專利名稱：Il－18抑制劑的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及到在幾種病理狀況下治療性使用IL-18抑制劑。更具體說，本發(fā)明涉及治療和/或預防關節(jié)炎、治療和/或預防肝臟疾病，以及治療和/或預防炎癥性腸道病癥(IBD)。
背景技術：
1989年有人描述了從小鼠脾細胞獲得的能誘導γ干擾素(IFN-γ)的一種內毒素誘導的血清活性(MicaIlef等，1996)。此種血清活性不是作為IFN-γ的直接誘導劑，而是與IL-2或有絲分裂原一起作為協(xié)同刺激劑起作用。嘗試從內毒素(誘導)后的小鼠血清純化此種活性，顯示一種看起來均一的50-55KDa的蛋白質。因為其他細胞因子對IFN-γ的產生可能起協(xié)同刺激作用，抗IL-1、IL-4、IL-5、IL-6或TNF的中和抗體不能中和此種血清活性，提示它是一種獨特的因子。1995年，還是這些科學家證實，產生IFN-γ所需的內毒素誘導的協(xié)同刺激物存在于用P.acnas預處理的小鼠肝臟提取液中(Novick等，1992)。在此模型中，肝臟巨噬細胞(枯否細胞)擴增，低劑量的細菌脂多糖(LPS)(在未預處理的小鼠中不致死)引起了這些小鼠死亡。該因子稱為IFN-γ誘導因子(IGIF)，后命名為白介素18(IL-18)，并從1200克重的P.acnas處理小鼠肝臟中，純化至均一成分。采用純化IL-18的氨基酸序列衍生的變性寡核苷酸克隆了小鼠的IL-18cDNA(Novick等，1992)。IL-18是一種157個氨基酸的18-19KDa蛋白質，與數據庫中的任何肽沒有明顯的相似性。已在枯否細胞和活化巨噬細胞中檢測到IL-18和IL-12的信使RNA。比起IL-12，重組IL-18誘導IFN-γ能力更強，看來是通過另一途徑(Novick等，1992)。與內毒素誘導的血清活性相似，IL-18本身不誘導IFN-γ，其主要功能是作為有絲分裂原或IL-2的協(xié)同刺激劑。IL-18增強T細胞增殖看來是通過IL-2依賴途徑，并增加體外Th1細胞因子的產生，以及在與IL-12聯(lián)合增加IFN-γ產生時顯示協(xié)同效應。(Maliszewski等，1990)。
抗小鼠IL-18的中和抗體顯示在P.acnas預處理的小鼠中能防止低劑量LPS引起的死亡。其他學者曾報告在預處理小鼠中IFN-γ作為LPS致死性介質的重要性。例如，中和性抗IFN-γ抗體保護小鼠抵抗了施瓦茨曼樣休克(Fantuzzi等，1998)，IFN-γ受體缺陷性小鼠經半乳糖胺處理后抵抗了LPS誘導的死亡(Bym，1990)。因此沒有預計到抗小鼠IL-18中和性抗體會保護P.acnas預處理小鼠抵御致死性LPS(Novick等，1992)。抗小鼠IL-18治療也保護存活小鼠抵御了嚴重的肝細胞毒性。
在克隆了小鼠的IL-18后，1996年報道了人IL-18的cDNA序列(Okamura等，1995)。重組人IL-18表現出天然IL-18的活性(Okamura等，1995)。重組的人IL-18對人T細胞無直接誘導IFN-γ的活性，而是在產生IFN-γ和其他Th1細胞因子中起協(xié)同刺激作用(Okamura等，1995)。迄今認為IL-18主要作用是Th1細胞因子(IFN-γ、Il-2和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子)產生的協(xié)同刺激劑(Izaki，1978)，也是FAS配體介導的小鼠自然殺傷細胞克隆細胞毒性的協(xié)同刺激劑(Novick等，1989)。
通過從受影響組織克隆IL-18和研究IL-18的基因表達，發(fā)現該細胞因子與自身免疫性疾病密切相關。非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠自發(fā)性產生自身免疫性胰島炎和糖尿病，通過一次注射環(huán)磷酰胺可加速此病和同步化。胰島炎早期在NOD小鼠胰腺中用逆轉錄PCR證實有IL-18 mRNA。環(huán)磷酰胺治療后IL-18 mRNA水平迅速升高，先于IFN-γmRNA的升高，隨之發(fā)生糖尿病。令人感興趣的是，這種動力學(變化)模擬了IL-12-p40mRNA的(變化)，導致個體mRNA水平密切相關。從胰腺RNA克隆了IL-18cDNA，隨后測序，揭示與從枯否細胞和體內預先活化的巨噬細胞克隆的IL-18序列相同。還有，NOD小鼠巨噬細胞對環(huán)磷酰胺的反應伴有IL-18基因表達，而同樣處理的Balb/c小鼠的巨噬細胞則無。因此在自身免疫性NOD小鼠中IL-18表達受到異常調節(jié)，與糖尿病的發(fā)展密切相關(Novick等，1992)。
IL-18通過增強Th1細胞上的Fas配體的功能活性，在免疫調節(jié)或炎癥中起著重要要作用(Conti等，1997)。IL-18也在腎上腺皮質中表達，因而可能是一種分泌性神經免疫調節(jié)劑，在經歷應激后免疫系統(tǒng)的和諧合作中(Chapter，1986)起著重要作用。
體外通過切割前IL-18形成IL-18，其內源性活力看來說明了它是P.acnas和LPS介導死亡中IFN-γ產生的原因。成熟的IL-18由其前體經IL-1β轉化酶(ICE，caspase-1)作用而產生。
IL-18受體由至少兩個成分組成，在配體結合中起協(xié)同作用。在小鼠IL-12激活的T細胞中發(fā)現存在IL-18的高親和力和低親和力位點(Yoshimoto等，1998)，提示其為多條鏈受體復合物。迄今已鑒定出二個受體亞基，二者均屬于IL-1受體家族(Parnet等，1996)。IL-18的信號傳導涉及NF-κB的激活(DiDonato等，1997)。
幾個已知的細胞因子結合蛋白是可溶性細胞因子受體，對應于其各自細胞表面細胞因子受體的胞外配體結合功能域。它們產生于Pre-mRNA的交替剪接(對細胞表面受體常見)，或細胞表面受體的蛋白水解切割。這種可溶性受體先前已有描述，包括IL-6和IFN-γ(Nakamura等，1989)、TNF(Dao等，1996；Engelmann等，1989)、IL-1和IL-4(John，1986)、IFN-α/β(Mizushima和Nagata，1990)等的可溶性受體。一種稱為ostesprotegerin(OPG)的細胞因子結合蛋白，也稱為破骨細胞抑制因子(OCIF)，為TNFR/Fas家族的一個成員，看來是僅作為分泌性蛋白存在的可溶性受體的第一個例子(Anderson，1997；Bollon，1980)。
最近已從人尿中分離到對IL-18有高親和力的可溶性受體，并描述了人和小鼠的cDNA(Novick等，1999，W099/09063)，該蛋白被命名為IL-18結合蛋白(IL-18BP)。
IL-18BP不是已知的IL-18受體之一的胞外結構域，而是一種分泌性天然循環(huán)性蛋白，它屬于分泌性蛋白的一個新家族。該家族還包括對IL-18BP有高度同源性的幾種痘病毒編碼蛋白質(Novick等，1999)。IL-18BP在脾臟中組成性表達，屬于免疫球蛋白超家族，與IL-1的II型受體具有有限的同源性。其基因位于人染色體11q13上，在8.3Kb的基因組序列中沒發(fā)現編碼跨膜區(qū)的外顯子。
在不同的cDNA文庫中，發(fā)現因mRNA剪接產生的4個人和2個小鼠IL-18BP同工型，并已表達、純化并對其結合和中和IL-18生物活性的能力進行了評估(Kim等，2000)。人IL-BP同工型a(IL-18BPa)對IL-18顯示出最大的親和力，結合快，解離慢，解離常數(K(d))為399pM。IL-18BPc具有IL-18BPa的Ig結構域，除29個C未端氨基酸外。IL-18BPc的K(d)小10倍(2.94nM)。然而在超過2摩爾濃度時，IL-18BPa和IL-18BPc可中和＞95％的IL-18。IL-18BPb和IL-18BPd同工型缺乏完整的Ig結構域，并缺乏結合或中和IL-18的能力。小鼠IL-18BPc和IL-18BPd同工型具有相同的Ig結構域，在超過2摩爾濃度時也可中和＞95％的小鼠IL-18。而具有與人IL-18BPa共同C未端基序的小鼠IL-18BPd也能中和人IL-18。分子模型鑒定到IL-18BP的Ig結構域中有一個大的靜電和疏水性混合結合位點，這可解釋其與配體的高親和力結合(Kim等，2000)。
最近有人提出，白介素IL-18參與了慢性炎癥性疾病的病理過程，包括內毒素性休克、肝炎和自身免疫性糖尿病(Kahiwamura和Okamura，1998)。Tsuij等(1999)發(fā)表的實驗顯示脂多糖誘導的急性肝損傷小鼠模型中IL-18水平升高，表明了IL-18在肝損傷產生中可能起作用。然而，迄今尚未闡明該多功能因子IL-18在肝損傷產生中的作用機理。
肝損傷可能有不同原因，例如，可能由于病毒或細菌感染、濫飲酒、免疫性疾病或癌癥。
病毒性肝炎，例如由乙肝病毒和丙肝病毒引起的肝炎是很難對付的疾病，影響到世界上許多人。已知肝炎病毒的數量持續(xù)增加，除乙肝和丙肝病毒外，迄今已發(fā)現至少4個引起病毒相關肝炎的其他病毒，稱為甲、丁、戊、庚肝炎病毒。
酒精性肝病是另一種廣泛分布的與長期消費酒精相關的疾病。免疫性肝炎是一種罕見的自身免疫病，很難對付。肝損傷還包括膽管損傷。原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)是一種自身免疫性肝病，其特征是肝內膽管的破壞。
幾項研究顯示酒精性肝炎、肝硬化、病毒性肝炎和原發(fā)性膽汁性肝硬化這些疾病中，肝損傷與T輔助細胞-1(Th1)應答反應相關。一項研究中，通過將含卵白蛋白的脂質體導向肝臟，隨后過繼性轉移卵白蛋白特異性Th1細胞，建立了一種小鼠新型肝損傷模型。用含卵白蛋白的脂質體和Th1細胞轉移聯(lián)合處理小鼠，導致血清轉氨酶活性增高，與血清IFN-γ水平升高相平行。恰恰相反，卵白蛋白特異性Th2細胞轉移導致血清IL-4水平增高，但不誘導肝損傷?？笽FN-γ抗體和抗腫瘤壞死因子(TNF-α)抗體可阻止肝損傷。這些發(fā)現表明Th1細胞是急性肝損傷中的主要效應細胞(Nishimura和Ohta，1999)。另一系列研究表明，過度表達IFN-γ的小鼠在無任何病原體或其他刺激物時表現出自發(fā)性肝炎(Okamoto等，1998)。
另一項研究表明原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)中有Th1應答反應。PBC是一種自身免疫性肝病，其特征是肝內膽道破壞。一般認為細胞免疫機制(尤其涉及T細胞)導致了這種膽管損傷。最近提出，Th1和Th2應答反應的相對強度是各種自身免疫病病理生理過程的重要因素。在此項研究中通過檢測這兩種T細胞亞組的特導性細胞因子，即Th1細胞的IFN-γ和Th2細胞的IL-4，評價了PBC中細胞亞組的平衡。用非同位素原位雜交和免疫組化方法，計數了18個PBC病人和35個疾病對照(包括慢性活動性丙肝、肝外膽道阻塞)和正常肝臟的肝切片中IFN-γ和IL-4信使RNA(mRNA)陽性細胞數。表達IFN-γ和IL4 mRNA的單個核的細胞聚集在PBC肝臟發(fā)炎的肝門管道中，但罕見于肝外膽道阻塞、酒精性纖維化或正常肝切片中。PBC肝臟中檢測到的IFN-γ和IL-4 mRNA陽性細胞數比對照肝臟明顯高(P＜0.01)。而PBC肝中IFN-γmRNA的表達比IL-4表達更常檢測到，IFN-γmRNA表達水平與肝門炎癥活動程度高度相關。檢測到IFN-γmRNA陽性細胞主要在損傷的膽管周圍，圍繞以淋巴樣聚集體。該資料表明Th1細胞是PBC淋巴樣滲出中較重要的T細胞亞組(Harada等，1997)。
還認為，病毒抗原識別的細胞因子模式，對分辨病毒感染和病毒清除起著深刻影響。一項研究調查了細胞因子向Th2型應答轉移而失平衡是否再慢性乙肝中起作用，用RT-PCR分析了與慢性乙肝相關的外周血單個核細胞的細胞因子譜。乙肝表面抗原(HBsAg)刺激后，在41％、8％、41％和50％的病人中分別檢測到IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的表達。這些細胞因子中，Th1細胞因子IFN-γ的表達與血清AST/ALT(天冬氨酸氨基轉移酶/丙氨酸氨基轉移酶)高水平(肝損傷的典型標志)相關。Th2細胞因子沒有顯示出對肝細胞有保護性作用。結論是HBsAg反應性細胞產生Th1細胞因子IFN-γ與慢性乙肝的肝細胞損傷相關(Lee等，1999)。據報告乙肝病人的肝臟中有高水平的FAS配體及其受體(CD95)(Luo等，1997)，認為FAS配體是導致肝細胞凋亡的重要細胞毒因子之一。
另一項研究鑒定了三十位未治療的慢性肝炎丙肝病毒/RNA(HCV/RNA)陽性病人中，與肝損傷進展相關的因子。用Ishak’s評分法評價了壞死性炎癥性和結構性損傷。通過α平滑肌肌動蛋白(αSMA)免疫組化測定，顯示出激活的肝星形細胞(HSC)，并用形態(tài)測定法定量，用競爭性RT-PCR法評價血漿HCV/RNA。為研究涉及肝損傷進展的免疫應答反應類型，用免疫組化評價IFN-γ陽性細胞(Th1樣應答的表達)并用形態(tài)測定法定量。發(fā)現大多數在靠近小葉壞死性炎癥或襯墊的纖維中隔區(qū)域可檢測到HSC。αSHA和Sirius紅陽性的實質，與壞死性炎癥和結構性評分顯著相關。肝門外周區(qū)域測到的IFN-γ陽性細胞與炎癥滲出相關與結構破壞顯著相關。因此結論是，HSC的激活和肝損傷進展與Th1樣應答相關(Baroui等，1999)。與乙肝情況相似，在丙肝病人的肝臟和血清中發(fā)現了Fas配體及其受體(hiramatsu等，1994；Okazaki等，1996；Lio等，1998)。
已發(fā)現Th1細胞因子和其他Th1標志與酒精性肝炎和肝硬化相關。炎性刺激和脂質過氧化激活了核因子κB(NF-κB)并上調促炎性細胞因子和趨化因子。一項研究中，評價了病理性肝損傷、內毒素血癥、脂質過氧化和NF-κB激活之間的關系及促炎癥和抗炎癥細胞因子之間的失平衡。通過胃內灌注給大鼠(每組5只)喂食乙醇和含飽和脂肪、棕櫚油、玉米油或魚油的飲食。對照大鼠用等卡路里的葡萄糖代替乙醇，進行了病理分析和內毒素測定，包括脂質過氧化，NF-κB和促炎癥細胞因子(TNFα、IL-1β、IFN-γ和IL-12)，C-C趨化因子(調節(jié)活化，由正常T細胞表達和分泌[RANTES]，單核細胞趨化蛋白[MCP]-1、巨噬細胞炎性蛋白[MIP]-1-α)，C-X-C趨化因子(誘導中性粒細胞趨化附著的細胞因子[CINC]、MIP-2、IP-10和上皮中性粒細胞活化蛋白[ENA]-78)及抗炎癥細胞因子(IL-10、IL-4和IL-13)的信使RNA(mRNA)水平。在顯示壞死性炎癥損傷(魚油-乙醇和玉米油-乙醇)的大鼠中觀察到NF-κB激活和促炎細胞因子C-C及C-X-C趨化因子的表達增加。這幾組大鼠還有最高水平的內毒素和脂質過氧化。在顯示炎性肝損傷的組中IL-10和IL-4mRNA水平較低。因此在存在促炎癥刺激時，發(fā)生NF-κB激活并導致Th1促炎癥細胞因子和趨化因子表達增加(Naji等，1999)。酒精性肝病中FAS配體及其受體也升高，再次提示Th1細胞因子參與了酒精性肝炎的自身免疫過程(GaIle等，1995；Taieb等，1998；Fiore等，1999)。
在酒精相關的肝壞死炎癥病理過程中，TNF-γ也出現于共同途徑中，文獻報道酒精性肝病的動物模型中和人酒精性肝病中，肝和血清TNF水平升高，推測這種TNF代謝異常在酒精性肝病的許多代謝性并發(fā)癥和肝損傷中起了作用(Grove等，1997；McClain和Cohen，1999)。例如，一項研究發(fā)現酒精性肝炎患者TNF-α水平(均值26.3ng/L；95％可信限(CI)21.7-30.9)比正常人(6.4ng/L；CI5.4-7.4)高。后來死亡的患者的TNF-α水平(34.7ng/L；CI 27.8-41.6)比存活者(16.6ng/L；CI 14.0-19.2)高。酒精性肝炎患者TNF-α水平與血清膽紅素(r＝0.74；p＝0.0009)和血清肌酸酐(r＝0.81；p＝0.0003)正相關。酒精性肝炎患者的TNF-α水平比非活動性酒精肝硬化患者(11.1ng/L；CI 8.9-13.3)和無肝病嚴重飲酒(6.4ng/L；CI 5.0-7.8)高。腎功能異?；颊逿NF-α水平(14.1ng/L；C1 5.4-22.8)比酒精性肝病患者低。因此結論是酒精性肝炎TNF-α升高在疾病嚴重時最顯著，提示TNF-α在致病過程中起了作用(Bird等，1990)。
TNF介導了內毒素的許多生物作用。最近的研究顯示給予TNF可引起肝損傷，TNF可能介導肝細胞毒素半乳糖胺的致死性。內毒素是最強的TNF誘導劑之一。由于酒精性肝病患者常有內毒素血癥，由于酒精性肝炎的許多臨床表現是已知的TNF的生物作用，故在酒精性肝炎病人中評價其作用。測定了16位酒精性肝炎病人和16位健康志愿者外周血單核細胞(TNF產生的主要來源)的基礎TNF和脂多糖刺激后的TNF釋放，16位酒精性肝炎病人有8人，16位健康志愿者只有2人具有可檢測的自發(fā)性TNF活性(P＜0.05)。脂多糖刺激后，酒精性肝炎病人的平均單核細胞TNF釋放顯著增加，超過健康對照的二倍(25.3±3.7對10.9±2.4單位/ml，p＜0.05)。因此結論是與健康志愿者的單核細胞相比，酒精性肝炎病人的單核細胞具有顯著增加的自發(fā)性TNF和脂多糖刺激的TNF釋放(McClain和Cohen，1989)。
脂多糖(LPS)結合蛋白(LBP)和CD14在內毒素激活細胞中起著關鍵的中介作用。推測腸LPS參與了酒精性肝病中促進肝損傷的病理過程。已證明胃內喂食油和酒精4周的大鼠，其枯否細胞和肝細胞中CD14和LBP水平升高，非骨髓性細胞中的CD14mRNA表達也升高。LBP和CD14表達升高迅速增加了LPS誘導的各種促炎癥細胞因子的表達，并與酒精性肝病的病理性肝損傷相關(Su等1998；Lukkari等1999)。
關節(jié)炎是一種涉及關節(jié)炎癥的疾病。這些關節(jié)呈現腫脹、僵硬、觸痛、發(fā)紅或發(fā)熱，可能伴有體重減輕、發(fā)燒或虛弱癥狀。當這些癥狀持續(xù)2周以上時，原因可能是炎癥性關節(jié)炎，如類風濕性關節(jié)炎。關節(jié)炎癥也可由感染引起，導致膿毒性關節(jié)炎。一種非常常見的關節(jié)炎是退行性關節(jié)病(骨關節(jié)炎)。
關節(jié)炎和相關疾病的常用處方藥是非類固醇抗炎藥(NSAID)，其包括阿斯匹林和阿斯匹林類藥物，它們可減輕引起關節(jié)疼痛的炎癥，關節(jié)僵硬和腫脹。然而NSAID是非特異性藥物，有許多副作用，包括胃出血(華盛頓大學關節(jié)炎矯形外科，FrederickMatsen(Chairman)，www.orthop.washington.edu)。除NSAID外，采用CelebrexTM，一種環(huán)氧合酶(COX類-2)抑制劑來緩解成人骨關節(jié)炎和類風濕關節(jié)炎的體癥和癥狀，它還可治療家族性腺瘤息肉病病人。
WO01/00229描述了用腫瘤壞死因子(TNF)拮抗劑和COX-2抑制劑聯(lián)合治療炎癥。TNF拮抗劑也用于治療關節(jié)炎，如W09103553中所述。
最近研究表明，IL-18在關節(jié)代謝中起著促炎癥作用。Olee等(1999)證明，IL-18由關節(jié)軟骨細胞產生并誘導促炎癥和分解代謝反應。軟骨細胞中IL-1β誘導了IL-18mRNA。軟骨細胞產生IL-18前體并在對IL-1刺激反應中分泌成熟形式的IL-18。研究IL-18對軟骨細胞的作用進一步證明它抑制TGF-β誘導的增殖和增加NO產生。IL-18激發(fā)正常人關節(jié)軟骨細胞中的幾種基因的表達，包括可誘導性NO合成酶、可誘導性環(huán)氧合酶、IL-6和Stromelysin?；虮磉_與相應蛋白質的合成相關。用IL-18處理正常人關節(jié)軟骨增加了葡糖胺聚糖的釋放。這些發(fā)現鑒定IL-18是一種調節(jié)軟骨細胞反應和對軟骨退化有作用的細胞因子。
Saha等(1999)已證明IL-1β轉化酶(ICE)/Caspase-1位于人骨關節(jié)炎組織中，在IL-1β和IL-18成熟中起作用，他研究了人正常軟骨和骨關節(jié)炎(OA)軟骨及滑液中Caspase-1的表達和產生，定量測定了骨關節(jié)炎軟骨細胞中的ICE水平，檢測了ICE、IL-1β和IL-18局部分布之間的關系以及軟骨細胞的凋亡。該研究所做的實驗表明，人滑膜和軟骨均表達和合成ICE，OA組織中陽性染色細胞數明顯高于正常組織。關節(jié)軟骨的淺表層和上中層優(yōu)先產生ICE。OA軟骨外植體和軟骨細胞產生成熟的IL-1β，用特異性ICE抑制劑處理完全阻抑了軟骨細胞，ICE抑制劑還明顯減少IL-18陽性細胞的數量?；钚訧L-1β和ICE之間的這種關系提示，ICE可能通過激活此促炎癥細胞因子而促進OA的發(fā)展，IL-18可能在軟骨病理學中起作用。
Gracie等(1999)提出，IL-18在類風濕關節(jié)炎中有促炎癥作用。他們檢測到類風濕關節(jié)炎滑膜組織中的IL-18mRNA和蛋白水平明顯高于骨關節(jié)炎對照。還證明體外IL-12或IL-15與IL-18聯(lián)合誘導了滑膜組織產生IFN-γ。給予用膠原/弗氏不完全佐劑免疫的小鼠IL-18，加速了其侵蝕性炎癥關節(jié)炎的發(fā)展，提示IL-18在體內可能是促炎癥的。
然而迄今除了化學藥物外，采用可溶性受體或單克隆抗體只阻斷TNFα和IL-1β，已顯示能降低小鼠膠原誘導的關節(jié)炎(CIA，是類風濕關節(jié)炎的一種小鼠模型)(Williams等，1994)，從而提示可用作類風濕關節(jié)炎的活療藥物。
術語“慢性或特發(fā)性炎癥性腸病”包括至少兩種狀況節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結腸炎，二者都是腸胃道疾病。節(jié)段性回腸炎最常影響小腸，當其還涉及結腸時與潰瘍性結腸炎的鑒別診斷可能是一個問題。
節(jié)段性回腸炎的慢性炎癥和潰瘍通常以小腸梗阻或腹痛開始，這可能類似于急性闌尾炎，其他主訴可能是關于其并發(fā)癥的。該病進程緩慢，盡管治療也可能惡化和緩解，通常發(fā)生于青壯年，約一半病例年齡在20-30歲之間，90％在10-40歲之間，男性略多于女性。
顯微鏡檢查反映了該病的總體外觀，炎癥涉及部位是不連續(xù)的，呈局灶性或斑塊狀。主要在粘膜和粘膜下層見到淋巴細胞和漿細胞集聚，但常影響全層(穿透性炎癥)。節(jié)段性回腸炎的典型顯微鏡特征是存在顆粒細胞，圍繞著淋巴細胞套。特發(fā)性炎癥性腸病的發(fā)生率顯示因地理而有相當差異。北歐和美國這些病的發(fā)病率比南歐、非洲、南美和亞洲國家高得多，雖然南歐部分地區(qū)和日本都市化和財富的增加導致較高的發(fā)病率(General and Systematic Pathology，Churchill Livingstone第三版，2000，JCEUnderwood編)。
節(jié)段性回腸炎臨床上有二種主要類型，第一種病人在發(fā)作后三年內病情持續(xù)緩解，第二種病人病情持續(xù)三年以上。
不論病因學如何，有證據表明此病具有持續(xù)和不恰當的T細胞和巨噬細胞激活，伴有促炎癥細胞因子，特別是白介素1，2，6和8，IFN-γ和TNF-α產生的增高。節(jié)段性回腸炎的特征是伴有纖維化的持續(xù)性(慢性)炎癥。成纖維細胞增殖和膠原沉積過程可能由轉化生長因子β所介導，該因子具有明確的抗炎癥作用，即成纖維細胞募集、基質合成和下調炎性細胞的下調，但可能牽涉到許多其他介質。
潰瘍性結腸炎是大腸的一種非特異性炎癥，通常起始于直腸，以不同程度向鄰近結腸延伸。不象節(jié)段性回腸炎，潰瘍性結腸炎局限于大腸。
越來越多的證據表明，潰瘍性結腸炎是一種改變的自身免疫性反應，但粘膜損傷也可能是T細胞不恰當激活和巨噬細胞、中性粒細胞的細胞因子、蛋白酶和反應性氧代謝物造成的間接損傷所致。對結腸上皮造成損傷的后一種機制稱為“無辜傍觀者”損傷。有利于自身免疫的證據是存在自身反應性T淋巴細胞和針對結腸上皮細胞和內皮細胞的自身抗體及抗中性粒細胞胞漿性自身抗體(ANCA)。然而，不應考慮潰瘍性結腸炎是自身免疫病，其粘膜損傷是對自身抗原的免疫反應的直接結果(Generaland Systematic Pathology，Churchill Livingstone第三版，2000，JCE Underwood編)。
關于節(jié)段性回腸炎的治療，大多數人首先用含mesalamine(一種有助于控制炎癥的物質)治療。不能從其獲益或不能耐受此藥的病人可用其他含mesalamine的，通常稱為5-ASA的藥。Mesalamine制劑的可能副作用包括惡心、嘔吐、胃灼熱、腹瀉和頭痛。
某些病人服用皮質類固醇以控制炎癥，這些藥對急性節(jié)段性回腸炎最有效，但可引起嚴重副作用，包括對感染的易感性增大。也可采用抑制免疫系統(tǒng)的藥物來治療此病，最常用處方藥是6-巰基嘌呤及相關藥物硫唑嘌呤。免疫抑制劑通過阻斷產生炎癥的免疫反應而起作用。這些藥物可能引起副作用，如惡心、嘔吐和腹瀉，并可降低病人對感染的抵抗力。當合用皮質類固醇和免疫抑制藥治療病人時，可減少皮質類固醇的劑量。某些研究提示免疫抑制藥可增強皮質類固醇的效果。
美國食品和藥物管理局批準了藥物infliximab用于治療對標準療法(mesalamine，皮質類固醇，免疫抑制劑)無反應的中度-重度節(jié)段性回腸炎和治療開放性引流瘺。首次批準專用于節(jié)段性回腸炎治療的infliximab是一種抗TNF單克隆抗體?？筎NF單抗在TNF到達小腸前從血流中去除TNF從而預防了炎癥。
狹窄、瘺管或外科手術引起的小腸中細菌過度生長可用抗生素治療。對此常見問題，醫(yī)生可處方以下抗菌素之一種或多種氨芐青霉素、磺胺、頭孢菌素、四環(huán)素或滅滴靈。
炎癥消退時腹瀉和痙攣性腹痛常緩解，但還可能需要其他藥物，可采用幾種抗腹瀉藥，包括diphenoxylate、loperamide和可待因。因腹瀉而脫水的病人常輸液和電解質治療。故仍然需要有效的療法來治療和/或預防炎癥性腸病，特別是節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結腸炎，該療法應減少副作用或甚至無副作用為理想。
組織學和免疫學觀察表明，細胞介導免疫力和T細胞激活是節(jié)段性回腸炎(CD)的關鍵特征。對人和實驗動物模型的研究提示，在此病中，局部免疫應答反應傾向于以Th1型為主(Desreumaux等，1997)，局部釋放的細胞因子，如IFN-γ、IL-1β和TNF-α導致促進和擴大炎癥反應(Reimund等，1996)。
細胞因子IL-18在Th1介導的免疫應答反應中，與細胞因子IL-12合作，通過刺激IFN-γ分泌、增強自然殺傷細胞的細胞毒性和刺激Th1細胞分化，而起著重要作用(Uschito等，1996)。
IL-18與IL-12、IL-2、抗原、有絲分裂原，可能還有其他因子一起作用，誘導產生IFN-γ。IL-18還增強GM-CSF和IL-2的產生，促進抗CD3誘導的T細胞增殖和加強自然殺傷細胞的Fas介導的殺傷。成熟的IL-18由其前體經IL-1β轉化酶(ICEcaspase-1)而產生。IL-18受體由至少二個組分組成，在配體結合中起協(xié)同作用。在小鼠受IL-12激活的T細胞中發(fā)現有IL-18的高親和力和低親和力結合位點(Okamoto等，1998)提出其為多條鏈的受體復合物。迄今已鑒定到二個受體亞基，二者均屬于IL-1受體家族(Okamoto等，1999)。IL-18的信號傳導涉及NF-κB的激活(Matsumoto等，1997)。
最近有人提出IL-18涉及炎癥性腸病(Pizarro等，1999；Monteleone等，1999)。
Pizarro等(1999)特征分析了節(jié)段性回腸炎病人結腸標本中IL-18的表達和定位并分離了粘膜細胞群。采用半定量RT-PCR法，與潰瘍性結腸炎(UC)和非炎癥對照病人相比，發(fā)現CD病人新鮮分離的小腸上皮細胞和固有層單個核細胞中IL-18mRNA轉錄增加。與固有層單個核細胞相比，小腸上皮細胞中的IL-18mRNA轉錄更加豐富。免疫組化分析手術切除的結腸組織將IL-18定位于固有層單個核細胞(尤其是巨噬細胞和樹突狀細胞)以及小腸上皮細胞。Western blot分析揭示，與重組和成熟的人IL-18蛋白相符的18.3KDa條帶，主要見于CD而非UC的腸粘膜活檢標本中。在CD和UC二者活檢標本的非炎癥區(qū)域中檢測到與無活性IL-18前體相符的第二條24KDa條帶。此條帶在非炎癥對照中是唯一的形式。
Monteleone等(1999)證實了這些發(fā)現，采用半定量RT-PCR和Western blot分析檢測了12個CD、9個UC病人和15個非炎癥性腸病對照者的整個腸粘膜組織和固有層單個核細胞中的IL-18。發(fā)現所有測試標本中均有IL-18轉錄，然而與UC和對照相比，在CD的粘膜和固有層單個核細胞樣本中均檢測到IL-18mRNA積累增高。CD中取自炎癥區(qū)域的粘膜標本中IL-18轉錄更豐富。與成熟IL-18相符的18KDa條帶主要見于CD粘膜標本中。非炎癥性腸病(non-IBD)對照粘膜標本中IL-18以24KDa多肽存在。與此相一致，CD或UC標本中表達了活性IL-1β轉化酶(ICE)的亞基(p20)，而non-IBD對照的結腸粘膜中，只合成ICE的前體(p45)。
Dayer(1999)綜述了IL-18的不同和部分相矛盾的功能。總結為，IL-18是一種多功效的白介素，具有炎癥增強和減弱功能。一方面它能增強促炎性細胞因子如TNFα的產生從而促進炎癥。另一方面，它誘導產生NO(一種Caspase-1的抑制物)而阻止IL-1β和IL-18的成熟，可能減弱炎癥。IL-18的這種雙向作用引起了對IL-18抑制劑在炎癥性疾病中效果的疑問。此外，由于在炎癥調節(jié)中存在多種不同細胞因子和趨化因子的相互作用，通過僅阻斷其中之一來治療或預防炎性疾病，有無良效是不可預測的。
發(fā)明概述本發(fā)明基于IL-18抑制劑對治療和/或預防(幾種)不同疾病有效的發(fā)現。
本發(fā)明的第一個目的是提供一種新方法來治療和/或預防肝損傷。因此本發(fā)明涉及使用IL-18抑制劑來制造治療和/或預防急性和慢性肝損傷的藥物。更具體說，本發(fā)明涉及治療和/或預防酒精性肝炎，病毒性肝炎，免疫性肝炎，暴發(fā)性肝炎，肝硬化和原發(fā)性膽汁性肝硬化。
本發(fā)明第二個目的是提供一種新方法來治療和/或預防關節(jié)炎。因此本發(fā)明涉及使用IL-18抑制劑來制備治療和/或預防關節(jié)炎的藥物。IL-18抑制劑的有益效果包括降低此病的嚴重性和防止此病傳播。這是意外的發(fā)現，因為從以上描述的本領域現狀不可能得出結論阻斷參與關節(jié)炎的一種特定因子，即白介素IL-18，會導致關節(jié)炎緩解或者甚至治愈患病的關節(jié)。
還發(fā)現在小鼠關節(jié)炎模型中，給予IL-18抑制劑顯著減輕軟骨的侵蝕。故本明還涉及使用IL-18抑制劑來制造治療和/或預防軟骨破壞的藥物。
本發(fā)明第三個目的是提供一種新方法來治療和/或預防炎癥性腸病(IBD)，特別是節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結腸炎。因此本發(fā)明還涉及使用IL-18抑制劑來制造治療和/或預防IBD的藥物。根據本發(fā)明，發(fā)現節(jié)段性回腸炎病人活檢標本中粘膜炎癥區(qū)域內IL-18BPmRNA和蛋白的濃度增高。而且在小鼠炎癥性腸病模型中已證明兩種不同的IL-18抑制劑保護了動物避免患病。
按照本發(fā)明，還考慮聯(lián)合應用IL-18抑制劑和/或干擾素和/或TNF拮抗劑和/或COX-2抑制劑。為了應用基因療法遞送IL-18抑制劑給患病組織或細胞，本發(fā)明另一內容涉及采用含IL-18抑制劑編碼序列的表達載體來治療和/或預防疾病。本發(fā)明還涉及應用內源性基因激活IL-18抑制劑和應用基因工程改造的細胞表達IL-18抑制劑來治療和/或預防肝損傷，關節(jié)炎和IBD。
附圖簡述
圖1 顯示小鼠注射LPS 1小時前注射不同劑量重組IL-18BP(0；0.04；0.4；4mg/kg)后血清IFN-γ水平(pg/ml)。血樣品采集自LPS注射后5小時，用ELISA分析其循環(huán)IFN-γ。
圖2 顯示丙氨酸氨基轉移酶(ALT)的血清水平。注射LPS之前給P.acnas致敏小鼠注射遞增劑量的重組人IL-18BP(0；0.04；0.4；4mg/kg)。注射LPS后5小時采血樣測定ALT血清水平。SF＝Sigma-Frankel1SF單位的AST/ALT在25pH7.5時將形成4.82×10-4μmol谷氨酸/分。
圖3 顯示注射LPS后小鼠存活時間。注射LPS前20分鐘給P.acnas致敏小鼠注射不同劑量的重組人IL-18BP(0；0.04；0.4；4mg/kg)。4mg/kg；0.4；0.04；不注射IL-18BP(只注射LPS)。
圖4 顯示注射LPS前20分鐘，給P.acnas致敏小鼠注射不同量的IL-18BP(0；0.04；0.4；4mg/kg)，5小時后測得的IFN-γ血清水平。
圖5 顯示注射大腸桿菌(圖5A)或傷寒桿菌(圖5B)LPS 40mg/ml(致死劑量)前30分鐘注射多克隆IL-18抗血清或正常兔血清(NDS＝對照)的小鼠的成活情況。注射IL-18抗血清小鼠；注射NDS小鼠。X軸顯示LPS攻擊后天數。*P＜0.05。
圖6 顯示按下述方法治療的每組5只小鼠的均值+標準差。小鼠腹腔內注射(ip)抗IL-18抗血清、可溶性TNF-α受體(TNFsRp55)或運載體(鹽水)后，立即靜脈給予伴刀豆球蛋白A(ConA，圖6A)或PEA(綠膿桿菌，圖6B)。**p＜0.01；***p＜0.001，對比ConA或單用PEA；#p＜0.01，對比TNFsRp55或抗IL-18階乘的ANOVA。
圖7 顯示關節(jié)炎小鼠模型中IL-18BP對臨床評分的影響。7A顯示每日給予(ip)小鼠不同量IL-18BP或IFN-β或運載體(NaCl)后測得的臨床評分。符號10000IU IFN-β，10mg/kg IL-βBP，3mg/kg IL-18BP，1mg/kg IL-18BP，0.5mg/kg IL-18BP，0.25mg/kg IL-18BP，NaCl。X軸顯示治療天數，Y顯示臨床評分平均值。用Mann Whitney檢驗作統(tǒng)計學分析。圖7B顯示從圖7產生的AUC(曲線下區(qū)域)。n＝動物數目。
圖8 顯示IL-18BP對腳爪腫脹的影響。圖8A顯示測量經不同量IL-18BP治療的各動物患病后爪的厚度(腫脹)所得結果。Y軸顯示從治療開始時爪厚的毫米變化。符號意義同圖7。圖8B顯示從圖8A產生的AUC。n＝動物數目。
圖9 顯示急性關節(jié)炎，即此病擴散到其他關節(jié)時，患病后爪數目分析。符號NaCl(對照)；10mg/kg IL-18BP；3m g/kg IL-18BP；1mg/kg IL-18BP；0.5mg/kg IL-18BP；0.25mg/kg IL-18BP。
圖10顯示患病關節(jié)軟骨的侵蝕評分。
圖11顯示小鼠關節(jié)的組織病理學。如下述實施例10所述，實驗結束時切下首先發(fā)生關節(jié)炎的爪子，固定。圖11A正常小鼠關節(jié)，圖11B關節(jié)炎小鼠關節(jié)，圖11C用rhIL-18BP治療小鼠的關節(jié)。
圖12顯示分別用3mg/kg IL-18BP或鹽水(載體)治療的小鼠的IgGl(空心直方圖)或IgG2a(影線直方圖)同種型抗II型膠原抗體的水平。于患病4天(D4)或8天(D8)時測定。
圖13顯示分別用1、3或10mg/kg IL-18BP，10000IU IFN-β，正常小鼠血清(NMS)或鹽水(NaCl)治療動物的IL-6水平(pg/ml)。
圖14顯示活動性節(jié)段性回腸炎、潰瘍性結腸炎患者或正常健康人的腸活檢標本中hIL-18BP的表達和IL-18 mRNA轉錄。顯示IL-18BP，IL-18和管家基因(β-肌動蛋白)的代表性RT-PCR產物(圖14A)。用Kodak數碼成像軟件進行了溴乙錠染色條帶的相對定量測定，報告為靶基因對β-肌動蛋白的比例。靶基因在圖14B中為IL-18，在圖14C中為IL-18BP。
圖15顯示人臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)的hIL-18BP mRNA轉錄和蛋白質表達，以及人單核細胞系THP1的蛋白質表達。從未處理的內皮細胞和用IL-1β、TNFα、IFNγ刺激的內皮細胞分離RNA。陽性對照節(jié)段性回腸炎病人的結腸；陰性對照無cDNA。以半定量RT-PCR分析了IL-18BP和IL-18表達(圖15A)。用ELISA分析未處理(培養(yǎng)液)和以IL-1β、TNFα、IFNγ激活24小時的HUVEC細胞(圖15B)或THP1(圖15C)細胞的培養(yǎng)上清液。
圖16顯示IBD小鼠模型腹腔內給予鹽水(NaCl)或IL-18BP(8mg/kg)后1-10天之間體重的發(fā)展。體重變化以自第一天體重變化的百分比表示，顯示兩組(每組8只小鼠)的平均值和標準差。
圖17顯示IL-18BP治療和未治療的IBD小鼠的結腸尾側淋巴結和脾臟的分析結果。圖17A顯示6厘米長結腸的重量。圖17B顯示尾側淋巴結中細胞總數。圖17C顯示脾中CD4+/CD69+染色陽性細胞的百分數。數據為平均值和標準差。*表示有顯著性差異。
圖18顯示用CD3/CD28刺激后48小時尾側淋巴結細胞(圖18A和C)和脾細胞(圖18B和D)上清液中產生的IFNγ量(18A和B)和TNFα量(圖18C和D)。以均值和標準差表示。
圖19顯示結腸勻漿中的TNFα(圖19A)和IFNγ(圖19B)含量。數據按結腸重量校正。以均值和標準差表示。*表示有顯著性差異。
發(fā)明詳述本發(fā)明基于IL-18抑制劑在(幾種)不同疾病中有良好效果的發(fā)現。
本發(fā)明上下文中的術語“IL-18抑制劑”，指能以減弱、降低或部分地、大量地或完全地防止或阻斷IL-18產生和/或作用的方式來調節(jié)IL-18的產生和/或作用的任何分子。術語“IL-18抑制劑”包括IL-18產生的抑制劑以及IL-18作用的抑制劑。
產生的抑制劑可以是負面影響IL-18合成、加工或成熟的任何分子。本發(fā)明考慮的抑制劑可以是IL-18基因表達的抑制劑、降低或阻止IL-18mRNA轉錄或導致該mRNA降解的反義mRNA，損害正確折疊或部分或基本上阻止IL-18分泌的蛋白質，一旦IL-18合成能降解其的蛋白酶，切割IL-18前體產生成熟IL-18的蛋白酶的抑制劑例如，caspase-1抑制劑等。
IL-18作用抑制劑可以是IL-18拮抗劑。例如，可以是以足夠親和力和特異性結合或隔離IL-18分子本身而部分或基本上中和IL-18或IL-18結合位點(負責IL-18與其配體結合的位點，例如，其受體)的拮抗劑。拮抗劑也可抑制在IL-18/受體結合時細胞中所激活的IL-18信號傳遞通路。
IL-18作用抑制也可以是可溶性IL-18受體或模擬受體的分子，或阻斷IL-18受體的物質，或IL-18抗體，如多克隆抗體或單克隆抗體，或阻止IL-18與其靶結合的其它物質或分子，從而減弱或阻止IL-18介導的細胞內外反應的觸發(fā)。
依據本發(fā)明第一方面內容，IL-18抑制劑用于制造治療和/或預防肝損傷的藥物。較佳的是，本發(fā)明使用IL-18抑制劑來制造治療和/或預防急慢性肝病的藥物，更佳的是防治酒精性肝炎、病毒性肝炎、免疫性肝炎、暴發(fā)性肝炎、肝硬化和原發(fā)性膽汁性肝硬化的藥物。
本文中的術語肝損傷或肝病包括各種不同病理狀況。本發(fā)明所考慮到的幾種狀況已在上述發(fā)明背景中有詳細解釋。其他本發(fā)明可治療和/或預防的肝病包括，例如，熱原質性肝膿腫，也稱為細菌性肝膿腫，是一種肝中產膿空洞。肝膿腫的病因有多種，可以由腹部感染(如闌尾炎、憩室炎或腸穿孔)、血液感染、膽道(肝分泌)感染或肝撞傷受感染發(fā)展而來。引起肝膿腫的最常見微生物是大腸肝菌、Proteus vularis和產氣腸桿菌，發(fā)病率1/萬。
酒精性肝病可用本發(fā)明IL-18抑制劑治療和/或預防。該病包括濫飲酒所致的急慢性肝臟炎癥。酒精性肝炎通常發(fā)生在多年過度飲酒之后。飲酒時間越長，飲酒量越大，產生肝病的可能性越大，因酒精缺乏卡路里、食欲減退和營養(yǎng)吸收障礙(小腸吸收營養(yǎng)不足)而發(fā)生營養(yǎng)不良，營養(yǎng)不良引起肝病。酒精對肝臟的毒性，個體對酒精誘導肝病的易感性和遺傳因素也對產生酒精性肝病有作用。
根據本發(fā)明，可用IL-18治療和/或預防肝硬化。肝硬化是一種慢性肝病，引起肝組織損傷，肝臟疤痕化(纖維化，結節(jié)性再生)，肝功能進行性減退，腹水過多，出血性疾病(凝血病)，血管壓力增高(門脈高壓)和腦功能障礙(肝性腦病)。受損和疤痕化的肝臟不能充分排出血中的廢物(毒素)，瘢痕組織的形成導致腸脾到肝臟的靜脈壓力增高(門脈高壓)。過度飲酒是肝硬化的主要原因，其他病因包括感染(如肝炎)，膽汁引流系統(tǒng)疾病和缺陷(如膽道狹窄或堵塞)，囊性纖維化和鐵銅吸收增加。
肝硬化類型取決于病因。肝硬化并發(fā)病可能嚴重。肝硬化是美國第九位死亡原因，可產生神經方面問題(如肝性腦病)，體蛋白減少、鈉增加和肝血管中壓力增加導致腹腔液體(腹水)增加。門脈高壓可引起食道血管壓力、體積和充盈度增加(食道血管曲張)。可發(fā)生出血和凝血問題。血管壓力升高和血凝問題可能增加發(fā)生威脅生命的嚴重出血的可能性。
本發(fā)明術語“肝損傷”包括的另一疾病是自身免疫性肝炎，此病是由于免疫系統(tǒng)相互反應所引起的肝臟炎癥。自身免疫性肝炎是一種慢性活動性肝炎。細胞免疫反應可能是其病因。慢性活動性肝炎病人血中可發(fā)現各種循環(huán)性自身抗體。其他自身免疫性疾病也可伴有慢性活動性肝炎或可發(fā)生在慢性活動性肝炎病人的親屬中。這些疾病是甲狀腺炎、糖尿病、潰瘍性結腸炎、抗球蛋白試驗陽性出血性貧血，增殖性腎小球腎炎和Sjogren綜合癥。危險因素可包括這些疾病，或者危險因素與慢性活動性肝炎相關。發(fā)病率為4/萬。
膽道閉鎖是“肝損傷”范圍內的另一種疾病，它是由于出身前胎內膽道不能正常發(fā)育所致的堵塞。膽道閉鎖由肝內外膽道發(fā)育異常和不足所引起。膽道系統(tǒng)的目的是去除肝中廢物和將脂肪消化所需的膽鹽運送到小腸。此病膽汁由肝流向膽囊受阻，可導致肝損傷和肝硬化，若不治療最終致死。
按照本發(fā)明，IL-18抑制劑也用于制造治療和/或預防慢性活動性肝炎的藥物。慢性活動性肝炎又稱為慢性進行性肝炎。它是一種肝臟的持續(xù)性炎癥，造成肝細胞損傷。慢性活動性肝炎的病因包括病毒感染、藥物反應/攝食、代謝障礙或自身免疫疾病，也可無明顯原因。此病的特征是肝細胞壞死或死亡、活動性炎癥和導致肝衰竭、硬化和死亡的纖維化，發(fā)病率1/萬。危險因素是自身免疫病、原先有的丙肝感染或甲肝或乙肝抗原陽性6個月以上。
慢性持續(xù)性肝炎是一種輕度非進行性肝臟炎癥，也包括在本發(fā)明的術語“肝損傷”內。
按照本發(fā)明，IL-18抑制劑也用于制造治療和/或預防原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)的藥物。PBS是一種肝中膽汁流動受阻而致的炎癥，導致肝細胞損傷。由未明病因引起肝內膽管發(fā)炎。此病最常影響中年婦女，癥狀發(fā)作是逐步的，皮膚搔癢為最初癥狀，肝中膽管發(fā)生炎癥，最終發(fā)生肝硬化。此病與自身免疫疾病有關，發(fā)病率8/10萬。本發(fā)明考慮也可用IL-18抑制劑來治療急性肝中毒，如大量服用撲熱息痛所引起的急性肝中毒，這是偶然事故或有意而為。
如以下實施例所述，本發(fā)明的發(fā)明者驚奇地發(fā)現IL-18抑制劑在預防和治療暴發(fā)型肝炎(急性肝炎)中特別有效。因此本發(fā)明宜涉及預防和治療暴發(fā)型肝炎。
本發(fā)明第二方面的內容是用IL-18抑制劑來制造治療和/或預防關節(jié)炎的藥物。
本文所用術語“關節(jié)炎”包括所有不同類型的關節(jié)炎和關節(jié)疾病，急慢性關節(jié)炎，見華盛頓大學矯形科關于關節(jié)炎主頁中的例子(www.orthop.washington.edu)。關節(jié)病的例子是關節(jié)強硬性脊椎炎，背痛，腕沉積綜合征，Ehlers-Danlos綜合征，痛風，青少年關節(jié)炎，盤狀紅斑，瘡，肌炎，骨質疏松癥，成骨不全，多關節(jié)炎，多肌炎，牛皮癬性關節(jié)炎，Reiter綜合征，硬皮病，腸病關節(jié)炎，Behcets病，兒童關節(jié)炎，退變性關節(jié)病，纖維肌痛癥，感染性關節(jié)炎，萊姆病，Marfan綜合癥，骨關節(jié)炎，骨壞死，Pagets病，風濕性多肌痛癥，假痛風，交感神經反射性營養(yǎng)不良，類風濕性關節(jié)炎，風濕病，Sjogren綜合征，家族性腺瘤息肉病等。
較佳地按照本發(fā)明，提供IL-18抑制劑來治療和/或預防炎癥性關節(jié)炎。炎癥性關節(jié)炎分類為慢性關節(jié)炎，這是按其連續(xù)性，持久性或復發(fā)病程而劃分。
本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，炎癥性關節(jié)炎是類風濕性關節(jié)炎(RA)。RA引起關節(jié)襯膜(滑膜，一層細胞層上皮)和/或內部器官炎癥。此病傾向持續(xù)多年，通常影響全身很多不同關節(jié)，最終引起軟骨、骨、肌腱和韌帶損傷。RA可影響頸、肩、肘、髖、腕、手、膝、踝和足關節(jié)。例如，許多RA病例對稱型的關節(jié)發(fā)炎。
RA在美國1％人群中流行，遍布所有種族和年齡。全世界都有此病。RA病人中，婦女多于男子，為3∶1。
如以下實施例所示，已證明IL-18抑制劑對軟骨侵蝕顯示出非常好的效果。因此本發(fā)明還涉及使用IL-18抑制劑來制造治療和/或預防軟骨破壞的藥物，即用IL-18抑制劑作為軟骨保護劑。IL-18抑制劑可用于軟骨破壞或發(fā)生侵蝕的任何情況。軟骨破壞是關節(jié)軟骨結構完整性的進行性衰退，它發(fā)生于影響關節(jié)軟骨的疾病中，如類風濕性關節(jié)炎、青少年性類風炎或骨關節(jié)炎，也見于感染性滑膜炎。
本發(fā)明第三方面涉及使用IL-18抑制劑來制造治療和/或預防炎癥性腸病的藥物。其根據是發(fā)現CD病人發(fā)炎的粘膜中IL-18上調。另一根據是發(fā)現小鼠結腸炎模型中給予不同的IL-18抑制劑具有保護作用。文獻中已描述了CD病人患病粘膜中IL-18上調(Monteleone等，1999；Pizarro等，1999)。
本發(fā)明在證明腸粘膜發(fā)炎區(qū)域中存在高含量IL-18BP后，甚至更令人驚訝的是發(fā)現全身給予IL-18BP對動物模型結腸炎的發(fā)展和癥狀有顯著的良好效果。雖然CD病人腸中IL-18BP已內源性上調，如以下實施例所證明，但機體所能夠產生的IL-18BP量似乎不足以戰(zhàn)勝疾病。
本發(fā)明所述的炎癥性腸病，優(yōu)選節(jié)段性回腸炎或潰瘍性結腸炎。
在本發(fā)明一優(yōu)選實施例中，IL-18抑制劑選自caspase-1(ICE)抑制劑?？笽L-18抗體、抗IL-18受體亞基之一的抗體，IL-18信號傳導通路抑制劑，能與IL-18競爭和阻斷IL-18受體的拮抗劑，以及IL-18結合蛋白質，其同工型、突變型蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性片段或具有相同活性的循環(huán)性變換衍生物。
本文所用術語“IL-18結合蛋白”與“IL-18BP”同義。其包括WO99/09063中或Novick等人1999所述IL-18結合蛋白，包括Kim等2000所述的IL-18結合蛋白的剪接變體和/或同工型。按照本發(fā)明，特別可用人IL-18BP的同工型a和c，按照本發(fā)明有用的蛋白質可以是糖基化或非糖基化的，它們可衍生于自然來源如尿，或較好用重組方法生產。重組表達可在原核表達系統(tǒng)如大腸桿菌中、或在真核(優(yōu)選哺乳動物)表達系統(tǒng)中進行。
本文所用術語“突變型蛋白”指IL-18BP的同類物，或病毒性IL-18BP的同類物，此同類物中天然IL-18BP或病毒性IL-18BP的一個或多個氨基酸殘基被不同氨基酸殘基所置換，或缺失，或IL-18BP、病毒性IL-18BP的天然序列中加入了一個或多個氨基酸殘基，但所產生的產物的活性與野生型IL-18BP或病毒性IL-18BP相比無顯著改變。采用已知的合成和/或定點誘變技術，或任何適合的其他已知技術制備這些突變型蛋白。
這類突變型蛋白宜具有與IL-18BP充分重復或與病毒性IL-18BP充分重復的氨基酸序列，從而具有與IL-18BP基本上相似的活性。IL-18BP的活性之一是其能結合IL-18。只要該突變型蛋白具有與IL-18實質性結合的活性。它就可用于純化IL-18，如借助親和層析，從而認為其具有與IL-18BP基本上相似的活性。因此，可借助常規(guī)實驗來確定某個突變型蛋白是否具有與IL-18BP基本相同的活性，包括對該突變型蛋白進行簡單的夾心競爭試驗來確定它是否能結合適當標記的IL-18，如放射免疫試驗或ELISA試驗。
本發(fā)明所用的IL-18BP多肽突變型蛋白或病毒性IL-18BP突變型蛋白，或它們的編碼核酸，包括一組有限的基本上相應的序列，如置換肽或多肽，本領域普通技術人員可根據本文所述的技術和指導用常規(guī)方法獲得，而無須過多實驗。
本發(fā)明突變型蛋白中的優(yōu)選變化是所謂的“保守性”置換。IL-18BP多肽或蛋白或病毒性IL-18BP的保守性氨基酸置換可包括具有足夠相似的理化特性的一組內的同義氨基酸，該組成員之間的置換將保存該分子的生物功能(Grantham，1974)。已清楚在上述序列中還可進行氨基酸的插入和缺失而不改變其功能，特別是如果這種插入或缺失只涉及少數氨基酸時，如30個以下，較佳為10個以下。不要去除或置換對功能性構象起關鍵作用的氨基酸，如半胱氨酸殘基。這類缺失和/或插入產生的蛋白質和突變型蛋白屬于本發(fā)明范圍。
較佳的同義氨基酸組是表I所示的那些組，更佳的同義氨基酸組是表II所示的那些組。最佳的同義氨基酸組是表III所示的那些組。
表1 較佳的同義氨基酸分組
表2 更佳的同義氨基酸組
表3 最佳的同義氨基酸組
在蛋白質中產生氨基酸置換的實施例可用來獲得IL-18BP多肽或蛋白質的突變型蛋白，或病毒性IL-18BP的突變型蛋白，任何已知的方法步驟都可用于本發(fā)明，如授予Mark等人的美國專利RE33653，4959314，4588585和4737462；授予Koths等人的5116943；授予Namen等人的4965195；授予Chong等人的4879111和授予Lee等人的5017691專利中提出的方法，以及美國專利No.4904584(Shaw等)中提出的賴氨酸置換蛋白。
術語“融合蛋白”指與另一蛋白質(如在體液中滯留時間延長的蛋白質)融合的含IL-18BP或病毒性IL-18BP或其突變蛋白或片段的多肽。故IL-18BP或病毒性IL-18BP可與另一蛋白質、多肽等如免疫球蛋白或其片段融合。
本文“功能性衍生物”，包括用本領域已知方法以殘基側鏈或N端或C端基團存在的功能基團制備的IL-18BP或病毒性IL-18BP的衍生物及其突變蛋白和融合蛋白。只要它們仍然在藥學上可接受，即它們不會破壞與IL-18BP或病毒性IL-18BP活性基本上相似的蛋白質活性，并且不會使含它們的組合物具有毒性，均包括在本發(fā)明中。
例如，這些衍生物可以包括聚乙二醇側鏈，其可遮蔽抗原位點并延長IL-18BP或病毒性IL-18BP在體液中的滯留。其他衍生物包括羧基的脂肪酯，羧基與氨或伯胺或腫胺反應產生的酰胺、氨基酸殘基的游離氨基與?；鶊F(如烷酰基或碳環(huán)芳?；?形成的N-?；苌?、或游離羥基(如絲氨?；蛱K氨酰殘基的游離羥基)與酰基基團形成的O-?；苌?。
本發(fā)明的IL-18BP或病毒性IL-18BP、突變型蛋白和融合蛋白的活性部分包括該蛋白分子多肽鏈的片段或前體，或單獨或與相關分子或與其相連的殘基如糖或磷酸根殘基一起，或該蛋白分子或糖殘基自身的凝聚物，只要所述部分具有與IL-18BP基本上相似的活性。
本發(fā)明另一優(yōu)選實施例中，IL-18抑制劑是IL-18抗體?？笽L-18抗體可以是多克隆或單克隆抗體，嵌合，人化或甚至完全是人的抗體。重組抗體或其片段特征是能與IL-18高親和力體內結合，毒性低?？捎糜诒景l(fā)明的抗體應具有的特征是經過對病人足夠時間的治療，它們能良好至優(yōu)異地減退或緩解病情或與病情相關的一種癥狀或多種癥狀，并且毒性低。
通過IL-18免疫接種，易在家兔、山羊或小鼠等動物中產生中和抗體。免疫小鼠特別可提供B細胞來源用于制備雜交瘤，進而培養(yǎng)雜交瘤產生大量抗IL-18單克隆抗體。
嵌合抗體是具有來自不同動物種系的二個或多個節(jié)段或部分的免疫球蛋白分子。通常嵌合抗體的可變區(qū)來自非人哺乳動物抗體，如鼠單克隆抗體，而該免疫球蛋白的恒定區(qū)來自人免疫球蛋白分子。最好如常規(guī)方法測得的這兩個區(qū)域及其聯(lián)合具有低免疫原性(Ellliott等，1994)。人化抗體是用基因工程技術構建的免疫球蛋白分子，該技術中用人配對物置換鼠恒定區(qū)而保留鼠抗原結合區(qū)。所產生的鼠—人嵌合抗體降低了免疫原性并改善了在人體中的藥物動力學(Knight等，1993)。
因此在另一優(yōu)選實施例中，IL-18抗體是人化IL-18抗體，歐洲專利申請EP0974600中描述了人化抗IL-18抗體的優(yōu)選例子。
另一優(yōu)選實施例中，IL-18抗體完全是人抗體，在WO00/76310，WO99/53049，US6162963或AU5336100中詳細描述了產生人抗體的技術。完全的人抗體優(yōu)選以轉基因動物(如異種移植小鼠，含有所有或部分的人Ig功能性基因座)產生的重組抗體。
本發(fā)明一個更優(yōu)選實施例中，IL-18抑制劑是IL-18BP，或其同工型、突變型蛋白、融合型蛋白、功能性衍生物、活性部分或環(huán)狀變換衍生物。這些同工型、突變型蛋白、融合蛋白或功能性衍生物保留了IL-18BP的生物活性，特別是結合IL-18的活性，優(yōu)選至少基本上活性類似于IL-18BP。理想的話，這些蛋白質具有生物活性甚至比未修飾的IL-18BP更高。優(yōu)選的活性部分所具有的活性比IL-18BP更好或更具優(yōu)點，如穩(wěn)定性更好，毒性或免疫原性更低，或它們更易大量生產，或更易提純。
IL-18BP及其剪接變體/同工型的序列可從WO99/09063(Novick等，1999)以及(Kim等，2000)中獲得。
可將IL-18BP的功能性衍生物與聚合物交聯(lián)以改進該蛋白質的性能，如穩(wěn)定性，半衰期，生物利用度，人體耐受性，或免疫原性。為達到此目的可將IL-18BP聯(lián)接于聚乙二醇(PEG)。例如按WO92/13095所述已知方法進行PEG化。
因此，本發(fā)明的一優(yōu)選實施例中，IL-18BP是PEG化的。
本發(fā)明另一優(yōu)選實施例中，IL-18抑制劑是融合蛋白，包含IL-18結合蛋白的全部或一部分，與免疫球蛋白全部或一部分融合。本領域技術人員知道所產生的融合蛋白保留IL-18BP的生物活性，特別是結合IL-18的活性。這種融合可以是直接的，或通過長度短至1-3個氨基酸殘基或較長(如13個氨基酸殘基長度)的一個短肽接頭相融合。所述接頭可以是E-F-M(谷氨酸-苯丙氨酸-甲硫氨酸)序列之3肽；或含Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met的13個氨基酸的接頭序列，位于IL-18BP序列和免疫球蛋白序列之間。所產生的融合蛋白具有改進的性能，如體液內滯留期(半衰期)延長，比活性提高，表達水平增加或有利于融合蛋白的純化。
一優(yōu)選實施例中，IL-18BP融合于Ig分子的恒定區(qū)，優(yōu)選融合于重鏈區(qū)域例如，人IgG1的CH2和CH3結構域。產生的特定融合蛋白包含有WP99/09063的實施例11中所述的IL-18BP和免疫球蛋白的一部分。Ig分子的其它同種型也適合用來產生本發(fā)明的融合蛋白，例如，同種型IgG2或IgG4，或其他Ig類，如IgM或IgA。融合蛋白可以是單體或多聚體，異質或同質多聚體。
主要知道干擾素對病毒復制和細胞增殖有抑制作用。例如，干擾素-r在促進免疫和炎癥反應中起重要作用。干擾素β(IFN-β，I型干擾素)據說有抗炎癥作用。Triantaphllopoulos等(1999)發(fā)表的研究表明IFN-β治療類風濕關節(jié)炎有良好效果如該病的小鼠模型—膠原誘導關節(jié)炎(CIA)模型所證明。IFN-β的這種良好效果在以下實施例中得到驗證。
本發(fā)明還涉及聯(lián)合使用IL-18抑制劑和干擾素來制造治療關節(jié)炎、特別是類風濕關節(jié)炎的藥物。
也可將干擾素與聚合物交聯(lián)以改進該蛋白質的穩(wěn)定性，例如，WO99/55377中描述了干擾素β和多元醇聚乙二醇(PEG)之間的交聯(lián)。
本發(fā)明另一優(yōu)選實施例中，干擾素是IFN-β，更優(yōu)選IFN-β1a。
IL-18產生和/或作用的抑制劑宜與干擾素同時、先后或分開使用。
本發(fā)明另一實施例中，IL-18抑制劑與TNF拮抗劑聯(lián)用。TNF拮抗劑以幾種方式發(fā)揮其活性。首先，該拮抗劑能以足夠的親和力和特異性結合或封蔽TNF分子本身，而部分或基本上中和了TNF表位(負責與TNF受體結合)(以下稱為遮蔽性拮抗劑)。例如，一種遮蔽性拮抗劑可以是針對TNF的抗體。
或者，TNF拮抗劑可抑制TNF結合細胞表面受體后激活的信號傳遞通路(以下稱為信號傳遞拮抗劑)。這二組拮抗劑可單獨或一起，與IL-18抑制劑聯(lián)合使用來治療關節(jié)炎，特別是類風濕關節(jié)炎。
通過在體外敏感細胞系(如TNF能引起其增殖和分泌免疫球蛋白的人B細胞)中常規(guī)篩檢候選藥物對天然TNF活性的影響，易于鑒定和評價TNF拮抗劑。此試驗包括不同稀釋度的候選拮抗劑(例如，為試驗所用TNF摩爾量的0.1倍-100倍)的TNF制劑，以及無TNF或只有拮抗劑的對照(Tucci等，1992)。
封蔽拮抗劑是用于本發(fā)明的優(yōu)選TNF拮抗劑。封蔽拮抗劑中那些能高親和力結合TNF并具有低免疫原性的多肽是優(yōu)選的，可溶性TNF受體分子和TNF中和抗體特別優(yōu)選。例如，TNF-RI和TNF-RII可用于本發(fā)明。這些受體的截短形式，包括受體的胞外結構域或其功能部分是本發(fā)明特別優(yōu)選的拮抗劑。截短的可溶性TNF-I型和TNF-II型受體在EP914431中有所描述。
截短形式的TNF受體是可溶的，在尿和血清中已檢測到，為30KD和40KD的TNF抑制性結合蛋白，分別稱為TBPI和TBPII(Engelmann等，1990)。本發(fā)明宜同時、先后或分別使用IL-18抑制劑和TNF拮抗劑和/或干擾素。
根據本發(fā)明，TBPI和TBPII和優(yōu)選的TNF拮抗劑和IL-18抑制劑聯(lián)用。此受體分子的衍生物、片段、區(qū)段和生物活性部分，裝配成功能性受體分子可用于本發(fā)明。該受體分子的這種生物活性等價物或衍生物，指多肽部分或編碼該受體分子的序列部分，其大小足夠并能結合TNF，其結合親和力使與膜結合的TNF受體相互作用而抑制或封閉它。
本發(fā)明另一優(yōu)選實施例中，可溶性人TNF-RI(TBPI)是用于本發(fā)明的TNF拮抗劑。天然和重組的可溶性TNF受體分子及其生產方法在歐洲專利EP308378、EP398327和EP433900中有所描述。
IL-18抑制劑可與TNF抑制劑同時、先后或分開使用。聯(lián)合使用IL-18抗體或抗血清和具有TNF抑制活性的可溶性TNF受體為佳。
本發(fā)明另一優(yōu)選實施例中，這種藥物還包括COX-抑制劑，優(yōu)選COX-2抑制劑。COX抑制劑是本領域已知的。例如具體的COX-2抑制劑在WO01/00229中有描述。
本發(fā)明還涉及聯(lián)用IL-18抑制劑和/或干擾素和/或TNF拮抗劑和/或COX-2抑制劑。這種聯(lián)用適合于治療和/或預防關節(jié)炎，特別是類風關，治療和/或預防肝損傷以及治療和/或預防炎癥性腸病，特別是節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結腸炎。可同時、先后或分開使用這些活性成分。
本發(fā)明一優(yōu)選實施例中，IL-18抑制劑用量為大約0.0001-10mg/kg體重，或大約0.01-5mg/kg體重，或約0.1-3mg/kg體重，或約1-2mg/kg體重。另一優(yōu)選實施例中，IL-18抑制劑用量為約0.1-1000μg/kg體重，或約1-100μg/kg體重，或約10-50μg/kg體重。
本發(fā)明還涉及使用含有IL-18抑制劑編碼序列的表達載體來制備預防和/或治療關節(jié)疾病或關節(jié)炎特別是類風濕關節(jié)炎、治療肝損傷和治療炎癥性腸病的藥物。即采用基因療法來治療和/或預防疾病。優(yōu)點是IL-18抑制劑的原位表達將有效地直接阻抑受疾病影響的組織或細胞中的IL-18。
為治療和/或預防關節(jié)炎，含IL-18產生和/或作用的抑制劑序列的基因治療載體可直接注射入患病關節(jié)，從而可避免全身給予基因治療載體所涉及的問題，如載體稀釋，抵達和靶向靶細胞或組織，及副作用。
本發(fā)明還考慮在平常不表達IL-18抑制劑或該抑制劑表達不充分的細胞中，使用能誘導和/或增強內源性產生IL-18抑制劑的載體。該載體可包含在所需細胞中起作用的調控序列以表達IL-18抑制劑，例如這類調控序列可以是啟動子或增強子。然后可通過同源重組將該調控序列導入基因組的正確基因座中，使調控序列與基因可操作性相連，所需要的該基因的表達即被誘導或被增強。該技術通常稱為內源性基因活化(EGA)，在例如WO91/09955中有所描述。
本領域技術人員懂得，也可能用同一技術降低IL-18表達，即導入一個負調節(jié)元件(如沉默元件)到IL-18的基因座中，如此導致下調或防止IL-18表達。本領域技術人員懂得，IL-18表達的這種下調或沉默具有使用IL-18抑制劑相同的效果，用以防治疾病。
本發(fā)明還涉及使用經過基因修飾的能產生IL-18抑制劑的細胞來制造治療和/或預防肝損傷、關節(jié)炎或炎癥性腸病的藥物。
本發(fā)明還涉及特別是用于預防和/或治療炎癥性關節(jié)炎、肝損傷或炎癥性腸病的藥物組合物，其含有治療有效量的IL-18抑制劑和治療有效量的干擾素。作為IL-18抑制劑，該組合物可包括caspase-1抑制劑、抗IL-18抗體、抗IL-18受體任一亞基的抗體、IL-18信號傳遞通路的抑制劑與IL-18競爭并阻斷IL-18受體的IL-18拮抗劑，和具有相同活性的IL-18結合蛋白、同種型、突變型、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或其環(huán)狀變換衍生物。
上述IL-18BP及其同種型、突變型、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或環(huán)狀變換衍生物是該藥物組合物的優(yōu)選活性成分。
該藥物組合物中包括的干擾素優(yōu)選IFN-β。
在另一優(yōu)選實施例中，該藥物組合物包含有治療有效量的IL-18抑制劑。任選的干擾素和TNF拮抗劑。此TNF拮抗劑可以是中和TNF活性的抗體，也稱為TBPI和TBPII的截短的可溶性TNF受體片段。本發(fā)明的藥物組合物還可包含一種或多種COX抑制劑，優(yōu)選COX-2抑制劑。
定義“藥學上可接受的”，指包含不會干擾活性成分的生物活性效果并對給藥的宿主無毒性的任何運載體。例如，為了非腸胃道給藥，可將這些活性蛋白以注射用劑量單位形式配制在運載體(如鹽水，葡萄糖液，血清白蛋白和Ringer液)中。
本發(fā)明藥物組合物的活性成分可以各種方法給予個體。給藥途徑包括皮內、透皮(如緩釋配方)、肌肉、腹膜內、靜脈內、皮下、口服、硬膜外、局部和鼻內途徑。也可采用其他治療有效途徑給藥，例如通過上皮或內皮組織吸收或通過基因治療將編碼活性藥物的DNA分子給予病人(如通過載體)，導致該活性藥物在體內表達和分泌。此外，可將本發(fā)明的蛋白質與生物活性藥物的其他組分(如藥學上可接受的表面活性劑、賦形劑、運載體、稀釋和載體劑等)一起給藥。
對于非腸胃道(如靜脈內、皮下、肌肉)給藥，可將活性蛋白質配制成溶液、懸浮液、乳液或與藥學上可接受的腸胃道外載體(如水，鹽水，葡萄糖液)和能維持等滲性(如甘露醇)或化學穩(wěn)定性(如防腐劑和緩沖液)的添加劑一起制成凍乾粉未。采用常規(guī)使用的技術給制劑滅菌。
本發(fā)明的活性蛋白質也可用偶聯(lián)方法增加其在人體內的半衰期而改善其生物利用度。例如，將活性蛋白分子與聚乙二醇相連接，PCT專利申請WO92/13095中有描述。
活性蛋白的治療有效量是很多變量的函數，包括拮抗劑類型、拮抗劑對IL-18的親和力、拮抗劑顯示的殘留毒性、給藥途徑、病人臨床狀態(tài)(包括維持內源性IL-18活性的非毒性水平是否合乎需要)。
“治療有效量”是給藥時IL-18抑制劑導致IL-18生物活性受抑制的量。給予個體單劑或多劑的劑量視各種因素而不同，包括IL-18抑制劑的藥物動力學性能，給藥途徑，病人狀態(tài)和特征(性別，年齡，體重，健康狀況和塊頭大小)、癥狀程度，相關治療，治療頻度和所要求的效果。判定和維持已確定的劑量范圍在本領域技術人員能力之內。以及個體IL-18抑制的體內外測定方法。
按照本發(fā)明，IL-18抑制劑的用量為約0.0001-10mg/kg或約0.01-5mg/kg體重，或約0.01-5mg/kg體重，或約0.1-3mg/kg體重，或約1-2mg/kg體重。更優(yōu)選的IL-18抑制劑用量是約0.1-1000μg/kg體重，或約1-100μg/kg體重或10-50μg/kg體重。
本發(fā)明優(yōu)選的給藥途徑是皮下途徑，肌肉內給藥也是本發(fā)明優(yōu)選的。
在另一優(yōu)選實施例中，IL-18抑制劑是每日或每隔一日給藥。
每日藥量通常分成幾劑或以緩釋形式給予，以有效獲得所需結果。第二次或后幾次給藥可用與首次或原先給予該個體的相同劑量、少于或多于此劑量進行。第二次或后幾次給藥可在疾病發(fā)作時或發(fā)作前給予。
按照本發(fā)明，IL-18抑制劑可以治療有效量先于其他治療方案或藥物(如多種藥物方案)特別是干擾素和/或TNF拮抗劑和/或COX-2抑制劑，同時或依次預防性或治療性地給予個體?；钚运幬锟稍谙嗤虿煌慕M合物中與其他治療劑同時給予。
本發(fā)明還涉及包括將有效量IL-18抑制劑和/或干擾素和/或TNF拮抗劑和/或COX抑制劑與藥學上可接受的載體混合的藥物組合物的制備方法。
參照以下提供的實施例將會更容易理解本發(fā)明所述內容，但以下實施例是用于闡述而不意味著對本發(fā)明的限制。
實施例第一部分實施例1-8關于在肝損傷中IL-18抑制劑的使用實施例1IL-18BP-His tag的產生在CHO細胞中產生含組氨酸尾的純化重組人IL-18BP(r-hIL-18BP-His tag)。本領域技術人員知道可在真核細胞中產生重組蛋白質?？衫檬熘姆椒▉順嫿ㄝd有編碼IL-18BP的DNA的恰當載體，其適合于轉染真核細胞以產生重組IL-18BP。為了細胞表達，將編碼IL-18BP的DNA(見Novick等，1999)切下并插入適合轉染細胞的表達載體中。或者，可用適當的有義和反義引物作PCR制備這種DNA。然后用本領域熟知的技術將產生的cDNA構建物插入適當構建的真核表達載體中(Manaitis，1982)。將該重組蛋白純化至95％以上純度，發(fā)現其在體內和體外是有生物活性的，對其配體有高親和力。實施例2IL-18BP對內毒素誘導死亡小鼠模型的保護效應采用小鼠模型來檢驗IL-18BP(IL-18抑制劑)是否能保護小鼠抵抗高劑量脂多糖(LPS)。LPS引起急性肝損傷后小鼠迅速死亡。
給C57BL/6小鼠腹腔內(ip)注射含his-尾的重組人IL-18BP(rhIL18BPhis，得自該蛋白質的重組產生)4mg/kg，1小時后，注射60mg/kg LPS(致死劑量)，與只接受LPS(無IL-18BP)的動物組比較小鼠存活率。
與對照小鼠相比，注射rhIL-18BP-his的7只小鼠有5只在注射LPS后存活，而對照組所有小鼠三日內死亡。
在缺乏或存在遞增劑量的rhIL-18BP-his時，注射LPS后5小時采集血樣，作ELISA分析循環(huán)性IFN-γ(圖1)。0.4和4mg/kg rhIL-18BP導致血清IFN-γ降低2倍。在較低劑量rhIL-18BP(0.004和0.04mg/kg)時，無此種抑制。實施例3IL-18BP在小鼠病理模型中具有抵抗肝損傷的保護作用采用暴發(fā)性肝炎小鼠模型來測試IL-18BP的效應。當相繼給予Proplioni-bacteriumacnes(P.acnas)和脂多糖(LPS)后，小鼠發(fā)生了肝損傷。
注射LPS前在不同時間(1小時，20分，同時)給P.acnas致敏的C57BL/6小鼠注射遞增劑量的rhIL-18BP-his(4，0.4，0.04，0mg/kg)。當與LPS同時ip給予rhIL-18BP-his時無小鼠存活并且循環(huán)IFN-γ和TNF-α水平不受影響。令人驚奇的是，rhIL-18BP(4和0.4mg/kg)導致循環(huán)丙氨酸氨基轉移酶(肝損傷的一種標志)降低70％，如圖2所示。
此外，監(jiān)測了小鼠存活率(圖3)，當LPS前20分鐘ip給予rhIL-18BP時，與對照鼠(接受NaCl代替IL-18BP)相比，兩個最高劑量IL-18BP(4和0.4mg/kg)使小鼠死亡延遲10小時。
血清IFN-γ水平測定結果見圖4。rhIL-18BP(4mg/kg)抑制了90％的循環(huán)性IFN-γ水平和80％循環(huán)丙氨酸氨基轉移酶(沒顯示)。當LPS之前1小時給予rhIL-18BP-his時，存活曲線和循環(huán)性TNF-γ水平類似于LPS之前20分鐘給予rhIL-18BP his時所見，但循環(huán)性丙氨酸氨基轉移酶水平不受影響(未顯示)。
此外用蘇木精-伊紅染色和導管顯微鏡術分析了小鼠肝組織，與正常肝組織相比，已引起嚴重肝炎的小鼠肝臟顯示出嚴重壞死。與此相反，經IL-18BP治療小鼠的肝組織比未治療小鼠壞死病灶少得多。實施例4抗IL-18抗體保護小鼠抵抗致死性內毒素血癥為了評價用IL-18抗體阻抑IL-18是否能保護小鼠抵抗致死量的細菌脂多糖的攻擊，給C57BL/6J小鼠先注射兔抗小鼠IL-18中和抗體(多克隆)或以正常兔血清(NDS)作為對照。抗體治療后30分鐘，注射致死量的大腸肝菌LPS(圖5A)或傷寒桿菌LPS(圖5B)。實驗包括10-20只小鼠/組，在不同時間進行2次。
圖5A顯示，用抗IL-18抗血清治療小鼠防止了40mg/kg大腸桿菌LPS導致的死亡，100％小鼠在抗IL-18治療后存活，而用正常兔血清治療小鼠僅10％存活(P＜0.005)。
圖5B顯示，抗體治療小鼠也受到保護，抵御了傷寒桿菌LPS的致死作用(存活率50％對0％，P＜0.05)。實施例5阻抑IL-18和TNF-α保護小鼠避免ConA和PEA誘導的肝細胞毒性采用兩個肝細胞毒性實驗模型評價IL-18和TNF-α在肝損傷中的作用。給小鼠注射伴刀豆球蛋白A(ConA)和綠膿桿菌(PEA)，均引起肝損傷，是T細胞介導肝炎的模型。
用抗IL-18抗血清或可溶性TNF-α受體(TNFsRp55)預處理C57BL/6j小鼠。測定血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)水平作為肝細胞損傷指標(圖6)。
如圖6A所示，與5只注射載體(無熱原質鹽水)的對照相比，IL-18抗血清和可溶性TNF受體均明顯降低ConA誘導的血清ALT水平。聯(lián)合給予可溶性TNF受體和IL-18抗血清導致完全抑制ConA誘導的肝損傷。
如圖6B所示，在注射PEA的小鼠中，TNF-α抑制劑或抗IL-18抗體的中和作用導致血清ALT水平分別受到93％和83％抑制。二者聯(lián)合阻抑產生99％保護。實施例6評價慢性肝病病人中IL-18結合蛋白的血漿水平采用IL-18BP單克隆抗體作特異性ELISA，測定了133名不同病因的慢性肝病病人(CLD)和31名健康對照者的IL-18BP血漿水平。
CLD病人血漿IL-18BP水平(12.91±0.89ng/ml，均值±標準差)比健康受試者(4.96±0.43ng/ml)高得多(p＜0.001)。肝硬化CLD病人比非肝硬化病人水平高得多(19.23±1.28ng/ml，n＝67對6.49±0.51ng/ml，n＝66，p＜0.001)。Child-Pugh分類法B期病人IL-18BP水平比A期病人高(22.48±2.44ng/ml，對9.57±1.25ng/ml，p＜0.001)。然而，Child B和C之間無顯著性差別(22.48±2.44ng/ml對20.62±4.75ng/ml，p＝0.7)。IL-18BP血漿水平與GOT、膽紅素、紅細胞沉降速率正相關，與凝血酶原時間負相關。
結論該結果顯示CLD中IL-18BP血漿水平升高，并與疾病嚴重程度相關，與疾病病因無關。雖然CLD中促炎癥性IL-18的內源性拮抗劑IL-18BP水平升高，但似乎不足以抵銷占優(yōu)勢的促炎癥介質的作用。實施例7IL-18BP抑制酒精性肝炎胃內灌注給4組大鼠(每組5只)喂飼乙醇和含玉米油飲食4周，對照大鼠以等卡路里葡萄糖代替乙醇，大鼠每日注射小鼠IL-18BP(1mg/kg)或鹽水。對肝切片作病理分析并測定血清肝酶、TNF-α、Fas配體和IFN-γ。在喂飼乙醇和注射鹽水的大鼠中發(fā)現肝壞死性炎癥損傷及肝酶、TNFα、Fas配體和IFN-γ的表達。
注射小鼠IL-18BP大鼠得到保護，避免了壞死性炎癥損傷，并且肝酶、TNF-α，Fas配體和IFN-γ水平明顯降低(＞90％)。實施例8IL18BP抑制伴刀豆球蛋白A誘導的肝炎給Balb/c小鼠注射12mg/kg伴刀豆球蛋白A(ConA)，在給予ConA前2小時、然后每日注射或不注射小鼠IL-18BP(1mg/kg)。測定肝酶、TNF-α、Fas配體和IFN-γ血清水平來評價肝損傷。與只用ConA處理的小鼠比較肝組織病理學。
IL-18BP預處理顯著降低了肝酶和TNF-α的血清水平。與用ConA處理的對照小鼠相比，組織病理學檢查無炎癥證據。第二部分實施例9和10關于IL-18抑制劑在關節(jié)炎中的應用實施例9 IL-18BP-His尾的產生在以下實施例10中對該實驗有詳述。在CHO細胞中產生含6個殘基組氨酸尾的重組人IL-18BP(rhIL-18BP-His尾)并如Kim等(2000)所述進行純化。發(fā)現純化后的該重組蛋白純度超過95％。體內外均有生物活性，對其配體有高親和力。
本領域技術人員知道可在其他真核系統(tǒng)中生產帶尾或不帶尾的重組蛋白質，不帶尾有利于重組蛋白的純化。可采用熟知的方法來構建攜帶編碼IL-18BP的DNA并適合轉染真核細胞的適宜載體，以生產重組IL-18BP。為了在細胞中表達，從此克隆載體上切下編碼IL-18BP的DNA(例如見Novick等，1999)，并將其插入適合轉染細胞的表達載體中。或者可用適當的正義和反義引物作PCR制備這種DNA。用本領域已知技術將產生的cDNA構建物插入已適當構建好的真核表達載體中(Maniatis等，1982)。實施例10阻抑關節(jié)炎小鼠模型中的內源性IL-18方法膠原誘導的關節(jié)炎(CIA)的產生如前所述(Plater-Zyberk等，1995)，用II型天然牛膠原(CII)免疫接種DBA/1雄鼠(8-12周齡)誘導CIA，CII免疫后25天起，逐日檢驗小鼠發(fā)病情況。
用rhIL-18BP-6his治療在首次出現疾病臨床癥狀時開始對CII免疫的DBA/1小鼠進行治療。用含6個組氨酸尾的重組人IL-18BP(rhIL-18BPa-6his)中和該膠原處理小鼠的內源性IL-18。每日以5種不同濃度10，3，1，0.5，0.25mg/kg腹腔內注射rhIL-18BP-6his，共七天。安慰劑對照小鼠只注射運載體(0.9％NaCl)。
評估疾病進展臨床評價(臨床評分)從首次出現臨床癥狀起，由一個不知治療方案的研究者每天檢查小鼠。就疾病嚴重程度給每個肢體分等級(評分0～3.5，最高分＝14/小鼠)。用精密卡尺對出現疾病癥狀的第一個腳爪測定其腫脹(炎癥)的進展(Proctest 2T，Kroeplin Langenmesstechik)。發(fā)病后每日評估疾病進展8天，然后處死所有小鼠，收集腳爪作組織病理檢查。
軟骨侵蝕和顯微炎癥的組織學評估實驗末，即發(fā)病后第8天，處死小鼠解剖切下首先發(fā)生疾病癥狀的腳爪。固定諸關節(jié)、脫鈣、石蠟包埋。制作諸關節(jié)的標準切片(5～7μm)并用蘇木精/伊紅/SafraninO染色。由不知道治療方案的二名研究者給各關節(jié)評分，(無軟骨或骨破壞＝0，軟骨局部侵蝕＝1～2，更廣泛侵蝕＝3，整個軟骨破壞和存在骨侵蝕＝4)。每只小鼠的最終評分為所有計分關節(jié)結果的平均值。顯微炎癥或滑膜評分為如下0～4無炎癥＝0，襯膜層輕度增厚和/或襯膜下層有一些浸潤性細胞＝1～2，襯膜層增厚和/或襯膜下層細胞更明顯滲入＝3，滑液腔中有細胞并且滑膜中有許多炎癥細胞浸潤＝4。
測定抗膠原抗體用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢查了抗II型牛膠原抗體，測定了IgG1和IgG2a滴度。簡言之，用10μg牛膠原包被板，用0.1M乙醇胺(Sigma)封閉非特異性結合位點，加入1∶2系列稀釋血清然后與同種特異性山羊抗小鼠過氧化物酶(SouthernBiotechnology Associates，Birmingham，AL，USA)培育，再與底物(5-氨基水揚酸，Sigma)培育。于492nm讀取此板，滴度以產生半數最大值的均值±標準差稀釋度表示。
IL-6試驗用商品化ELISA試劑(R&D systems，Minneapolis MN，USA)測定IL-6水平。用B9細胞增殖試驗測定IL-6生物活性。簡言之，在園底微滴板中每孔接種200μl 5％FCS-RpMI 1640培養(yǎng)液，含5×103B9細胞，培養(yǎng)3天，用重組人IL-6(R&D systems，Minneapolis，MN，USA)作標準物。培養(yǎng)末每孔加入0.5μCi3[H]胸腺嘧啶(NEN-Dupont，Boston，MA，USA)。3小時后收獲細胞測定胸腺嘧啶摻入量。IL-6生物試驗的測定限度為1pg/ml。
統(tǒng)計學分析采用Sigma Stat統(tǒng)計學分析程序和GraphPad Prism程序經Mann Whitney檢驗評估了差異有無顯著性。
結果采用小鼠實驗模型CIA(膠原誘導的關節(jié)炎)評估IL-18BP作為治療關節(jié)炎藥物的效果。給予DBA/1小鼠膠原和弗氏不完全佐劑誘導產生侵蝕性炎性關節(jié)炎，這提供了探索IL-18BP治療潛能的理想機會。最后，用IL-18BP中和內源性IL-18并評價其對各種病理參數的作用。
進行了劑量相關性研究。以5劑量IL-18BP腹腔注射(ip)治療三組膠原誘導關節(jié)炎DBA/1小鼠。在首次出現疾病臨床癥狀時給予10、3、1、0.5或0.25mg/kg濃液的IL-18BP。注射生理鹽水(NaCl)作為對照。此外，ip給予10000IU的IFN-β來評估IFN在該關節(jié)炎實驗模型中的效果。如上所述，逐日對各腳爪進行評分以監(jiān)測藥物對病情嚴重程序的影響。發(fā)病后第8天處死小鼠，測定以下數值·肉眼臨床評分(每腳爪0～3.5)(圖7A和B)·首先患病腳爪(如果是后爪)的關節(jié)腫脹/水腫(mm.，用卡尺測量)情況(圖8)·繼而患病的腳爪數目·首先患病腳爪的侵蝕評分(0～4軟骨破壞，圖10)·首先發(fā)生關節(jié)炎腳爪的組織病理學分析(圖11)·抗II型膠原抗體水平(圖12)·IL-6水平(圖13)疾病的臨床嚴重程度如圖7A和B所示，用1mg/ml(P＜0.01)和0.5mg/ml(0.01＜P0.05)rhIL-18BP治療的組中此病的臨床嚴重程度明顯降低。接受低劑量(0.25mg/kg)或高劑量(10mg/kg)rhIL-18BP的小鼠臨床評分類似于安慰劑組，1mg/kg劑量的IL-18BP效果與IFN-β大致相同。(圖7A)。
關節(jié)炎癥和腳爪腫脹(水腫)從發(fā)病第一天至實驗結束的第8天測定了腳爪腫脹研究宏觀炎癥(腫脹)，結果見圖8A和B。IL-18BP的有效劑量為1.3和10mg/kg，給予較低劑量對腫脹無有益效果。如圖8A和B所示，10000IU濃度的IFN-β對腳爪腫脹顯示了有益效果。
實驗結束時對組織病理切片作顯微滑膜炎檢查以評分表示(“滑膜炎評分”)，炎癥(腫脹)結果和滑膜炎評分小結于表1。用1和3mg/kg劑量rhIL-18BP治療有腫脹減低傾向，但任一劑量的IL-18BP治療對炎癥性滑膜只有有限的效果(圖1)表1 IL-18BP治療關節(jié)炎癥的效果
圖9顯示給予IL-18BP受疾病影響的腳爪數目減少，特別是治療性注射1和0.5mg/kg劑量的IL-18BP減少了繼后患病的腳爪數，證明體內阻抑IL-18制止了關節(jié)炎向其他關節(jié)的擴散。用1和0.5mg/kg IL-18BP治療甚至看來能夠將某些發(fā)炎關節(jié)變成正常。
保護關節(jié)避免遭破壞用rhIL-18BP治療小鼠結果保護了其關節(jié)免遭破壞(圖10)。一項半定量評分體系證明骨侵蝕顯示劑量相關性保護效應，這在10和3mg/kg時表現明顯(P＜0.05，圖10)，接受1mg/kg rhIL-18BP的小鼠骨侵蝕比只接受載體的小鼠輕，而0.5mg/kg和0.25mg/kg劑量未見保護作用。令人感興趣的是，3和10mg/kg劑量IL-18BP對關節(jié)保護的效果比得上10000IU的IFN-β的良好效果，或甚至更顯著(圖11)顯示健康關節(jié)(A)和患病關節(jié)(B)與用IL-18BP治療的動物關節(jié)(C)相比較的組織學情況。切片于實驗未取自首先發(fā)生關節(jié)炎的那些腳爪。
患關節(jié)炎小鼠的關節(jié)顯示有嚴重的破壞性關節(jié)炎，伴軟骨缺損和侵蝕，發(fā)炎的滑膜中有許多浸潤細胞。而rhIL-18BP治療小鼠的關節(jié)中，軟骨看起來幾乎正常，盡管滑膜腔中存在炎癥細胞，軟骨量較多，而且軟骨外觀光滑。
抗IL-18治療調節(jié)了抗II型膠原抗體的水平CIA小鼠血循環(huán)中抗II型膠原的IgG1和IgG2a抗體水平升高。同種型IgG1抗體與Th2介導的疾病相關，而同種型IgG2a和IgG2b抗體與Th1介導的疾病相關。關節(jié)炎通常歸類為Th1介導的疾病。
測定了用IL-18BP治療動物的血清中抗II型膠原(C11)IgG1和IgG2a抗體(圖12)。在臨床上患病的第4天或第8天(D4、D8)，IL-18BP治療沒有顯著改變抗C11同種型IgG1和IgG2a(相加后的)IgG水平。然而膠原特異性IgG1/IgG2a比率在1和3mg/kg rh IL-18BP治療8天后分別降低了2.6和3.4倍。圖12實驗采用3mg/kg。采用1mg/kg量的IL-18BP所獲結果基本相同?？笴11抗體IgG1/IgG2a比率下降表明抗II型膠原同種性IgG2a抗體濃度下降和抗II型膠原同種性IgG1抗體濃度升高，提示此關節(jié)炎模型向Th2介導的疾病轉移。
IL-18被中和后IL-6水平下降為了觀察IL-18阻抑的效果，測定了IL-18BP治療動物的血清IL-6。圖13顯示接受1、3和10mg/kg各劑量IL-18BP治療和IFN-β治療的動物生物活性IL-6水平顯著降低。用3mg/kg rhIL-18BP治療的動物血清中測得的IL-6免疫活性水平比鹽水治療動物顯著降低(P＜0.0023)，而用1、3或10mg IL-18BP或10000IU IFN-β治療的患病動物血清IL-6水平與健康動物即未患炎癥疾病的動物的正常小鼠血清(NMS)水平相似。
這些發(fā)現證明發(fā)病期間IL-18控制著IL-6水平。因為IL-6是一種炎癥標志，這些發(fā)現表明用IL-18BP治療患病小鼠減少了動物炎癥。
從上述實驗可得出以下結論·給予IL-18BP可降低關節(jié)炎的臨床嚴重程度·IL-18BP還可抑制此病的進展或擴散·給予IL-18BP可減輕水腫·IL-18BP治療后血清IL-6水平降低，IgG1/IgG2a抗C11抗體比率下降。
以上資料表明中和發(fā)病后的IL-18的生物活性代表了一種緩解病情的抗風濕療法，這些結果清楚地表明阻抑IL-18減慢了關節(jié)炎的臨床進程，更重要的是停止了軟骨和骨破壞的進程。因此以IL-18BP、抗IL-18抗體或其他IL-18阻抑劑阻抑IL-18，代表了一種新的緩解病情的抗風濕療法。
以上具體實施例的描述揭示了本發(fā)明總的本質，因此其他人應用目前的知識，不難對這些具體實施例進行修飾和/或適合于各種應用的修改，但這并未脫離本發(fā)明的總思路。應強調這種適應性修改和修飾均在所公開的實施例的含義和范圍之內。應懂得本文所用措詞和術語目的是為了描述而非限制。第三部分 實施例11-12關于炎癥性腸病實施例11 活動性節(jié)段性回腸炎時內皮細胞和巨噬細胞的IL-18BP表達收集樣品自CD或UC病人外科手術切除樣本分離出腸粘膜標本。包括14名CD病人(3男11女)，平均年齡37.8歲(20-78歲)，患病時間8.3年(1-21年)。8個病人疾病位于回腸，6個病人位于結腸，12名病人服用免疫抑制藥。組織病理學檢查和根據以下標準診斷為活動性CD存在潰瘍、炎癥細胞數目增加，跨腸壁性炎癥。鑒定為活動性CD七人，非活動性疾病七人?；顒有院头腔顒有訡D病人之間的年齡、患病部位、性別、用藥和患病時間未見顯著性差異。5名UC病人(3男2女)平均年齡37.6歲(30-44歲)。所有病人病變于結腸，均接受免疫抑制劑治療。平均患病時間4年(1-9年)。對照樣品取自5名非1BD相關疾病(3男2女)手術切除樣品，此組平均年齡55.2歲(24-76歲)，所有病人病變位于結腸。
人IL-18和IL-18BP的半定量RT-PCR抽提CD、UC病人和對照病人冰凍腸道活檢樣品的總RNA，采用Trizol(Gibco)按廠家說明書進行RNA抽提。獲得樣品并通過測定260nm吸收值定量。在1％瓊脂糖凝膠上電泳估計RNA完整性。用Promega的逆轉錄系統(tǒng)按廠家方案自1μg總RNA合成cDNA。在含1μAmpliTag DNA聚合酶(Perkin Elmer Roche，USA)、2.5mMdNTP(Amersham，USA)和50pmole正向和反向PCR引物的150μl總體積中進行PCR反應。反應物培育在PTC-200 Peltiet Effect熱循環(huán)儀(MJ Research，USA)中按以下條件進行94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘。測定條帶飽和前IL-18BP、IL-18和β-肌動量白所需的最佳循環(huán)次數(分別為31、28和25輪)，根據發(fā)表的序列(AF110799，D49950，X00351)設計如下PCR引物IL-18反向5’-GCGTCACTACACTCAGCTAA-3’，正向5’-GCCTAGAGGTATGGCTGTAA-3’。IL-18BP正向5’-ACCTGTCTACCTGGAGTGAA-3’，反向5’-GCACGAAGATAGGAAGTCTG-3’。β-肌動蛋白反向5’-GGAGGAGCAATGATCTTGATCTTC-3’；反向5’-GCTCACCATGGATGATGATATCGC-3’。為了排除污染樣品基因組DNA的擴增，在沒有cDNA模板時進行PCR反應。在1％瓊脂糖凝膠上以1×TAE緩沖液對PCR產物(10μl)作電泳分析。凝膠染色后與1kb梯(Gibco)比較驗證PCR產物大小。在UV燈下用kodak數字科學分析軟件進行溴乙錠染色條帶的相對定量測定，報告為靶基因(hIL-18BP、hIL-18)對管家基因(hβ-肌動蛋白)的比值。
抗hIL-18BP單克降抗體的產生于0，7和28天給BALB/C小鼠四肢皮下和淋巴結內注射以PBS和佐劑(MPL+TDM Emulsion，RIBIImmunochem Research，Inc，.)配的同工型rh IL-18BP-6his(從中國倉鼠卵巢細胞提純，Interpharm Laboratories，Nes Ziona Israel)50μg。第三次免疫后4天取得淋巴結用2.4？g/ml膠原酶(collagenase 1V，Worthington BiochemicalCorp.)和0.1％DNA酶(Sigma)消化。將分離得到的細胞用PEG1000(LUKAa)與Sp2/0骨髓瘤細胞融合。重懸細胞于含10％FCS(Gibco)和HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶)的DMEM-F12中，以5×10-4細胞/ml濃度分種于96孔板中。以直接篩檢試驗篩檢雜交瘤培養(yǎng)上清液樣品是否存在反應性抗體。為此，ELISA板用山羊抗小鼠F(ab’)2抗體(Jackson Immano Research，Milan analytica，Switzerland)包被，加入雜交瘤培養(yǎng)上清液后，加生物素化rhIL-18BP-6his(如Novick等1999所述，自COS細胞純化而得)，加或不加rhIL-18(自重組大腸桿菌純化，Serono PharmaceuticalResearch Institute，Geneva)，最后加鏈酶親和素—辣根過氧化物酶(HRP，JacksonImmuno Research，Milan analtyica，Switzerland)，用鄰苯二胺(OPD，Sigma)顯色，選出非中和抗體并亞克隆。在此研究中采用95-H20，一種小鼠IgG1單克隆抗體。
IL-18BP陽性細胞定位的免疫組化研究快速凍結組織樣品保存于-80℃。獲得一系列冰凍切片(10μm)，置于聚L-賴氨酸包被的Superfrost/Pus玻片(Polyalbo，Plan-les-Ouates，Switzerland)上，以冰冷丙酮固定，用單抗95-H20作免疫組化分析人IL-18BP蛋白的定位。以PBS簡單復水后，將切片在添加了2％FCS(Cansera，Ontario，Canada)、1％人血清(AB+血清，TransfusionCenter，Annemasse，France)和0.5％BSA(Sigma，St.Louis，MO，USA)的PBS中預培育30分鐘。將玻片置于含2％FCS、1％人血清、0.5％BSA和1％過氧化氫(H2O2，Fluka，Switzerland)的PBS液中1小時，封閉內源性過氧化物酶的活性。以PBS淋洗后，切片與單抗95-H20不稀釋的培養(yǎng)上清液培育過夜。再用PBS洗滌后，切片與生物素化山羊抗小鼠抗體(Jackson Immuno Research，Milan analytica，Switzerland)(5？g/ml)在含0.5％BSA的PBS中培育1小時，與親和素DH/生物素化HRP復合物(Vectastain Elite ABC Kit，Vector Laboratories，CA，USA)培育30分鐘增加染色靈敏度。用PBS洗滌玻片，用30％H2O2、3，3-氨基-9-乙基咔唑(AEC，Sigma)、N，N-二甲基甲酰胺(Merck)的pH5乙酸鹽緩沖液顯色。用蘇木精(Sigma)反染色，切片上覆蓋甘油和蓋玻片。采用小鼠IgG1抗體(R和D system)作同型對照。
為了鑒定人IL-18BP的細胞定位，對腸粘膜切片進行了雙色免疫組化研究。10分鐘后，以PBS復水，將切片在添加了2％FCS、1％人血清和0.5％BSA的PBS中預培育30分鐘。為了共同定位內皮細胞，將切片與混合有FITC-交聯(lián)小鼠抗人CD31(1∶50，Pharmingen，CA，USA)的生物素化單抗95-H20(20μg/ml)在PBS/0.5％BSA中培育過夜。為了共同定位巨噬細胞，將切片與混有FIET交聯(lián)抗人CD68(1∶25，Dako.Denmark)的生物素化單抗95-H20(20μg/ml)培育過夜。PBS洗滌后，加入鏈酶親和素Texas紅(Southern Biotechnology Associates，AL，USA)1小時。再洗滌玻片。切片用moviol和蓋玻片覆蓋。用生物素化小鼠IgG1抗體(Pharmingen)然后鏈酶親和素Tesas紅作為同種型對照。
細胞培養(yǎng)采用添加了重組人上皮生長因子(hEGF，10ng/ml)、氫化可的松(1？g/ml)、慶大霉素和兩性霉素B(50？？g/ml)、牛腦提取物(BBE，3mg/ml)和2％胎牛血清(FBS)(Clonetics Corp.，San Diego，CA)的內皮細胞生長培養(yǎng)液(EGM)，按廠家說明書培養(yǎng)人臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC，Clonetics Corp.，San Diego，CA)。組織培養(yǎng)皿用人纖連蛋白(10？g/cm2，Boehringer，Mannhein)預先包被。細胞培養(yǎng)在潮濕的5％CO2孵箱中，用第三代HUVEC進行實驗。用人IL-1β(10ng/ml)、TNF2(10ng/ml)和IFNγ(20ng/ml)(R&D，system Germany)處理HUVEC 24小時。培養(yǎng)結束時收集細胞，分離RNA作RT-PCR進行IL-18BP和IL-18 mRNA轉錄分析。收集上清液用ELISA分析IL-18BP和IL-18蛋白的表達。
將人單核細胞系THP-1懸浮培養(yǎng)于添加了10％熱失活FCS、L-谷氨酰胺(2mM)、青霉素-鏈霉素(10U/ml，Gibco BRL，Life Technologies)和β-巰基乙醇(50？M，Fluka)的RPMl培養(yǎng)液中。細胞培養(yǎng)于潮濕的5％CD2孵箱中每5天以1∶10傳代。實驗前三天用維生素D3(80nm，Biomol Research Laboratories，USA)將人單核細胞分化成0.4×106細胞/ml密度并使其粘附。一旦粘附，向細胞培養(yǎng)物中加入LPS(100ng/ml，Calbiochem)、人IL-1β(10ng/nl)、TNF2(10ng/ml)和IFNγ(20ng/ml)。48小時時，收集上清液用ELISA分析IL-18BP和IL-18蛋白質表達。
測定人IL-18BP和IL-18的產生用ELISA評價了用混合細胞因子(IL-1β、TNFα、IFNγ)刺激或不刺激24小時的HUVEC以及(LPS、IL-1β、TNFα、IFNγ)刺激和不刺激48小時的THP-1細胞系的無細胞上清液中IL-18BP的存在。為此，用抗rhIL-18BP(同工型a)的捕獲單抗(克隆657.27，0.5μg/100？l/孔，Interpharm Laboratories，Nes Ziona，Israel)包被測試板過夜。用兔抗rh IL-18BP-6his(從中國倉鼠卵巢細胞純化而得，InterpharmLaboratories，Nes Ziona，Israel)多克隆抗體(稀釋度1/10000)，然后與親和純化的過氧化物酶偶聯(lián)山羊抗兔IgG(稀釋度1/20000，Jackson Immuno Research，Milananalytica，Switzerland)培育來檢測可溶性hIL-18BP。捕獲單抗和兔多克隆抗體都經Western blot測試以證實其IL-18BP的特異性。采用重組人IL-18BP-6his作為標準品，ELISA的靈敏度為100pg/ml。平行試驗用人IL-18 ELISA試劑盒(MBL Immunotech)定量測定IL-18水平，此ELISA的靈敏度為12.5pg/ml。
CHO細胞中hIL-18BPa-His6的表達從中國倉鼠卵巢細胞純化獲得重組人IL-18BP(hIL-18BPa-His6尾，InterpharmLaboratories，Nes Ziona，Israel)。
結果腸活檢樣品中IL-18BPmRNA轉錄物的表達。
對活動性CD非活動性CD或UC病人的腸手術樣本或和非炎性腸組織的組織勻漿進行了IL-18BPmRNA表達的分析(圖14)，在所有測試的腸勻漿中檢測到IL-18BP和肌動蛋白轉錄。與此相似，在CD、UC或非IBD對照者的所有組織勻漿中發(fā)現了IL-18轉錄(圖14A)。IL-18BP或IL-18與對照肌動蛋白mRNA水平的比率顯示，在活動性CD病人的活檢樣品中IL-18BP和IL-18二者的轉錄量比非活動性CD、UC和非IBD對照者活檢樣品相比，有統(tǒng)計學顯著意義的升高(見后述)(圖14B和C)。這些資料表明活動性CD時粘膜組織中IL-18BP上調，提供了第一個證據，證明活動性CD的IL-18BP表達水平與非活動性CD、UC及非IBD對照者明顯不同。
對腸活檢樣品中IL-18BPmRNA轉錄表達的統(tǒng)計學分析將所有可得數據放在一起進行方差分析，輸出信號清楚地表明，關于活動性CD組中的一名病人(其IL-18的OD比率很高，為16252，IL-18BP的OD比率很低，為1058)有統(tǒng)計學分離現象(outlier)。測定的這種單一而非常不規(guī)則的耦合并沒有證實ANOVA模式(Shapiro-Wilks檢驗對殘差的標準化P值＜0.0001)，為此決定忽略統(tǒng)計學分析中這種測定耦合。
所用ANOVA模式考慮了因素分組(對照、活動性CD、非活動性CD和UC)，蛋白質(IL-18或IL-18BP)和病人數目(23人)。組內有顯著性差異(P＜0.0001)。還令人感興趣的是注意到IL-18和IL-18BP之間的OD比率差異不顯著(P＝0.369)。而且還進行了IL-18和IL-18BP表達之間的相關性(研究)。IL-18與IL-18BP之間的相關系數等于0.67，這提示測得的IL-18和IL-18BP的OD比率之間有很強聯(lián)系。隨訪有關分組影響的結果，用Shceff”e方法比較了不同的組，可得出結論為活動性CD的IL-18BP和IL-18表達的OD比率明顯高于對照(+3280)、UC(+2590)，特別是非活動性CD(+4580)。
IL-18BP在腸組織中的免疫組化定位為了評估IL-18BP的原位細胞表達，采用抗hIL-18BP特異性單抗，對獲自活動性CD和非IBD對照者腸組織的冰凍切片進行了免疫組化分析。在固有層、粘膜下層和肌層內檢測到IL-18BP陽性細胞(未顯示)。存在于固有層和粘膜下層中的陽性染色單核細胞擁有豐富的胞漿、囊網狀核，形態(tài)上與組織巨噬細胞相一致。肌層中陽性染色細胞具有豐富的胞漿，某些時候中部有開放腔隙，提示為陽性染色的微血管，形態(tài)上與內皮細胞相一致。大血管也被抗hIL-18BP單抗特異性染色。在獲自活動性CD病人的樣品中陽性染色細胞比獲自非IBD對照者的樣品明顯增多，此與RT-PCR分析觀察到IL-18BP表達增加相關。將毗連切片與相關的小鼠同種型對照(抗體)一起培育。
鑒定存在于粘膜活檢樣品中的IL-18BP產生細胞用巨噬細胞(抗CD68)和內皮細胞(抗CD31)的特異性標志鑒定了發(fā)炎腸組織中的IL-18BP陽性細胞(未顯示)。在活動性CD病人腸組織固有層和粘膜下層檢測到CD68陽性細胞(綠色)和IL-18BP陽性細胞(紅色)(未顯示)。粘膜下層中檢測到CD31陽性細胞(綠色)和IL-18BP陽性細胞(紅色)。為證實巨噬細胞和內皮細胞也是IL-18BP陽性，一起分析了兩種顏色抗CD68或抗CD31為綠色，抗IL-18BP為紅色，證明結合抗IL-18BP抗體的所有細胞或CD68陽性或為CD31陽性(橘黃色)。該免疫雙標記證明巨噬細胞和內皮細胞是CD病人炎癥組織中IL-18BP染色的主要來源。
內皮細胞表達IL-18BP mRNA和蛋白質為了研究人內皮細胞產生IL-18BP的能力以及證實整個活檢樣品免疫染色和RT-PCR所見結果，對人臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)也進行了RT-PCR實驗(圖15A)。用混合細胞因子(hIL-1β、hTNFα、IFNγ)處理內皮細胞，24小時后收集細胞作RNA抽提和RCR分析，IL-18BP與對照肌動蛋白的mRNA水平的比率顯示，24小時后處理細胞中IL-18BP的量比未刺激細胞增加。而且IL-18BP mRNA在內皮細胞中似乎為組成性表達。還分析IL-18 mRNA水平，顯示處理細胞中輕度升高，然而在未刺激內皮細胞中無IL-18mRNA表達。
用非刺激細胞的(培養(yǎng)液)上清液和處理24小時的HUVEC作ELISA，揭示培養(yǎng)液中和受刺激細胞中均有IL-18BP，刺激24小時后增加30倍(圖15B)。
單核細胞系(THP-1)表達IL-18BP蛋白質用ELISA分析了非刺激和受刺激而分化的THP-1細胞培養(yǎng)上清液中IL-18和IL-18BP的表達(圖15C)，該實驗顯示，LPS、hIL-1β、hTNFα、hIFNγ刺激48小時后IL-18BP表達增加，刺激后IL-18分泌平行增加(圖15C)。
小結本研究特征性分析了節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結腸炎病人粘膜組織中IL-18BP的表達和定位。采用半定量RT-PCR方案，發(fā)現活動性節(jié)段性回腸炎病人粘膜活檢樣品中IL-18BP mRNA轉錄比潰瘍性結腸炎和非炎癥對照病人增高。粘膜活檢樣品的免疫組化分析將IL-18BP蛋白定位于內皮細胞和患病時滲入粘膜的巨噬細胞。證實在原代人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)和體外受刺激的THP1單核細胞系中內皮細胞和激活的巨噬細胞表達IL-18BP。刺激后這些細胞分泌生物活性IL-18BP。實施例12 IL-18抑制劑治療緩解了實驗性結腸炎材料與方法小鼠和結腸炎的誘導荷蘭Amsterdam大學動物研究道德委員會批準了所有的實驗。BALB/c小鼠獲自Harlan Sprague Dawlev Inc(Horst，the Netherlands)。小鼠飼養(yǎng)在標準條件下，供應水和食物(AM-11 10mm，Hoke Farms，Woerden，The Netherlands)。
用8周和10周齡BALB/c小鼠進行實驗，直腸給予兩劑量(間隔7天)用48％乙醇(Merck，Darmstadt，Germany)配制的2mg2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)(SigmaChemical CO.St Louis，MO，USA)誘導結腸炎，采用乙烯導管將其置于離肛門3厘米處(每組10只小鼠)。置管時用異氟烷(1-氯-2，2，2-三氟乙基-異氟烷-二氟甲基醚，Abbott Laboratories，Queenborough，Kent，UK)麻醉小鼠，置管后保持管子垂直60秒。對照小鼠經歷同樣過程但用生理鹽水代替。首次給予TNBS后9天(即第二次TNBS攻擊后48小時)處死所有小鼠。
用500μl 0.9％鹽水配的人IL-18BP腹腔注射治療小鼠
hIL-18是在CHO表達系統(tǒng)中生產的帶6個組氨酸尾的注射重組蛋白質，hIL-18BP生物活性是抑制KG-1細胞系產生IFNγ和減少小鼠脾細胞產生IFNγ(Kim等2000)。
炎癥評估每日記錄體重，處死，收集脾、尾淋巴結和結腸。通過中央切口取出結腸沿長軸切開，取出糞便后記錄6cm長的濕重作為與疾病相關的腸壁增厚的指標。然后沿長軸將結腸分成二份，一份用作組織學評估。
組織學分析卷起沿長軸分開的結腸，以4％甲醛固定，包埋石蠟中作常規(guī)組織學檢查。兩位對小鼠處置不知情的研究人員按下列參數進行評分1)涉及區(qū)域的百分比；2)濾泡聚集增生；3)水腫；4)侵蝕/潰瘍；5)濾泡喪失和6)單核細胞和多形核細胞浸潤。涉及區(qū)域百分比和濾泡喪失評分范圍為如下0～4分正常0分，不到10％1分；10％2分；10％-50％3分；50％以上4分。侵蝕定為如果上皮完整為0分，涉及固有層1分，潰瘍涉及粘膜下層2分，潰瘍穿入肌層3分。其他參數的嚴重程度評分范圍為如下0～3分缺乏0分，弱1分，中等2分，嚴重3分。此評分范圍從0到最高26分。
結腸勻漿收集結腸用組織勻漿器在9體積Greenbarger裂解緩沖液(300mM NaCl、15mMTris、2mM MgCl、2mM Triton X-100、抑胃酶肽A、亮抑酶肽、抑蛋白酶肽ng/ml)，pH7.4)中制勻漿。冰上裂解組織30分鐘，然后離心(10分，14000g)二次。勻漿貯存于-20℃直至使用。
細胞培養(yǎng)和細胞因子ELISA測定為制備脾和尾淋巴結細胞懸液，采用細胞過濾器(Becton/Dickinson Labwore，NewJersey，USA)。用含10％FCS和ciproxin(10μg/ml，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)的RPMI 1640培養(yǎng)液(BioWhittaker Boehringer，Verviers Belgium)懸浮細胞。用無菌Ficoll(Pharmacia，Uppsala，Sweden)離心脾細胞，將單個核細胞移入RPMI并對細胞懸液計數。以含抗菌素和10％FCS的200μl RPMI(Biowittaker Europe，A CambrexCompany，Verviers，Belglum)培育總數每孔1×105細胞，一式三孔。以抗CD3單抗(1∶30濃度，145.2C11克隆)和可溶性抗CD28抗體(1∶1000濃度，Pharmigen)預先包被來刺激細胞。48小時后取上清，用ELISA試驗測定IFNγ(Pharmigen)和TNFα(R&D system，Abingdon，UK)濃度。
流式細胞術用Facs緩沖液(PBS，含0.5％BSA，0.3mM EDTA和0.01％NaN3)洗滌分離的脾細胞并保持在冰上以待進行基余步驟。每孔2×105細胞(96孔V形微孔板，GreinerB.V.Labor techniek，Alphen ann de Rijn，The Netherlands)與下述抗體(mAb)共培育Cy-chrome偶聯(lián)的大鼠抗小鼠CD4(克隆RM4-5)、Fitc-偶聯(lián)的大鼠抗小鼠CD69和Fitc-偶聯(lián)的大鼠抗小鼠CD25(Pharmigen，San Diego，CA)，用FACScan流式細胞儀結合Facscan軟件(Becton Dickinson，Mountain View，USA)前散射和側散射門控淋巴細胞，計數5000個細胞，結果表示為所用mAb陽性門控細胞百分率。
統(tǒng)計學分析每治療組給出平均值±SEM。用非參數性Mann-Withmey U檢驗分析組間差異，用單向方差分析分析體重隨時間的變化，P＜0.05為有顯著意義，所有分析采用SPSS統(tǒng)計學軟件(SPSS inc.，Chicago，USA)。
結果IL-18BP保護結腸炎小鼠模型避免體重損失為了研究實驗性結腸炎中IL-18的作用，特別是IL-18結合蛋白(IL-18BP)的保護作用，在BALB/c小鼠中誘發(fā)了TNBS結腸炎。此模型包括局部接觸三硝基苯磺酸(TNBS，以40％乙醇配)，它激發(fā)了對半抗原(三硝基苯)修飾的自身抗原的遲發(fā)型過敏反應，此反應是Th1型，伴有增強的促炎癥細胞因子產生。
每日用人IL-18BP或對照藥腹內注射(ip)治療小鼠。
每日腹內注射劑量12.5μg～50μg hIL-18BP對疾病的嚴重性無影響(資料未展示)。然而用每日200μg劑量hIL-18BP腹內注射有效減少了與此病相關的體重損失。
如預計的那樣，直腸內放置TNBS導致腹瀉和消瘦，如圖16所示，二治療組動物第3天時損失15％基線體重。但與對照小鼠相反，從TNBS放置后4天開始，hIL-18BP治療的小鼠從最初的體重損失迅速復原，第8天時回復到基線體重。對照組小鼠第8天第2次給予TNBS導致顯著失重，給予hIL-18BP則基本上制止了失重。鹽水處理小鼠給予hIL-18BP無效(資料未顯示)。因此，給予hIL-18BP顯著減輕與TNBS誘導的結腸炎相關的體重損失。
對炎癥參數的作用第10天處死小鼠，測定最后6厘米結腸的重量(圖17A)。TNBS結腸炎時結腸重量比鹽水治療小鼠增加，但hIL-18BP治療小鼠的結腸重量增加少得多(181.6mg±11.4，而鹽水治療小鼠為268mg±27.3，P＜0.05)。先前已有報告，TNBS結腸炎伴有細胞向尾淋巴結遷移增加(Camoglio等，2000)。與用鹽水治療的TNBS小鼠尾淋巴結細胞數相比，IL-18BP減少侵入尾淋巴結的細胞數(圖17B)。
CD69表達是早期T淋巴細胞激活的一種標志，用Facscan分析對其進行了測定(圖17C)表達CD69的CD4+脾細胞TNBS處理小鼠為11.4％，而hIL-18BP治療的TNBS小鼠CD4+/CD69+細胞為7.3％(P＜0.05)。
脾、尾淋巴結和結腸勻漿的細胞因子產量為研究T細胞受體活化后hIL-18BP對T淋巴細胞合成促炎癥細胞因子能力的影響，從尾淋巴結和脾分離細胞，并用抗CD3/CD28抗體刺激48小時，測定上清液中IFNγ和TNFα的產量(圖18)。IL-18BP治療和對照治療小鼠細胞因子產量之間未見明顯差異，因此用hIL-18BP中和IL-18，不導致T淋巴細胞對T細胞受體活化應答反應能力的下降。
分析了結腸勻漿的細胞因子水平，測定了細胞因子的局部產量(圖19)，TNBS小鼠和用hIL-18BP治療的TNBS小鼠的結腸勻漿IFNγ水平沒測到差別(分別為134pg/ml±7.8和139pg/ml±23)，然而，hIL-18BP治療小鼠的結腸勻漿中TNFα水平明顯降低，TNBS小鼠為110pg/ml±3，而hIL-18BP治療的TNBS小鼠為59pg/ml±2.7。
組織學發(fā)現為了研究hIL-18BP是否介導炎癥參數的降低，是否還影響組織學評分，對石蠟切片進行了組織病理學分析。hIL-18BP治療小鼠與對照治療小鼠相比，組織學炎癥總評分顯著降低(未治療小鼠15.9±1.1，hIL-18BP治療小鼠9.8±1.3)，主要是因為滲入粘膜的白細胞數減少之故(P＜0.05)。一項顯著發(fā)現是IL-18BP治療小鼠完全沒有粘膜潰瘍(P＜0.05)。這些發(fā)現總結于下述表2中。IL-18BP治療小鼠完全預防了潰瘍的產生，是特別顯著的。
表2 TNBS小鼠用鹽水或rhIL-18BPa治療的各項結腸炎評分
數據以均值±SEM表示，范圍為0～4，*表示有顯著性差異。
抗m IL-18多克隆抗體保護右旋糖酐硫酸鈉誘導的結腸炎小鼠模型不患病。
在此模型中，從0天開始至動物處死，在飲水中給予右旋糖酐硫酸鈉(DSS)。第0、4和8天ip給予抗IL-18BP多克隆抗體，劑量是200μl和400μl兔血清，該最高劑量(400μl)顯著減少了體重損失，臨床評分，直腸出血和結腸縮短(未顯示)。兔抗mIL-18治療顯示延遲此病發(fā)作并防止其進展(未顯示)。
小結上述實施例12表明，給予hIL-18BP或抗IL-18多克隆抗血清來中和IL-18，有效地降低了小鼠實驗性誘導結腸炎的嚴重程度。
每日hIL-18BP腹腔內注射治療的小鼠，與對照治療小鼠相比，從最初的體重減少迅速復原。通過結腸重量和細胞進入尾淋巴結測得的其他結腸炎癥參數在hIL-18BP治療小鼠中也降低。治療小鼠組織病理學特征是組織破壞(潰瘍)嚴重程度降低，滲出細胞數相當程度降低。如脾細胞CD69表達降低所證明的，hIL-18BP的作用也是全身性的。
結腸勻漿中測得的TNFα局部產生的hIL-18BP治療的TNBS小鼠中明顯降低，這表明TNFα在此病發(fā)展中起了重要作用。TNBS小鼠和用hIL-18BP治療的TNBS小鼠之間的IFNγ水平相當，可能解釋是誘導IFNγ的刺激減少。
結論，上述資料表明，IL-18抑制劑在治療炎癥性結腸病中具有良好效果。
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權利要求
1.IL18抑制劑在制造治療和/或預防肝損傷藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其中肝損傷是急性損傷。
3.根據權利要求1所述的應用，其中肝損傷是慢性損傷。
4.根據權利要求1-3任一項所述的應用，其中肝損傷是酒精性肝炎、病毒性肝炎、免疫性肝炎、暴發(fā)型肝炎、肝硬化和原發(fā)性膽汁性肝硬化。
5.根據權利要求4所述的應用，其中肝損傷是暴發(fā)型肝炎。
6.IL-18抑制劑在制造治療和/或預防關節(jié)炎藥物中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其中關節(jié)炎是炎癥性關節(jié)炎。
8.根據權利要求6所述的應用，其中炎癥性關節(jié)炎是類風濕關節(jié)炎。
9.IL-18抑制劑在制造治療和/或預防軟骨破壞藥物中的應用。
10.IL-18抑制劑在制造治療和/或預防炎癥性腸病藥物中的應用。
11.根據權利要求10所述的應用，其中炎癥性腸病是節(jié)段性回腸炎。
12.根據權利要求10所述的應用，其中炎癥性腸病是潰瘍性結腸炎。
13.根據權利要求1-12任一項所述的應用，其中，IL-18抑制劑選自Caspase-1(ICE)抑制劑、抗IL-18抗體、抗IL-18受體亞基之一的抗體、IL-18信號傳導通路抑制劑、能與IL-18競爭和阻抑IL-18受體的IL-18拮抗劑及IL-18結合蛋白，具有IL-18結合蛋白相同活性的其同工型、突變型蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或環(huán)狀變換衍生物。
14.根據權利要求13所述的應用，其中IL-18抑制劑是IL-18抗體。
15.根據權利要求14所述的應用，其中IL-18抗體是人化的IL-18抗體。
16.根據權利要求15所述的應用，其中IL-18抗體是人IL-18抗體。
17.根據權利要求13所述的應用，其中IL-18抑制劑是IL-18結合蛋白或其同工型、突變型蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或環(huán)狀變換衍生物。
18.根據權利要求17所述的應用，其中IL-18結合蛋白是PEG化蛋白。
19.根據權利要求17所述的應用，其中IL-18抑制劑是融合蛋白，它包含融合于免疫球蛋白所有部分或一部分的全部或部分的IL-18結合蛋白，并且其中融合蛋白結合于IL-18。
20.根據權利要求19所述的應用，其中融合蛋白包含免疫球蛋白所有或部分恒定區(qū)。
21.根據權利要求20所述的應用，其中免疫球蛋白是IgG1或IgG2同種型。
22.根據上述權利要求任何一項所述的應用，其中藥物還包括干擾素。
23.根據權利要求22所述的應用，其中干擾素是干擾素-β。
24.根據權利要求22或23所述的應用，其中IL-18抑制劑與干擾素同時、先后或分開使用。
25.根據上述權利要求任何一項所述的應用，其中藥物還包括腫瘤壞死因子(TNF)拮抗劑。
26.根據權利要求25所述的應用，其中TNF拮抗劑是TBPI和/或TBPII。
27.根據權利要求25或26所述的應用，其中IL-18抑制劑和/或干擾素與TNF拮抗劑同時、先后或分開使用。
28.根據上述權利要求任何一項所述的應用，其中藥物還包括COX抑制劑。
29.根據權利要求28所述的應用，其中COX抑制劑是COX-2抑制劑。
30.根據上述權利要求任何一項所述的應用，其中IL-18抑制劑的用量為每公斤體重約0.0001-10mg，或每公斤體重約0.01-5mg，或每公斤體重約0.1-3mg，或每公斤體重約1-2mg。
31.根據上述權利要求任何一項所述的應用，其中IL-18抑制劑的用量為每公斤體重約0.1-1000微克，或每公斤體重約1-100微克，或每公斤體重約10-50微克。
32.根據上述權利要求任何一項所述的應用，其中IL-18抑制劑通過皮下注射給藥。
33.根據上述權利要求任何一項所述的應用，其中IL-18抑制劑通過肌肉注射給藥。
34.根據上述權利要求任何一項所述的應用，其中IL-18抑制劑每日給藥。
35.根據上述權利要求任何一項所述的應用，其中IL-18抑制劑每隔一日給藥。
36.含有IL-18抑制劑編碼序列的表達載體在制造治療和/或預防肝損傷藥物中的應用。
37.含有IL-18抑制劑編碼序列的表達載體在制造治療和/或預防肝損傷關節(jié)炎藥物中的應用。
38.含有IL-18抑制劑編碼序列的表達是載體在制造治療和/或預防炎、癥性腸病藥物中的應用。
39.根據權利要求36-38任何一項所述的用于基因療法的應用。
40.誘導和/或增強細胞內源性產生IL-18抑制劑的載體在制造治療和/或預防肝損傷藥物中的應用。
41.誘導和/或增強細胞內源性產生IL-18抑制劑的載體在制造治療和/或預防關節(jié)炎藥物中的應用。
42.誘導和/或增強細胞內源性產生IL-18抑制劑的載體在制造治療和/或預防炎癥性腸道疾病藥物中的應用。
43.經基因工程修飾以產生IL-18抑制劑的細胞在制造治療和/或預防肝損傷藥物中的應用。
44.經基因工程修飾以產生IL-18抑制劑的細胞在制造治療和/或預防關節(jié)炎藥物中應用。
45.經基因工程修飾以產生IL-18抑制劑的細胞在制造治療和/或預防炎癥性腸道病癥中的應用。
46.一種藥物組合物，包含治療有效量的IL-18抑制劑和治療有效量的干擾素。
47.一種藥物組合物，包含治療有效量的IL-18抑制劑和治療有效量的TNF拮抗劑。
48.一種藥物組合物，包含治療有效量的IL-18抑制劑和治療有效量的COX-2抑制劑、
49.一種藥物組合物，包含治療有效量的IL-18抑制劑聯(lián)合治療有效量的干擾素、TNF拮抗劑或COX-2抑制之一種或全部。
50.治療和/或預防肝損傷的方法，其特征在于，包括給予需要者有效抑制量的IL-18抑制劑。
51.治療和/或預防關節(jié)炎的方法，其特征在于，包括給予需要者有效抑制量的IL-18抑制劑。
52.治療和/或預防炎癥性腸道疾病的方法，其特征在于，包括給予需要者有效抑制量的IL-18抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及到在制備治療和/或預防肝臟損傷的藥物中，應用IL－18抑制劑。本發(fā)明涉及到在制備治療和/或預防關節(jié)炎，特別是類風濕性關節(jié)炎的藥物中，應用IL－18抑制劑。此外，本發(fā)明涉及在制備治療和/或預防炎癥性腸病，特別是Crohn’s(節(jié)段性回腸炎)病和潰瘍性結腸炎的藥物中，應用IL－18抑制劑。
文檔編號A61P31/12GK1404400SQ01805293
公開日2003年3月19日 申請日期2001年2月20日 優(yōu)先權日2000年2月21日
發(fā)明者Y·奇韋提克, C·迪納埃羅, C·普拉特爾－齊貝克, S·馮德文特, M·魯賓斯坦, D·諾維克, S·H·金 申請人:應用研究系統(tǒng)Ars股份公司, 耶達研究發(fā)展有限公司