一株高產嘧啶核苷的菌株及其氨甲酰磷酸合成酶調節(jié)位點的制作方法
【技術領域】：
[0001] 本發(fā)明屬于酶工程技術領域，具體設及一株高產喀晚核巧的菌株及其氨甲酯憐酸 合成酶調節(jié)位點。
【背景技術】：
[0002] 喀晚核巧包括尿巧和胞巧，是一切生物體的重要組成成分，它們用途廣泛，尤其是 作為抗病毒抗腫瘤藥物的中間體，在醫(yī)藥領域占有重要地位?？ν砗饲傻纳a方法有化學 合成法，水解RNA法和微生物發(fā)酵法，綜合幾種方法的優(yōu)缺點，微生物發(fā)酵法因其周期短、易 控制、產率高、污染小等優(yōu)點，具有大規(guī)模工業(yè)化的潛力，因此日益受到人們的重視。
[0003] 喀晚核巧生產菌株的選育始于20世紀60年代，國內外有關喀晚核巧高產菌株的選 育基本上都是誘變結合結構類似物抗性菌株篩選的方法，其中W日本武田化學公司的研究 最為突出。
[0004] 武田公司在高產尿巧菌種選育的過程中先W野生型枯草芽抱桿菌為出發(fā)菌株，經 過NTG誘變，選育出一株尿喀晚缺陷型菌株No. 122,該菌株在提供50mg/L尿喀晚情況下，能 夠積累乳清酸8.58g/L(50mM)乳清酸和7.78g/L(27mM)乳清酸核巧;在No. 122的基礎上，再 次經過NTG誘變，在含有300mg/L 6-氮雜尿喀晚的培養(yǎng)基中篩選到菌株No.258,此菌株積累 尿巧lOg/L，尿喀晚7g/L。繼續(xù)NTG誘變，在含有5g/L的6-氮雜尿喀晚培養(yǎng)基中篩選到菌株 No . 508，該菌株積累尿巧46g/L，尿喀晚6g/L。最后，為了降低副產物尿喀晚的積累量，繼續(xù) 進行誘變，篩選到一株尿巧憐酸化酶幾乎活性喪失的菌株No. 556，能夠積累尿巧55g/L，尿 喀晚積累量<lg/L，通過對培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基成分的優(yōu)化，在6000L發(fā)酵罐中穩(wěn)定積累尿巧 65g/L〇
[0005] 他們對高產胞巧菌種的選育同樣基于No. 122菌株。首先通過NTG誘變后，篩選出一 株一株胞巧脫氨酶缺失菌株No. 229，積累胞巧0.2g/L，尿巧Ig/L，此菌株在50mg/L 5-氣胞 巧的存在下即失去生長能力。因此，繼續(xù)誘變后，獲得一株能耐受500mg/L 5-氣胞巧的菌株 No.344,該菌株積累胞巧10.4g/L。經酶活性驗證實驗得知，此菌株與No. 122菌株相比，氨甲 酷憐酸合成酶和CTP合成酶的活性均提高了十倍W上。經過對該菌株的進一步誘變處理，篩 選出能夠耐受12g/L 3-脫雜氮尿喀晚菌株No.428,能夠積累胞巧14.2g/L，該菌基本上解 除了 CTP合成酶所受的反饋調節(jié)作用。之后，通過同源重組在No.428中引入了突變，獲得了 不受反饋抑制的氨甲酯憐酸合成酶菌株No.515,使胞巧產量達到18.8g/L。再經過NTG誘變， 獲得了一株高絲氨酸脫氨酶缺失菌株No.615,該菌株能積累胞巧23.5g/L，最后通過對碳源 葡萄糖濃度的調整優(yōu)化，該菌株在60噸發(fā)酵罐中能夠積累胞巧30.2g/L，并且產量穩(wěn)定。
[0006] 而日本武田公司雖然在喀晚核巧高產菌株的選育方法取得了豐碩成果，其選育的 菌種產巧能力也在國際上遙遙領先，但是受當時技術條件限制，他們并沒有指出與喀晚核 巧高產息息相關的氨甲酯憐酸合成酶關鍵調控位點。
[0007] B.subtilis 有兩種氨甲酯憐酸合成酶化 C 6.3.5.5, carbamoyl phosphate synthetase，CPSase): -是pyrAA/pyrAB基因編碼，催化UMP從頭合成途徑的第一步反應;二 是carA/ca巧基因編碼，參與精氨酸生物合成。雖然，運兩種氨甲酯憐酸合成酶都催化谷氨 酷胺與C〇2反應，消耗2分子ATP生成氨甲酯憐酸。但是，B.subtilis的兩個氨甲酯憐酸合成 酶生理功能不同，它們的表達和酶活性調節(jié)機制也完全不同。
[000引pyrAA/pyrAB位于pyr操縱子的第5和6位，編碼與UMP合成相關的氨甲酯憐酸合成 酶。其中pyrAA基因長度為1095bp，編碼氨甲酯憐酸合成酶的小亞基，催化谷氨酷胺的ε-氨 基轉移到大亞基。pyrAB基因長度為3216bp，編碼氨甲酯憐酸合成酶的大亞基，催化MgATP、 C02與N出合成氨甲酯憐酸。pyr AA/pyrAB屬于pyr操縱子，其表達也受PRPP激活，受IMP、UDP和 UTP的反饋阻遏。pyrAA/pyrAB編碼的氨甲酯憐酸合成酶還是一個變構酶，其酶活受UMP反饋 抑制，受PRPP激活，并需要Mgh的存在。
[0009] 喀晚核巧高產菌株選育的難點在于解除終產物的反饋阻遏和反饋抑制作用，特別 是反饋抑制作用的解除，雖然研究人員已經掲示了喀晚核巧合成代謝具體的調控機制，并 從分子層面上闡述了喀晚操縱子受終產物阻遏的機理，但是對于受終產物反饋抑制的氨甲 酷憐酸合成酶具體的調控位點卻并不清楚。
[0010] 隨著分子生物學在微生物育種中的應用，有關研究人員也嘗試利用PCR法引入點 突變的方法解除氨甲酯憐酸合成酶所受的反饋抑制，但是由于氨甲酯憐酸合成酶結構和功 能的研究并不是太深入，PCR引入點突變的方法在解除氨甲酯憐酸合成酶所受反饋抑制中 的應用受到限制，已經報道的位點對反饋抑制作用的解除效果并不是太明顯。
[0011] 本發(fā)明提供了一株通過誘變選育出來的具有工業(yè)化應用潛力的枯草芽抱桿菌，可 W用于發(fā)酵法生產喀晚核巧的相關研究;對菌株的相關基因測序并經過序列比對后，明確 了與氨甲酯憐酸合成酶受終產物反饋抑制相關的關鍵調控位點，可W為W后喀晚核巧高產 菌株的選育提供參考。

【發(fā)明內容】
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[0012] 本發(fā)明解決上述問題的技術方案之一：是提供一枯草芽抱桿菌突變株，所述突變 株氨甲酯憐酸合成酶大亞基的第1016位氨基酸為亮氨酸。
[0013] 所述枯草芽抱桿菌突變株具體為枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)A219。該菌 株已于2015年12月2日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，地址:北京 市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101，保藏編號為CGMCC No.11774。
[0014] 所述枯草芽抱桿菌A219是W-株積累喀晚核巧的枯草芽抱桿菌為出發(fā)菌株，通過 常壓室溫等離子誘變和喀晚核巧結構類似物抗性菌株篩選而選育出來的，具體步驟如下： W產喀晚核巧的枯草芽抱TD131為出發(fā)菌株，進行常壓室溫等離子誘變，然后在含300mg/L 2-硫尿喀晚基本培養(yǎng)基上篩選出菌株T823,接著WT823為出發(fā)菌株，通過常壓室溫等離子 誘變后，在含有l(wèi)OOmg/L 6-氮雜尿喀晚基本培養(yǎng)基上篩選出菌株A219。
[001引對突變株A219的喀晚核巧操縱子進行測序，并與出發(fā)菌株TD131進行序列對比，發(fā) 現(xiàn)突變株A219的氨甲酯憐酸合成酶的編碼基因發(fā)生突變，突變位點在大亞基（調控位點所 在亞基，由pyrAB基因編碼)上，A219中pyrAB基因第3047位堿基發(fā)生突變，胞喀晚變?yōu)樾叵?喀晚，導致氨甲酯憐酸合成酶大亞基1016位的脯氨酸轉變?yōu)榱涟彼幔ν砗饲刹倏v子其它 基因未發(fā)現(xiàn)突變。
[0016]原始pyrAB基因的核巧酸序列如序列表SEQ ID No.l所示；
[0017] 原始氨甲酯憐酸合成酶大亞基氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示；
[0018] 突變pyrAB基因的核巧酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；
[0019] 氨甲酯憐酸合成酶大亞基突變體氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示；
[0020] 本發(fā)明中核巧酸的位置編號對應序列表SEQ ID No. 1所述核巧酸序列；
[0021] 本發(fā)明中氨基酸的位置編號對應序列表SEQ ID No.3所述氨基酸序列。
[0022] 本發(fā)明解決上述問題的技術方案之二:是提供一種氨甲酯憐酸合成酶的大亞基編 碼基因，所述基因的核巧酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0023] 本發(fā)明解決上述問題的技術方案之是提供一種喀晚核巧的發(fā)酵生產方法，具 體為：WA219為生產菌株，接種量為10 %，培養(yǎng)溫度為34-36 °C，pH 6.7-7.0，溶氧控制在so- so% ，殘?zhí)强刂圃?0.5-1% ，發(fā)酵周期 4 她，發(fā)酵完成后，發(fā)酵液中尿巧濃度可達 13.5±lg/L， 是出發(fā)菌株了0131尿巧產量(4.1±0.5邑/1)的3.3倍。
[0024] 發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖50,酵母粉5,玉米漿20,硝酸鋼15,憐酸二氨鐘1，憐酸氨 二鐘5.2,硫酸儀5,硫酸錠5,巧樣酸鋼10,谷氨酸鋼10,氯化巧1，硫酸儘0.02,硫酸鋒0.02， pH 6.7~7.0，玉米漿單獨滅菌，巧鹽單獨滅菌，儀儘鋒鹽配成混合溶液一起滅菌，葡萄糖配 成80 %溶液單獨滅菌，其余組分一起滅菌，滅菌條件玉米漿為0.1M化，20min，其余為 0.075MPa，15min。
[00巧]有益效果：
[0026] 1、本發(fā)明提供了一株生產喀晚核巧的枯草芽抱桿菌突變株和一個氨甲酯憐酸合 成酶的編碼基因，明確了一個與氨甲酯憐酸合成酶受終產物反饋抑制相關的關鍵調控位 點，可W為W后喀晚核巧高產菌株的選育提供參考。
[0027] 2、本發(fā)明提供了一株生產喀晚核巧的枯草芽抱桿菌突變株，通過發(fā)酵法生產核巧 喀晚尿巧產量可達13.5±1邑/1，是出發(fā)菌株了0131尿巧產量(4.1±0.5邑/1)的3.3倍。
[0028] 3、本發(fā)明所提供的生產喀晚核巧的枯草芽抱桿菌突變株與出發(fā)菌株TD131相比， 對不同喀晚核巧結構類似物的耐受性顯著提高：2-硫尿喀晚、6-氮雜尿喀晚和5-氣尿喀晚 對TD131的臨界100%致死濃度分別為150mg/L、100mg/L和80yg/L;2-硫尿喀晚、6-氮雜尿喀 晚和5-氣尿喀晚對A219的臨界100%致死濃度則分別提高到3g/L、3.5g/L和lOOmg/L。對2- 硫尿喀晚的耐受能力提高了大約20倍;對6-氮雜尿喀晚的耐受性分別提高了大約35;對5- 氣尿喀晚的耐受能力提高了大約125倍。
【附圖說明】：
[00巧]圖1 96微孔板篩選結果
[0030] 圖2搖瓶篩選結果
[0031] 圖3 5L罐發(fā)酵過程中菌體的生長狀況
[0032] 圖4 5L罐發(fā)酵過程中葡萄糖的消耗
[0033] 圖5 5L罐發(fā)酵過程中尿巧的積累量
【具體實施方式】：
[0034] 實施例1.枯草芽抱桿菌A219的篩選
[0035] 本發(fā)明將初始菌株TD131經常壓室溫等離子誘變-結構類似物抗性篩選-高通量篩 選-搖瓶復篩，獲得菌株A219，具體過程如下：
[0036] 1.出發(fā)菌株:B.subtilis TD131
[0037] 2.常壓室溫等離子誘變
[0038] (1)菌體培養(yǎng)方法:保菌管接LB平板，Ξ區(qū)劃線，37Γ培養(yǎng)12h;從平板上挑單菌落 接LB搖管，37 °C，200巧m，培養(yǎng)12h;搖管轉接LB搖瓶，接種量為1 %，37 °C，200巧m，培養(yǎng)4-化。
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