專利名稱：用于治療和預(yù)防肝纖維化和肝硬化的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于治療和預(yù)防肝纖維化和肝硬化的藥物組合物。具體地，本發(fā)明涉及一種用于治療和預(yù)防肝纖維化和肝硬化的藥物組合物，其含有5-(2-吡嗪基)-4-甲基-1，2-二硫醇-3-硫酮(吡噻硫酮(oltipraz))和二甲基-4，4′-二甲氧基-5，6，5′，6′-二亞甲基二氧二苯基-2，2′-二羧酸酯(DDB)作為主要活性成分。
背景技術(shù)：
肝臟在生物異源物質(zhì)的代謝和內(nèi)源性物質(zhì)的代謝起重要作用，它是協(xié)調(diào)酶反應(yīng)和能量代謝的重要器官。在韓國地許多慢性疾病中，肝炎、肝硬化和肝癌是僅次于心血管疾病的最普遍和威脅生命最大的疾病。由于與發(fā)達(dá)國家相比韓國有相對(duì)更多的酗酒者，由狂歡酗酒導(dǎo)致的肝損傷的數(shù)量很多，所以在治療肝疾病方面受到許多關(guān)注。從病毒感染和酗酒導(dǎo)致的慢性肝損傷經(jīng)常會(huì)引起肝硬化和肝癌?？紤]到肝組織的生理特征和重要意義，以及根據(jù)治療和預(yù)防肝疾病的重要性，急需開發(fā)出治療和預(yù)防肝損傷的藥物。
多種藥物包括多種合成化合物和植物制劑在體外和體內(nèi)表現(xiàn)出肝保護(hù)功能。盡管已知水飛薊素或甜菜堿由于細(xì)胞素抑制和谷胱甘肽水平增加的活性機(jī)理而具有肝保護(hù)作用，但因?yàn)槠涞偷挠行院茈y預(yù)期治療效果。由于目前還沒有適當(dāng)?shù)闹委熕幬镏委煾渭膊?，所述藥物還經(jīng)常用于臨床治療。臨床用于治療肝纖維化的馬洛替酯及其衍生物能夠保護(hù)肝臟免受毒性化學(xué)物質(zhì)的損傷，其可能的活性機(jī)理包括誘導(dǎo)II相結(jié)合酶和抑制細(xì)胞色素P450。但是這些化合物非選擇性地抑制幾種細(xì)胞色素P450，表現(xiàn)出有限的預(yù)防效果。
已知十字花科植物天然來源的含硫的二硫醇硫酮的幾種取代物具有肝保護(hù)作用。在它們當(dāng)中，具有下式的吡噻硫酮用作治療血吸蟲病的臨床藥物。
吡噻硫酮能增加細(xì)胞中硫醇含量，誘導(dǎo)對(duì)維持谷胱甘肽(GSH)庫和親電分子組織解毒有作用的酶的表達(dá)。吡噻硫酮能增加下列酶的活性NAD(P)H醌還原酶，微粒體環(huán)氧化物水解酶，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)和UDP-GT。尤其是，GST保護(hù)肝臟免受某些毒性物質(zhì)如四氯化碳或?qū)σ阴０被拥膿p害(Ansher SS，Dolan P，和Bueding E.，兩種二硫醇硫酮和丁基羥基茴香醚對(duì)四氯化碳或?qū)σ阴０被佣拘缘幕瘜W(xué)保護(hù)效果，1983肝臟病學(xué)(Hepatology)3，932-935)。
并且，吡噻硫酮能抑制苯并[a]芘、NDEA和尿嘧啶氮芥引起的化學(xué)致癌作用，以及黃曲霉素B1-誘導(dǎo)的肝腫瘤發(fā)生和azoxymethane-誘導(dǎo)的結(jié)腸腫瘤發(fā)生(Bolton MG，Munoz A，Jacobson LP，Groopman JD，Maxuitenko YY，Roebuck BD，和Kensler TW.吡噻硫酮保護(hù)對(duì)抗黃曲霉素-誘導(dǎo)的肝腫瘤發(fā)生的短暫干涉，1993，癌癥研究(Cancer Res.)53，3499-3504)。
已知的通過吡噻硫酮抑制癌發(fā)生的機(jī)理如下所述。第一，吡噻硫酮能增加組織中抗氧劑、還原的GSH的水平。第二，它通過抑制I相酶如細(xì)胞色素P450而抑制致癌物質(zhì)的生物活化。第三，它通過誘導(dǎo)包括GST和UDP-GT的II相解毒酶而使致癌物質(zhì)解毒。第四，吡噻硫酮能抑制體內(nèi)I型人免疫缺陷病毒(HIV)的復(fù)制。第五，它能夠通過增加硫醇水平和促進(jìn)DNA修復(fù)而除去反應(yīng)性中間體。已報(bào)道吡噻硫酮能增加大多數(shù)組織的GSH水平，除去由于放射或異生物產(chǎn)生的游離基。還已知通過幫助維持細(xì)胞的自動(dòng)調(diào)節(jié)，吡噻硫酮能用作對(duì)輻射的保護(hù)劑。
關(guān)于上述描述，更詳細(xì)的信息如下所列。癌癥是不受控制的細(xì)胞生長和變異，推測(cè)是由于體細(xì)胞中的DNA損傷而引起(Cancer Biology，第三版，Raymond W.Ruddon，pp.61-95，497-507，Oxford Press)?；瘜W(xué)藥物的抗癌作用主要是依賴于其抗突變發(fā)生效果或其抑制轉(zhuǎn)化成癌細(xì)胞或癌細(xì)胞增殖的活性。吡噻硫酮已被研究作為癌癥化學(xué)防治藥物(Ansher等，1983；Bolton等，1993)。吡噻硫酮的癌癥化學(xué)防治效果不僅與抑制細(xì)胞色素P4503A有關(guān)，而且與II相解毒酶的誘導(dǎo)有關(guān)。通過吡噻硫酮在細(xì)胞和動(dòng)物中，能增加谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的表達(dá)(Clapper等，1994；Davidson等，1990)，其與抑制毒物誘導(dǎo)的組織損傷和致癌作用有關(guān)(Kensler等，1987；Maxuitenko等，1998)。吡噻硫酮保護(hù)肝臟免受輻射引起的組織損傷(Kim等，1997)，從現(xiàn)有技術(shù)已知GST誘導(dǎo)意味著細(xì)胞適應(yīng)反應(yīng)。吡噻硫酮還能保護(hù)肝臟對(duì)抗毒物(Ansher等，1983)。通過吡噻硫酮對(duì)黃曲霉素B1-誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生的抑制是通過干預(yù)細(xì)胞色素P450 3A催化的致癌物的代謝活化介導(dǎo)。按照最近的臨床實(shí)驗(yàn)，吡噻硫酮能有效降低肝癌高風(fēng)險(xiǎn)的人的血漿黃曲霉素B1水平。通過施用吡噻硫酮也能減少動(dòng)物中黃曲霉素B1-誘導(dǎo)的致癌作用。
已有報(bào)道吡噻硫酮能抑制肝炎B病毒(HBV)在2.2.15細(xì)胞中的復(fù)制，其中該細(xì)胞被含HBV DNA的質(zhì)粒感染。因此，吡噻硫酮能抑制肝炎B病毒基因的轉(zhuǎn)錄，提高p53蛋白表達(dá)(Chi等，1998)，以及抑制人免疫缺陷病毒(HIV)的復(fù)制(Prochaska等，1995)。
在中國已進(jìn)行了關(guān)于吡噻硫酮對(duì)肝癌發(fā)生的化學(xué)防治的臨床實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明吡噻硫酮對(duì)肝癌發(fā)生有弱的保護(hù)作用。還表明吡噻硫酮至少能適度地保護(hù)肝對(duì)抗毒物誘導(dǎo)的肝中毒。此外，在鼠和犬中進(jìn)行的毒性研究也證明了吡噻硫酮的安全性(Fund.Appl.Toxicol.1997 Jan；35(1)9-21)。
DDB(二甲基-4，4′-二甲氧基-5，6，5′，6′-二亞甲基二氧二苯基-2，2′-二羧酸酯)，一種來源于Shizandrae的成分，在包括韓國的東亞地區(qū)作為臨床治療肝炎的藥物。DDB保護(hù)肝組織免受四氯化碳-、半乳糖胺-、硫代乙酰胺-或氫化潑尼松-誘導(dǎo)的損傷，并增加抗體產(chǎn)生量。已知對(duì)肝炎患者的的臨床實(shí)驗(yàn)有效后，DDB已廣泛應(yīng)用到臨床中。本發(fā)明人報(bào)道了DDB的藥理效果與NF-κB活化和TNF-α生產(chǎn)的已知有關(guān)。另外，發(fā)現(xiàn)DDB不影響藥物代謝酶的表達(dá)。由于已知NF-κB作為介導(dǎo)炎性反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB的抑制劑能夠抑制全身性炎癥反應(yīng)。
肝纖維化為前病理(prepathological)狀態(tài)，其中在諸如肝炎的慢性肝疾病中的損傷的肝組織不能修復(fù)成正常組織，但是作為體內(nèi)適應(yīng)性反應(yīng)的一部分其能轉(zhuǎn)化成纖維組織如膠原蛋白。盡管肝纖維化是對(duì)組織損傷的反應(yīng)的體內(nèi)修復(fù)過程的結(jié)果，但是損傷的肝組織被纖維組織代替，其不再具有正常的功能(例如體內(nèi)代謝或生成膽汁)。由于連續(xù)和重復(fù)的肝纖維發(fā)生會(huì)導(dǎo)致肝硬化，最終導(dǎo)致死亡，因此開發(fā)治療肝纖維化的新藥非常重要。但是，由于還不清楚肝纖維發(fā)生的明確機(jī)理，因此還未開發(fā)出適合的治療性藥物。
最近的研究顯示轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)，一種從肝中肝巨噬細(xì)胞(Kupffer)和Ito細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，是肝纖維化的重要介質(zhì)。此外，報(bào)道通過使用TGF-β抗體、反義RNA和修飾TGF-β受體而阻斷TGF-β活性能明顯降低肝纖維化。但是，所述研究的效果僅在于實(shí)驗(yàn)水平得以驗(yàn)證。還沒有報(bào)道對(duì)肝纖維化和肝硬化臨床可行的藥物。發(fā)明目的
本發(fā)明的目的在于提供一種藥物組合物，其對(duì)肝纖維化和肝硬化具有最好的治療效果，并且其也可以用作預(yù)防藥物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種藥物組合物在制備用于治療和預(yù)防肝纖維化和肝硬化的藥物中的用途。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供治療或預(yù)防肝纖維化和肝硬化的方法，其包括對(duì)哺乳動(dòng)物給藥一種藥物組合物。發(fā)明概述
本發(fā)明提供了一種用于治療和預(yù)防肝纖維化和肝硬化的藥物組合物，其含有5-(2-吡嗪基)-4-甲基-1，2-二硫醇-3-硫酮(吡噻硫酮)和二甲基-4，4′-二甲氧基-5，6，5′，6′-二亞甲基二氧二苯基-2，2′-二羧酸酯(DDB)作為主要成分。所述組合物的吡噻硫酮與DDB的比例優(yōu)選為25∶0-25，更優(yōu)選為5∶0.1-5，最優(yōu)選為5∶1。按照本發(fā)明的吡噻硫酮/DDB制劑對(duì)治療和預(yù)防肝纖維化和肝硬化表現(xiàn)出人意外地好的效果，并且是對(duì)人體具有低毒性的安全藥物。


圖1a為顯示當(dāng)對(duì)大鼠給藥DMN時(shí)，吡噻硫酮對(duì)肝組織中的TGF-β1mRNA表達(dá)的抑制效果的照片。
圖2a為正常動(dòng)物的肝組織的照片(H & E染色)。
圖2b為正常動(dòng)物的肝組織照片(H & E染色)。
圖3a為給藥DMN組的肝組織照片(H & E染色)。
圖3b為給藥DMN組的肝組織照片(Masson′s trichrome染色)。
圖4a為聯(lián)合給藥(co-administer)DMN和吡噻硫酮(25mg/kg)/DDB(5mg/kg)組的肝組織照片(H & E染色)。
圖4b為聯(lián)合給藥DMN和吡噻硫酮(25mg/kg)/DDB(5mg/kg)組的肝組織照片(Masson′s trichrome染色)。
圖5a為聯(lián)合給藥DMN和吡噻硫酮(15mg/kg)/DDB(15mg/kg)組的肝組織照片(H & E染色)。
圖5b為聯(lián)合給藥DMN和吡噻硫酮(15mg/kg)/DDB(15mg/kg)組的肝組織照片(Masson′s trichrome染色)。
圖6a為聯(lián)合給藥DMN和吡噻硫酮(5mg/kg)/DDB(25mg/kg)組的肝組織照片(H & E染色)。
圖6b為聯(lián)合給藥DMN和吡噻硫酮(5mg/kg)/DDB(25mg/kg)組的肝組織照片(Masson′s trichrome染色)。發(fā)明詳述
本發(fā)明人首先發(fā)現(xiàn)吡噻硫酮對(duì)治療和預(yù)防肝纖維化和肝硬化有意想不到地另人驚異的效果。并且，他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)與DDB組合時(shí)，能明顯增加吡噻硫酮的治療和預(yù)防效果。
當(dāng)多種因素對(duì)肝造成嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，會(huì)出現(xiàn)纖維化，肝硬化的初級(jí)階段。肝硬化與癌形成有部分關(guān)系，并且會(huì)明顯增加其受害者患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)。但是，肝硬化的病理學(xué)機(jī)理與肝癌有明顯的區(qū)別。也就是說，當(dāng)肝組織有慢性和嚴(yán)重的損傷時(shí)，出現(xiàn)肝纖維化。肝損傷的病因包括病毒、寄生蟲、酗酒、化學(xué)物質(zhì)和藥物。通過肝組織中諸如肝巨噬細(xì)胞、星形細(xì)胞等非實(shí)質(zhì)細(xì)胞活化引起的細(xì)胞外基質(zhì)(例如I、III和IV型膠原蛋白)的過度生產(chǎn)會(huì)出現(xiàn)肝纖維化。更具體地，從星形細(xì)胞活化并隨后轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞出現(xiàn)纖維化。然后，活化的星形細(xì)胞產(chǎn)生過量的細(xì)胞基質(zhì)。并且，肝纖維化和肝硬化在病理現(xiàn)象上明顯不同于病毒性肝炎和肝癌。因此，它們各自的治療和預(yù)防也是不同的。但是，目前對(duì)于肝硬化，還沒有臨床上適用的藥物。
本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)了已知有效預(yù)防肝癌的吡噻硫酮也能有效抑制肝纖維化和肝硬化，而肝纖維化和肝硬化具有完全不同于肝癌的病理機(jī)理。并且，本發(fā)明的特征在于吡噻硫酮與DDB合用的用途，其中以前已知DDB僅有效治療肝炎，該用途在治療和預(yù)防肝纖維化和肝硬化中提供了超出預(yù)期的效果。這些事實(shí)在下述的實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。
吡噻硫酮或吡噻硫酮/DDB減少了纖維化得分和Knodell得分，二甲基亞硝胺(DMN)加速纖維化的指標(biāo)。這與示范性的組織的顯微鏡檢查相一致。此外，基于給藥，吡噻硫酮或吡噻硫酮/DDB明顯抑制肝中毒指標(biāo)如ALT，AST，膽紅素，和γ-谷胺酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)。這表明吡噻硫酮或吡噻硫酮/DDB通過延遲其各自的過程能改善纖維化。該吡噻硫酮或吡噻硫酮/DDB纖維化抑制機(jī)理涉及TGF-β表達(dá)的抑制。按照定量RT-PCR結(jié)果，吡噻硫酮或吡噻硫酮/DDB能完全抑制通過二甲基亞硝胺加速的TGF-βmRNA表達(dá)。這可以用作吡噻硫酮作為能夠抑制肝纖維化和肝硬化發(fā)生和發(fā)展的藥物的證據(jù)。吡噻硫酮誘導(dǎo)肝解毒酶GST和mEH，增加GSH，并表現(xiàn)出自由基結(jié)合活性；相反，DDB不誘導(dǎo)解毒酶。綜上所述，認(rèn)為吡噻硫酮和DDB具有互補(bǔ)的藥理效果。更具體地，通過DDB在人肝微粒體中的CYP3A代謝活性的抑制被認(rèn)為是隨后抑制吡噻硫酮的代謝，甚至低劑量的吡噻硫酮也可以提供強(qiáng)的肝保護(hù)作用，并能延長藥物的有效時(shí)間。
在本發(fā)明中，對(duì)已給藥DMN的大鼠中觀察了不同比例的吡噻硫酮/DDB組合對(duì)肝纖維化的治療效果。吡噻硫酮DDB進(jìn)行測(cè)試的重量比為25∶5，15∶15和5∶25(mg/kg)。在結(jié)果中，當(dāng)給藥DMN(給藥3周后進(jìn)行1周觀察)時(shí)，與對(duì)照組相比，ALT，AST，膽紅素，和γ-谷胺酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)，纖維化得分和Knodell得分均明顯提高。相反，當(dāng)給藥吡噻硫酮/DDB時(shí)，這些值都降低。吡噻硫酮(25mg/kg)/DDB(5mg/kg)表現(xiàn)出最高的肝纖維化抑制效果。這證明了吡噻硫酮和DDB在抑制肝損傷和纖維化的協(xié)同效果，教導(dǎo)了它們之間的最佳比例為5∶1。并且，吡噻硫酮/DDB組合給藥比單獨(dú)給藥吡噻硫酮(50mg/kg)能降低更多的血液生化指標(biāo)，即肝纖維化和Knodell得分。因此，認(rèn)為吡噻硫酮與DDB組合應(yīng)用可以減少副作用如胃腸道疾病、手足感覺異常等，這些副作用可以由于高吡噻硫酮?jiǎng)┝慨a(chǎn)生。DDB抑制通過DMN誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，而吡噻硫酮能防止TGF-β表達(dá)，增加抗氧化劑酶的表達(dá)，并誘導(dǎo)增加GSH。通過該機(jī)理，吡噻硫酮/DDB能使治療和預(yù)防肝纖維化的效果最大化。因此，吡噻硫酮/DDB利用其對(duì)肝保護(hù)的互補(bǔ)效果。并且，由于吡噻硫酮/DDB表現(xiàn)出幾乎沒有副作用，其可以臨床應(yīng)用。
優(yōu)選本發(fā)明的藥物組合物通過組合獨(dú)立制劑的藥物應(yīng)用，或通過制成含有藥物混合物的組合制劑應(yīng)用。當(dāng)本發(fā)明的藥物組合物實(shí)際應(yīng)用時(shí)，配制成適合于口服給藥的單位劑量形式，按照合適的藥物領(lǐng)域的常規(guī)方法給藥。為此，口服劑型包括硬或軟膠囊、片劑、粉末等。除了吡噻硫酮/DDB作為藥理活性成分外，該口服劑型可以含有一種或多種藥理非活性的常規(guī)載體介質(zhì)。例如該口服劑型可以含有添加劑淀粉、乳糖、羧甲基纖維素、高嶺土等賦型劑；水、明膠、醇、葡萄糖、阿拉伯膠、黃蓍膠等粘合劑；淀粉、糊精、海藻酸鈉等崩解劑；滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、液體石蠟等潤滑劑。可以進(jìn)一步加入溶解的助劑。
本發(fā)明的每日劑量根據(jù)多種因素，如患者的肝損傷程度、肝炎的發(fā)病時(shí)間、年齡、健康程度、并發(fā)癥等。但是對(duì)于正常的成年人，一天給藥吡噻硫酮/DDB組合物一次或兩次，每日總劑量為5-200mg，更優(yōu)選25-50mg。但是如果患者患有嚴(yán)重的肝損傷或當(dāng)肝癌切除后用作抗復(fù)發(fā)藥時(shí)，本發(fā)明可以偏離上述藥物組合物的范圍，使用更大的劑量。更優(yōu)選地，每日口服給藥兩次含有25mg吡噻硫酮和5mg DDB的一個(gè)或兩個(gè)單位劑量。
本發(fā)明藥物組合物最好將DDB補(bǔ)充到吡噻硫酮中，其中吡噻硫酮具有顯著的纖維化抑制和肝保護(hù)性質(zhì)，而DDB具有卓越的炎性反應(yīng)抑制效果。上述提供了對(duì)肝纖維化和肝硬化的抑制，具有低的毒性，并且?guī)缀鯖]有副作用。因此，本發(fā)明可以安全地長期用于治療和預(yù)防肝纖維化和肝硬化。
下面通過本發(fā)明的具體實(shí)施例更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。但是本發(fā)明不限于這些具體實(shí)施例。測(cè)試實(shí)施例測(cè)試實(shí)施例1吡噻硫酮抗-纖維化效果(1)
大鼠在4周內(nèi)連續(xù)給藥二甲基亞硝胺(DMN)，使血漿中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶增加到4倍。用50mg/kg吡噻硫酮預(yù)處理后，血漿中ALT和AST活化的增加被抑制50％(表1)。
血漿中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)活性和膽紅素含量用作肝功能的指標(biāo)。吡噻硫酮抑制DMN給藥大鼠的γ-GT活化增加的70％-80％。另一方面，當(dāng)給藥DMN時(shí)，與對(duì)照組相比膽紅素含量增加到8倍。當(dāng)50mg/kg吡噻硫酮和DMN同時(shí)給藥時(shí)，膽紅素的增加被抑制65％。表1ALT、AST、γ-GT和膽紅素值
每個(gè)值都由平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。使用的動(dòng)物數(shù)為8-16。通過多次分析的Newman-Keuls檢驗(yàn)顯示每組間的顯著性差異。表示顯著性的符號(hào)含義為*＝與對(duì)照相比p＜0.05，#＝與DMN處理組相比p＜0.05。測(cè)試實(shí)施例2吡噻硫酮抗-纖維化效果(2)
在動(dòng)物測(cè)試模型中觀察吡噻硫酮對(duì)DMN誘導(dǎo)的肝纖維化的組織病理學(xué)影響。給藥DMN4周、每周3次后的大鼠可觀察到明顯的纖維化。當(dāng)同時(shí)給藥吡噻硫酮(口服給藥5-50mg/kg劑量，每周3次后，超過4周)和DMN，與單獨(dú)給藥DMN相比肝組織的纖維化減少。通過使用肝組織病理學(xué)指示劑即Van Gieson染色和Masson′s trichrome染色，在病理學(xué)上測(cè)定肝組織的壞死和纖維化(表2)。
50mg/kg吡噻硫酮?jiǎng)┝磕苡行Ц纳艱MN誘導(dǎo)的纖維化(表2)。通過評(píng)價(jià)纖維化和Knodell得分(其指示了肝損傷和纖維化的程度)，確定了纖維化的程度。與只給藥DMN組相比，DMN+吡噻硫酮組表現(xiàn)出低的纖維化和Knodell得分，表現(xiàn)出肝損傷和纖維化的治療補(bǔ)救。表2吡噻硫酮對(duì)肝組織纖維化的抑制效果
每個(gè)值都由平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。使用的動(dòng)物數(shù)為8-16。通過多次分析的Newman-Keuls測(cè)試顯示每組間的顯著性差異。*p＜0.05，**p＜0.01。纖維化程度0＝正常，1＝存在微弱的纖維化組織，2＝存在中等的纖維化組織，3＝存在明顯的纖維化組織，4＝存在嚴(yán)重的纖維化。從門靜脈周的橋連(periportal bridging)(最大＝10)、小葉內(nèi)細(xì)胞損傷(最大＝4)、肝門炎癥(最大＝4)、和纖維化(最大＝4)的值的總和為Knodell得分。測(cè)試實(shí)施例3吡噻硫酮在抗-纖維化中的藥理學(xué)機(jī)理
TGF-β1是在組織損傷后纖維化中表達(dá)升高的主要細(xì)胞因子。在只給藥DMN和同時(shí)給藥DMN和吡噻硫酮中，根據(jù)RT-PCR分析方法觀察了動(dòng)物TGF-β1mRNA的表達(dá)。在動(dòng)物給藥DMN4周，不可逆的過度纖維發(fā)生妨礙了TGF-β1mRNA表達(dá)的觀察。在只給藥DMN的動(dòng)物中觀察到TGF-β1mRNA的表達(dá)。給藥DMN后18小時(shí)，給藥吡噻硫酮。然后在24小時(shí)后觀察TGF-β1mRNA表達(dá)。在DMN給藥的大鼠中，肝組織中TGF-β1mRNA顯著增加。通過給藥100mg/kg吡噻硫酮可以完全抑制DMN誘導(dǎo)的TGF-β1mRNA的表達(dá)。在只給藥DMN或同時(shí)給藥DMN和吡噻硫酮后，GAPDH mRNA的表達(dá)沒有變化。因此，表明吡噻硫酮通過減少TGF-β1表達(dá)的藥理學(xué)機(jī)理抑制肝纖維化(圖1)。測(cè)試實(shí)施例4吡噻硫酮對(duì)抑制TGF-β生產(chǎn)的評(píng)價(jià)
為了觀察吡噻硫酮是否能直接抑制TGF-β的生產(chǎn)(其在巨噬細(xì)胞過度表達(dá))和評(píng)價(jià)相關(guān)的分子藥理學(xué)機(jī)理，應(yīng)用RAW264.7巨噬細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試。當(dāng)吡噻硫酮直接加入到RAW264.7巨噬細(xì)胞時(shí)(其已增加TGF-β的表達(dá))，發(fā)現(xiàn)吡噻硫酮能以劑量依賴的方式抑制TGF-β表達(dá)。這些結(jié)果表明吡噻硫酮可以通過抑制TGF-β生產(chǎn)而用作肝的肝巨噬細(xì)胞中的抗-纖維化藥物。并且，通過EGTA或染料木黃酮(其為酪氨酸激酶的抑制劑)可以抑制TGF-β表達(dá)的增加。該結(jié)果表明通過吡噻硫酮對(duì)TGF-β生產(chǎn)的抑制可能是細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)和蛋白激酶活性改變的結(jié)果(表3)。表3通過吡噻硫酮對(duì)TGF-β在巨噬細(xì)胞中表達(dá)的抑制測(cè)試實(shí)施例5DDB抗炎機(jī)理(抑制NF-κB活化)
已知NF-κB活化與炎性反應(yīng)有關(guān)。為了比較給藥DDB與未給藥DDB時(shí)的肝組織中的NF-κB活性的差異，進(jìn)行了下列測(cè)試。使用體重大約150g的SD雄性大鼠。每組使用7只大鼠。對(duì)于對(duì)照組(給藥載體)和測(cè)試組(給藥20-100mg/kg/天的DDB)，通過應(yīng)用電泳活動(dòng)移動(dòng)檢測(cè)(ElectrophoresisMobility Shift Assay(EMSA))測(cè)定按照內(nèi)毒素(脂多糖，LPS)處理的NF-κB活性。
LPS處理(1μg/kg)導(dǎo)致NF-κB核轉(zhuǎn)錄p50和p65復(fù)合物水平的增加。但是LPS處理前2小時(shí)的DDB處理(20-100mg/kg)阻滯了NF-κB復(fù)合物易位進(jìn)入核子及其活性。這些結(jié)果表明DDB能夠抑制在大鼠肝臟中LPS誘導(dǎo)的NF-κB活化。
用1μg/kg of LPS刺激Raw264.7細(xì)胞會(huì)引起30分鐘至1小時(shí)后的NF-κB的DNA結(jié)合活性增加。在濃度為0.1、0.3和1mM的DDB能夠以濃度依賴的方式抑制NF-κB活性。這些結(jié)果與用DDB處理的大鼠肝中得到的結(jié)果相一致。表4DDB對(duì)NF-κB活化的影響
I-κBα降解的抑制
通過I-κBα亞基的磷酸化和蛋白酶降解進(jìn)行NF-κB到核的易位。進(jìn)行該測(cè)試是為了確定DDB對(duì)NF-κB活化的效果是否與I-κBα降解的抑制有關(guān)。大鼠用LPS(1μg/kg)處理30分鐘后I-κBα蛋白水平下降。相反，在LPS處理前2小時(shí)用DDB處理，能減少由LPS造成的I-κBα蛋白下降。而且與RAW264.7細(xì)胞，DDB在0.3-1mM的濃度下以濃度依賴的方式抑制蛋白降解。這些結(jié)果表明DDB抑制I-κBα降解并由此抑制NF-κB活化(表5)。表5DDB對(duì)I-κBα降解的影響測(cè)試實(shí)施例6DDB抗炎機(jī)理(TNF-α生產(chǎn)和mRNA表達(dá)的抑制)
TNF-α是對(duì)LPS反應(yīng)的主要介質(zhì)，其涉及炎性過程。通過ELISA確定當(dāng)通過DDB抑制NF-κB活性時(shí)，釋放到血中的TNF-α的量是否降低。單劑量的LPS處理(1μg/kg，i.v.)在給藥后2小時(shí)能使TNF-α的水平從35pg/ml升高至5160pg/ml。DDB在20、50或100mg/kg的劑量下處理能防止通過LPS造成的血漿TNF-α水平提高，得到的每毫升血漿值分別為1350、1230或690pg。對(duì)于RAW264.7細(xì)胞，DDB能降低由LPS造成的TNF-α生產(chǎn)。這些結(jié)果顯示DDB能抑制TNF-α在巨噬細(xì)胞和肝中的表達(dá)(表6)。表6DDB對(duì)在血漿中TNF-α生產(chǎn)的影響測(cè)試實(shí)施例7吡噻硫酮/DDB的組合的抗纖維化效果(1)
通過改變組合中的成分的比例，評(píng)價(jià)了吡噻硫酮/DDB的組合抗纖維化效果。為了評(píng)價(jià)按照組成比例的組合效果，部分改變了DMN的劑量安排。即，在測(cè)試實(shí)施例1和2中，DMN在四周內(nèi)每周給藥3次，即以每次給藥10μl/kg的劑量總共給藥12次，而為了評(píng)價(jià)按照組成比例的組合效果，使用具有減少的肝損傷的動(dòng)物模型，其中在測(cè)試?yán)蠨MN在三周內(nèi)每周給藥3次，即以每次給藥10μl/kg的劑量總共給藥9次，在剩余的一周不給藥。
給藥DMN三周后1周，動(dòng)物的纖維化得分為2.9，Knodell得分為11.7。因此，當(dāng)與動(dòng)物給藥DMN四周的纖維化得分為3.7和Knodell得分為16.1相比，表明動(dòng)物的肝纖維化降低。
給藥DMN三周、每周3次后1周，與對(duì)照組相比動(dòng)物的血漿中ALT和AST活性增加至大約4倍。
在每次給藥DMN后1天在三周內(nèi)(每周3次)以25∶5、15∶5和5∶25mg/kg的劑量比給藥吡噻硫酮和DDB的動(dòng)物中，當(dāng)與只給藥DMN的動(dòng)物的結(jié)果相比，給藥吡噻硫酮和DDB的動(dòng)物的血漿中ALT和AST活性明顯被抑制。對(duì)比組合中不同組成比例間的效果，發(fā)現(xiàn)以15∶15mg/kg的劑量給藥吡噻硫酮和DDB的動(dòng)物組雖然也表現(xiàn)出ALT和AST活性的明顯抑制，但抑制程度低于以25∶5mg/kg的劑量給藥吡噻硫酮和DDB的動(dòng)物組的結(jié)果(表7)。
血漿中的γ-GT活性和膽紅素含量被用作肝功能的代表指標(biāo)。在以25∶5、15∶5和5∶25mg/kg的劑量比給藥吡噻硫酮和DDB三周的動(dòng)物中，DMN-誘導(dǎo)的膽紅素含量增加在統(tǒng)計(jì)學(xué)上受到顯著的抑制。與ALT和AST的結(jié)果相類似，在給藥吡噻硫酮和DDB的動(dòng)物組中，以25∶5mg/kg的劑量給藥吡噻硫酮和DDB的動(dòng)物的膽紅素增加最大程度地受到抑制。
血中總蛋白含量和膽紅素水平為肝組織蛋白合成的指標(biāo)。當(dāng)發(fā)生肝硬化，血中總蛋白含量通常降低。給藥DMN三周后1周，處理組動(dòng)物中的總蛋白含量明顯降低，但是以25∶5和15∶5mg/kg的劑量比給藥吡噻硫酮和DDB的動(dòng)物組中的總蛋白含量恢復(fù)到正常對(duì)照組的水平。
這些結(jié)果表明在測(cè)試實(shí)施例中使用的吡噻硫酮和DDB組成比中，給藥25∶5mg/kg的吡噻硫酮和DDB的動(dòng)物組顯示出對(duì)通過DMN誘導(dǎo)的肝纖維化最大的抑制效果。并且，還可以注意到給藥吡噻硫酮(25mg/kg)/DDB(5mg/kg)的動(dòng)物組的效果等于或優(yōu)于在測(cè)試實(shí)施例1中單獨(dú)給藥50mg/kg吡噻硫酮的動(dòng)物組的效果。實(shí)際上，單獨(dú)給藥50mg/kg吡噻硫酮的動(dòng)物組中對(duì)由DMN引起的ALT增加的抑制百分比為40％，給藥25∶5mg/kg吡噻硫酮和DDB的動(dòng)物組的肝纖維化抑制百分比為43％。對(duì)于其它的指標(biāo)，也能觀察到類似的結(jié)果。表7ALT、AST、膽紅素、白蛋白和總蛋白含量值
每個(gè)值都由平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。使用的動(dòng)物數(shù)為8-10。通過多次分析的Newman-Keuls檢驗(yàn)顯示每組間的顯著性差異。表示顯著性的符號(hào)含義為*＝與對(duì)照相比p＜0.05，#＝與DMN處理組相比p＜0.05。測(cè)試實(shí)施例8吡噻硫酮/DDB的抗纖維化效果(2)
在動(dòng)物模型中觀察到吡噻硫酮/DDB的多種組合對(duì)DMN誘導(dǎo)的肝纖維化的組織病理學(xué)效果。在正常大鼠中沒有觀察到肝纖維化(圖2a和2b)。給藥DMN三周、每周3次后1周的大鼠中觀察到肝組織的明顯肝纖維化(圖3a和3b)。當(dāng)給藥DMN后1天以25∶5和15∶15mg/kg的劑量比給藥吡噻硫酮和DDB三周(每周3次)時(shí)，肝組織中的纖維化比只給藥DMN的結(jié)果明顯降低。尤其是，以25∶5mg/kg的劑量比給藥吡噻硫酮和DDB的動(dòng)物組(圖4a和4b)顯示出比以15∶15mg/kg(圖5a和5b)和5∶25mg/kg(圖6a和6b)的劑量比給藥吡噻硫酮和DDB的動(dòng)物組更好的藥效，并能明顯地抑制肝纖維化的發(fā)展。
通過使用膠原蛋白累積的病理學(xué)指示劑即Masson′s trichrome染色，在病理學(xué)上測(cè)定肝組織的壞死和纖維化。通過評(píng)價(jià)纖維化值和Knodell得分(其指示了肝損傷和纖維化的程度)，確定了纖維化的程度。表8吡噻硫酮/DDB組合對(duì)肝組織纖維化的抑制效果
每個(gè)值都由平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。使用的動(dòng)物數(shù)為8-10。通過多次分析的Newman-Keuls測(cè)試顯示每組間的顯著性差異。表示顯著性的符號(hào)含義為**p＜0.01，與DMN處理組相比。纖維化分級(jí)為0＝正常，1＝存在微弱的纖維化組織，2＝存在中等的纖維化組織，3＝存在明顯的纖維化組織，4＝存在嚴(yán)重的纖維化。從門靜脈周的橋連(periportal bridging)(最大＝10)、小葉內(nèi)細(xì)胞損傷(最大＝4)、肝門炎癥(最大＝4)、和纖維化(最大＝4)的值的總和為Knodell得分。測(cè)試實(shí)施例9吡噻硫酮/DDB組合對(duì)TGF-β表達(dá)的影響
如上所述，TGF-β是引起肝纖維化的細(xì)胞因子，并且已知與肝纖維化的發(fā)展有關(guān)。表9顯示了通過RT-PCR方法的TGF-βmRNA的存在的變化。
與對(duì)照組相比，給藥DMN組顯示出TGF-β生產(chǎn)的明顯增加。在給藥不同組合比例的吡噻硫酮/DDB的動(dòng)物中，關(guān)于TGF-β表達(dá)的定量RT-PCR結(jié)果顯示給藥30mg/kg吡噻硫酮和聯(lián)合給藥25∶5mg/kg吡噻硫酮和DDB能完全抑制TGF-β表達(dá)。但是，隨DDB對(duì)于吡噻硫酮的比例的增加，TGF-β表達(dá)的抑制逐漸下降。在只給藥DDB的動(dòng)物組中，沒有抑制TGF-β的表達(dá)。因此，認(rèn)為TGF-β表達(dá)的抑制是由于吡噻硫酮引起。在這方面，吡噻硫酮與DDB最佳的組合比例為5∶1(表9)。表9吡噻硫酮/DDB組合對(duì)TGF-β表達(dá)的相對(duì)抑制工作實(shí)施例工作實(shí)施例1吡噻硫酮25mgDDB 1mg乳糖50mg淀粉10mg硬脂酸鎂適量
將上述成分混合，按照常規(guī)的片劑制備方法制備片劑。工作實(shí)施例2吡噻硫酮50mgDDB 1mg乳糖50mg淀粉10mg硬脂酸鎂適量
將上述成分混合，按照常規(guī)的片劑制備方法制備片劑。工作實(shí)施例3吡噻硫酮5mgDDB 10mg乳糖50mg淀粉10mg硬脂酸鎂適量
將上述成分混合，按照常規(guī)的片劑制備方法制備片劑。工作實(shí)施例4吡噻硫酮25mgDDB 5mg乳糖30mg淀粉28mg滑石2mg硬脂酸鎂適量
將上述成分混合，按照常規(guī)的膠囊制備方法通過填充到硬明膠膠囊中制備膠囊劑。工作實(shí)施例5吡噻硫酮25mgDDB 5mg乳糖30mg淀粉28mg滑石2mg硬脂酸鎂適量
將上述成分混合，按照常規(guī)的膠囊制備方法通過填充到硬明膠膠囊中制備膠囊劑。工作實(shí)施例6吡噻硫酮1mgDDB 50mg乳糖30mg淀粉28mg滑石2mg硬脂酸鎂適量
將上述成分混合，按照常規(guī)的膠囊制備方法通過填充到硬明膠膠囊中制備膠囊劑。工作實(shí)施例7吡噻硫酮5mgDDB 25mg乳糖30mg淀粉28mg滑石2mg硬脂酸鎂適量
將上述成分混合，按照常規(guī)的膠囊制備方法通過填充到硬明膠膠囊中制備膠囊劑。工作實(shí)施例8吡噻硫酮250mgDDB 50mg異構(gòu)化糖10g糖 30mgCMC鈉 100mg檸檬調(diào)味劑 適量加入純水至總體積100ml
按照常規(guī)的混懸劑制備方法，將上述成分制成混懸劑。將該混懸劑填充到100ml棕色瓶中，并進(jìn)行滅菌。工作實(shí)施例9吡噻硫酮50mgDDB 250mg異構(gòu)化糖20g糖 20g海藻酸鈉100mg橙味調(diào)味劑 適量加入純水至體積100ml
按照常規(guī)的混懸劑制備方法，將上述成分制成混懸劑。將該混懸劑填充到100ml棕色瓶中，并進(jìn)行滅菌。工作實(shí)施例10吡噻硫酮25mgDDB 5mg乳糖30mg淀粉20mg硬脂酸鎂適量
將上述成分混合，填充到聚乙烯包封袋中，密封制備粉末劑。工作實(shí)施例111軟膠囊含有吡噻硫酮25mgDDB 5mg聚乙二醇400 400mg濃甘油 55mg純水335mg
將聚乙二醇與濃甘油混合，然后加入純水。將混合物維持在60℃，向該混合物中加入吡噻硫酮。將該混合物在1,500rpm下攪拌。混合物混合均勻后，在緩慢攪拌下將混合物冷卻至室溫。用真空泵除去氣泡，將內(nèi)容物置于軟膠囊中。
軟膠囊的膜按照常規(guī)方法制備，應(yīng)用公知的軟明膠增塑劑配方，該配方每膠囊中含有明膠132mg，濃甘油52mg，70％二山梨醇溶液6mg，以及適量的乙基香蘭素調(diào)味劑和棕櫚蠟作為包衣劑。工業(yè)實(shí)用性
按照本發(fā)明的吡噻硫酮/DDB制劑對(duì)治療和預(yù)防肝纖維化和肝硬化表現(xiàn)出出人意料地好的效果。因此，它可以臨床用于治療和預(yù)防肝纖維化和肝硬化。
權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)防和治療肝纖維化和肝硬化的發(fā)展的藥物組合物，其含有5-(2-吡嗪基)-4-甲基-1，2-二硫醇-3-硫酮(吡噻硫酮)和二甲基-4，4′-二甲氧基-5，6，5′，6′-二亞甲基二氧二苯基-2，2′-二羧酸酯(DDB)。
2.按照權(quán)利要求1藥物組合物，其中所述組合物配制成選自膠囊、片劑、軟膠囊、混懸劑、糖漿劑、注射劑和粉末劑的劑型。
3.按照權(quán)利要求1藥物組合物，其中所述組合物用于口服給藥。
4.按照權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述組合物含有重量比50-1∶1-50的吡噻硫酮和DDB。
5.按照權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的藥物組合物在制備用于預(yù)防和治療肝纖維化和肝硬化的發(fā)展的藥物中的用途。
6.一種用于預(yù)防和治療肝纖維化和肝硬化的發(fā)展的方法，其包括對(duì)哺乳動(dòng)物給藥按照權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于治療和預(yù)防肝纖維化和肝硬化的藥物組合物，其含有5－(2－吡嗪基)－4－甲基－1，2－二硫醇－3－硫酮(吡噻硫酮)和二甲基－4，4′－二甲氧基－5，6，5′，6′－二亞甲基二氧二苯基－2，2′－二羧酸酯(DDB)作為主要成分。在所述組合物中的吡噻硫酮與DDB的比例優(yōu)選為25∶0－25，更優(yōu)選為5∶0.1－5，特別優(yōu)選為5∶1。按照本發(fā)明的吡噻硫酮/DDB制劑對(duì)治療和預(yù)防肝纖維化和肝硬化表現(xiàn)出意外好的效果，并且是對(duì)人體具有低毒性的安全藥物。
文檔編號(hào)A61K45/06GK1407891SQ0180596
公開日2003年4月2日 申請(qǐng)日期2001年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月2日
發(fā)明者金相建, 姜建旭 申請(qǐng)人:金相建