是這些化合物可以增加或減少特定細胞因子或細胞因子組的表達/分泌。因此，所涉及的是根據(jù)發(fā)明主題的化合物可以調(diào)制生物體的免疫系統(tǒng)，以便可以更加突出1型或2型應(yīng)答。所以，所涉及的是根據(jù)發(fā)明主題的化合物通過作為病毒聚合酶抑制劑的直接作用和/或間接激活免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特定的體液或細胞應(yīng)答，可以有效減少活體系統(tǒng)中的病毒效價。進一步涉及的是根據(jù)發(fā)明主題的化合物還可以通過減少針對同種或異種移植物的細胞應(yīng)答的嚴重性，用于減少免疫系統(tǒng)針對同種或異種移植物的應(yīng)答。
實施例下列方案描述根據(jù)發(fā)明主題的各種化合物的示范性合成，僅供例證而不限制本文所列發(fā)明概念。
甲基2，3-O-亞異丙基-5(R，S)-C-乙炔基-β-呋喃核糖苷(2b)的制備在-42℃氬下，向攪拌著的甲基4-C，5-O-二脫氫-2，3-O-亞異丙基-β-D-呋喃核糖苷(Jones等，Methods in Carbohydrate Chemistry(碳水化合物化學(xué)方法)，vol.1，pp 315-322(1972)，4.00g，19.78mmol)的無水THF(20ml)溶液中滴加溴化乙炔基鎂(0.5M THF溶液，80ml，40mmol)。加入后，將所得混合物緩慢加溫至0℃(～90min)。加入冰(50g)/水(50ml)猝滅反應(yīng)，將混合物攪拌30分鐘。用10％含水乙酸中和后，混合物用乙酸乙酯萃取兩次。合并有機層，干燥(Na2SO4)，濃縮。二氧化硅色譜(乙酸乙酯-己烷1∶4)得到3.48g標(biāo)題化合物(R/S比1∶1)，為白色固體。按相似方式制備下列化合物從甲基4-C，5-O-二脫氫-2，3-O-亞異丙基-β-D-呋喃核糖苷和溴化乙基鎂制備甲基2，3-O-亞異丙基-5(R)-C-甲基-β-D-呋喃核糖苷(2a)；從甲基4-C，5-O-二脫氫-2，3-O-亞異丙基-β-D-呋喃核糖苷和溴化乙烯基鎂制備甲基2，3-O-亞異丙基-5(R)-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖苷(2c)；從甲基4-C，5-O-二脫氫-2，3-O-亞異丙基-β-D-呋喃核糖苷和溴化烯丙基鎂制備甲基5(R)-C-烯丙基-2，3-O-亞異丙基-β-D-呋喃核糖苷(2d)。
甲基2，3-O-亞異丙基-5-O-甲磺?；?5(R)-C-甲基-β-D-呋喃核糖苷(16)的制備在0℃下，向攪拌著的甲基2，3-O-亞異丙基-5(R)-C-甲基-β-D-呋喃核糖苷(2a，7.24g，33.17mmol)的無水吡啶(50ml)溶液中加入甲磺酰氯(3.1ml，39.92mmol)。將所得混合物在室溫下攪拌1小時，冷卻至0℃，加入水(1.0ml)猝滅，在室溫下攪拌30分鐘。蒸發(fā)溶劑，將殘余物溶于乙酸乙酯，用鹽水洗滌三次，干燥(Na2SO4)，濃縮。二氧化硅色譜(含30％EtOAc的己烷)得到8.62g標(biāo)題化合物16，為無色糖漿狀物。
甲基2，3-O-亞異丙基-5-O-乙?；?5(S)-C-甲基-β-D-呋喃核糖苷(17)的制備將攪拌著的甲基2，3-O-亞異丙基-5-O-甲磺?；?5(R)-C-甲基-β-D-呋喃核糖苷(16，8.62g，29.1mmol)與NaOAc(無水，3.5g，42.5mmol)的無水DMF(350ml)懸液在125℃和氬下加熱4天。蒸發(fā)溶劑，殘余物經(jīng)過二氧化硅色譜處理(含25％EtOAc的己烷)，得到4.0g標(biāo)題化合物17，為白色固體。
甲基2，3-O-亞異丙基-4-C-羥甲基-β-D-呋喃核糖苷(28)的制備在0℃下，向攪拌著的4-C，5-O-二脫氫-2，3-O-亞異丙基-β-D-呋喃核糖苷1(20.22g，100mmol)的二噁烷(380ml)溶液中滴加甲醛(37％溶液，76ml)、然后是2M NaOH(188ml)。將所得反應(yīng)混合物在室溫下攪拌20小時，冷卻至0℃，中和(10％乙酸)，濃縮(～50％)，用二氯甲烷萃取兩次。合并有機層，干燥(Na2SO4)，濃縮至干。二氧化硅色譜(含4％甲醇的氯仿)得到20.2g標(biāo)題化合物28，為白色固體。
甲基2，3-O-亞異丙基-5-脫氧-β-D-呋喃核糖苷(8)的制備在10℃下，向攪拌著的甲基2，3-O-亞異丙基-β-D-呋喃核糖苷(14.2g，70.0mmol)的無水吡啶(250ml)溶液中分批(歷經(jīng)30min)加入對-甲苯磺酰氯(19.1g，100mmol)。將所得混合物在室溫下攪拌18小時，冷卻至0℃，加入水(5.0ml)猝滅，在室溫下攪拌30分鐘。蒸發(fā)溶劑。將殘余物溶于乙酸乙酯，用鹽水洗滌三次，干燥(Na2SO4)，濃縮至干。二氧化硅色譜(乙酸乙酯-己烷1∶3)得到24.1g標(biāo)題化合物，為白色固體。
向攪拌著的LiAlH4(4.58g，120.5mmol)的無水二乙醚(120ml)懸液中加入甲基2，3-O-亞異丙基-5-O-對-甲苯磺?；?β-D-呋喃核糖苷(13.1g，36.55mmol)的二乙醚-甲苯(2.5∶1，140ml)溶液。將所得混合物回流22小時，冷卻至室溫，用乙酸乙酯(25ml)稀釋，加入水(5.0ml)猝滅。蒸發(fā)溶劑。將殘余物溶于乙酸乙酯，用鹽水洗滌三次，干燥(Na2SO4)，濃縮至干。二氧化硅色譜(乙酸乙酯-己烷1∶3)得到3.58g標(biāo)題化合物，為無色液體。
甲基(5R)-C-烯丙基-5-O-苯甲?；?2，3-O-亞異丙基-β-D-呋喃核糖苷(3d)的制備在0℃下，向攪拌著的甲基(5R)-C-烯丙基-2，3-O-亞異丙基-β-D-呋喃核糖苷(4.49g，18.38mmol)的無水吡啶(40ml)溶液中加入苯甲酰氯(2.7ml，23.0mmol)。將所得混合物在室溫下攪拌18小時，用冰冷卻，加入水(1ml)猝滅，在室溫下攪拌30分鐘。蒸發(fā)溶劑，將殘余物溶于乙酸乙酯，用鹽水洗滌三次，干燥(Na2SO4)，濃縮。二氧化硅色譜(含12％乙酸乙酯的己烷)得到6.26g標(biāo)題化合物3d，為無色糖漿狀物。按相似方式制備下列化合物從甲基5(R，S)-C-乙炔基-2，3-O-亞異丙基-β-D-呋喃核糖苷(2b)制備甲基5-O-苯甲酰基-5(R，S)-C-乙炔基-2，3-O-亞異丙基-β-D-呋喃核糖苷(3b，R/S比1∶1)；從甲基2，3-O-亞異丙基-4-C-羥甲基-β-D-呋喃核糖苷制備甲基4-C-羥甲基-5-O-苯甲?；?2，3-O-亞異丙基-β-D-呋喃核糖苷。
甲基(5R)-C-烯丙基-5-O-苯甲?；?β-D-呋喃核糖苷(4d)的制備將甲基(5R)-C-烯丙基-5-O-苯甲酰基-2，3-O-亞異丙基-β-D-呋喃核糖苷(3d，6.2g，17.8mmol)在TFA-H2O混合物(9∶1)中的溶液在0℃下攪拌90分鐘，在0℃下濃縮至干。將殘余物溶于甲醇-甲苯混合物(20ml，1∶1)，濃縮至干。二氧化硅色譜(乙酸乙酯-己烷1∶1)得到3.70g標(biāo)題化合物4 d，為白色固體。按相似方式制備下列化合物從甲基5-O-苯甲?；?5(R，S)-C-乙炔基-2，3-O-亞異丙基-β-D-呋喃核糖苷(3b)制備甲基5-O-苯甲?；?5(R，S)-C-乙炔基-β-D-呋喃核糖苷(4b，R/S比1∶1)；從甲基5-O-苯甲?；?4-C-苯甲酰氧基甲基-2，3-O-亞異丙基-β-D-呋喃核糖苷制備甲基5-O-苯甲?；?4-C-苯甲酰氧基甲基-β-D-呋喃核糖苷。
甲基(5R)-C-烯丙基-2，3，5-三-O-苯甲?；?β-D-呋喃核糖苷(5d)的制備在0℃下，向攪拌著的甲基(5R)-C-烯丙基-5-O-苯甲?；?β-D-呋喃核糖苷(4d，3.60mg，11.68mmol)的無水吡啶(80ml)溶液中加入苯甲酰氯(3.0ml，25.84mmol)。將所得混合物在室溫下攪拌18小時，用冰冷卻，加入水(1ml)猝滅，在室溫下攪拌30分鐘。濃縮混合物，用乙酸乙酯稀釋，用鹽水洗滌三次，干燥(Na2SO4)，濃縮至干。二氧化硅色譜(含15％乙酸乙酯的己烷)得到5.3g標(biāo)題化合物5d，為無色糖漿狀物。按相似方式制備下列化合物從甲基5-O-苯甲?；?5(R，S)-C-乙炔基-β-D-呋喃核糖苷(4b)制備甲基5(R，S)-C-乙炔基-2，3，5-三-O-苯甲?；?β-D-呋喃核糖苷(5b，R/S比1∶1)；從甲基-4-C-苯甲酰氧基甲基-5-O-苯甲酰基-β-D-呋喃核糖苷制備甲基4-C-苯甲酰氧基甲基-2，3，5-三-O-苯甲?；?β-D-呋喃核糖苷。
1-O-甲基-2，3，5-三-O-苯甲?；?5(R)-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖(5c)的制備將甲基2，3-O-亞異丙基-5(R)-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖苷(2c，1.0g，4.3mmol)在三氟乙酸與水的混合物(9∶1，v/v，11ml)中的溶液在0℃下攪拌30分鐘，濃縮至干。將殘余物溶于甲醇，濃縮至干(3次)，然后溶于吡啶，蒸發(fā)，最后溶于無水吡啶(11ml)。向該溶液中加入苯甲酰氯(1.9ml，16mmol)。將反應(yīng)混合物在25℃下攪拌16小時，倒在冰水(20ml)中。混合物用二氯甲烷(20ml)萃取，有機層經(jīng)硫酸鈉干燥，濃縮至干。殘余物經(jīng)過二氧化硅色譜處理(含0-5％乙酸乙酯的二氯甲烷)，得到1.0g標(biāo)題化合物5c，為糖漿狀物。
1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲?；?5(R)-C-烯丙基-D-呋喃核糖(6d)的制備在0℃下，向攪拌著的甲基(5R)-C-烯丙基-2，3，5-三-O-苯甲?；?β-D-呋喃核糖苷(5d，4.0g，7.74mmol)的乙酸(14ml)與乙酸酐(1.75ml，18.36mmol)溶液中加入濃硫酸(200μl，3.79mmol，4.0ml乙酸溶液)。將所得混合物在室溫下攪拌20小時，冷卻至0℃，用冷乙酸乙酯稀釋，用水、5％含水NaHCO3和鹽水洗滌，干燥(Na2SO4)，濃縮。二氧化硅色譜(乙酸乙酯-己烷1∶4)得到2.82g標(biāo)題化合物6d(α/β比1∶2)，為無色泡沫。按相似方式制備下列化合物從甲基5(R，S)-C-乙炔基-2，3，5-三-O-苯甲?；?β-D-呋喃核糖苷(5b)制備1-O-乙酰基-5(R，S)-C-乙炔基-2，3，5-三-O-苯甲?；?β-D-呋喃核糖(6b，R/S比1∶1，α/β比1∶2)；從甲基4-C-苯甲酰氧基甲基-2，3，5-三-O-苯甲?；?β-D-呋喃核糖苷制備1-O-乙酰基-4-C-苯甲酰氧基甲基-2，3，5-三-O-苯甲?；?β-D-呋喃核糖(α/β比1∶3)；從甲基2，3-O-亞異丙基-5(R)-C-甲基-β-D-呋喃核糖苷制備5(R)-C-甲基-1，2，3，5-四-O-乙?；?β-D-呋喃核糖。
從甲基5-O-乙?；?2，3-O-亞異丙基-5(R)-C-甲基-β-D-呋喃核糖苷制備1，2，3，5-四-O-乙?；?5(S)-C-甲基-D-呋喃核糖6a；從甲基5-O-乙?；?2，3-O-亞異丙基-β-D-呋喃核糖苷制備5-脫氧-1，2，3-三-O-乙?；?D-呋喃核糖9；從甲基2，3，5-三-O-苯甲酰基-5(R)-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖苷制備1-O-乙?；?2，3，5-三-O-苯甲酰基-5(R)-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖6c。
4-氨基-6-溴-5-氰基-7-(2，3，5-三-O-苯甲酰基-5(R)-C-烯丙基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶的制備將4-氨基-6-溴-5-氰基吡咯并[2，3-d]嘧啶(Tolman等，J.Org.Chem.(有機化學(xué)雜志)1969，91，2102-2108，1.05g，4.41mmol)與硫酸銨(50mg)的HMDS(75ml)與無水間-二甲苯(25ml)懸液在氬下回流18小時。蒸發(fā)溶劑，在真空下干燥殘余物。將殘余物溶于無水1，2-二氯乙烷(80ml)，與1-O-乙?；?2，3，5-三-O-苯甲?；?5(R)-C-烯丙基-D-呋喃核糖(2.00g，3.67mmol)混合。在冰冷卻下，加入TMSOTf(1.3ml，7.30mmol，5ml無水1，2-二氯乙烷溶液)。將混合物在室溫和氬下攪拌30分鐘，然后回流90小時，冷卻后倒在冰/NaHCO3(50ml)上猝滅，過濾。分離有機層，干燥(Na2SO4)，濃縮。二氧化硅色譜(EtOAc-己烷2∶3)得到1.81g標(biāo)題化合物，為無色固體。按相似方式制備下列化合物從1-O-乙?；?2，3，5-三-O-苯甲?；?5(R，S)-C-乙炔基-D-呋喃核糖和4-氨基-6-溴-5-氰基吡咯并[2，3-d]嘧啶制備4-氨基-6-溴-5-氰基-7-(2，3，5-三-O-苯甲酰基-5(R，S)-C-乙炔基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶(R/S比1∶1)；從1-O-乙酰基-4-苯甲酰氧基甲基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-D-呋喃核糖和4-氨基-6-溴-5-氰基吡咯并[2，3-d]嘧啶制備4-氨基-6-溴-5-氰基-7-(4-苯甲酰氧基甲基-2，3，5-三-O-苯甲?；?β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶；從1，2，3，5-四-O-乙?；?5(R)-C-甲基-D-呋喃核糖和4-氨基-6-溴-5-氰基吡咯并[2，3-d]嘧啶制備4-氨基-6-溴-5-氰基-7-(1，2，3，5-四-O-乙酰基-5(R)-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶；從1，2，3，5-四-O-乙?；?5(S)-C-甲基-D-呋喃核糖和4-氨基-6-溴-5-氰基吡咯并[2，3-d]嘧啶制備4-氨基-6-溴-5-氰基-7-(1，2，3，5-四-O-乙?；?5(S)-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶；從1，2，3-三-O-乙酰基-5-脫氧-D-呋喃核糖和4-氨基-6-溴-5-氰基吡咯并[2，3-d]嘧啶制備4-氨基-6-溴-5-氰基-7-(2，3-二-O-乙酰基-5-脫氧-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶；從1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲?；?5(R)-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖和4-氨基-6-溴-5-氰基吡咯并[2，3-d]嘧啶制備4-氨基-6-溴-5-氰基-7-(2，3，5-三-O-苯甲?；?5(R)-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶。
4-氨基-5-氰基-7-(2，3，5-三-O-苯甲?；?5(R)-C-烯丙基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶(20e)的制備向4-氨基-6-溴-5-氰基-7-(2，3，5-三-O-苯甲?；?5(R)-C-烯丙基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶(738mg，1.0mmol)的乙酸(25ml)溶液中分兩批(間隔一小時)加入鋅粉(1.04g，16.0mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌20小時，過濾。蒸發(fā)濾液至干，殘余物經(jīng)過二氧化硅色譜處理(乙酸乙酯-己烷1∶1)，得到450mg標(biāo)題化合物20e，為無色泡沫。按相似方式制備下列化合物從4-氨基-6-溴-5-氰基-7-(2，3，5-三-O-苯甲酰基-5(R，S)-C-乙炔基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶制備4-氨基-5-氰基-7-(2，3，5-三-O-苯甲酰基-5(R，S)-C-乙炔基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶(R/S比1∶1)20b；從4-氨基-6-溴-5-氰基-7-(2，3，5-三-O-苯甲?；?5(R)-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶制備4-氨基-5-氰基-7-(2，3，5-三-O-苯甲酰基-5(R)-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶20c。
4-氨基-5-氰基-7-(2，3，5-三-O-苯甲?；?5(R)-C-丙基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶(20f)的制備將4-氨基-6-溴-5-氰基-7-(2，3，5-三-O-苯甲酰基-5(R)-C-烯丙基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶(400mg，0.54mmol)與10％Pd/C(100mg，～50％水)的二噁烷(50ml)與三乙胺(0.5ml)懸液在氫化裝置(H2，20psi)中搖動4小時。過濾催化劑，洗滌(二噁烷)。合并濾液，濃縮，殘余物經(jīng)過二氧化硅色譜處理(乙酸乙酯-己烷1∶1)，得到340mg標(biāo)題化合物20f，為無色泡沫。按相似方式制備下列化合物從4-氨基-6-溴-5-氰基-7-(2，3，5-三-O-苯甲?；?5(R，S)-C-乙炔基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶制備4-氨基-5-氰基-7-(2，3，5-三-O-苯甲?；?5(R，S)-C-乙基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶(R/S比1∶1)20d；從4-氨基-6-溴-5-氰基-7-(4-苯甲酰氧基甲基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶制備4-氨基-5-氰基-7-(4-苯甲酰氧基甲基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶；從4-氨基-6-溴-5-氰基-7-(1，2，3，5-四-O-乙?；?5(R)-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶制備4-氨基-5-氰基-7-(1，2，3，5-四-O-乙?；?5(R)-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶20a；從4-氨基-6-溴-5-氰基-7-(1，2，3，5-四-O-乙?；?5(S)-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶制備4-氨基-5-氰基-7-(1，2，3，5-四-O-乙?；?5(S)-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶20a；從4-氨基-6-溴-5-氰基-7-(1，2，3-三-O-乙?；?5-脫氧-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶制備4-氨基-5-氰基-7-(1，2，3-三-O-乙?；?5-脫氧-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶；從4-氨基-5-氰基-7-(2，3-二脫氧-β-D-呋喃戊-2-烯糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶制備4-氨基-5-氰基-7-(2，3-二脫氧-β-D-甘油基-呋喃戊糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶。
4-氨基-5-氰基-7-(5(R)-C-烯丙基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶(23e)的制備將4-氨基-5-氰基-7-(2，3，5-三-O-苯甲?；?5(R)-C-烯丙基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶(300mg，0.454mmol)的甲醇(40ml)溶液在0℃下用氨飽和。將溶液在室溫下放置2天。蒸發(fā)溶劑，將殘余物與NaOAc(無水，20mg)一起懸浮在DMF(20ml)中。將混合物在120℃和氬下攪拌5小時。蒸發(fā)溶劑。使殘余物吸附在硅膠上，從硅膠柱洗脫(甲醇-乙酸乙酯1∶25)，得到145mg標(biāo)題化合物，為無色固體。
在DMF中加熱之前，產(chǎn)物含有兩種主要的化合物21和23，它們能夠通過硅膠色譜法分離。化合物21是通過這種程序制備的。按相似方式制備下列化合物從4-氨基-5-氰基-7-(2，3，5-三-O-苯甲?；?5(R)-C-丙基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶制備4-氨基-5-氰基-7-(5(R)-C-丙基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶23f；從4-氨基-5-氰基-7-(2，3，5-三-O-苯甲?；?5(R，S)-C-乙炔基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶制備4-氨基-5-氰基-7-(5(R，S)-C-乙炔基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶(R-S比1∶1)2 3b；從4-氨基-5-氰基-7-(2，3，5-三-O-苯甲酰基-5(R，S)-C-乙基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶制備4-氨基-5-氰基-7-(5(R，S)-C-乙基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶(R-S比1∶1)2 3d；從4-氨基-5-氰基-7-(4-苯甲酰氧基甲基-2，3，5-三-O-苯甲?；?β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶制備4-氨基-5-氰基-7-(4-羥甲基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶33d；從4-氨基-5-氰基-7-(1，2，3，5-四-O-乙酰基-5(R)-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶制備4-氨基-5-氰基-7-(5(R)-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶23a(5’-R)；從4-氨基-5-氰基-7-(1，2，3，5-四-O-乙酰基-5(S)-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶制備4-氨基-5-氰基-7-(5(S)-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶23a(5’-S)；從4-氨基-5-氰基-7-(1，2，3-三-O-乙酰基-5-脫氧-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶制備4-氨基-5-氰基-7-(5-脫氧-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶10；從4-氨基-5-氰基-7-(2，3，5-三-O-苯甲?；?5(R)-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶制備4-氨基-5-氰基-7-(5(R)-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶23c。
4-氨基-5-氰基-7-(2，3-二-O-甲磺?；?5-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶的制備在0℃下，向攪拌著的豐加霉素43(5.83g，20.0mmol)的無水吡啶(100ml)溶液中加入氯化叔丁基二苯基硅(6.2ml，24.0mmol)。將所得混合物在室溫下攪拌18小時，然后冷卻至0℃，加入甲磺酰氯(3.4ml，44.0mmol)。將所得混合物在室溫下攪拌2小時，用冰冷卻，加入水(2ml)猝滅，在室溫下攪拌30分鐘。蒸發(fā)溶劑。將殘余物溶于乙酸乙酯，用鹽水洗滌三次，干燥(Na2SO4)，濃縮。二氧化硅色譜(乙酸乙酯-己烷3∶2)得到8.41g標(biāo)題化合物，為無色固體。
4-氨基-5-氰基-7-(5-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-2，3-二脫氫-2，3-二脫氧-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶的制備在氬下熔封碲粉(200目，640mg，5.0mmol)，與三乙基硼水合鋰(1.0M THF溶液，11.25ml，11.25mmol)混合。將混合物在室溫下攪拌6小時，然后冷卻至5℃，加入4-氨基-5-氰基-7-(2，3-二-O-甲磺?；?5-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶(1.40g，2.09mmol)的THF(12ml)溶液。將所得混合物在室溫下攪拌18小時，用冰冷卻，加入水(0℃，5ml)猝滅，在室溫下攪拌30分鐘。蒸發(fā)溶劑，殘余物用乙酸乙酯萃取。濃縮萃取液，殘余物經(jīng)過二氧化硅色譜處理(含15％乙酸乙酯的己烷)，得到640mg標(biāo)題化合物，為無色泡沫。
4-氨基-5-氰基-7-(2，3-二脫氫-2，3-二脫氧-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶(49)的制備在5℃下，向攪拌著的4-氨基-5-氰基-7-(5-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-2，3-二脫氫-2，3-二脫氧-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶(2.55g，5.32mmol)的無水THF(100ml)溶液中加入氟化四丁銨(1.0MTHF溶液，6.6ml)。將所得混合物在室溫下攪拌3小時，濃縮。二氧化硅色譜(含6％甲醇的乙酸乙酯)得到1.09g標(biāo)題化合物49，為無色固體。
5-氰基-7-(5(R)-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]-4-嘧啶酮(25a)的制備在55℃下，向攪拌著的4-氨基-5-氰基-7-(5(R)-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶(306mg，1.0mmol)的水(30ml)與乙酸(2.0ml)溶液中分批加入亞硝酸鈉(590mg，8.55mmol)。將所得混合物在70℃下攪拌3小時，加入更多的亞硝酸鈉(300mg，4.30mmol)。將混合物在相同溫度下攪拌另外18小時。蒸發(fā)溶劑，殘余物經(jīng)過二氧化硅色譜處理(含12％甲醇的二氯甲烷)，得到210mg標(biāo)題化合物25a(5’-R)，為無色固體。類似地，制備下列化合物從4-氨基-5-氰基-7-(5(S)-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶制備4-氨基-5-氰基-7-(5(S)-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]-4-嘧啶酮25a(5’-S)；從4-氨基-5-氰基-7-(5-脫氧-β-D-呋喃阿糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶制備4-氨基-5-氰基-7-(β-D-呋喃阿糖基)吡咯并[2，3-d]-4-嘧啶酮5 8；從4-氨基-5-氰基-7-(5-脫氧-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶制備4-氨基-5-氰基-7-(5-脫氧-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]-4-嘧啶酮11；從4-氨基-5-氰基-7-(2，3-二脫氧-β-D-呋喃戊-2-烯糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶制備4-氨基-5-氰基-7-(2，3-二脫氧-2，3-二脫氫-β-D-甘油基-呋喃戊糖基)吡咯并[2，3-d]-4-嘧啶酮50；從4-氨基-5-氰基-7-(2，3-二脫氧-β-D-甘油基-呋喃戊糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶制備4-氨基-5-氰基-7-(2，3-二脫氧-β-D-甘油基-呋喃戊糖基)吡咯并[2，3-d]-4-嘧啶酮65；從4-氨基-5-氰基-7-(2-脫氧-β-D-eritro呋喃戊糖基)吡咯并[2，3-d]嘧啶制備4-氨基-5-氰基-7-(2-脫氧-β-D-呋喃糖基)吡咯并[2，3-d]-4-嘧啶酮69。
7-(5(R)-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]-4-嘧啶酮-5-甲偕胺肟(24a)的制備將攪拌著的5-氰基-7-(5(R)-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]-4-嘧啶酮(240mg，0.784mmol)、鹽酸羥胺(163mg，2.352mmol)與碳酸鉀(162mg，1.176mmol)的乙醇(50ml)懸液在氬下回流18小時。過濾沉淀，用熱乙醇洗滌。濃縮濾液，殘余物經(jīng)過二氧化硅色譜處理(含20％甲醇的二氯甲烷)，得到170mg標(biāo)題化合物26a(5’-R)，為無色固體。類似地，制備下列化合物從4-氨基-5-氰基-7-(5-脫氧-β-D-呋喃阿糖基)吡咯并[2，3-d]-4-嘧啶酮制備4-氨基-5-氰基-7-(β-D-呋喃阿糖基)吡咯并[2，3-d]-4-嘧啶酮-5-甲偕胺肟。
從4-氨基-5-氰基-7-(5-脫氧-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]-4-嘧啶酮制備4-氨基-5-氰基-7-(5-脫氧-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]-4-嘧啶酮-5-甲偕胺肟13；從4-氨基-5-氰基-7-(2，3-二脫氫-2，3-二脫氧-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]-4-嘧啶酮制備4-氨基-5-氰基-7-(2，3-二脫氫-2，3-二脫氧-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]-4-嘧啶酮-5-甲偕胺肟51；從4-氨基-5-氰基-7-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]-4-嘧啶酮制備4-氨基-5-氰基-7-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]-4-嘧啶酮-5-甲偕胺肟。
7-(5(R)-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]-4-嘧啶酮-5-甲脒鹽酸鹽(27a)的制備在室溫下，將7-(5(R)-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]-4-嘧啶酮-5-甲偕胺肟(110mg，0.324mmol)、氯化銨(20mg，0.374mmol)與阮內(nèi)鎳(50％水淤漿，200mg)的水(75ml)懸液在氫化裝置(H2，50psi)中搖動18小時。過濾催化劑，洗滌(熱水)。合并濾液，濃縮，產(chǎn)物從甲醇中重結(jié)晶，得到100mg標(biāo)題化合物27a(5’-R)，為無色固體。按相似方式制備下列化合物從4-氨基-5-氰基-7-(5-脫氧-β-D-呋喃阿糖基)吡咯并[2，3-d]-4-嘧啶酮-5-甲偕胺肟制備4-氨基-5-氰基-7-(β-D-呋喃阿糖基)吡咯并[2，3-d]-4-嘧啶酮-5-甲脒鹽酸鹽63；從4-氨基-5-氰基-7-(5-脫氧-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]-4-嘧啶酮-5-甲偕胺肟制備4-氨基-5-氰基-7-(5-脫氧-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]-4-嘧啶酮-5-甲脒鹽酸鹽15；從4-氨基-5-氰基-7-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]-4-嘧啶酮-5-甲偕胺肟制備4-氨基-5-氰基-7-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)吡咯并[2，3-d]-4-嘧啶酮-5-甲脒鹽酸鹽70。
因而，已經(jīng)公開了吡咯并[2，3-d]嘧啶核苷類似物的具體實施方式
和應(yīng)用。不過對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說應(yīng)當(dāng)顯而易見的是，在不背離發(fā)明概念的前體下，除了上述以外更多的修飾也是可能的。因此發(fā)明主題僅受權(quán)利要求書精神的限制。而且，在解釋說明書和權(quán)利要求書時，所有術(shù)語都應(yīng)當(dāng)被解釋為與上下文一致的最廣義的可能方式。特別是術(shù)語“包含”應(yīng)當(dāng)被解釋為以非排他性方式提到元素、組分或步驟，表示所提到的元素、組分或步驟可以與沒有明確提到的元素、組分或步驟一起存在、利用或組合。
權(quán)利要求
1.根據(jù)式(I)結(jié)構(gòu)的核苷類似物 其中A是O、S或CH2；X是H、NH2或OH；Y是H、鹵素或NH2；Z選自由H、鹵素、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、CN、C(O)NH2、COOH、COOR、CH2NH2、C(＝NOH)NH2和C(＝NH)NH2組成的組，其中的R是烷基、烯基、炔基或芳烷基；R2和R3獨立地選自由H、F和OH組成的組；R4選自由氫、烷基、烯基、炔基和芳烷基組成的組，其中R4可選地具有至少一個雜原子和官能團；R5是H、OH、OP(O)(OH)2、P(O)(OH)2、OP(O)(OR’)2或P(O)(OR’)2，其中的R’是掩蔽基團；R5’選自由烷基、烯基、炔基和芳烷基組成的組，其中R5’具有至少兩個碳原子，并且可選地具有至少一個雜原子和官能團。
2.權(quán)利要求1的核苷類似物，其中Z是CN、C(O)NH2或C(＝NH)NH2，其中R5’具有至少兩個碳原子，選自由烷基、烯基、炔基和芳烷基組成的組。
3.具有下式結(jié)構(gòu)的權(quán)利要求1的核苷類似物 其中Z是CN、C(O)NH2、C(＝NH)NH2或C(＝NOH)NH2，R4和R5’獨立地選自由氫、烷基、烯基、炔基和芳烷基組成的組，其中R4和R5’獨立地和可選地含有至少一個雜原子和官能團；其條件是R4和R5’不同時為氫。
4.改變細胞因子從細胞分泌的方法，包含提供根據(jù)式(II)的化合物 其中A是O、S或CH2；X是H、NH2或OH；Y是H、鹵素或NH2；Z選自由H、鹵素、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、CN、C(O)NH2、COOH、COOR、CH2NH2、C(＝NOH)NH2和C(＝NH)NH2組成的組，其中的R是烷基、烯基、炔基或芳烷基；R2和R3獨立地選自由H、F和OH組成的組；R4和R5’獨立地選自由氫、烷基、烯基、炔基和芳烷基組成的組，其中R4和R5’獨立地和可選地含有至少一個雜原子和官能團；R5是H、OH、OP(O)(OH)2、P(O)(OH)2、OP(O)(OR’)2或P(O)(OR’)2，其中的R’是掩蔽基團；和向該細胞呈遞該化合物，其濃度有效改變細胞因子的分泌。
5.權(quán)利要求4的方法，其中該細胞因子是1型細胞因子。
6.權(quán)利要求5的方法，其中該1型細胞因子是IFNγ。
7.權(quán)利要求4的方法，其中該細胞因子是2型細胞因子。
8.權(quán)利要求7的方法，其中該2型細胞因子是IL-4。
9.權(quán)利要求4的方法，其中該細胞是淋巴細胞。
10.權(quán)利要求4的方法，其中該細胞是癌細胞。
11.權(quán)利要求10的方法，其中該癌細胞是前列腺癌細胞。
12.改變細胞因子從細胞分泌的方法，包含提供根據(jù)式(III)的化合物 其中Z是CN、C(O)NH2、C(＝NH)NH2、C(＝NNH2)NH2或-C(＝NOH)NH2；其中R5是H、OH、OP(O)(OH)2、P(O)(OH)2、OP(O)(OR’)2或P(O)(OR’)2，其中的R’是掩蔽基團；和向該細胞呈遞該化合物，其濃度有效改變細胞因子的分泌。
13.減少過度增殖性細胞生長的方法，包含提供根據(jù)式(IV)的化合物 其中A是O、S或CH2；X是H、NH2或OH；Y是H、鹵素或NH2；Z選自由H、鹵素、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、CN、C(O)NH2、COOH、COOR、CH2NH2、C(＝NOH)NH2和C(＝NH)NH2組成的組，其中的R是烷基、烯基、炔基或芳烷基；R2和R3獨立地選自由H、F和OH組成的組；R4選自由氫、烷基、烯基、炔基和芳烷基組成的組，其中R4可選地含有至少一個雜原子和官能團；R5’選自由氫、烷基、烯基、炔基和芳烷基組成的組，其中R5’具有至少兩個碳原子，并且可選地含有至少一個雜原子和官能團；R5是H、OH、OP(O)(OH)2、P(O)(OH)2、OP(O)(OR’)2或P(O)(OR’)2，其中的R’是掩蔽基團；其條件是R4和R5’不同時為氫；和向該過度增殖性細胞呈遞該化合物，其濃度有效減少該過度增殖性細胞的生長。
14.權(quán)利要求13的方法，其中該過度增殖性細胞是癌細胞。
15.權(quán)利要求14的方法，其中該癌細胞是前列腺癌細胞。
16.權(quán)利要求13的方法，其中生長的減少包含DNA合成的減少。
17.減少生長因子從細胞釋放的方法，包含提供根據(jù)權(quán)利要求1的化合物；和向該細胞呈遞該化合物，其濃度有效減少該生長因子的釋放。
18.權(quán)利要求17的方法，其中該生長因子是VEGF。
19.權(quán)利要求17的方法，其中該細胞是癌細胞。
20.權(quán)利要求19的方法，其中該癌細胞是前列腺癌細胞。
全文摘要
提供了關(guān)于吡咯并[2,3－d]嘧啶核苷類似物的組合物和方法,這些類似物在呋喃核糖部分的C4’和C5’位具有取代基。所涉及的組合物尤其表現(xiàn)出抗癌和免疫調(diào)制作用,減少了毒性。
文檔編號A61P29/00GK1384834SQ00814992
公開日2002年12月11日 申請日期2000年8月17日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月27日
發(fā)明者王廣義, R·譚, Z·皮特爾茨科夫斯基, E·甘尼克 申請人:Icn藥品公司