專利名稱：用于生產(chǎn)型動物的改良dna疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于家畜(特別是牛和豬)的改良DNA疫苗。
背景技術(shù)：
自從二十世紀(jì)九十年代初以來，已經(jīng)了解了脫氧核糖核酸(DNA)分子在接種中的用途(Wolf等人，Science 1990.247.1465-1468)。用編碼有免疫活性的蛋白質(zhì)的DNA或RNA分子體內(nèi)轉(zhuǎn)染將要接種的受體的細胞后，該接種技術(shù)誘發(fā)細胞和體液免疫。
一種DNA疫苗由至少一種質(zhì)粒和藥學(xué)可接受的載體或賦形劑組成，這種質(zhì)粒由將要接種的受體的細胞機器表達。該質(zhì)粒的核苷酸序列尤其編碼一種或多種免疫原，例如能夠在將要接種的受體中誘發(fā)細胞免疫應(yīng)答(T淋巴細胞的動員)和體液免疫應(yīng)答(刺激產(chǎn)生針對免疫原的特異性抗體)的蛋白質(zhì)或糖蛋白(Davis H.L.Current Opinion Biotech.1997.8.635-640)。
來自病原體的所有免疫原都不是在將要接種的動物中自然地十分有效地誘發(fā)最佳保護性免疫應(yīng)答的抗原。因此必須增強免疫應(yīng)答。
已提出DNA疫苗的多種施用途徑(腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、粘膜等)。也提出了多種施用工具，特別是DNA包被和發(fā)射的金顆粒—用以穿透到將要接種的受體的皮膚細胞內(nèi)(Tang等人，Nature 1992.356.152-154)，和液體射流注射器—能轉(zhuǎn)染皮膚細胞和下面的組織細胞(Furth等人，Analytical Bioch.1992.205.365-368)。
一些化學(xué)化合物已經(jīng)用于DNA的體外轉(zhuǎn)染A/-陽離子脂類。
陽離子脂類本身分為4個亞類。
1)含有季銨鹽的陽離子脂，如DOTMA(二油酰-氧丙基三甲銨，Gibco生產(chǎn)，商品名為Lipofectine)、DOTAP(三甲基-2，3-(十八碳-9-烯酰氧基)-1-丙基銨；Gregoriadis等人，F(xiàn)EBS Letters 1997.402.107-110)、DMRIE(N-(2-羥乙基)-N， N-二甲基-2，3-雙(十四烷氧基)-1-丙基銨；WO-A-9634109)、DLRIE(N-(2-羥乙基)-N，N-二甲基-2，3-雙(十二烷氧基)-1-丙基銨；Felgner等人，Ann.N Y Acad.Sci.1995.772.126-139)。
這些含有季銨鹽的陽離子脂可以與另一種中性脂組合，如DOPC(二油酰-磷脂酰膽堿)或DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)(J.P.Behr，Bioconjugate Chemistry 1994，5.382-389)。
2)脂胺(lipoamine)，如DOGS(雙十八烷基氨基甘氨酰精胺，Promega生產(chǎn)，商品名為Transfectam；Abdallah等人，Biol.Cell.1995.85.1-7)、DC-Chol(二甲基氨基乙烷-氨甲?；?膽固醇；Gao和Huang，Biochem.Biophys.Res.Commun.1991.179.280-285)、BGSC(雙胍-亞精胺-膽固醇)、BGTC(雙胍-三(氨乙基)胺-膽固醇)(Vigneron等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996.93.9682-9686)。
3)含有季銨鹽和脂銨的陽離子脂類，如DOSPA(N，N-二甲基-N-(2-(精胺羧基酰胺基)乙基)-2，3-雙(二油酰氧基)-1-丙烷亞胺五氫-氯化物，Gibco銷售，商品名為LipofectAmine；Hawley-Nelson等人，F(xiàn)ocus 1993.15.73-79)、GAP-DLRIE(N-(3-氨基丙基)-N，N-二甲基-2，3-雙(十二烷氧基)-1-丙烷銨；Wheeler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996.93.11454-11459；Norman等人，Vaccine 1997.15.801-803)。
4)含有脒鹽的脂類，如ADPDE、ADODE(Ruysschaert等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.1994.203.1622-1628)。
B/-聚合物，如SuperFectTM(活化的dendrimer分子，Qiagen生產(chǎn)；Xu等人，Mol.Genet.Metab.1998.64.193-197)，和C/-生物化學(xué)劑，如毒素，特別是霍亂毒素。
這些化合物中有一些已經(jīng)用于配制效果減輕的DNA疫苗。體外轉(zhuǎn)染領(lǐng)域的知識不適用于DNA接種，后者的最終目的在于確保保護性免疫反應(yīng)。利用已知能促進體外轉(zhuǎn)染的化合物觀察到對誘發(fā)有效免疫保護的負面影響。一些制劑化學(xué)化合物在高劑量時對轉(zhuǎn)染的細胞有毒性。
在Etchart的工作中(Etchart等人，J.Gen.Virol.1997.78.1577-1580)，在經(jīng)鼻內(nèi)途徑施用DNA疫苗的過程中使用DOTAP沒有佐劑作用，而經(jīng)口途徑有佐劑作用。DOTAP也已經(jīng)用于編碼流感病毒血凝素(HA)的DNA疫苗(用于小鼠模型)，經(jīng)鼻內(nèi)途徑施用(Ban等人，Vaccine1997.15.811-813)，但是加入DOTAP抑制免疫應(yīng)答。在通過肌內(nèi)途徑施用的編碼乙肝病毒表面蛋白(S)的DNA疫苗(用于小鼠模型)中使用DC-Chol或DOTAP/DOPE，能提高抗體應(yīng)答，而使用Lipofectine(或DOTMA)不能提高這種應(yīng)答(Gregoriadis等人，F(xiàn)EBS Letters 1997.402.107-110)。DC-Chol/DOPE也已經(jīng)用于針對人類免疫缺陷病毒(HIV，Env蛋白)的DNA疫苗(用于小鼠模型)，經(jīng)肌內(nèi)途徑施用誘發(fā)更有效的免疫應(yīng)答，而經(jīng)皮下或皮內(nèi)途徑施用不能提高這種應(yīng)答(Ishii等人，AIDS Res.Hum.Retro.1997.13.1421-1428)。
添加某些細胞因子，特別是白介素和干擾素，能提高特別是由DNA疫苗誘發(fā)的免疫應(yīng)答。每種細胞因子引發(fā)一種特異性的反應(yīng)，將免疫應(yīng)答較高或較低程度地定向于細胞反應(yīng)或體液反應(yīng)(Pasquini等人，Immunol.Cell.Biol.1997.75.397-401；Kim等人，J.InterferonCytokine Res.1999.19.77-84)。如果免疫內(nèi)容不同，特別是如果對另外的物種施用這種細胞因子，因此處于異源免疫系統(tǒng)中，從特定種獲得的細胞因子的佐劑作用不一定相同。加入細胞因子也可能沒有佐劑作用，或者甚至可能導(dǎo)致所研究的作用逆轉(zhuǎn)，也就是說，免疫應(yīng)答降低或者抑制。因此，編碼與GM-CSF融合的單鏈免疫球蛋白的DNA疫苗不能增強免疫應(yīng)答，而直接對小鼠施用這種融合蛋白是有效的，施用由Fv和細胞因子IL-1β組成的融合蛋白，或者施用編碼后一種融合蛋白的DNA疫苗，具有相同的結(jié)果(Hakim等人，J.Immunol.1996.157.5503-5511)。使用以融合或非融合構(gòu)象共表達細胞因子IL-2和乙型肝炎病毒包膜蛋白的質(zhì)粒導(dǎo)致體液和細胞免疫應(yīng)答均增強(Chow等人，J.Virol.1997.71.169-78)。然而，使用編碼人類獲得性免疫缺陷病毒(HIV-1)糖蛋白gp120和細胞因子IL-2的雙順反子質(zhì)粒，比使用只編碼gp120的單順反子質(zhì)粒誘發(fā)更低的特異性抗-gp120免疫應(yīng)答(Barouch等人，J.Immunol.1998.161.1875-1882)。向小鼠中同時注射兩種表達載體—一種編碼狂犬病病毒G糖蛋白，另一種編碼鼠GM-CSF-刺激B和T淋巴細胞的活性，而同時注射編碼γ-干擾素(代替鼠GM-CSF)的質(zhì)粒導(dǎo)致免疫應(yīng)答降低(Xiang等人，Immunity 1995.2.129-135)。
抗原的某種修飾，如編碼抗原的核苷酸序列部分的缺失，DNA片段插入編碼抗原的核苷酸序列中或非翻譯區(qū)上游或下游，也能提高DNA疫苗的效能，特別是通過提高抗原的表達水平或其遞呈。
然而實際上，對編碼抗原的核苷酸序列操作可能導(dǎo)致最初的免疫活性降低或喪失。因此，編碼狂犬病病毒G抗原的基因中跨膜域缺失，使得通過肌內(nèi)途徑施用編碼這種修飾抗原的DNA疫苗后在小鼠模型中誘發(fā)的保護水平降低(Xiang等人，Virol.1995.209.569)。編碼牛皰疹病毒(HBV)gD糖蛋白的基因中跨膜域缺失，在經(jīng)肌內(nèi)途徑接種的牛中不能增強抗體應(yīng)答，只能誘發(fā)部分保護(van Drunen Little-van den Hurk等人，J.Gen.Virol.1998.79.831-839)。在用編碼埃博拉病毒GP糖蛋白的DNA疫苗或用編碼分泌形式的此種GP糖蛋白的DNA疫苗免疫后攻擊的豚鼠中，體液和細胞免疫應(yīng)答及引起的保護相同(Xu等人，NatureMedicine 1998.4.37-42)向編碼瘧疾Pf332抗原的基因中插入人組織纖溶酶原激活物(tPA)的信號序列，在經(jīng)肌內(nèi)途徑接種的小鼠中不能增強抗體應(yīng)答(Haddad等人，F(xiàn)EMS 1997.18.193-202)。向編碼鼠輪狀病毒VP7抗原的基因中同時加入tPA序列，在經(jīng)皮內(nèi)途徑接種的小鼠中也不能增強抗體應(yīng)答，而由VP4抗原和tPA組成的融合蛋白則致使應(yīng)答增強，但不誘發(fā)有效的保護(Choi等人，Virology 1998.250.230-240)。
對一種抗原的核苷酸序列進行的修飾通常不能直接用于另一種抗原，因為抗原不總是具有相同的結(jié)構(gòu)排列。

發(fā)明內(nèi)容
本申請人有提高DNA接種效率的目的。其目的特別在于通過DNA接種在家畜(特別是牛和豬)中獲得更好的免疫應(yīng)答，特別是有效的保護。
本申請人以生產(chǎn)如下改良DNA疫苗為目的，這些疫苗能在牛中誘發(fā)有效和保護性的免疫應(yīng)答，對抗1型牛皰疹病毒(BHV-1)，也稱為牛傳染性鼻氣管炎(IBR)，牛呼吸道合胞病毒(BRSV)，粘膜病病毒或1型或2型牛瘟病毒(牛病毒性腹瀉病毒或BVDV-1和BVDV-2)，3型副流感病毒(bPI-3)。
本申請人以生產(chǎn)如下改良DNA疫苗為目的，這些疫苗能在豬中誘發(fā)有效和保護性的免疫應(yīng)答，包含至少一種針對選自下列的病毒的效價豬皰疹病毒或奧耶斯基病(假狂犬病病毒或PRV)、豬生殖道呼吸道綜合征病毒(porcine reproductive respiratory syndrome virus)(或PRRSV)、豬流感病毒(或SIV)、普通豬霍亂病毒(或HCV)、細小病毒。
本申請人也以生產(chǎn)如下改良DNA疫苗為目的，這些疫苗能在牛中獲得有效和保護性的免疫保護，包含至少一種針對BHV-1、BRSV、BVDV、bPI-3和狂犬病病毒的效價。
本發(fā)明的主題是改良的DNA疫苗，它們能獲得針對至少一種感染家畜(特別是牛和豬)的病原體的有效保護。DNA疫苗的改良方法包括配制、添加GM-CSF、抗原的優(yōu)化或這些辦法的組合。
優(yōu)選地，DNA疫苗的改良方法是配制，任選地添加GM-CSF或抗原優(yōu)化，或者最后添加GM-CSF和優(yōu)化抗原。
根據(jù)定義，DNA疫苗含有編碼并表達基因或基因片段(例如表位)的質(zhì)粒作為活性成分。術(shù)語質(zhì)粒包括DNA轉(zhuǎn)錄單元，它含有多核苷酸序列，該序列含有將要表達的基因序列和在體內(nèi)表達所必需的元件。環(huán)狀質(zhì)粒形式、超螺旋形式等是優(yōu)選的。線性形式也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
每個質(zhì)粒含有啟動子，它能確保插入的基因在其控制下在宿主細胞中表達。它們通常是強真核啟動子，特別是巨細胞病毒早期啟動子CMV-IE，是人或鼠來源的，或者任選地是其它來源的，如大鼠或豚鼠來源的。一般來說，啟動子是病毒來源或細胞來源的。關(guān)于CMV-IE以外的病毒啟動子，能夠提到的有SV40病毒早期或晚期啟動子，或勞斯肉瘤病毒LTR啟動子。也可以是衍生基因的病毒的啟動子，例如對該基因特異的啟動子。至于細胞啟動子，能夠提到的有細胞骨架基因的啟動子，如結(jié)蛋白啟動子，或肌動蛋白啟動子。當(dāng)幾個基因存在于同一質(zhì)粒中時，它們可能在同一轉(zhuǎn)錄單元或幾個不同的單元中。
根據(jù)第一種模式，通過加入含有季銨鹽的下式陽離子脂作為佐劑配制根據(jù)本發(fā)明的DNA疫苗 其中R1是飽和或不飽和的線型脂族基團，含有12-18個碳原子，R2是另一脂族基團，含有2或3個碳原子，X是羥基或氨基。
優(yōu)選地，這是DMRIE(N-(2-羥乙基)-N，N-二甲基-2，3-雙(十四烷基氧基)-1-丙銨；WO-A-9634109)，優(yōu)選與中性脂，特別是DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)組合，形成DMRIE-DOPE。
因此，本發(fā)明的主題是一種針對至少一種侵襲家畜(特別是牛或豬)的病原體的DNA疫苗，它含有至少一種質(zhì)?！撡|(zhì)粒含有至少一種編碼動物種病原體的免疫原的核苷酸序列(在允許該序列在體內(nèi)表達的條件下)，和含有季銨鹽的陽離子脂，特別是DMRIE，優(yōu)選地與DOPE組合。
優(yōu)選地，在使用前即刻將重組載體與該佐劑混合，優(yōu)選地在對動物施用之前使這樣制備的混合物形成復(fù)合物，例如保持10-60分鐘，特別是30分鐘左右。
當(dāng)含有DOPE時，DMRIE∶DOPE的摩爾比優(yōu)選地是95∶5至5∶95，更特別地是1∶1。
質(zhì)粒DMRIE或DMRIE-DOPE佐劑的重量比尤其可以為50∶1至1∶10，特別是10∶1至1∶5，優(yōu)選地1∶1至1∶2。
根據(jù)第二種模式，向根據(jù)本發(fā)明的疫苗中加入GM-CSF(粒細胞巨噬細胞集落刺激因子；Clark S.C.等人，Science 1987.230.1229；GrantS.M.等人，Drugs 1992.53.516)；其實現(xiàn)方法可以是直接向疫苗組合物中摻入GM-CSF蛋白，或者優(yōu)選地在允許體內(nèi)表達的條件下向表達載體中插入編碼GM-CSF的核苷酸序列。對于表達載體，優(yōu)選地使用質(zhì)粒，例如含有編碼目的抗原的核苷酸序列的質(zhì)?；蛄硪毁|(zhì)粒。優(yōu)選地根據(jù)將要接種的動物種選擇GM-CSF；因此，對于牛，使用牛GM-CSF；對于豬，使用豬GM-CSF。
根據(jù)第三種模式，編碼免疫原的核苷酸序列是一種優(yōu)化的形式。優(yōu)化是指核苷酸序列的任何修飾，特別是至少表現(xiàn)為該核苷酸序列的較高水平的表達，和/或編碼該抗原的信使RNA的穩(wěn)定性提高，和/或引發(fā)向胞外基質(zhì)中分泌該抗原，直接或間接的結(jié)果是誘發(fā)的免疫應(yīng)答增強。
在本發(fā)明中，目的抗原的優(yōu)化優(yōu)選地在于編碼目的抗原跨膜域的核苷酸序列片段的缺失(缺失是指完全缺失或足以使跨膜域不再或基本上不再有功能的部分缺失)，和/或在于編碼tPA(Montgomery等人，Cell.Mol.Biol.1997.43.285-292；Harris等人，Mol.Biol.Med.1986.3.279-292)信號的核苷酸序列的框內(nèi)添加，和/或在于穩(wěn)定化內(nèi)含子向?qū)⒁磉_的基因上游的插入。編碼目的抗原跨膜域的DNA片段的缺失促使截短的抗原向胞外基質(zhì)中分泌，從而提高了它們與免疫系統(tǒng)的細胞接觸的可能性。編碼tPA信號的核苷酸序列的插入提高與tPA信號連接的信使RNA的可翻譯性，從而提高該信使RNA的表達水平，因此提高抗原的產(chǎn)生水平。tPA信號也在合成抗原的分泌中起作用。
也可以使用其它編碼信號肽的核苷酸序列，特別是從蜜蜂中獲得的編碼蜂毒肽的信號肽的序列(Sisk W.P.等人，1994，J.Virol.68，766-775)。
穩(wěn)定化內(nèi)含子插入編碼目的抗原的基因中避免了其信使RNA的異常剪接，并且保持后者的物理完整性。
優(yōu)選地，tPA信號是人源的。人tPA信號的核苷酸序列可從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得，編號為NM_000930。優(yōu)選地，內(nèi)含子是兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II(van Ooyen等人，Science 1979.206.337-344)，其核苷酸序列可從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得，編號為V00882，在參考文獻中命名為2號內(nèi)含子。
本發(fā)明的主題是一種改良DNA疫苗，它在牛中能誘發(fā)針對牛傳染性鼻氣管炎(IBR)的有效和保護性的免疫應(yīng)答。
引起牛傳染性鼻氣管炎的病毒是1型牛皰疹病毒(BHV-1)，它是甲型皰疹病毒科(Alphaherpesviridae)的成員(Babiuk L.A.等人，1996，Vet.Microbiol.，53，31-42)。編碼糖蛋白gB、gC和gD的核苷酸序列已知，可從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得，編號為AJ004801。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地通過用根據(jù)本發(fā)明的佐劑(特別是DMRIE，優(yōu)選地是DMRIE-DOPE)配制，改進針對IBR的DNA疫苗。任選地，可以同時加入牛GM-CSF(Maliszewski等人，Molec.Immunol.，1988，25，843-850)，或者優(yōu)化至少一種IBR抗原，或者最后加入牛GM-CSF和優(yōu)化至少一種IBR抗原。
編碼牛GM-CSF的核苷酸序列可從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得，編號為U22385。
牛GM-CSF的添加可以如下實現(xiàn)向疫苗組合物中摻入牛GM-CSF多肽，或者優(yōu)選地向體內(nèi)表達載體(優(yōu)選地質(zhì)粒)中插入編碼牛GM-CSF的核苷酸序列。優(yōu)選地，編碼牛GM-CSF的核苷酸序列插入第二表達質(zhì)粒(例如pLF1032，實施例13)中，該質(zhì)粒不同于插入編碼IBR抗原的基因的質(zhì)粒。
來自IBR的抗原的優(yōu)化如下進行將糖蛋白gB和/或糖蛋白gC和/或糖蛋白gD的信號肽序列替換為一種“信號”序列，特別是人源tPA信號的那些(GenBank編號NM_000930)，和/或缺失編碼gB和/或gC和/或gD跨膜域的DNA片段。編碼這些糖蛋白之一的跨膜域的DNA片段優(yōu)選地伴隨著鄰接的C端部分(糖蛋白的胞質(zhì)部分)缺失。根據(jù)本發(fā)明的針對IBR的DNA疫苗因此能編碼并表達一種優(yōu)化的IBR抗原(gB、gC或gD)或其中兩種或所有三種，即，優(yōu)化的gB、優(yōu)化的gC和優(yōu)化的gD。
能在本發(fā)明中應(yīng)用的編碼BHV-1抗原的核苷酸序列，和表達載體的不同構(gòu)建體，在附加實施例和FR-A1-2751229中，特別是在實施例7和8及圖3和圖4中給出。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，針對HBV-1的DNA疫苗用DMRIE-DOPE配制，包含編碼BHV-1 gB抗原的表達質(zhì)粒(例如pPB281，實施例3.1.2)，通過缺失編碼跨膜域的核苷酸序列片段和鄰接的C端部分優(yōu)化；編碼BHV-1gC抗原的第二表達質(zhì)粒(例如pPB292，實施例3.2.2)，通過缺失編碼跨膜域的核苷酸序列片段和鄰接的C端部分優(yōu)化；編碼BHV-1gD抗原的第三表達質(zhì)粒(例如pPB284，實施例3.3.2)，通過缺失編碼跨膜域的核苷酸序列片段和鄰接的C端部分優(yōu)化。
通常，且不僅對于BHV-1，與編碼跨膜域的序列鄰接的C端部分可能是保守的。然而，與編碼跨膜域的序列同時刪除它通常比較容易。
本發(fā)明的目的也在于一種改良DNA疫苗，它在牛中能誘發(fā)針對牛呼吸道合胞病毒(BRSV)的有效和保護性的免疫應(yīng)答。
BRSV病毒是一種副粘病毒，也是副粘病毒科(Paramyxoviridae)的成員(Baker等人，Vet.Clin.North Am.Food Anim.Pract.，1997，13，425-454)。編碼F蛋白和G糖蛋白的核苷酸序列已知，可從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得，編號分別為Y17970和U33539。
針對BRSV的DNA疫苗優(yōu)選地用根據(jù)本發(fā)明的佐劑(特別是DMRIE，優(yōu)選地是DMRIE-DOPE)配制。任選地，可以同時加入牛GM-CSF，或者優(yōu)化至少一種BRSV抗原，或者最后加入牛GM-CSF和優(yōu)化至少一種BRSV抗原。
牛GM-CSF的添加可以如BHV-1所述進行。
來自BRSV的抗原的優(yōu)化如下進行將BRSV的F蛋白和/或BRSV的G包膜糖蛋白的信號序列替換為一種“信號”序列，特別是人源tPA信號序列，和/或缺失編碼F和/或G的跨膜域的DNA片段。編碼這些蛋白質(zhì)之一的跨膜域的DNA片段優(yōu)選地伴隨著鄰接的C端部分缺失。根據(jù)本發(fā)明的針對BRSV的DNA疫苗因此能編碼并表達一種優(yōu)化的BRSV抗原(F或G)或此兩者(F和G)。
能在本發(fā)明中應(yīng)用的編碼BRSV抗原的核苷酸序列，和不同表達載體構(gòu)建體，在附加實施例和FR-A1-2751229中，特別是在實施例9和10及圖5和圖6中給出。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，針對BRSV的DNA疫苗用DMRIE-DOPE配制，包含編碼BRSV F抗原的表達質(zhì)粒(例如pSB114，實施例4.1.3)，通過插入人tPA的信號序列代替F的信號序列、缺失編碼跨膜域的F的核苷酸序列片段和鄰接的C端部分優(yōu)化；編碼BRSV G抗原的第二表達質(zhì)粒(例如pSB110，實施例4.2.2)，通過插入人tPA的信號序列代替G的信號序列、缺失編碼G的跨膜域的核苷酸序列片段和鄰接的C端部分優(yōu)化。
本發(fā)明的主題也在于一種改良DNA疫苗，它在牛中能誘發(fā)針對BVDV病毒的有效和保護性的免疫應(yīng)答。
BVDV病毒是黃病毒科(Flaviviridae)的一種瘟病毒。它廣泛分布于牛群中，表現(xiàn)為胚胎畸形、流產(chǎn)或臨床呼吸道(粘膜病)和腸道(牛病毒性腹瀉)癥狀。
BVDV病毒可以根據(jù)臨床指征的嚴(yán)重程度區(qū)分，分成兩組1型BVDV(不明顯的或輕度的臨床指征)和2型BVDV(急性臨床指征，出血，高發(fā)病率，高死亡率)(Dean H.J.和Leyh R.，1999，Vaccine，17，1117-1124)。
當(dāng)BVDV病毒類型不能清楚地指明時，該病毒被認為是1型或2型。
BVDV病毒是一種包膜單鏈RNA病毒，由編碼一種多蛋白的單基因組成，該多蛋白在裂解后產(chǎn)生幾種明確區(qū)分的蛋白質(zhì)，特別是E0蛋白(gp48)和E2蛋白(gp53)(Vassilev V.B.等人，1997，J.Virol.，71，471-478)。
編碼E0-E2多蛋白的核苷酸序列已知，可從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得，BVDV-1的保藏號為M96687，BVDV-2的為AF145967。
針對BVDV的DNA疫苗優(yōu)選地用根據(jù)本發(fā)明的佐劑(特別是DMRIE，優(yōu)選地是DMRIE-DOPE)配制。任選地，可以同時加入牛GM-CSF，或者優(yōu)化至少一種BVDV抗原，或者最后加入牛GM-CSF和優(yōu)化至少一種BVDV抗原。
牛GM-CSF的添加可以如BHV-1所述進行。
來自BVDV的抗原的優(yōu)化如下進行在編碼BVDV的E0蛋白和/或BVDV的E2蛋白的核苷酸序列上游添加一種“信號”序列，特別是人源tPA的信號序列，和/或缺失編碼E2跨膜域的DNA片段，和/或在編碼E0和/或E2的核苷酸序列上游插入內(nèi)含子，特別是兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II。根據(jù)本發(fā)明的針對BVDV的DNA疫苗因此能編碼并表達一種優(yōu)化的BVDV抗原(E0或E2)或此兩者(E0和E2)。
能在本發(fā)明中應(yīng)用的編碼BVDV抗原的核苷酸序列，和表達載體的不同構(gòu)建體，在附加實施例和FR-A1-2751229中，特別是在實施例13及圖9中給出。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，針對BVDV的DNA疫苗用DMRIE-DOPE配制，包含編碼BVDV E0抗原的表達質(zhì)粒(例如pLF1029，實施例5.1.2，pLF1031，實施例6.2.2)，通過在E0上游插入人tPA的信號序列并且在E0上游插入兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II優(yōu)化；編碼BVDV E2抗原的第二表達質(zhì)粒(例如pLF1021，實施例5.2.2，pLF1023，實施例6.1.2)，通過在E2上游插入人tPA的信號序列、缺失編碼E2跨膜域的核苷酸序列片段和鄰接的C端部分并且在E2上游插入兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II優(yōu)化。
能有利地生產(chǎn)一種質(zhì)?；旌衔?。該混合物可含有至少兩種表達質(zhì)粒，每種均表達一種不同的免疫原(E0或E2)和/或從不同類型的BVDV(BVDV-1或BVDV-2)獲得。特別是，混合物由表達BVDV-1E0、BVDV-1E2、BVDV-2E0和BVDV-2E2的4種質(zhì)粒組成。
本發(fā)明的主題也在于一種改良的DNA疫苗，它能在牛中誘發(fā)針對3型副流感病毒(bPI-3)的有效和保護性的免疫應(yīng)答。
bPI-3病毒是一種副粘病毒，也是副粘病毒科的成員(Tsai等人，Infect.Immun.，1975，11，783-803)。
編碼bPI-3的血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)和融合蛋白(F)的核苷酸序列已知，可從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得，保藏號為U31671。
針對bPI-3的DNA疫苗優(yōu)選地用根據(jù)本發(fā)明的佐劑(特別是DMRIE，優(yōu)選地是DMRIE-DOPE)配制。任選地，可以同時加入牛GM-CSF，或者優(yōu)化至少一種bPI-3抗原，或者最后加入牛GM-CSF和優(yōu)化至少一種bPI-3抗原。
牛GM-CSF的添加可以如BHV-1所述進行。
來自bPI-3的抗原的優(yōu)化如下進行將bPI-3的血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)的和/或bPI-3的融合蛋白(F)的信號序列替換為一種“信號”序列，特別是人源tPA信號序列，和/或缺失編碼HN和/或F的跨膜域的DNA片段，和/或在編碼HN和/或F的核苷酸序列上游插入一種內(nèi)含子，特別是兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II。編碼這些蛋白質(zhì)之一的跨膜域的DNA片段優(yōu)選地伴隨著鄰接的C端部分缺失。根據(jù)本發(fā)明的針對bPI-3的DNA疫苗因此能編碼并表達一種優(yōu)化的bPI-3抗原(HN或F)或此兩者(HN和F)。
能在本發(fā)明中應(yīng)用的編碼bPI-3抗原的核苷酸序列，和不同表達載體構(gòu)建體，在附加實施例和FR-A1-2751229中，特別是在實施例14和15及

圖10和圖11中給出。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，針對bPI-3的DNA疫苗用DMRIE-DOPE配制，包含編碼bPI-3HN抗原的表達質(zhì)粒(例如pLF1025，實施例7.1.2)，通過插入人tPA的信號序列代替HN的信號序列、缺失編碼跨膜域的HN的核苷酸序列片段和鄰接的C端部分并且在HN上游插入兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II優(yōu)化；編碼bPI-3F抗原的第二表達質(zhì)粒(例如pLF1027，實施例7.2.2)，通過插入人tPA的信號序列代替F的信號序列、缺失編碼F的跨膜域的核苷酸序列片段和鄰接的C端部分并且在F上游插入兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II優(yōu)化。
本發(fā)明的主題也在于一種改良DNA疫苗，它在豬中能誘發(fā)針對皰疹病毒(PRV)的有效和保護性的免疫應(yīng)答。
PRV是甲型皰疹病毒科(Alphaherpesvirinae)的成員，該病毒引起奧耶斯基病(Sawitzky D.，Arch.Virol.Suppl.，1997，13，201-206)。
編碼糖蛋白gB、gC和gD的核苷酸序列已知，可從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得，保藏號分別為M17321、AF158090、AF086702。
針對PRV的DNA疫苗優(yōu)選地用根據(jù)本發(fā)明的佐劑(特別是DMRIE，優(yōu)選地是DMRIE-DOPE)配制。任選地，可以同時加入豬GM-CSF(Inumaru S.和Takamatsu H.，Immunol.Cell.Biol.，1995，73，474-476)，或者優(yōu)化至少一種PRV抗原，或者最后加入豬GM-CSF和優(yōu)化至少一種PRV抗原。
豬GM-CSF的添加可以如下進行向疫苗組合物中摻入豬GM-CSF多肽，或者向體內(nèi)表達載體(優(yōu)選地質(zhì)粒)中插入編碼豬GM-CSF的核苷酸序列(例如，可從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得，保藏號為D21074)。優(yōu)選地，編碼豬GM-CSF的核苷酸序列插入第二表達質(zhì)粒(例如pLF1033，實施例14)中，該質(zhì)粒不同于插入編碼PRV抗原的基因的質(zhì)粒。
來自PRV的抗原的優(yōu)化如下進行將糖蛋白gB和/或糖蛋白gC和/或糖蛋白gD的信號肽序列替換為一種“信號”序列，特別是人源tPA信號序列(GenBank保藏號NM_000930)，和/或缺失編碼gB和/或gC和/或gD跨膜域的DNA片段。編碼這些糖蛋白之一的跨膜域的DNA片段優(yōu)選地伴隨著鄰接的C端部分缺失。根據(jù)本發(fā)明的針對PRV的DNA疫苗因此可編碼并表達一種優(yōu)化的PRV抗原(gB、gC或gD)或其中兩種或所有三種，即，優(yōu)化的gB、優(yōu)化的gC和優(yōu)化的gD。
能在本發(fā)明中應(yīng)用的編碼PRV抗原的核苷酸序列，和不同表達載體構(gòu)建體，在附加實施例和FR-A1-2751224中，特別是在實施例8和9以及圖3和圖5中給出。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，針對PRV的DNA疫苗用DMRIE-DOPE配制，包含編碼PRV gB抗原的表達質(zhì)粒(例如pSB102，實施例8.1.2)，通過缺失編碼跨膜域的核苷酸序列片段和鄰接的C端部分優(yōu)化；編碼PRV gC抗原的第二表達質(zhì)粒(例如pSB104，實施例8.2.2)，通過缺失編碼跨膜域的核苷酸序列片段和鄰接的C端部分優(yōu)化；編碼PRV gD抗原的第三表達質(zhì)粒(例如pSB106，實施例8.3.2)，通過缺失編碼跨膜域的核苷酸序列片段和鄰接的C端部分優(yōu)化。
本發(fā)明的目的也在于一種改良DNA疫苗，它在豬中能誘發(fā)針對豬生殖道呼吸道綜合征病毒(PRRSV)的有效和保護性的免疫應(yīng)答。
PRRSV是一種動脈炎病毒(Arterivirus)，是動脈炎病毒科(Arteriviridae)的成員(Murtaugh等人，Arch.Virol.，1995，140，1451-1460)。
編碼由開放閱讀框ORF3、ORF5和ORF6編碼的蛋白質(zhì)的核苷酸序列已知，可從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得，保藏號為U87392。
針對PRRSV的DNA疫苗優(yōu)選地用根據(jù)本發(fā)明的佐劑(特別是DMRIE，優(yōu)選地是DMRIE-DOPE)配制。任選地，可以同時加入豬GM-CSF，或者優(yōu)化至少一種PRRSV抗原，或者最后加入豬GM-CSF和優(yōu)化至少一種PRRSV抗原。
豬GM-CSF的添加可以如PRV所述進行。
來自PRRSV的抗原的優(yōu)化如下進行將開放閱讀框3(ORF3，gp45或大包膜糖蛋白)和/或糖蛋白ORF5(gp25或包膜糖蛋白E)和/或糖蛋白ORF6(gp18或膜蛋白)編碼的蛋白質(zhì)的信號肽序列替換為一種“信號”序列，特別是人源tPA信號序列(GenBank保藏號NM-000930)，和/或缺失編碼ORF3和/或ORF5和/或ORF6跨膜域的DNA片段。編碼這些糖蛋白之一的跨膜域的DNA片段優(yōu)選地伴隨著鄰接的C端部分缺失。根據(jù)本發(fā)明的針對PRRSV的DNA疫苗因此可編碼并表達一種優(yōu)化的PRRSV抗原(ORF3、ORF5或ORF6)或其中兩種或所有三種，即，優(yōu)化的ORF3、優(yōu)化的ORF5和優(yōu)化的ORF6。
能在本發(fā)明中應(yīng)用的編碼PRRSV抗原的核苷酸序列，和不同表達載體構(gòu)建體，在附加實施例和FR-A1-2751224中，特別是在實施例14-17以及圖14-17中給出。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，針對PRRSV的DNA疫苗用DMRIE-DOPE配制，包含編碼PRRSV ORF3抗原的表達質(zhì)粒(例如pLF1009，實施例9.1.1，pLF1015，實施例10.1.1)；編碼PRRSV ORF5抗原的第二表達質(zhì)粒(例如pLF1012，實施例9.2.2，pLF1018，實施例10.2.2)，通過將ORF5的信號序列替換為人tPA信號肽序列、缺失編碼跨膜域的核苷酸序列片段和鄰接的C端部分優(yōu)化；編碼PRRSV ORF6抗原的第三種表達質(zhì)粒(例如pLF1014，實施例9.3.2，pLF1016，實施例10.3.2)，通過將ORF6的信號序列替換為人tPA信號肽序列、缺失編碼跨膜域的核苷酸序列片段和鄰接的C端部分優(yōu)化。
可以有利地能生產(chǎn)一種質(zhì)粒混合物。該混合物可含有至少兩種表達質(zhì)粒，每種均表達一種不同的免疫原(ORF3、ORF5或ORF6)和/或從不同的PRRSV株(例如歐洲株，如Lelystad，美國株ATCC VR-2332)獲得。特別是，一種混合物由表達PRRSV Lelystad ORF3、PRRSV Lelystad ORF5、PRRSV Lelystad ORF6、PRRSV VR-2332 ORF3、PRRSV VR-2332 ORF5和PRRSV VR-2332 ORF6的6種質(zhì)粒組成。
本發(fā)明的主題也在于一種改良的DNA疫苗，它能在豬中誘發(fā)針對豬流感病毒(SIV)的有效和保護性的免疫應(yīng)答。
SIV病毒是一種A族流感病毒，是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的成員(Murphy B.R.和Webster R.G.，《病毒學(xué)》，第二版，B.N.Fields，D.M.Knipe等人編寫，Raven Press Ltd.，紐約1990)。
編碼SIV H1N1株和H3N2株的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)蛋白的核苷酸序列已知，可從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得，保藏號分別為K00992、U86145、U07146、AF153238。
針對SIV的DNA疫苗優(yōu)選地用根據(jù)本發(fā)明的佐劑(特別是DMRIE，優(yōu)選地是DMRIE-DOPE)配制。任選地，可以同時加入豬GM-CSF，或者優(yōu)化至少一種SIV抗原，或者最后加入豬GM-CSF和優(yōu)化至少一種SIV抗原。
豬GM-CSF的添加可以如PRV所述進行。
來自SIV的抗原的優(yōu)化如下進行將SIV血凝素(HA)和/或SIV神經(jīng)氨酸酶(NA)蛋白的信號序列替換為一種“信號”序列，特別是人源tPA信號序列，和/或缺失編碼HA和/或NA的跨膜域的DNA片段，和/或在編碼HA和/或NA的核苷酸序列上游插入一種內(nèi)含子，特別是兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II。編碼這些蛋白質(zhì)之一的跨膜域的DNA片段優(yōu)選地伴隨著鄰接的C端部分缺失。根據(jù)本發(fā)明的針對SIV的DNA疫苗因此可編碼并表達一種優(yōu)化的SIV抗原(HA或NA)或此兩者(HA和NA)。
能在本發(fā)明中應(yīng)用的編碼SIV抗原的核苷酸序列，和不同表達載體構(gòu)建體，在附加實施例和FR-A1-2751224中給出，對于SIV H1N1株，特別是在實施例10和11及圖7和圖9中給出，對于SIV H3N2株，在實施例12和13及圖11和圖13中給出。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，針對SIV的DNA疫苗用DMRIE-DOPE配制，包含編碼SIV HA抗原的表達質(zhì)粒(例如pLF1002，實施例11.1.2，pLF1006，實施例12.1.2)，通過插入人tPA的信號序列代替HA的信號序列、缺失編碼跨膜域的HA的核苷酸序列片段和鄰接的C端部分并且在HA上游插入兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II優(yōu)化；編碼SIV NA抗原的第二表達質(zhì)粒(例如pLF1004，實施例11.2.2，pLF1008，實施例12.2.2)，通過插入人tPA的信號序列代替NA的信號序列、缺失編碼NA的跨膜域的核苷酸序列片段和鄰接的C端部分并且在NA上游插入兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II優(yōu)化。
可以有利地生產(chǎn)一種質(zhì)?；旌衔铩Ｔ摶旌衔锟珊兄辽賰煞N表達質(zhì)粒，每種均表達一種不同的免疫原(HA或NA)和/或來自于不同的SIV株(例如H1N1或H3N2)。特別是，一種混合物由表達SIV HiN1 HA、SIVH1N1 NA、SIV H3N2 HA和SIV H3N2 NA的4種質(zhì)粒組成。
盡管本發(fā)明對特定DNA疫苗進行了描述，但是本發(fā)明特別是根據(jù)本發(fā)明的佐劑的應(yīng)用也適用于針對這些動物種的其它病原體的DNA疫苗。
出于同樣的考慮，對于一個動物種，根據(jù)本發(fā)明的疫苗可以互相組合，和/或與針對同一種的其它病原體的DNA疫苗組合。
其它病原體尤其可能是狂犬病病毒、豬霍亂病毒和豬細小病毒。
針對狂犬病病毒的根據(jù)本發(fā)明的免疫原制劑或改良DNA疫苗尤其含有一種質(zhì)粒，該質(zhì)粒編碼未修飾的狂犬病病毒的G糖蛋白和DMRIE-DOPE，任選地添加GM-CSF。
針對豬細小病毒的根據(jù)本發(fā)明的改良免疫原制劑或DNA疫苗尤其含有一種質(zhì)粒，該質(zhì)粒編碼來自細小病毒的抗原(例如VP2蛋白，F(xiàn)R-A1-2751224的實施例18和圖18)和DMRIE-DOPE，任選地添加豬GM-CSF(例如pLF1033，實施例14)。
針對豬霍亂病毒(HCV)的根據(jù)本發(fā)明的改良免疫原制劑或DNA疫苗尤其含有一種質(zhì)粒，該質(zhì)粒編碼來自HCV的抗原(例如E1蛋白，同一文獻的實施例19和圖19，或E2蛋白，實施例20和圖20)和DMRIE-DOPE，任選地添加豬GM-CSF(例如pLF1033，實施例14)。
因此，本發(fā)明的主題也在于改良的多價DNA疫苗，它能在牛中獲得針對選自BHV-1、BRSV、BVDV、bPI-3和狂犬病病毒的至少兩種牛病原體的有效保護。
本發(fā)明的主題也在于改良的多價DNA疫苗，它能在豬中獲得針對選自PRV病毒、PRRSV病毒、SIV病毒、豬霍亂病毒(或HCV)和豬細小病毒的至少兩種豬病原體的有效保護。
這些多價DNA疫苗可以通過用根據(jù)本發(fā)明的佐劑(特別是DMRIE，優(yōu)選地是DMRIE-DOPE)配制加以改進。任選地可以同時加入如前所述的GM-CSF，或者優(yōu)化至少一種如前所述的目的抗原，或者最后加入GM-CSF和優(yōu)化至少一種目的抗原。
根據(jù)本發(fā)明的改良多價DNA疫苗由一種或多種表達質(zhì)粒構(gòu)成，以致這些疫苗在體內(nèi)表達第一病原體的至少一種免疫原，和感染同一動物物種的至少一種其它病原體的至少一種免疫原。其中至少一種免疫原優(yōu)選地選自下列組別的成員-對于牛，BRSV的F、BRSV的G、BHV-1的gB、BHV-1的gC、BHV-1的gD、BVDV-1的E0、BVDV-1的E2、BVDV-2的E0、BVDV-2的E2、bPI-3的F和bPI-3的HN，和-對于豬，PRV的gB、PRV的gC、PRV的gD、PRRSV Lelystad株的ORF3、PRRSV Lelystad株的ORF5、PRRSV Lelystad株的ORF6、PRRSVVR-2332株的ORF3、PRRSV VR-2332株的ORF5、PRRSV VR-2332株的ORF6、SIV H1N1株的HA、SIV H1N1株的NA、SIV H3N2株的HA和SIV H3N2株的NA。
也可以利用一種體內(nèi)表達載體(例如痘病毒、腺病毒、皰疹病毒)，將根據(jù)本發(fā)明的改良單價或多價DNA疫苗與至少一種常規(guī)疫苗(滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗)或重組疫苗組合，對抗感染同一種的至少一種不同的病原體，或者用作這些疫苗的強化劑。
關(guān)于構(gòu)建具有這些牛效價的質(zhì)粒的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可參考FR-A1-2751229，對于具有豬效價的質(zhì)粒的方法，參考FR-A1-2751224。
本發(fā)明的目的也在于一種接種家畜(特別是?；蜇i)的方法。這種接種方法包括施用如上所述的單價或多價改良DNA疫苗之一。這些接種方法涉及用于被動轉(zhuǎn)移免疫性的妊娠雌畜或幼畜或成畜。該接種方法包括施用一次或多次改良DNA疫苗。
在根據(jù)本發(fā)明的疫苗中使用的DNA的量，對于特定質(zhì)粒，為約10μg至約1000μg，優(yōu)選地約50μg至約500μg。本領(lǐng)域技術(shù)人員具有精確確定每一接種方案所用DNA的有效劑量所必需的能力。
優(yōu)選地，劑量體積為0.2至5ml，優(yōu)選地1至3ml。
在該接種方法中，可以通過現(xiàn)有技術(shù)中用于多核苷酸接種的多種施用途徑，并利用已知的施用技術(shù)，施用根據(jù)本發(fā)明的改良DNA疫苗。
根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選模式，接種方法包括，通過肌內(nèi)途徑、皮下途徑或者借助于無針注射器通過皮內(nèi)途徑施用根據(jù)本發(fā)明的改良DNA疫苗。
現(xiàn)在將借助于被視為非限制性實施例的實施方案并參照附圖更詳細地描述本發(fā)明，其中圖1質(zhì)粒pVR1012圖2質(zhì)粒pAB110序列表SEQ ID NO 1寡核苷酸PB326SEQ ID NO 2寡核苷酸PB329SEQ ID NO 3寡核苷酸SB090SEQ ID NO 4寡核苷酸SB091SEQ ID NO 5寡核苷酸LF001SEQ ID NO 6寡核苷酸LF002SEQ ID NO 7寡核苷酸PB234SEQ ID NO 8寡核苷酸PB235SEQ ID NO 9寡核苷酸PB511SEQ ID NO 10寡核苷酸PB512SEQ ID NO 11寡核苷酸SB221SEQ ID NO 12寡核苷酸SB222SEQ ID NO 13寡核苷酸PB507SEQ ID NO 14寡核苷酸PB508SEQ ID NO 15寡核苷酸PB513SEQ ID NO 16寡核苷酸PB514SEQ ID NO 17寡核苷酸SB223
SEQ ID NO 18寡核苷酸SB224SEQ ID NO 19寡核苷酸PB497SEQ ID NO 20寡核苷酸PB498SEQ ID NO 21寡核苷酸SB225SEQ ID NO 22寡核苷酸SB226SEQ ID NO 23寡核苷酸SB210SEQ ID NO 24寡核苷酸SB211SEQ ID NO 25寡核苷酸SB212SEQ ID NO 26寡核苷酸SB220SEQ ID NO 27寡核苷酸SB213SEQ ID NO 28寡核苷酸SB214SEQ ID NO 29寡核苷酸SB215SEQ ID NO 30寡核苷酸SB216SEQ ID NO 31寡核苷酸LF050SEQ ID NO 32寡核苷酸LF051SEQ ID NO 33寡核苷酸LF052SEQ ID NO 34寡核苷酸LF053SEQ ID NO 35寡核苷酸LF039SEQ ID NO 36寡核苷酸LF040SEQ ID NO 37寡核苷酸LF041SEQ ID NO 38寡核苷酸LF042SEQ ID NO 39寡核苷酸LF043SEQ ID NO 40寡核苷酸LF044SEQ ID NO 41寡核苷酸LF045SEQ ID NO 42寡核苷酸LF046SEQ ID NO 43寡核苷酸LF064SEQ ID NO 44寡核苷酸LF065SEQ ID NO 45寡核苷酸LF066SEQ ID NO 46寡核苷酸LF067
SEQ ID NO 47寡核苷酸LF047SEQ ID NO 48寡核苷酸LF048SEQ ID NO 49寡核苷酸LF058SEQ ID NO 50寡核苷酸LF059SEQ ID NO 51寡核苷酸LF060SEQ ID NO 52寡核苷酸LF061SEQ ID NO 53寡核苷酸LF062SEQ ID NO 54寡核苷酸LF063SEQ ID NO 55寡核苷酸SB201SEQ ID NO 56寡核苷酸SB202SEQ ID NO 57寡核苷酸SB203SEQ ID NO 58寡核苷酸SB217SEQ ID NO 59寡核苷酸SB204SEQ ID NO 60寡核苷酸SB205SEQ ID NO 61寡核苷酸SB206SEQ ID NO 62寡核苷酸SB218SEQ ID NO 63寡核苷酸SB207SEQ ID NO 64寡核苷酸SB208SEQ ID NO 65寡核苷酸SB209SEQ ID NO 66寡核苷酸SB219SEQ ID NO 67寡核苷酸LF027SEQ ID NO 68寡核苷酸LF028SEQ ID NO 69寡核苷酸LF019SEQ ID NO 70寡核苷酸LF020SEQ ID NO 71寡核苷酸LF021SEQ ID NO 72寡核苷酸LF022SEQ ID NO 73寡核苷酸LF023SEQ ID NO 74寡核苷酸LF024SEQ ID NO 75寡核苷酸LF025
SEQ ID NO 76寡核苷酸LF026SEQ ID NO 77寡核苷酸LF037SEQ ID NO 78寡核苷酸LF038SEQ ID NO 79寡核苷酸LF029SEQ ID NO 80寡核苷酸LF030SEQ ID NO 81寡核苷酸LF031SEQ ID NO 82寡核苷酸LF032SEQ ID NO 83寡核苷酸LF033SEQ ID NO 84寡核苷酸LF034SEQ ID NO 85寡核苷酸LF035SEQ ID NO 86寡核苷酸LF036SEQ ID NO 87寡核苷酸LF003SEQ ID NO 88寡核苷酸LF004SEQ ID NO 89寡核苷酸LF005SEQ ID NO 90寡核苷酸LF006SEQ ID NO 91寡核苷酸LF007SEQ ID NO 92寡核苷酸LF008SEQ ID NO 93寡核苷酸LF009SEQ ID NO 94寡核苷酸LF010SEQ ID NO 95寡核苷酸LF011SEQ ID NO 96寡核苷酸LF012SEQ ID NO 97寡核苷酸LF013SEQ ID NO 98寡核苷酸LF014SEQ ID NO 99寡核苷酸LF015SEQ ID NO 100寡核苷酸LF016SEQ ID NO 101寡核苷酸LF017SEQ ID NO 102寡核苷酸LF018SEQ ID NO 103寡核苷酸LF054SEQ ID NO 104寡核苷酸LF055
SEQ ID NO 105寡核苷酸LF056SEQ ID NO 106寡核苷酸LF057
以大約10mg的規(guī)模純化加入疫苗組合物的質(zhì)粒，用氯化銫-溴化乙錠梯度法(Sambrook等人，1989)進行。實施例2基本質(zhì)粒構(gòu)建體由質(zhì)粒pVR1020(圖1，WO-A-9803199的圖1和實施例7)衍生的真核表達質(zhì)粒pVR1020(C.J.Luke等人，J.of Infecetious Diseases，1997，175，95-97)含有人組織纖溶酶原激活物(tPA)信號序列的編碼序列。
通過BamHI-BglII消化并插入一種序列修飾質(zhì)粒pVR1020，該插入序列含有幾個克隆位點(BamHI、NotI、EcoRI、XbaI、PmII、PstI、BglII)，由下列寡核苷酸的配對產(chǎn)生PB326(40mer)(SEQ ID NO 1)5′GATCTGCAGCACGTGTCTAGAGGATATCGAATTCGCGGCC 3′和PB329(40mer)(SEQ ID NO 2)5′GATCCGCGGCCGCGAATTCGATATCCTCTAGACACGTGCT 3′.
這樣獲得的載體大小約為5105個堿基對(或bp)，稱為pAB110(圖2)。
用兔外周血細胞的基因組DNA作為模板，利用下列寡核苷酸通過PCR產(chǎn)生相應(yīng)的DNA片段SB090(20mer)(SEQ ID NO 3)5 ′TTGGGGACCCTTGATTGTTC 3′和SB091(21mer)(SEQ ID NO 4)5′CTGTAGGAAAAAAGAAGAAGGC 3′之后，將兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II克隆到載體pCRII(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中，產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pNS050。
表達質(zhì)粒pAB110如下修飾向位于組織纖溶酶原激活物(tPA)信號肽ATG上游的SalI位點導(dǎo)入兔珠蛋白基因內(nèi)含子II的序列。利用下列寡核苷酸對，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，由質(zhì)粒pNS050擴增兔珠蛋白基因內(nèi)含子II的序列
LF001(30mer)(SEQ ID NO 5)5′CTCCATGTCGACTTGGGGACCCTTGATTGT 3′和LF002(30mer)(SEQ ID NO 6)5′CTCCATGTCGACCTGTAGGAAAAAGAAGAA 3′PCR產(chǎn)物(573個堿基對或bp)用SalI消化，克隆到預(yù)先用SalI線性化的質(zhì)粒pAB110中，產(chǎn)生約5678bp的質(zhì)粒pLF999。實施例3編碼不同形式的1型牛皰疹病毒(BHV-1)抗原的質(zhì)粒含有BHV-1 B901株的gB、gC和gD基因的病毒DNA片段如下分離用不同限制酶消化病毒基因組，通過瓊脂糖凝膠電泳分離，利用對應(yīng)于BHV-1 ST株gB、gC和gD基因片段的探針通過Southern印跡法分析(Leung-Tack D.等人，Virology，1994，199，409-421)。也能使用BHV-1科羅拉多株[cooper](ATCC號VR-864)。將這樣鑒定的片段克隆到載體pBluescript SK+(Stratagene，La Jolla，CA，USA)中，位于這三個基因向表達載體pVR1012克隆的起點。3.1編碼不同形式的BHV-1gB的質(zhì)粒3.1.1 pPB280克隆到載體pVR1012中的gB基因(原始形式)含有BHV-1gB基因的5’和3’部分的兩種XhoI-XhoI片段通過Southern印跡法鑒定，克隆到預(yù)先用XhoI消化的載體pBluescript SK+(Stratagene，La Jolla，CA，USA)中。這樣獲得的質(zhì)粒分別命名為pPB128和pPB117。
用NotI和XhoI消化含有g(shù)B基因5’片段的質(zhì)粒pPB128，產(chǎn)生1708bp的片段(片段A)。
用XhoI和StuI消化含有g(shù)B基因3’部分的質(zhì)粒pPB117，產(chǎn)生1345bp的片段。將后一片段克隆到預(yù)先用EcoRV和XhoI消化的載體pBluescript KS+(Stratagene，La Jolla，CA，USA)中。產(chǎn)生的質(zhì)粒稱為pPB279。然后用XhoI和BamHI消化質(zhì)粒pPB279，產(chǎn)生1413bp的DNA片段(片段B)。
然后將片段A和B克隆到用NotI和BamHI消化的載體pBluescriptKS+中，產(chǎn)生質(zhì)粒pPB278(約6063bp)，允許BHV-1gB基因的重構(gòu)。
載體pPB278然后在PCR反應(yīng)中用作模板，該反應(yīng)利用下列寡核苷酸進行
PB234(30mer)(SEQ ID NO 7)5′TTGTCGACATGGCCGCTCGCGGCGGTGCTG 3′和PB235(21mer)(SEQ ID NO 8)5′GCAGGGCAGCGGCTAGCGCGG 3′.PCR產(chǎn)物(146bp)用限制酶SalI和NheI消化。
質(zhì)粒pPB278用NheI和BamHI消化。這樣獲得的2728bp片段和預(yù)先消化的PCR片段連接到預(yù)先用SalI和BamHI消化的載體pVR1012(實施例2)中，產(chǎn)生大小約為7742bp的質(zhì)粒pPB280。
BHV-1gB基因編碼一種有933個氨基酸的蛋白質(zhì)。3.1.2 pPB281克隆到載體pVR1012中的gB基因(Δ[TM-Cter]形式)BHV-1gB基因的截短形式(其跨膜域(TM)和羧基端(Cter)域缺失)的獲得方法是向SalI和BamHI預(yù)消化的質(zhì)粒pVR1012(實施例2)中連接以SalI-PvuII消化質(zhì)粒pPB280(實施例3.1.1)獲得的大小為2234bp的片段和由下列寡核苷酸配對獲得的56bp片段PB511(52mer)(SEQ ID NO 9)5′CTGCACGAGCTCCGGTTCTACGACATTGACCGCGTGGTCAAGACGGACTGAG3′和PB512(57mer)(SEQ ID NO 10)5′GATCCTCAGTCCGTCTTGACCACGCGGTCAATGTCGTAGAACCGGAGCTCGTGCAG 3′.
這樣產(chǎn)生的質(zhì)粒大小約為7154bp，稱為pPB281。截短的BHV-1 gB基因編碼一種有759個氨基酸的蛋白質(zhì)。3.1.3 pSB115克隆到載體pAB110中的gB基因(tPAΔ[TM-Cter]形式)利用下列引物，由模板pPB281(實施例3.1.2)PCR擴增BHV-1gB基因的tPAΔ[TM-Cter]形式SB221(39mer)(SEQID NO 11)5′AAAATTTCGATATCCGCCGCGGGGCGACCGGCGACAACG 3′和SB222(33mer)(SEQ ID NO 12)5′GGAAGATCTTCAGTCCGTCTTGACCACGCGGTC 3′用酶EcoRV和BglII消化擴增產(chǎn)物(2088bp)，克隆到預(yù)先用EcoRV和BglII消化的載體pAB110(實施例2)中，產(chǎn)生大小約為7154bp的質(zhì)粒pSB115。
gB基因的tPAΔ[TM-Cter]形式編碼一種有729個氨基酸的糖蛋白，含有BHV-1gB糖蛋白的胞外域。3.2編碼不同形式的BHV-1gC的質(zhì)粒3.2.1 pPB264克隆到載體pVR1012中的gC基因(原始形式)含有完整BHV-1gC基因的3.5kb的BamHI-HindIII片段通過Southern印跡法鑒定，并克隆到載體pBluescript SK+中。這樣獲得的質(zhì)粒稱為pPB287。
然后用NcoI-BssSI消化質(zhì)粒pPB287。獲得大小為1492bp的消化片段。將它與通過下列寡核苷酸配對獲得的合成DNA片段連接PB507(37mer)(SEQ ID NO 13)5′TCGTGCCTGCGGCGCAAGGCCCGGGCGCGCCTGTAGT 3′和PB508(37mer)(SEQ ID NO 14)5′CTAGACTACAGGCGCGCCCGGGCCTTGCGCCGCAGGC 3′克隆到用NcoI和XbaI預(yù)消化的質(zhì)粒pLitmus 28(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA，USA)中，產(chǎn)生中間質(zhì)粒pPB290。
將PstI和XbaI消化pPB290產(chǎn)生的1554bp片段克隆到預(yù)先用PstI和XbaI消化的載體pVR1012(實施例2)中，從而產(chǎn)生大小約為6427bp的質(zhì)粒pPB264。BHV-1gC基因編碼一種有508個氨基酸的蛋白質(zhì)。3.2.2 pPB292克隆到載體pVR1012中的gC基因(Δ[TM-Cter]形式)通過將下列三種DNA片段連接于預(yù)先用PstI和XbaI消化的載體pVR1012(實施例2)中，獲得BHV-1gC基因的截短形式。
(a)用PstI和XhoI消化pPB264(實施例3.2.1)產(chǎn)生的1035bp片段，(b)用XhoI和BanI消化pPB264產(chǎn)生的350bp片段，和(c)由寡核苷酸PB513和PB514配對產(chǎn)生的43bp合成片段。
這些寡核苷酸如下
PB513(43mer)(SEQ ID NO 15)5′GCACCGCTGCCCGAGTTCTCCGCGACCGCCACGTACGACTAGT 3′和PB514(43mer)(SEQ ID NO 16)5′CTAGACTAGTCGTACGTGGCGGTCGCGGAGAACTCGGGCAGCG 3 ′.
這樣獲得的大小約為6305bp的質(zhì)粒稱為pPB292。截短的BHV-1gC基因編碼一種有466個氨基酸的蛋白質(zhì)。3.2.3 pSB116克隆到載體pAB110中的gC基因(tPAΔ[TM-Cter]形式)利用下列引物，由模板pPB292(實施例3.2.2)PCR擴增BHV-1gC基因的tPAΔ[TM-Cter]形式SB223(39mer)(SEQ ID NO 17)5 ′AAAATTTCGATATCCCGGCGGGGGCTCGCCGAGGAGGCG 3′和SB224(32mer)(SEQ ID NO 18)5′GGAAGATCTCTAGTCGTACGTGGCGGTCGCGG 3′用EcoRV和BglII酶消化擴增產(chǎn)物(1362bp)，克隆到預(yù)先用EcoRV和BglII消化的載體pAB110(實施例2)中，產(chǎn)生大小約為6404bp的質(zhì)粒pSB116。
gC基因的tPAΔ[TM-Cter]形式編碼一種有479個氨基酸的糖蛋白，其含有BHV-1gC糖蛋白的胞外域。3.3編碼不同形式的BHV-1gD的質(zhì)粒3.3.1 pPB148克隆到載體pVR1012中的gD基因(原始形式)含有BHV-1gD基因的5kb的XhoI-XhoI片段通過Southern印跡法鑒定，克隆到預(yù)先用XhoI消化的載體pBluescript SK+中，產(chǎn)生質(zhì)粒pPB147。
然后將NdeI和BsrBI消化pPB147產(chǎn)生的325bp片段與NdeI和StyI消化pPB147產(chǎn)生的943bp片段連接到用EcoRV和XbaI預(yù)消化的載體pVR1012(實施例2)中，從而產(chǎn)生大小約為6171bp的質(zhì)粒pPB148。BHV-1gD基因編碼一種有417個氨基酸的蛋白質(zhì)。3.3.2 pPB284克隆到載體pVR1012中的gD基因(Δ[TM-Cter]形式)利用下列引物對
PB497(33mer)(SEQ ID NO 19)5′TTTCTGCAGATGCAAGGGCCGACATTGGCCGTG 3′和PB498(31mer)(SEQ ID NO 20)5′TTTCTAGATTAGGGCGTAGCGGGGGCGGGCG 3′.對PstI和XbaI預(yù)消化的BHV-1病毒B901株的基因組DNA進行PCR擴增，由這樣獲得的片段獲得截短的BHV-1gD基因。
然后將該PCR片段克隆到用PstI和XbaI預(yù)消化的質(zhì)粒pVR1012(實施例2)中，產(chǎn)生大小約為5943bp的質(zhì)粒pPB284。截短的BHV-1gD基因編碼一種有355個氨基酸的蛋白質(zhì)。3.3.3 pSB117克隆到載體pAB110中的gD基因(tPAΔ[TM-Cter]形式)利用下列引物，由模板pPB284(實施例3.3.2)PCR擴增BHV-1gD基因的tPAΔ[TM-Cter]形式SB225(39mer)(SEQ ID NO 21)5′AAAATTTCGATATCCCCCGCGCCGCGGGTGACGGTATAC 3′和SB226(33mer)(SEQ ID NO 22)5′GGAAGATCTTTAGGGCGTAGCGGGGGCGGGCGG 3′用酶EcoRV和BglII消化擴增產(chǎn)物(1029bp)，克隆到預(yù)先用EcoRV和BglII消化的載體pAB110(實施例2)中，產(chǎn)生大小約為6071bp的質(zhì)粒pSB117。
gD基因的tPAΔ[TM-Cter]形式編碼一種有368個氨基酸的糖蛋白，含有BHV-1gD糖蛋白的胞外域。實施例4編碼不同形式的牛呼吸道合胞病毒(BRSV)抗原的質(zhì)粒編碼BRSV病毒F和G抗原的基因由Snook株的病毒RNA通過RT-PCR獲得(Thomas等人，Research in Vet.Science，1982，33，170-182)。也可以使用BRSV A 51908株(ATCC號VR-794)。4.1編碼不同形式的BRSV-F的質(zhì)粒4.1.1 pSB107克隆到載體pVR1012中的F基因(原始形式)用病毒RNA作為模板，利用下列引物，經(jīng)RT-PCR擴增BRSV Snook株的F基因SB210(34mer)(SEQ ID NO 23)5′AAATTTTCTGCAGATGGCGACAACAGCCATGAGG 3′和SB211(35mer)(SEQ ID NO 24)5′TTAAGGATCCTCATTTACTAAAGGAAAGATTGTTG 3 ′.
用酶PstI和BamHI消化大小為1739bp的擴增產(chǎn)物，克隆到預(yù)先用PstI和BamHI消化的載體pVR1o12(實施例2)中，從而產(chǎn)生大小約為6583bp的質(zhì)粒pSB107。
BRSV病毒的F基因編碼一種有574個氨基酸的蛋白質(zhì)。4.1.2 pSB108克隆到載體pVR1012中的F基因(Δ[TM-Cter]形式)用病毒RNA作為模板，利用下列引物，經(jīng)RT-PCR擴增BRSV Snook株F基因的截短形式SB210(SEQ ID NO 23) 和SB212(39mer)(SEQ ID NO 25)5′AATTTTGGATCCTCATGTGGTGGATTTTCCTACATCTAC 3′.
用酶PstI和BamHI消化擴增產(chǎn)物(1581bp)，克隆到預(yù)先用PstI和BamHI消化的載體pVR1012(實施例2)中，產(chǎn)生大小約為6430bp的質(zhì)粒pSB108。
F基因的截短形式編碼一種有523個氨基酸的糖蛋白，含有BRSV F糖蛋白的胞外域。4.1.3 pSB114克隆到載體pAB110中的F基因(tPAΔ[TM-Cter]形式)用病毒RNA作為模板，利用下列引物，通過RT-PCR擴增BRSV Snook株的F基因的tPAΔ[TM-Cter]形式SB212(SEQ ID NO 25)和SB220(38mer)(SEQ ID NO 26)5′AAAATTCACGTGAACATAACAGAAGAATTTTATCAATC 3′.
用酶PmlI和BglII消化擴增產(chǎn)物(1516bp)，克隆到預(yù)先用PmlI和BglII消化的載體pAB110(實施例2)中，產(chǎn)生大小約為6572bp的質(zhì)粒pSB114。
F基因的tPAΔ[TM-Cter]形式編碼一種有535個氨基酸的糖蛋白，含有BRSV F糖蛋白的胞外域。4.2編碼不同形式的BRSV-G的質(zhì)粒對于BRSV G蛋白(II型糖蛋白)，信號序列和跨膜序列無法區(qū)別，在跨膜域缺失過程中需要在對應(yīng)于胞外域的序列上游添加一個信號序列。
質(zhì)粒pAB110(實施例2)用于構(gòu)建含有編碼BRSV G蛋白的基因的截短形式的質(zhì)粒。4.2.1 pSB109克隆到載體pVR1012中的G基因(原始形式)用病毒RNA作為模板，利用下列引物，經(jīng)RT-PCR擴增BRSV Snook株的G基因SB213(32mer)(SEQ ID NO 27)5′ACGCGTCGACATGTCCAACCATACCCATCATC 3′和SB214(38mer)(SEQ ID NO 28)5′TTAAAATCTAGATTAGATCTGTGTAGTTGATTGATTTG 3′.
用酶SalI和XbaI消化擴增產(chǎn)物(784bp)，克隆到預(yù)先用SalI和XbaI消化的載體pVR1012(實施例2)中，產(chǎn)生大小約為5661bp的質(zhì)粒pSB109。
BRSV G基因編碼一種有257個氨基酸的糖蛋白。4.2.2 pSB110克隆到載體pVR1012中的G基因(tPAΔ[TM-Cter]形式)用病毒RNA作為模板，利用下列引物，通過RT-PCR擴增BRSV Snook株的G基因的截短形式SB215(33mer)(SEQ ID NO 29)5′TTTTAAGGATCCGCTAAAGCCAAGCCCACATCC 3′和SB216(33mer)(SEQ ID NO 30)5′TTAAAATCTAGATTAGATCTGTGTAGTTGATTG 3′.
用酶BamHI和XbaI消化擴增產(chǎn)物(666bp)，克隆到預(yù)先用BamHI和XbaI消化的載體pAB110(實施例2)中，產(chǎn)生大小約為5660bp的質(zhì)粒pSB110。
BRSV病毒G基因的tPAΔ[TM-Cter]形式編碼一種有218個氨基酸的糖蛋白，含有G糖蛋白的胞外域，但在它之前為組織纖酶原激活物的信號序列。實施例5編碼不同形式的1型牛病毒性腹瀉病毒(BVD-1)抗原的質(zhì)粒編碼1型BVDV病毒的E0(48kDa的糖蛋白或gp48)和E2(gp53)抗原的基因由Osloss株的病毒RNA通過RT-PCR獲得(L.De Morelooze等人，J.Gen.Virol.1993，74，1433-1438；A.Renard等人，DNA，1985，4，439-438；A.Renard等人，Ann.Rech.Vet.，1987，18，121-125)。也可以使用NADL(ATCC VR-534)或紐約(ATCC VR-524)株。5.1編碼不同形式的1型BVDV Osloss株E0的質(zhì)粒5.1.1 pLF1028克隆到載體pVR1012中的E0基因(原始形式)利用引物L(fēng)F051，由相應(yīng)的病毒RNA合成Osloss株E0基因的互補DNA(cDNA)，并且利用下列寡核苷酸對通過PCR反應(yīng)擴增LF050(36mer)(SEQ ID NO 31)5 ′CATACCGTCGACATGAAGAAACTAGAGAAAGCCCTG 3′和LF051(40mer)(SEQ ID NO 32)5′CATACCGGATCCTCAGGCTGCATATGCCCCAAACCATGTC 3′.
SalI和BamHI消化PCR產(chǎn)物獲得的約765bp的DNA片段與SalI和BamHI消化pVR1012(實施例2)產(chǎn)生的4866bp片段連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pLF1028(約5636bp)。BVDV-1OsloSS株的E0基因編碼一種有252個氨基酸的蛋白質(zhì)。
向寡核苷酸LF050序列中引入一個ATG密碼子，以允許相應(yīng)重組E0多肽翻譯的起始。5.1.2 pLF1029克隆到載體pLF999中的E0基因(β-珠蛋白tPA-E0形式)利用下列寡核苷酸對，通過PCR反應(yīng)由pLF1028模板(實施例5.1.1)合成E0基因
LF052(39mer)(SEQ ID NO 33)5′CATGACGCGGCCGCTATGAAGAAACTAGAGAAAGCCCTG 3′和LF053(40mer)(SEQ ID NO 34)5′CATGACAGATCTTTAGGCTGCATATGCCCCAAACCATGTC 3′.
NotI和BglII消化PCR產(chǎn)物獲得的約770bp的DNA片段與NotI和BglII消化pLF999(實施例2)產(chǎn)生的5642bp片段連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pLF1029(約6417bp)。
這樣修飾的BVDV-1Osloss株的E0基因(β-珠蛋白tPA-E0)編碼一種有283個氨基酸的蛋白質(zhì)。5.2編碼不同形式的1型BVDV Osloss株E2的質(zhì)粒5.2.1 pLF1020克隆到載體pVR1012中的E2基因(原始形式)利用引物L(fēng)F040，由相應(yīng)的病毒RNA合成Osloss株E2基因的cDNA，并且利用下列寡核苷酸對通過PCR反應(yīng)擴增LF039(33mer)(SEQ ID NO 35)5′CATGACGTCGACATGACGACTACTGCATTCCTG 3′和LF040(36mer)(SEQ ID NO 36)5′CATGACAGATCTTCAACGTCCCGAGGTCATTTGTTC 3′.
SalI和BglII消化PCR產(chǎn)物獲得的約1235bp的DNA片段與SalI和BglII消化pVR1012(實施例2)產(chǎn)生的4860bp片段連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pLF1020(約6100bp)。
BVDV-1Osloss株的E2基因編碼一種有409個氨基酸的蛋白質(zhì)。
向寡核苷酸LF039序列中引入一個ATG密碼子，以允許相應(yīng)重組E2多肽翻譯的起始。5.2.2 pLF1021克隆到載體pLF999中的E2基因(β-珠蛋白tPA-E2Δ[TM+Cter]形式)利用下列寡核苷酸對，通過PCR反應(yīng)由pLF1020模板(實施例5.2.1)合成跨膜域和羧基端域缺失的E2基因
LF041(36mer)(SEQ ID NO 37)5′CATGACGCGGCCGCTATGACGACTACTGCATTCCTG 3′和LF042(35mer)(SEQ ID NO 38)5′CATGACAGATCTCAAGCGAAGTAATCCCGGTGGTG 3.
NotI和BglII消化PCR產(chǎn)物獲得的1132bp的DNA片段與NotI和BglII消化pLF999(實施例2)產(chǎn)生的5642bp片段連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pLF1021(約6779bp)。
這樣修飾的BVDV-1Osloss株的E2基因(β-珠蛋白tPA-E2Δ[TM+Cter])編碼一種有404個氨基酸的蛋白質(zhì)。實施例6編碼不同形式的2型牛病毒性腹瀉病毒(BVDV-2)抗原的質(zhì)粒編碼2型BVDV病毒E2抗原(gp53)的基因由890株的病毒RNA通過RT-PCR獲得(J.F.Ridpath和S.R.Bolin，Virology，1995，212，36-46)。也能使用Q140株，它可以獲自Quebec Ministry of Agriculture，F(xiàn)isheries and Food，Armand-Frappier Institute (P.Tijssen等人，Virology，1996，217，356-361)。也可以使用1373株和296株(J.F.Ridpath，BVDV研究計劃，國家動物疾病中心，2300 Dayton Avenue，Ames，USA)。6.1編碼不同形式的2型890株E2的質(zhì)粒6.1.1 pLF1022克隆到載體pVR1012中的E2基因(原始形式)利用引物L(fēng)F044，由相應(yīng)的病毒RNA合成890株E2基因的cDNA，并且利用下列寡核苷酸對通過PCR反應(yīng)擴增LF043(36mer)(SEQ ID NO 39)5′ACTGTATCTAGAATGACCACCACAGCTTTCCTAATC 3′和LF044(39mer)(SEQ ID NO 40)5′ACTGTAAGATCTTTAAGTATTCACTCCAGCACCCATAGC 3′.
XbaI和BglII消化PCR產(chǎn)物獲得的約1240bp的DNA片段與XbaI和BglII消化pVR1012(實施例2)產(chǎn)生的4891bp片段連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pLF1022(約6136bp)。
BVDV-2 890株的E2基因編碼一種有410個氨基酸的蛋白質(zhì)。
向寡核苷酸LF043序列中引入一個ATG密碼子，以允許相應(yīng)重組E2多肽翻譯的起始。6.1.2 pLF1023克隆到載體pLF999中的E2基因(β-珠蛋白tPA-E2Δ[TM+Cter]形式)利用下列寡核苷酸對，通過PCR反應(yīng)由pLF1022模板(實施例6.2.1)合成跨膜域和羧基端域缺失的E2基因LF045(41mer)(SEQ ID NO 41)5′CATGACGCGGCCGCCCTATGACCACCACAGCTTTCCTAATC 3′和LF046(36mer)(SEQ ID NO 42)5′CATGACAGATCTTTATATGAACTCTGAGAAGTAGTC 3′.
NotI和BglII消化PCR產(chǎn)物獲得的1140bp的DNA片段與NotI和BglII消化pLF999(實施例2)產(chǎn)生的5642bp片段連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pLF1023(約6787bp)。
這樣修飾的BVDV-2 890株的E2基因(β-珠蛋白tPA-E2Δ[TM+Cter])編碼一種有405個氨基酸的蛋白質(zhì)。6.2編碼不同形式的2型890株E0的質(zhì)粒6.2.1 pLF1030克隆到載體pVR1012中的E0基因(原始形式)利用引物L(fēng)F065，由相應(yīng)的病毒RNA合成890株E0基因的cDNA，并且利用下列寡核苷酸對通過PCR反應(yīng)擴增LF064(39mer)(SEQ ID NO 43)5′CATACCGTCGACATGAGAAAGAAATTGGAGAAGGCACTG 3′和LF065(39mer)(SEQ ID NO 44)5′CATACCGGATCCTCATGCTGCATGAGCACCAAACCATGC 3′.
SalI和BamHI消化PCR產(chǎn)物獲得的約768bp的DNA片段與SalI和BamHI消化pVR1012(實施例2)產(chǎn)生的4866bp片段連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pLF1030(約5639bp)。BVDV-2 890株的E0基因編碼一種有253個氨基酸的蛋白質(zhì)。
向寡核苷酸LF064的序列中引入一個ATG密碼子，以允許相應(yīng)重組E0多肽翻譯的起始。6.2.2 pLF1031克隆到載體pLF999中的E0基因(β-珠蛋白tPA-E0形式)利用下列寡核苷酸對，通過PCR反應(yīng)由pLF1030模板(實施例6.2.1)合成E0基因LF066(42mer)(SEQ ID NO 45)5′ CATGACGCGGCCGCTATGAGAAAGAAATTGGAGAAGGCACTG 3′和LF067(39mer)(SEQ ID NO 46)5′CATACCAGATCTTCATGCTGCATGAGCACCAAACCATGC 3′.
NotI和BglII消化PCR產(chǎn)物獲得的約770bp的DNA片段與NotI和BglII消化pLF999(實施例2)產(chǎn)生的5642bp片段連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pLF1031(約6417bp)。
這樣修飾的BVDV-2 890株的E0基因(β-珠蛋白tPA-E0)編碼一種有283個氨基酸的蛋白質(zhì)。實施例7編碼不同形式的3型牛副流感病毒(bPI-3)抗原的質(zhì)粒編碼bPI-3病毒的血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)和融合(F)抗原的基因由Rinsinger SF-4株(可從ATCC獲得，ATCC號為VR-281)的病毒RNA通過RT-PCR獲得。7.1編碼不同形式的bPI-3 SF-4株HN的質(zhì)粒7.1.1 pLF1024克隆到載體pVR1012中的HN基因(原始形式)利用引物L(fēng)F048，由相應(yīng)的病毒RNA合成SF-4株的HN基因的cDNA，并且利用下列寡核苷酸對通過PCR反應(yīng)擴增LF047(39mer)(SEQ ID NO 47)5′CATATCGTCGACATGGAATATTGGAAACACACAAACAGC 3′和LF048(38mer)(SEQ ID NO 48)5′CATGACGATATCTAGCTGCAGTTTTTCGGAACTTCTGT 3′.
SalI和EcoRV消化PCR產(chǎn)物獲得的約1726bp的DNA片段與SalI和EcoRV消化pVR1012(實施例2)產(chǎn)生的4896bp片段連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pLF1024(約6619bp)。
bPI-3HN基因編碼一種有572個氨基酸的蛋白質(zhì)。7.1.2 pLF1025克隆到載體pLF999中的HN基因(β-珠蛋白tPA-E2Δ[TM]形式)利用下列寡核苷酸對，通過PCR反應(yīng)，由pLF1024模板(實施例7.1.1)合成跨膜域缺失的HN基因LF058(33mer)(SEQ ID NO 49)5′CATACTGCGGCCGCTTTAATTCAAGAGAACAAT 3′和LF059(35mer)(SEQ ID NO 50)5′CATATCGATATCTAGCTGCAGTTTTTCGGAACTTC 3′.
NotI和EcoRV消化PCR產(chǎn)物獲得的1566bp的DNA片段與NotI和EcoRV消化pLF999(實施例2)產(chǎn)生的5663bp片段連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pLF1025(約7229bp)。
這樣修飾的bPI-3HN基因(β-珠蛋白tPA-E2Δ[TM])編碼一種有548個氨基酸的蛋白質(zhì)。7.2編碼不同形式的bPI-3 SF-4株F的質(zhì)粒7.2.1 pLF1026克隆到載體pVR1012中的F基因(原始形式)利用引物L(fēng)F061，由相應(yīng)的病毒RNA合成SF-4株的F基因的cDNA，并且利用下列寡核苷酸對通過PCR反應(yīng)擴增LF060(36mer)(SEQ ID NO 51)5′CATATCGTCGACATGATCATCACAAACACAATCATA 3′和LF061(36mer)(SEQ ID NO 52)5′CATGACCAGATCTTATTGTCTATTTGTCAGTATATA 3′.
SalI和BglII消化PCR產(chǎn)物獲得的1628bp的DNA片段與SalI和BglII消化pVR1012(實施例2)產(chǎn)生的4860bp片段連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pLF1026(約6488bp)。
bPI-3F基因編碼一種有550個氨基酸的蛋白質(zhì)。7.2.2 pLF1027克隆到載體pLF999中的F基因(β-珠蛋白tPA-FΔ[TM+Cter]形式)利用下列寡核苷酸對，通過PCR反應(yīng)由pLF1026模板(實施例7.2.1)合成跨膜域和C端域缺失的F基因
LF062(42mer)(SEQ ID NO 53)5′CATACTGCGGCCGCTCAAATAGACATAACAAAACTGCAACGT 3′和LF063(41mer)(SEQ ID NO 54)5′CATATCGATATCTATGCACTAGATTGATACCAACTTCCAAC 3′.
NotI和EcoRV消化PCR產(chǎn)物獲得的1434bp的DNA片段與NotI和EcoRV消化pLF999(實施例2)產(chǎn)生的5663bp片段連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pLF1027(約7097bp)。
這樣修飾的bPI-3F基因(β-珠蛋白tPA-FΔ[TM+Cter)編碼一種有504個氨基酸的蛋白質(zhì)。實施例8編碼不同形式的假狂犬病病毒(PRV)抗原的質(zhì)粒編碼PRV糖蛋白gB、gC和gD的基因由NIA3株的病毒DNA經(jīng)PCR獲得(M.Riviere等人，J.Virol.66，3424-3434；A.Baskerville等人，The Veterinary Bulletin，1973，43，第9號)。也可以使用PRV NIA3株的突變體，在US-A-4，680176中有描述，保藏于國立微生物保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)(CNCM)，Institut Pasteur，巴黎，法國，編號為I-351和I-352。8.1編碼不同形式的PRV-gB的質(zhì)粒8.1.1 pSB101克隆到載體pVR1012中的gB基因(原始形式)用病毒DNA作為模板，利用下列引物，PCR擴增PRV NIA3株的gB基因SB201(36mer)(SEQ ID NO 55)5′TTTTAAGATATCATGCCCGCTGGTGGCGGTCTTTGG 3′和SB202(39mer)(SEQ ID NO 56)5′TTTTAAGGATCCCTACAGGGCGTCGGGGTCCTCGCTCTC 3′.
用酶EcoRV和BamHI消化擴增產(chǎn)物(2766bp)，克隆到預(yù)先用EcoRV和BamHI消化的載體pVR1012(實施例2)中，產(chǎn)生大小約為7631bp的質(zhì)粒pSB101。
PRVgB基因編碼一種有913個氨基酸的糖蛋白。8.1.2 pSB102克隆到載體pVR1012中的gB基因(Δ[TM-Cter]形式)
用病毒DNA作為模板，利用下列引物，PCR擴增PRV NIA3株的gB基因的截短形式SB201(SEQ ID NO 55)和SB203(39mer)(SEQ ID NO 57)5′TTTTAAGGATCCCTAGTGGTCCACCTTGACCACGCGGTC 3′.
用酶EcoRV和BamHI消化擴增產(chǎn)物(2262bp)，克隆到預(yù)先用EcoRV和BamHI消化的載體pVR1012(實施例2)中，產(chǎn)生大小約為7142bp的質(zhì)粒pSB102。
gB基因的截短形式(Δ[TM-Cter])編碼一種有750個氨基酸的糖蛋白，含有PRVgB糖蛋白的胞外域。8.1.3 pNS009克隆到載體pAB110中的gB基因(tPAΔ[TM-Cter]形式)利用下列引物，由模板pSB101(實施例8.1.1)PCR擴增PRV NIA3株的gB基因的tPAΔ[TM-Cter]形式SB203(SEQ ID NO 57)和SB217(39mer)(SEQ ID NO 58)5 ′AAAATTTCGATATCCACCTCGGCCTCGCCGACGCCCGGG 3′.
用酶EcoRV和BglII消化擴增產(chǎn)物(2088bp)，克隆到預(yù)先用EcoRV和BglII消化的載體pAB110(實施例2)中，產(chǎn)生大小約為7127bp的質(zhì)粒pNS009。
gB基因的tPAΔ[TM-Cter]形式編碼一種有720個氨基酸的糖蛋白，含有PRV gB糖蛋白的胞外域。8.2編碼不同形式的PRV-gC的質(zhì)粒8.2.1 pSB103克隆到載體pVR1012中的gC基因(原始形式)用病毒DNA作為模板，利用下列引物，PCR擴增PRV NIA3株的gC基因SB204(36mer)(SEQ ID NO 59)5′TTTTAAGATATCATGGCCTCGCTCGCGCGTGCGATG 3′和SB205(37mer)(SEQ ID NO 60)5 ′TTTTAAAGATCTTTAAGGCCCCGCCTGGCGGTAGTAG 3′.
用酶EcoRV和BglII消化擴增產(chǎn)物(1452bp)，克隆到預(yù)先用EcoRV和BglII消化的載體pVR1012(實施例2)中，產(chǎn)生大小約為6323bp的質(zhì)粒pSB103。
PRVgC基因編碼一種有479個氨基酸的糖蛋白。8.2.2 pSB104克隆到載體pVR1012中的gC基因(Δ[TM-Cter]形式)用病毒DNA作為模板，利用下列引物，PCR擴增PRV NIA3株的gC基因的截短形式SB204(SEQ ID NO 59)和SB206(36mer)(SEQ ID NO 61)5′TTTTAAAGATCTTTAGGGGGAGGCGTCGTAGCGCTG 3′.
用酶EcoRV和BglII消化擴增產(chǎn)物(1332bp)，克隆到預(yù)先用EcoRV和BglII消化的載體pVR1012(實施例2)中，產(chǎn)生大小約為6206bp的質(zhì)粒pSB104。
gC基因的截短形式(Δ[TM-Cter])編碼一種有440個氨基酸的糖蛋白，含有PRVgC糖蛋白的胞外域。8.2.3 pNS012克隆到載體pAB110中的gC基因(tPAΔ[TM-Cter]形式)利用下列引物，由模板pSB103(實施例8.2.1)PCR擴增PRV NIA3株的gC基因的tPAΔ[TM-Cter]形式SB206(SEQ ID NO 61)和SB218(39mer)(SEQ ID NO 62)5′AAAATTTCGATATCCACGGCGCTCGGCACGACGCCCAAC 3′.
用酶EcoRV和BglII消化擴增產(chǎn)物(1270bp)，克隆到預(yù)先用EcoRV和BglII消化的載體pAB110(實施例2)中，產(chǎn)生大小約為6311bp的質(zhì)粒pNS012。
gC基因的tPAΔ[TM-Cter]形式編碼一種有448個氨基酸的糖蛋白，含有PRVgC糖蛋白的胞外域。8.3編碼不同形式的PRV-gD的質(zhì)粒8.3.1 pSB105克隆到載體pVR1012中的gD基因(原始形式)用病毒DNA作為模板，利用下列引物，PCR擴增PRV NIA3株的gD基因SB207(36mer)(SEQ ID NO 63)5′AATTTTGATATCATGCTGCTCGCAGCGCTATTGGCG 3′和SB208(36mer)(SEQ ID NO 64)5′AATTTTGGATCCCTACGGACCGGGCTGCGCTTTTAG 3′.
用酶EcoRV和BamHI消化擴增產(chǎn)物(1227bp)，克隆到預(yù)先用EcoRV和BamHI消化的載體pVR1012(實施例2)中，產(chǎn)生大小約為6104bp的質(zhì)粒pSB105。
PRVgD基因編碼一種有404個氨基酸的糖蛋白。8.3.2 pSB106克隆到載體pVR1012中的gD基因(Δ[TM-Cter]形式)用病毒DNA作為模板，利用下列引物，PCR擴增PRV NIA3株的gD基因的截短形式SB207(SEQ ID NO 63)和SB209(40mer)(SEQ ID NO 65)5′AAATTTTGGATCCCTAGCGGTGGCGCGAGACGCCCGGCGC 3′.
用酶EcoRV和BamHI消化擴增產(chǎn)物(1077bp)，克隆到預(yù)先用EcoRV和BamHI消化的載體pVR1012(實施例2)中，產(chǎn)生大小約為5957bp的質(zhì)粒pSB106。
gD基因的截短形式(Δ[TM-Cter])編碼一種有355個氨基酸的糖蛋白，含有PRVgD糖蛋白的胞外域。8.3.3 pPB238克隆到載體pAB110中的gD基因(tPAΔ[TM-Cter]形式)利用下列引物，由模板pSB105(實施例8.3.1)PCR擴增PRV NIA3株的gD基因的tPAΔ[TM-Cter]形式SB209(SEQ ID NO 65)和SB219(39mer)(SEQ ID NO 66)5′AAAATTTCGATATCCACCTTCCCCCCGCCCGCGTACCCG 3′.
用酶EcoRV和BamHI消化擴增產(chǎn)物(1015bp)，克隆到預(yù)先用EcoRV和BglII消化的載體pAB110(實施例2)中，產(chǎn)生大小約為6056bp的質(zhì)粒pPB238。
gD基因的tPAΔ[TM-Cter]形式編碼一種有363個氨基酸的糖蛋白，含有PRV gD糖蛋白的胞外域。實施例9編碼不同形式的豬生殖道呼吸道綜合征病毒(PRRSV)Lelystad株抗原的質(zhì)粒編碼PRRSV ORF3、ORF5和ORF6蛋白的基因由Lelystad株的病毒RNA經(jīng)RT-PCR獲得(J.Meulenberg等人，Virology，1993，19，62-72；WO-A-92-21375)，于1991年6月5日保藏于國立微生物保藏中心(CNCM)，Institut Pasteur，巴黎，法國，編號為I-1102。9.1編碼不同形式的PRRSV Lelystad株ORF3的質(zhì)粒9.1.1 pLF1009克隆到載體pVR1012中的ORF3基因(原始形式)利用引物L(fēng)F028，由相應(yīng)的病毒RNA合成Lelystad株的ORF3基因的cDNA，并利用下列寡核苷酸對通過PCR反應(yīng)擴增LF027(30mer)(SEQ ID NO 67)5′CACTACGATATCATGGCTCATCAGTGTGCA 3′和LF028(30mer)(SEQ ID NO 68)5′CACTACAGATCTTTATCGTGATGTACTGGG 3′.
EcoRV和BglIII消化PCR產(chǎn)物獲得的802bp的DNA片段與EcoRV和BglIII消化pVR1012(實施例2)產(chǎn)生的4879bp片段連接，產(chǎn)生大小約為5681bp的質(zhì)粒pLF1009。
PRRSV Lelystad ORF3基因編碼一種有265個氨基酸的蛋白質(zhì)。9.2編碼不同形式的PRRSV Lelystad株ORF5的質(zhì)粒9.2.1 pLF1011克隆到載體pVR1012中的ORF5基因(原始形式)利用引物L(fēng)F020，由相應(yīng)的病毒RNA合成Lelystad株的ORF5基因的cDNA，并利用下列寡核苷酸對通過PCR反應(yīng)擴增LF019(30mer)(SEQ ID NO 69)5′CTCACCGTCGACATGAGATGTTCTCACAAA 3′和LF02O(30mer)(SEQ ID NO 70)5′CTCACCTCTAGACTAGGCCTCCCATTGCTC 3 ′.
SalI和XbaI消化PCR產(chǎn)物獲得的802bp的DNA片段與SalI和XbaI消化pVR1012(實施例2)產(chǎn)生的4879bp片段連接，產(chǎn)生大小約為5681bp的質(zhì)粒pLF1011。
PRRSV Lelystad ORF5基因編碼一種有201個氨基酸的蛋白質(zhì)。9.2.2 pLF1012克隆到載體pAB110中的ORF5基因(截短形式)利用下列寡核苷酸對，由模板pLF1011(實施例9.2.1)通過PCR反應(yīng)合成跨膜域和羧基端域缺失的ORF5基因LF021(30mer)(SEQ ID NO 71)5′CACCTCGGATCCTTTGCCGATGGCAACGGC 3′和LF022(33mer)(SEQ ID NO 72)5 ′CACCTCGGATCCTTAGACTTCGGCTTTGCCCAA 3′.
BamHI消化PCR產(chǎn)物獲得的432bp的DNA片段與BamHI消化pAB110(實施例2)產(chǎn)生的5105bp片段連接，產(chǎn)生大小約為5537bp的質(zhì)粒pLF1012。
這樣修飾的PRRSV Lelystad 0RF5基因(tPAΔ[TM+Cter])編碼一種有168個氨基酸的蛋白質(zhì)。9.3編碼不同形式的PRRSV Lelystad株ORF6的質(zhì)粒9.3.1 pLF1013克隆到載體pVR1012中的ORF6基因(原始形式)利用引物L(fēng)F024，由相應(yīng)的病毒RNA合成Lelystad株的ORF6基因的cDNA，并利用下列寡核苷酸對通過PCR反應(yīng)擴增LF023(30mer)(SEQ ID NO 73)5′CACTCAGTCGACATGGGAGGCCTAGACGAT 3′和LF024(30mer)(SEQ ID NO 74)5′CACTCATCTAGATTACCGGCCATACTTGAC 3′.
SalI和XbaI消化PCR產(chǎn)物獲得的528bp的DNA片段與SalI和XbaI消化pVR1012(實施例2)產(chǎn)生的4881bp片段連接，產(chǎn)生大小約為5409bp的質(zhì)粒pLF1013。
PRRSV Lelystad ORF6基因編碼一種有173個氨基酸的蛋白質(zhì)。9.3.2 pLF1014克隆到載體pAB110中的ORF6基因(截短形式)利用下列寡核苷酸對，由模板pLF1013(實施例9.3.1)通過PCR反應(yīng)合成跨膜域和羧基端域缺失的ORF6基因LF025(30mer)(SEQ ID NO 75)5′CACTACGGATCCGTGTCACGCGGCCGACTC 3′和LF026(33mer)(SEQ ID NO 76)5′CACTACGGATCCTTAAACAGCTCGTTTGCCGCC 3′.
BamHI消化PCR產(chǎn)物獲得的390bp的DNA片段與BamHI消化pAB110(實施例2)產(chǎn)生的5105bp片段連接，產(chǎn)生大小約為5495bp的質(zhì)粒pLF1014。
這樣修飾的PRRSV Lelystad ORF6基因(tPAΔ[TM+Cter])編碼一種有154個氨基酸的蛋白質(zhì)。實施例10編碼不同形式的豬生殖道呼吸道綜合征病毒(PRRSV)美國株ATCC VR-2332抗原的質(zhì)粒編碼PRRSV病毒ORF3、ORF5和ORF6蛋白的基因由保藏為ATCC號VR-2332的美國株的病毒RNA經(jīng)RT-PCR獲得(M.Murtaugh等人，Arch.Virol.，1995，140，1451-1460)。10.1編碼不同形式的PRRSV VR-2332株ORF3的質(zhì)粒10.1.1 pLF1015克隆到載體pVR1012中的ORF3基因(原始形式)利用引物L(fēng)F038，由相應(yīng)的病毒RNA合成VR-2332株的ORF3基因的cDNA，并利用下列寡核苷酸對通過PCR反應(yīng)擴增LF037(30mer)(SEQ ID NO 77)5′CACTACGATATCATGGTTAATAGCTGTACA 3′和LF038(30mer)(SEQ ID NO 78)5′CACTACTCTAGACTATCGCCGTACGGCACT 3′.
EcoRV和XbaI消化PCR產(chǎn)物獲得的769bp的DNA片段與EcoRV和BglIII消化pVR1012(實施例2)產(chǎn)生的4900bp片段連接，產(chǎn)生大小約為5669bp的質(zhì)粒pLF1015。
PRRSV VR-2332株ORF3基因編碼一種有254個氨基酸的蛋白質(zhì)。10.2編碼不同形式的PRRSV VR-2332株ORF5的質(zhì)粒10.2.1 pLF1017克隆到載體pVR1012中的ORF5基因(原始形式)
利用引物L(fēng)F030，由相應(yīng)的病毒RNA合成VR-2332株的ORF5基因的cDNA，并利用下列寡核苷酸對通過PCR反應(yīng)擴增LF029(30mer)(SEQ ID NO 79)5′CACTACGATATCATGTTGGAGAAATGCTTG 3′和LF030(30mer)(SEQ ID NO 80)5′CACTACAGATCTCTAAGGACGACCCCATTG 3′.
EcoRV和BglII消化PCR產(chǎn)物獲得的607bp的DNA片段與EcoRV和BglII消化pVR1012(實施例2)產(chǎn)生的4879bp片段連接，產(chǎn)生大小約為5486bp的質(zhì)粒pLF1017。
PRRSV VR-2332株ORF5基因編碼一種有200個氨基酸的蛋白質(zhì)。10.2.2 pLF1018克隆到載體pAB110中的ORF5基因(截短形式)利用下列寡核苷酸對，由模板pLF1017(實施例10.2.1)通過PCR反應(yīng)合成跨膜域和羧基端域缺失的ORF5基因LF031(33mer)(SEQ ID NO 81)5′CACTACGGATCCGCCAGCAACGACAGCAGCTCC 3′和LF032(33mer)(SEQ ID NO 82)5′CACTACGGATCCTTAGACCTCAACTTTGCCCCT 3′.
BamHI消化PCR產(chǎn)物獲得的426 bp的DNA片段與BamHI消化pAB110(實施例2)產(chǎn)生的5105bp片段連接，產(chǎn)生大小約為5531bp的質(zhì)粒pLF1018。
這樣修飾的PRRSV VR-2332株ORF5基因(tPAΔ[TM+Cter])編碼一種有166個氨基酸的蛋白質(zhì)。10.3編碼不同形式的PRRSV VR-2332株ORF6的質(zhì)粒10.3.1 pLF1019克隆到載體pVR1012中的ORF6基因(原始形式)利用引物L(fēng)F034，由相應(yīng)的病毒RNA合成VR-2332株的ORF6基因的cDNA，并利用下列寡核苷酸對通過PCR反應(yīng)擴增LF033(33mer)(SEQ ID NO 83)5′CACATCCTGCAGATGGGGTCGTCCTTAGATGAC 3′和LF034(30mer)(SEQ ID NO 84)5′CACATCTCTAGATTATTTGGCATATTTGAC 3′.
PstI和XbaI消化PCR產(chǎn)物獲得的527bp的DNA片段與PstI和XbaI消化pVR1012(實施例2)產(chǎn)生的4871bp片段連接，產(chǎn)生大小約為5398bp的質(zhì)粒pLF1019。
PRRSV VR-2332株ORF6基因編碼一種有174個氨基酸的蛋白質(zhì)。10.3.2 pLF1016克隆到載體pAB110中的ORF6基因(截短形式)利用下列寡核苷酸對，由模板pLF1019(實施例10.3.1)通過PCR反應(yīng)合成跨膜域和羧基端域缺失的ORF6基因LF035(30mer)(SEQ ID NO 85)5′CACTACGGATCCGTGAGTCGCGGCCGACTG 3′和LF036(33mer)(SEQ ID NO 86)5′CACTACGGATCCTTAAACAGCTTTTCTGCCACC 3′.
BamHI消化PCR產(chǎn)物獲得的390 bp的DNA片段與BamHI消化pAB110(實施例2)產(chǎn)生的5105bp片段連接，產(chǎn)生大小約為5459bp的質(zhì)粒pLF1016。
這樣修飾的PRRSV VR-2332株ORF6基因(tPAΔ[TM+Cter])編碼一種有154個氨基酸的蛋白質(zhì)。實施例11編碼不同形式的豬流感病毒(SIV)H1N1株抗原的質(zhì)粒編碼豬流感病毒H1N1型的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)抗原的基因由“SW”H1N1株的病毒RNA經(jīng)RT-PCR獲得。這些株可從位于加拿大Laval的魁北克大學(xué)Armand-Frappier研究所的病毒學(xué)研究中心獲得(D.S.Arora等人，Virus Genes，1997，14，251-254)。參見G.W.Both等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1983，80，6996-7000。11.1編碼不同形式的SIV H1N1株HA的質(zhì)粒11.1.1 pLF1001克隆到載體pVR1012中的HA基因(原始形式)利用引物L(fēng)F004，由相應(yīng)的病毒RNA合成H1N1株的HA基因的cDNA，并利用下列寡核苷酸對通過PCR反應(yīng)擴增LF003(30mer)(SEQ ID NO 87)5′CTCCATGATATCATGGAAGCAAAACTATTC 3′和LF004(30mer)(SEQ ID NO 88)5′CTCCATCAGATCTTAAATGCATATTCTGCA 3′
EcoRV和BglIII消化PCR產(chǎn)物獲得的1705bp的DNA片段與EcoRV和BglIII消化pVR1012(實施例2)產(chǎn)生的4879bp片段連接，產(chǎn)生大小約為6584bp的質(zhì)粒pLF1001。
SIV H1N1 HA基因編碼一種有566個氨基酸的蛋白質(zhì)。11.1.2 pLF1002克隆到載體pLF999中的HA基因(修飾形式)利用下列寡核苷酸對，由模板pLF1001(實施例11.1.1)通過PCR反應(yīng)合成跨膜域和羧基端域缺失的HA基因LF005(30mer)(SEQ ID NO 89)5′TCCGCGGCCGCACATGCTAACAATTCCACA 3′和LF006(32mer)(SEQ ID NO 90)5 ′TCCGCGGCCGCTTACATTGATTCTAGTTTCAC 3′.
NotI消化PCR產(chǎn)物獲得的1515bp的DNA片段與NotI消化pLF999(實施例2)產(chǎn)生的5678bp片段連接，產(chǎn)生大小約為7193bp的質(zhì)粒pLF1002。
這樣修飾的SIV H1N1 HA基因(兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II，tPA，Δ[TM+Cter])編碼一種有530個氨基酸的蛋白質(zhì)。11.2編碼不同形式的SIV H1N1株NA的質(zhì)粒11.2.1 pLF1003克隆到載體pVR1012中的NA基因(原始形式)利用引物L(fēng)F008，由相應(yīng)的病毒RNA合成H1N1株的NA基因的cDNA，并利用下列寡核苷酸對通過PCR反應(yīng)擴增LF007(30mer)(SEQ ID NO 91)5′CACCTGGTCGACATGAATCCAAATCAGAAG 3′和LF008(30mer)(SEQ ID NO 92)5′CACCTGTCTAGACTACTTGTCAATGGTGAA 3′.
SalI和XbaI消化PCR產(chǎn)物獲得的1416bp的DNA片段與SalI和XbaI消化pVR1012(實施例2)產(chǎn)生的4881bp片段連接，產(chǎn)生大小約為6297bp的質(zhì)粒pLF1003。
SIV H1N1 NA基因編碼一種有469個氨基酸的蛋白質(zhì)。11.2.2 pLF1004克隆到載體pLF999中的NA基因(修飾形式)
利用下列寡核苷酸對，由模板pLF1003通過PCR反應(yīng)合成跨膜域和羧基端域缺失的NA基因LF009(31mer)(SEQ ID NO 93)5′CACTACGAATTCACAAATTGGGAATCAAAAAT 3＇和LF010(30mer)(SEQ ID NO 94)5′AATTTGTGAATTCGCGGCCGCGGATCCGGT 3′.
EcoRI消化PCR產(chǎn)物獲得的1207bp的DNA片段與EcoRI消化pLF999(實施例2)產(chǎn)生的5678bp片段連接，產(chǎn)生大小約為6885bp的質(zhì)粒pLF1004。
這樣修飾的SIV H1N1 NA基因(兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II，tPA，Δ[TM+Cter])編碼一種有431個氨基酸的蛋白質(zhì)。實施例12編碼不同形式的豬流感病毒(SIV)H3N2株抗原的質(zhì)粒編碼H3N2型豬流感病毒的HA和NA抗原的基因由“Cotes du Nord1987”(cdn87)株的病毒RNA經(jīng)RT-PCR獲得，該毒株由世界衛(wèi)生組織(WHO)引用，可獲自國家流感參考中心，病毒學(xué)實驗室，8 avenueRockfeller，69008里昂，法國。12.1編碼不同形式的SIV H3N2株HA的質(zhì)粒12.1.1 pLF1005克隆到載體pVR1012中的HA基因(原始形式)利用引物L(fēng)F012，由相應(yīng)的病毒RNA合成H3N2株的HA基因的cDNA，并利用下列寡核苷酸對通過PCR反應(yīng)擴增LF011(30mer)(SEQ ID NO 95)5′CTGCACGTCGACATGAAGACTGTCATTGCC 3′和LF012(24mer)(SEQ ID NO 96)5′GATATCTCAGATGCAAATGTTGCA 3′.
EcoRV和SalI消化PCR產(chǎn)物獲得的1709bp的DNA片段與EcoRV和SalI消化pVR1012(實施例2)產(chǎn)生的4893bp片段連接，產(chǎn)生大小約為6602bp的質(zhì)粒pLF1005。
SIV H3N2 HA基因編碼一種有566個氨基酸的蛋白質(zhì)。12.1.2 pLF1006克隆到載體pLF999中的HA基因(修飾形式)利用下列寡核苷酸對，由模板pLF1005(實施例12.1.1)通過PCR反應(yīng)合成跨膜域和羧基端域缺失的HA基因LF013(33mer)(SEQ ID NO 97)5′CACCGCGGATCCCTTCCAGAAAATGGCAGCACA 3′和LF014(33mer)(SEQ ID NO 98)5′CACCGCGGATCCTTAGTCTTTGTATCCCGACTT 3′.
BamHI消化PCR產(chǎn)物獲得的1542bp的DNA片段與BamHI消化pLF999(實施例2)產(chǎn)生的5678bp片段連接，產(chǎn)生大小約為7220bp的質(zhì)粒pLF1006。
這樣修飾的SIV H3N2 HA基因(兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II，tPA，Δ[TM+Cter])編碼一種有538個氨基酸的蛋白質(zhì)。12.2編碼不同形式的SIV H3N2株NA的質(zhì)粒12.2.1 pLF1007克隆到載體pVR1012中的NA基因(原始形式)利用引物L(fēng)F016，由相應(yīng)的病毒RNA合成H3N2株的NA基因的cDNA，并利用下列寡核苷酸對通過PCR反應(yīng)擴增LF015(30mer)(SEQ ID NO 99)5′CACTCAGATATCATGAATCCAAAGCAAAAG 3′和LF016(30mer)(SEQ ID NO 100)5′CACTCATCTAGATTATATAGGCATGAGATC 3′.
EcoRV和XbaI消化PCR產(chǎn)物獲得的1414bp的DNA片段與EcoRV和XbaI消化pVR1012(實施例2)產(chǎn)生的4900bp片段連接，產(chǎn)生大小約為6314bp的質(zhì)粒pLF1007。
SIV H3N2 NA基因編碼一種有469個氨基酸的蛋白質(zhì)。12.2.2 pLF1008克隆到載體pLF999中的NA基因(修飾形式)利用下列寡核苷酸對，由模板pLF1005(實施例12.2.1)通過PCR反應(yīng)合成跨膜域和羧基端域缺失的NA基因LF017(33mer)(SEQ ID NO l01)5′CACTACGGATCCTTCAAGCAATATGAGTGCGAC 3′和LF018(33mer)(SEQ ID NO 102)5′CACTACGGATCCTTATGAAGTCCACCATACTCT 3′.
BamHI消化PCR產(chǎn)物獲得的1221bp的DNA片段與BamHI消化pLF999(實施例2)產(chǎn)生的5678bp片段連接，產(chǎn)生大小約為6899bp的質(zhì)粒pLF1008。
這樣修飾的SIV H3N2 NA基因(兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II，tPA，Δ[TM+Cter])編碼一種有431個氨基酸的蛋白質(zhì)。實施例13編碼牛GM-CSF的質(zhì)粒利用引物L(fēng)F065，由牛血單核細胞的細胞RNA合成牛GM-CSF基因的cDNA，并利用下列寡核苷酸對通過PCR反應(yīng)擴增LF054(36mer)(SEQ ID NO 103)5′CATATCGTCGACATGTGGCTGCAGAACCTGCTTCTC 3′和LF055(34mer)(SEQ ID NO 104)5′CATGACCAGATCTTCACTTCTGGGCTGGTTCCCA 3′.
SalI和BglII消化PCR產(chǎn)物獲得的437bp的DNA片段與SalI和BglII消化pVR1012(實施例2)產(chǎn)生的4860bp片段連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pLF1032(約5297bp)。牛GM-CSF基因編碼一種有143個氨基酸的蛋白質(zhì)。實施例14編碼豬GM-CSF的質(zhì)粒利用引物L(fēng)F067，由豬血單核細胞的細胞RNA合成豬GM-CSF基因的cDNA，并利用下列寡核苷酸對通過PCR反應(yīng)擴增LF056(36mer)(SEQ ID NO 105)5′CATATCGTCGACATGTGGCTGCAGAACCTGCTTCTC 3′和LF057(37mer)(SEQ ID NO 106)5′CATGACCAGATCTTCACTTCTGGGCTGGTTCCCAGCA 3′.
SalI和BglII消化PCR產(chǎn)物獲得的440bp的DNA片段與SalI和BglII消化pVR1012(實施例2)產(chǎn)生的4860bp片段連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pLF1033(約5300bp)。豬GM-CSF基因編碼一種有144個氨基酸的蛋白質(zhì)。實施例15疫苗質(zhì)粒的配制含有一種或多種根據(jù)實施例3-14的質(zhì)粒的DNA溶液如Sambrook等人(1989)所述通過乙醇沉淀濃縮。DNA沉淀溶解于0.9％NaCl溶液中，獲得1mg/ml的濃度。用適當(dāng)體積的無菌水溶解DMRIE-DOPE的凍干物制備0.75mM DMRIE-DOPE溶液。
通過溶于0.9％NaCl溶液的1mg/ml DNA溶液與0.75mM DMRIE-DOPE溶液等份稀釋，實現(xiàn)質(zhì)粒DNA-脂復(fù)合物的形成。利用26G針頭，沿瓶壁逐漸加入該DNA溶液，瓶中含有陽離子脂溶液，以避免形成泡沫。兩種溶液一混合就輕輕搖動。最終獲得含有0.375mM DMRIE-DOPE和500μg/ml質(zhì)粒的組合物。
對于上述所有操作，在室溫下使用所有溶液是所希望的。在免疫動物之前，DNA/DMRIE-DOPE復(fù)合物的形成在室溫下進行30分鐘。實施例16牛針對BHV-1的免疫12頭牛隨機分配到3組中，每組4頭。
第1組為對照動物組。
對第2組的動物施用疫苗質(zhì)粒pPB281(編碼Δ[TM-Cter]形式的BHV-1gB，實施例3.1.2)、pPB292(編碼Δ[TM-Cter]形式的BHV-1 gC，實施例3.2.2)和pPB284(編碼Δ[TM-Cter]形式的BHV-1 gD，實施例3.3.2)的混合物。
對第3組的動物施用與第2組相同的混合物，但是該混合物如實施例15所述用DMRIE-DOPE配制。
利用針頭注射器經(jīng)肌內(nèi)途徑對每頭牛進行10ml的注射，21天后重復(fù)一次。每次免疫中使用的每種質(zhì)粒的總量為1500μg。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員有根據(jù)所需的質(zhì)粒劑量調(diào)節(jié)體積或濃度的必要能力。
在第一次接種后的35天的時間內(nèi)，監(jiān)測由兩種表達BHV-1gB、gC和gD抗原的疫苗質(zhì)粒混合物誘發(fā)的血清學(xué)反應(yīng)。
結(jié)果示于下表中

實施例17豬針對PRV的免疫15只大約7周齡的豬隨機分配到3組中，每組5只。
第1組為對照動物組。
對第2組的動物施用疫苗質(zhì)粒pNS009(編碼tPAΔ[TM-Cter]形式的PRV gB，實施例8.1.3)、pNS012(編碼tPAΔ[TM-Cter]形式的PRV gC，實施例8.2.3)和pPB238(編碼tPAΔ[TM-Cter]形式的PRV gD，實施例8.3.3)的混合物。
對第4組的動物施用與第3組相同的混合物，但是該混合物如實施例15所述用DMRIE-DOPE配制，獲得0.0535mM的終DMRIE-DOPE濃度。
這些接種方案所需的質(zhì)粒，每種350μg混合于14ml終體積中。
利用針頭注射器經(jīng)肌內(nèi)途徑對每只豬進行2ml的注射，21天后重復(fù)一次。
在第35天時，經(jīng)鼻施用2ml PRV NIA3株攻擊病毒溶液攻擊這些豬，每只鼻孔1ml，效價為107.76CCID50/ml。
在第一次接種后的42天的時間內(nèi)，監(jiān)測每只動物的體重(kg)。
在攻擊后的7天內(nèi)計算每只動物的相對體重增加(G7)。它是第7天(D7)的體重減去攻擊日(D0)的體重，除以攻擊日的體重，每日表示為百分?jǐn)?shù)(D7的體積-D0的體重)·100/(D0.7的體重)ΔG7是接種動物與對照動物的相對體重增加平均值的差。
結(jié)果示于下表中

應(yīng)當(dāng)清楚地理解，附加權(quán)利要求書所確定的本發(fā)明不限于以上說明書所述的具體實施方案，而包括既不超出本發(fā)明的范圍又不違反其精神的變化。
權(quán)利要求
1.針對侵襲家畜特別是牛或豬的病原體的DNA疫苗，其含有質(zhì)粒—該質(zhì)粒含有編碼所述動物種的病原體免疫原的核苷酸序列，條件是允許該序列在體內(nèi)表達—和下式的含有季銨鹽的陽離子脂 其中R1是飽和或不飽和的線型脂族基團，含有12-18個碳原子，R2是另一脂族基團，含有2或3個碳原子，X是羥基或氨基，該脂優(yōu)選地是DMRIE。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗，其特征在于它還含有DOPE。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的疫苗，其特征在于該疫苗另外還含有所述動物種的GM-CSF蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的疫苗，其特征在于該疫苗另外還含有表達載體，該表達載體含有編碼所述動物種的GM-CSF蛋白的基因，條件是允許該序列在體內(nèi)表達。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的疫苗，其特征在于該表達載體是質(zhì)粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項的疫苗，其特征在于編碼病原體免疫原的核苷酸序列是編碼跨膜域的部分已經(jīng)缺失的基因序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項的疫苗，其特征在于含有編碼病原體免疫原的核苷酸序列的質(zhì)粒也含有編碼異源信號序列—優(yōu)選tPA—的核苷酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項的疫苗，其特征在于含有編碼病原體免疫原的核苷酸序列的質(zhì)粒也含有穩(wěn)定化的內(nèi)含子。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的疫苗，其特征在于該內(nèi)含子是兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一的疫苗，其特征在于含有BHV-1的核苷酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的疫苗，其特征在于含有經(jīng)如下優(yōu)化的gB基因序列用信號序列，特別是人源tPA信號的那些，替換糖蛋白gB的信號肽序列，和/或缺失編碼gB跨膜域的DNA片段。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的疫苗，其特征在于含有經(jīng)如下優(yōu)化的gC基因序列用信號序列，特別是人源tPA信號的那些，替換糖蛋白gC的信號肽序列，和/或缺失編碼gC跨膜域的DNA片段。
13.根據(jù)權(quán)利要求10的疫苗，其特征在于含有經(jīng)如下優(yōu)化的gD基因序列用信號序列，特別是人源tPA信號的那些，替換糖蛋白gD的信號肽序列，和/或缺失編碼gD跨膜域的DNA片段。
14.根據(jù)權(quán)利要求10的疫苗，其特征在于含有DMRIE-DOPE和下列質(zhì)粒編碼BHV-1 gB抗原的表達質(zhì)粒，通過缺失編碼跨膜域和鄰接的C端部分的核苷酸序列片段優(yōu)化；編碼BHV-1 gC抗原的第二表達質(zhì)粒，通過缺失編碼跨膜域和鄰接的C端部分的核苷酸序列片段優(yōu)化；和編碼BHV-1gD抗原的第三表達質(zhì)粒，通過缺失編碼跨膜域和鄰接的C端部分的核苷酸序列片段優(yōu)化。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一的疫苗，其特征在于含有BRSV的核苷酸序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的疫苗，其特征在于含有經(jīng)如下優(yōu)化的BRSV F基因的序列將BRSV F蛋白的信號序列替換為一種信號序列，特別是人源tPA的信號序列，和/或缺失編碼F的跨膜域的DNA片段。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的疫苗，其特征在于含有經(jīng)如下優(yōu)化的BRSV G基因的序列將BRSV G糖蛋白的信號序列替換為一種信號序列，特別是人源tPA的信號序列，和/或缺失編碼G的跨膜域的DNA片段。
18.根據(jù)權(quán)利要求15的疫苗，其特征在于含有DMRIE-DOPE和下列質(zhì)粒編碼BRSV F抗原的表達質(zhì)粒，通過插入人tPA的信號序列代替F的信號序列、缺失編碼跨膜域和鄰接的C端部分的F的核苷酸序列片段優(yōu)化；和編碼BRSV G抗原的第二表達質(zhì)粒，通過插入人tPA的信號序列代替G的信號序列、缺失編碼G的跨膜域和鄰接的C端部分的核苷酸序列片段優(yōu)化。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一的疫苗，其特征在于含有BVDV的核苷酸序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的疫苗，其特征在于含有經(jīng)如下優(yōu)化的BVDV E0基因的序列在編碼E0蛋白的核苷酸序列上游添加信號序列，特別是人源tPA的信號序列，和/或在編碼E0的核苷酸序列上游插入內(nèi)含子，特別是兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的疫苗，其特征在于含有經(jīng)如下優(yōu)化的E2基因的序列在編碼E2蛋白的核苷酸序列上游添加信號序列，特別是人源tPA的信號序列，和/或缺失編碼E2的跨膜域的DNA片段，和/或在編碼E2的核苷酸序列上游插入內(nèi)含子，特別是兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II。
22.根據(jù)權(quán)利要求19的疫苗，其特征在于含有DMRIE-DOPE和下列質(zhì)粒編碼BVDV E0抗原的表達質(zhì)粒，通過在E0上游插入人tPA的信號序列并且在E0上游插入兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II優(yōu)化；和編碼BVDV E2抗原的第二質(zhì)粒，通過在E2上游插入人tPA的信號序列、缺失編碼E2跨膜域的核苷酸序列片段并且在E2上游插入兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II優(yōu)化。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一的疫苗，其特征在于含有bPI-3的核苷酸序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的疫苗，其特征在于含有經(jīng)如下優(yōu)化的bPI-3 HN基因的序列將HN的信號序列替換為一種信號序列，特別是人源tPA的信號序列，和/或缺失編碼HN跨膜域的DNA片段，和/或在編碼HN的核苷酸序列上游插入內(nèi)含子，特別是兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的疫苗，其特征在于含有經(jīng)如下優(yōu)化的bPI-3 F基因的序列將F的信號序列替換為一種信號序列，特別是人源tPA的信號序列，和/或缺失編碼F跨膜域的DNA片段，和/或在編碼F的核苷酸序列上游插入內(nèi)含子，特別是兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II。
26.根據(jù)權(quán)利要求23的疫苗，其特征在于含有DMRIE-DOPE和下列質(zhì)粒編碼bPI-3 HN抗原的表達質(zhì)粒，通過插入人tPA的信號序列代替HN的信號序列、缺失編碼跨膜域和鄰接的C端部分的HN的核苷酸序列片段并且在HN上游插入兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II優(yōu)化；和編碼bPI-3 F抗原的第二表達質(zhì)粒，通過插入人tPA的信號序列代替F的信號序列、缺失編碼F的跨膜域和鄰接的C端部分的核苷酸序列片段并且在F上游插入兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II優(yōu)化。
27.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項的疫苗，其特征在于含有PRV的核苷酸序列。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的疫苗，其特征在于含有經(jīng)如下優(yōu)化的gB基因的序列將gB糖蛋白的信號肽序列替換為一種信號序列，特別是人源tPA信號的那些，和/或缺失編碼gB跨膜域的DNA片段。
29.根據(jù)權(quán)利要求27的疫苗，其特征在于含有經(jīng)如下優(yōu)化的gC基因的序列將gC糖蛋白的信號肽序列替換為一種信號序列，特別是人源tPA信號的那些，和/或缺失編碼gC跨膜域的DNA片段。
30.根據(jù)權(quán)利要求27的疫苗，其特征在于含有經(jīng)如下優(yōu)化的gD基因的序列將gD糖蛋白的信號肽序列替換為一種信號序列，特別是人源tPA信號的那些，和/或缺失編碼gD跨膜域的DNA片段。
31.根據(jù)權(quán)利要求27的疫苗，其特征在于含有DMRIE-DOPE和下列質(zhì)粒編碼PRV gB抗原的表達質(zhì)粒，通過缺失編碼跨膜域和鄰接的C端部分的核苷酸序列片段優(yōu)化；編碼PRV gC抗原的第二表達質(zhì)粒，通過缺失編碼跨膜域和鄰接的C端部分的核苷酸序列片段優(yōu)化；編碼PRV gD抗原的第三表達質(zhì)粒，通過缺失編碼跨膜域和鄰接的C端部分的核苷酸序列片段優(yōu)化。
32.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一的疫苗，其特征在于含有PRRSV的核苷酸序列。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的疫苗，其特征在于含有經(jīng)如下優(yōu)化的ORF3基因的核苷酸序列將ORF3編碼的蛋白質(zhì)的信號肽序列替換為信號序列，特別是人源tPA信號的那些，和/或缺失編碼ORF3跨膜域的DNA片段。
34.根據(jù)權(quán)利要求32的疫苗，其特征在于含有經(jīng)如下優(yōu)化的ORF5基因的核苷酸序列將ORF5編碼的蛋白質(zhì)的信號肽序列替換為信號序列，特別是人源tPA信號的那些，和/或缺失編碼ORF5跨膜域的DNA片段。
35.根據(jù)權(quán)利要求32的疫苗，其特征在于含有經(jīng)如下優(yōu)化的ORF6基因的核苷酸序列將ORF6編碼的蛋白質(zhì)的信號肽序列替換為信號序列，特別是人源tPA信號的那些，和/或缺失編碼ORF6跨膜域的DNA片段。
36.根據(jù)權(quán)利要求32的疫苗，其特征在于含有DMRIE-DOPE和下列質(zhì)粒編碼PRRSV ORF3抗原的表達質(zhì)粒；編碼PRRSV ORF5抗原的第二表達質(zhì)粒，通過將ORF5的信號序列替換為人tPA信號肽序列、缺失編碼跨膜域和鄰接的C端部分的核苷酸序列片段優(yōu)化；和編碼PRRSV ORF6抗原的第三表達質(zhì)粒，通過將ORF6的信號序列替換為人tPA信號肽序列、缺失編碼跨膜域和鄰接的C端部分的核苷酸序列片段優(yōu)化。
37.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一的疫苗，其特征在于含有SIV的核苷酸序列。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的疫苗，其特征在于含有經(jīng)如下優(yōu)化的HA基因的核苷酸序列將HA的信號序列替換為一種信號序列，特別是人源tPA的信號序列，和/或缺失編碼HA的跨膜域的DNA片段，和/或在編碼HA的核苷酸序列上游插入內(nèi)含子，特別是兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II。
39.根據(jù)權(quán)利要求37的疫苗，其特征在于含有經(jīng)如下優(yōu)化的NA基因的核苷酸序列將NA的信號序列替換為一種信號序列，特別是人源tPA的信號序列，和/或缺失編碼NA的跨膜域的DNA片段，和/或在編碼NA的核苷酸序列上游插入內(nèi)含子，特別是兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II。
40.根據(jù)權(quán)利要求37的疫苗，其特征在于含有DMRIE-DOPE和下列質(zhì)粒編碼SIV HA抗原的表達質(zhì)粒，通過插入人tPA的信號序列代替HA的信號序列、缺失編碼跨膜域和鄰接的C端部分的HA的核苷酸序列片段并且在HA上游插入兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II優(yōu)化；和編碼SIV NA抗原的第二表達質(zhì)粒，通過插入人tPA的信號序列代替NA的信號序列、缺失編碼NA的跨膜域和鄰接的C端部分的核苷酸序列片段并且在NA上游插入兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II優(yōu)化。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種針對感染生產(chǎn)型動物(特別是?；蜇i)的病原體的DNA疫苗，它含有質(zhì)?！撡|(zhì)粒含有編碼所述動物種的病原體免疫原的核苷酸序列(在使該序列能在體內(nèi)表達的條件下)，和含有季銨鹽的陽離子脂，這種脂具有通式(I)，其中R
文檔編號A61K48/00GK1404398SQ0180540
公開日2003年3月19日 申請日期2001年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月21日
發(fā)明者J-C·F·奧多奈特, L·B·費希爾, S·巴祖-勒-魯 申請人:梅瑞爾公司