專利名稱：組織等效物的冷凍保存方法和冷凍保存的組織等效物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織等效物的冷凍保存方法和冷凍保存的組織等效物。進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)是涉及由在冷凍保存液中懸浮細(xì)胞工序、在基材上接種該細(xì)胞工序、以及由此得到的組織等效物在細(xì)胞和基材粘附前使其冷凍的工序構(gòu)成的組織等效物的冷凍保存方法以及利用該方法得到的冷凍保存的組織等效物。
但是，現(xiàn)有方法存在細(xì)胞生存率非常低之外，為調(diào)節(jié)下降一定的溫度又必需精密而且昂貴的程序冷凍儀等冷凍裝置的問(wèn)題。另外還存在為和基材粘附，需要細(xì)胞經(jīng)預(yù)培養(yǎng)工序(數(shù)小時(shí)到過(guò)夜)或在冷凍前用冷凍保存液洗細(xì)胞的工序，進(jìn)一步往細(xì)胞內(nèi)浸透冷凍保存液以及達(dá)到平衡都需要時(shí)間的問(wèn)題。
特別是在人造皮膚，特許公報(bào)第2722134號(hào)公開了片狀上皮細(xì)胞在冷凍狀態(tài)保存的方法，另外在特開平第8-23968號(hào)公報(bào)中還公開了利用溶膠—凝膠法固定培養(yǎng)皮膚，以及保存·運(yùn)輸?shù)姆椒ā?br> 還有在特表平第9-505032號(hào)公報(bào)中記載了通過(guò)在冷凍保護(hù)劑溶液中浸泡攪拌組織等效物，使冷凍保護(hù)劑溶液充分浸透組織等效物時(shí)、冷凍組織等效物的冷凍保存方法。這種方法即使在組織等效物比較厚且不均勻的情況下，也能無(wú)損地保全結(jié)構(gòu)、保持著細(xì)胞生命力而使組織等效物的冷凍保存成為可能，但在冷凍保護(hù)劑溶液浸透時(shí)需要時(shí)間這一點(diǎn)上，還是不能充分滿足冷凍保存工序的簡(jiǎn)單化。
還有，植物細(xì)胞的冷凍保存方法以及解凍方法在特開平第9-87102號(hào)公報(bào)中、人造肝臟的冷凍保存方法在特開昭第53-56897號(hào)公報(bào)、特開平2-71755號(hào)公報(bào)以及特表平11-506687號(hào)公報(bào)中、角膜組織等效物的冷凍保存方法在美國(guó)專利5374515號(hào)公報(bào)中分別有記載。但是，這些方法并不能充分滿足冷凍細(xì)胞的高存活率、融解后的高生物活性(例如細(xì)胞的增殖活性(率)、物質(zhì)生產(chǎn)能力等)以及冷凍保存工序的簡(jiǎn)單化。
因此，本發(fā)明的目的是提高冷凍細(xì)胞的存活率和融解細(xì)胞的生物活性，并且提供工序簡(jiǎn)化的組織等效物的冷凍方法。進(jìn)一步本發(fā)明的目的是還提供由該方法得到的冷凍保存的組織等效物。
即，本發(fā)明涉及一種組織等效物的冷凍保存方法，由在冷凍保存液中懸浮細(xì)胞的工序、在基材上接種該細(xì)胞的工序、以及將得到的組織等效物在細(xì)胞和基材粘附前使其冷凍的工序構(gòu)成；細(xì)胞是選自來(lái)自哺乳動(dòng)物的成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、朗格爾漢斯細(xì)胞、黑素細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、毛母細(xì)胞、毛乳頭細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、角膜實(shí)質(zhì)細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞以及角膜內(nèi)皮細(xì)胞中1種以上的上述冷凍保存方法；以及由在冷凍保存液中懸浮細(xì)胞工序、在基材上接種該細(xì)胞工序、以及得到的組織等效物在細(xì)胞和基材粘附前使其冷凍的工序構(gòu)成的方法得到的冷凍保存的組織等效物。
本發(fā)明的“懸浮”是指在溶液中將細(xì)胞分散的操作。
還有，本發(fā)明的“接種”是指將懸浮在培養(yǎng)基等中的細(xì)胞植入培養(yǎng)容器的培養(yǎng)基中或者基材中的過(guò)程。
進(jìn)一步，本發(fā)明的“冷凍”是指在基材上接種細(xì)胞而制得的組織等效物不經(jīng)培養(yǎng)，就立即冷凍保存的工序。由于經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)使細(xì)胞粘附到基材上之后冷凍，細(xì)胞存活率非常低，所以優(yōu)選在細(xì)胞接種后，細(xì)胞和基材粘附前將細(xì)胞冷凍。此時(shí)，細(xì)胞和基材不粘附，融解后的清洗幾乎不造成細(xì)胞損失。這里所說(shuō)的粘附是指在加了物理學(xué)上的力時(shí)，也不能使細(xì)胞從基材上容易地脫離的狀態(tài)。還有，細(xì)胞接種后，優(yōu)選在細(xì)胞容易從基材脫離的時(shí)間內(nèi)，將細(xì)胞冷凍。在此脫離是指細(xì)胞從基材容易脫離而在溶液中浮游的狀態(tài)。因此具體地說(shuō)必須以使細(xì)胞和基材不發(fā)生粘附的速度冷卻到4～10℃。冷卻速度慢時(shí)，細(xì)胞和基材就發(fā)生粘附，這種狀態(tài)下冷凍組織等效物會(huì)使細(xì)胞的存活率下降。這時(shí)的冷卻速度根據(jù)使用的細(xì)胞以及冷凍保存液的種類、冷卻開始時(shí)組織等效物的溫度等而變。例如在厚2-3mm的膠原蛋白海綿上接種成纖維細(xì)胞的人造皮膚情況下，在4℃～常溫接種細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選在3小時(shí)內(nèi)冷卻至4℃。
本發(fā)明的冷凍方法沒有特別的限制，優(yōu)選緩冷凍法、快速冷凍法以及玻璃化冷凍法等。
在此，“緩冷凍法”是指用添加了冷凍保護(hù)劑的溶液、使人造在細(xì)胞外形成的冰晶，通過(guò)緩慢而且適當(dāng)?shù)睦鋮s速度冷卻而漸漸地增長(zhǎng)，以緩慢的速度使細(xì)胞內(nèi)脫水濃縮、隨后通過(guò)快速冷卻、防止細(xì)胞胞內(nèi)冷凍而保存，得到融解后高存活率的方法(日本胚移植學(xué)雜志第18卷1期、“由體外受精的牛胚的玻璃化保存”、家畜改良事業(yè)團(tuán)·家畜生命科技中心)。冷卻速度，以上述的那樣使細(xì)胞和基材不發(fā)生粘附的溫度冷卻到4℃，之后優(yōu)選以-0.1℃/分～-10℃/分，更優(yōu)選-0.2℃/分～-5℃/分的速度降到至少達(dá)-20℃或者更低的溫度。
“快速冷凍法”是指用添加了冷凍保護(hù)劑的溶液、在超低溫冰箱等中快速使組織等效物(或者細(xì)胞)冷卻冷凍至冰點(diǎn)以下的方法。冷卻至4速度以上述的那樣使細(xì)胞和基材不發(fā)生粘附的溫度冷卻到4℃，之后優(yōu)選-10℃/分～-30℃/分，更優(yōu)選-10℃/分～-20℃/分。如果快于-30℃/分，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生結(jié)凍，有細(xì)胞破碎的危險(xiǎn)。
“玻璃化冷凍法”是指在添加了高濃度冷凍保護(hù)劑的溶液(稱為玻璃化溶液，通常是細(xì)胞滲透性溶液和非細(xì)胞滲透性溶液合用)中使細(xì)胞浮游后，通過(guò)投入液氮等使其快速冷卻冷凍的方法。這是應(yīng)用高濃度水溶液在快速冷卻時(shí)，成為不存在冰晶核的玻璃化(Vitrification)狀態(tài)的現(xiàn)象(生殖細(xì)胞培養(yǎng)法，學(xué)術(shù)出版中心，1983年；研究期刊21(9)，志水學(xué)著，1998年)。本方法可使組織等效物在數(shù)秒內(nèi)冷凍。
本發(fā)明的方法中組織等效物的保存溫度，為了長(zhǎng)時(shí)間維持高的生物活性，無(wú)論上述三種冷凍方法的哪一種都優(yōu)選-20℃～-196℃，更優(yōu)選-80℃～-196℃。在比-20℃高的溫度下長(zhǎng)期保存(數(shù)月以上)，可使細(xì)胞的存活率下降。因此，短期保存時(shí)，-20℃完全可以，但長(zhǎng)期保存時(shí)，就需要在較低溫度下保存。在-80℃時(shí)，可以保存1-2年，在-120℃以下(氮蒸汽)或者-196℃(液氮)時(shí)，可以半永久地保存。
本發(fā)明中使用的“冷凍保存液”是指含有選自具有細(xì)胞防凍傷效果的冷凍保護(hù)劑中至少一種的溶液。
在緩冷冷凍法和快速冷凍法中，作為冷凍保護(hù)劑，優(yōu)選選自甘油、二甲亞砜(DMSO)、丙二醇、乙二醇、蔗糖、羥甲基纖維素鹽、羥甲基纖維素、單糖類和二糖類(海藻糖等)中的至少一種。溶劑使用水系溶液。特別優(yōu)選生理鹽類溶液。生理鹽類溶液是指具有適合細(xì)胞生存的pH和滲透壓的鹽水溶液，可以舉生理鹽水(0.9％水溶液)、在生理鹽水中補(bǔ)充了K+、Ca2+等數(shù)種主要離子的鹽類溶液或者各種細(xì)胞培養(yǎng)液等。具體地可以舉DMEM(Dulbeco改良Eagles培養(yǎng)基)、磷酸緩沖液、Ringer氏液、Ringer-Locke氏液、Tyrode氏液、Earle氏液、HanK氏液、Locke氏液、Eagle最小必須培養(yǎng)液、Ham合成培養(yǎng)液F12、Green培養(yǎng)液、Leibovitz的L-15培養(yǎng)液、Cheese必須培養(yǎng)液、改良Eagle氏培養(yǎng)液、Waymouth培養(yǎng)液、Kreb氏培養(yǎng)液以及無(wú)血清培養(yǎng)液MCDB153、MCDB151、MCDB104、MCDB131、MCDB402、MCDB201、MCDB302、MCDB105和MCDB110等。
在玻璃化冷凍法中，作為冷凍保護(hù)劑可以使用非細(xì)胞浸透性玻璃化劑和/或細(xì)胞浸透性玻璃化劑。作為非細(xì)胞浸透性玻璃化劑優(yōu)選聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、Ficoll(Amersham Pharmacia Biotech公司制)以及葡聚糖等多糖類，以及蔗糖等；作為細(xì)胞浸透性玻璃化劑優(yōu)選甘油、丙二醇、乙二醇以及DMSO等。還有作為溶劑，緩冷冷凍法和快速冷凍法同樣優(yōu)選生理鹽類溶液，具體可以舉DMEM、磷酸緩沖液、Ringer氏液、Ringer-Locke氏液、Tyrode氏液、Earle氏液、HanK氏液、Locke氏液、Eagle氏最小必須培養(yǎng)液、Ham合成培養(yǎng)液F12、Green氏培養(yǎng)液、Leibovitz的L-15培養(yǎng)液、Cheese必須培養(yǎng)液、改良Eagle氏培養(yǎng)液、Waymouth培養(yǎng)液、Kreb氏培養(yǎng)液以及無(wú)血清培養(yǎng)液MCDB153、MCDB151、MCDB104、MCDB131、MCDB402、MCDB201、MCDB302、MCDB105和MCDB110等。
本發(fā)明使用的“基材”必須是給患者使用(貼附)組織等效物后不被患者的免疫機(jī)能排斥的、有優(yōu)良的機(jī)體適應(yīng)性的材料。還有優(yōu)選用后不需要去除的、具有生物降解性的材料。具體地說(shuō)是來(lái)自生物體的材料，優(yōu)選膠原蛋白、明膠、甲殼素、殼聚糖、纖維蛋白，以及軟骨素、硫酸軟骨素以及透明質(zhì)酸等粘多糖類；生物降解性高分子的聚乙醇酸、聚乳酸以及這些的混合物；非生物降解性的合成高分子中細(xì)胞粘附性優(yōu)良的聚氨酯、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯等；以及由這些組成的混合物。進(jìn)一步，更優(yōu)選具有優(yōu)良的生物體適應(yīng)性、基材內(nèi)適宜細(xì)胞存留那樣的多孔質(zhì)、具有海綿狀形態(tài)的不全膠原蛋白(atelocollagen)、膠原蛋白、明膠、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸。細(xì)胞接種時(shí)，為使細(xì)胞容易浸透海綿，孔是和細(xì)胞接種面垂直的縱向孔，希望在表面和/或和表面相對(duì)的面形成一定大小的孔?？讖綖槔诮臃N時(shí)細(xì)胞浸透并且不利于氣泡進(jìn)入，所以優(yōu)選20μm-1000μm的范圍。但是，只要能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，并不是非要限定在這個(gè)范圍。
本發(fā)明的“組織等效物”是指由基材和來(lái)自哺乳動(dòng)物的細(xì)胞一起組合形成的、至少與哺乳動(dòng)物組織具有一部分同等機(jī)能的構(gòu)成物。因此，本發(fā)明的組織等效物含有基材和該組織有代表性的細(xì)胞。因?yàn)檫@些有代表性的細(xì)胞在基材或者內(nèi)部具有和該組織細(xì)胞同等的活性，因此該組織等效物是以①組織損傷、切除等造成患者的組織或臟器機(jī)能不全，為此為全部或部分取代該組織或臟器而通過(guò)各種方法進(jìn)行移植或者植入為目的，或者以②調(diào)查各種制品·原材料和組織的相互作用，或者這些對(duì)組織影響為目的而使用。
本發(fā)明的“人造皮膚”是指由基材和來(lái)自哺乳類皮膚的細(xì)胞(成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞、朗格爾漢斯細(xì)胞、黑素細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、毛母細(xì)胞、毛乳頭細(xì)胞等)組成而制成的哺乳類(特別是人類)的皮膚組織等效物。本發(fā)明的人造皮膚，以促進(jìn)創(chuàng)傷愈合為目的，適用于由熱致傷的部位、潰瘍部位、褥瘡部位、采皮部位等各種皮膚的缺損部位。構(gòu)成人造皮膚的各種細(xì)胞可以在創(chuàng)傷面增殖的同時(shí)，合成·分泌對(duì)創(chuàng)傷愈合有效的物質(zhì)(通過(guò)促進(jìn)各種細(xì)胞增殖·移動(dòng)以及增殖因子的分泌而促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的細(xì)胞因子，周圍細(xì)胞移動(dòng)成為再形成組織時(shí)的基礎(chǔ)的細(xì)胞外基質(zhì)等)。
本發(fā)明的“人造肝臟”是指由基材和來(lái)自哺乳動(dòng)物的肝細(xì)胞組合而制成的哺乳動(dòng)物肝臟等效物。該人造肝臟是以代行肝臟擔(dān)負(fù)的機(jī)能；生命必需物的代謝或合成、有害物質(zhì)的異化作用、除去代謝產(chǎn)物中的部分功能為目的而開發(fā)的，并有望作為治療末期急性和慢性肝衰竭患者而應(yīng)用于臨床。
作為人造皮膚的一般制作方法，首先利用來(lái)自皮膚細(xì)胞調(diào)制細(xì)胞懸浮液后，在基材上接種該細(xì)胞懸浮液而制得。以下例示從成纖維細(xì)胞制作人造皮膚。
首先在清潔的環(huán)境下對(duì)采取的皮膚(含有表皮以及真皮的一部分或者全部)進(jìn)行消毒、用含有抗生素的生理鹽水或者Hanks’液等緩沖液浸泡。這些皮膚在分散酶(disperse)濃度調(diào)至1000IU/ml的DMEM中浸泡后，真皮與表皮分離。將得到的真皮用剪子仔細(xì)剪碎，再用均化器等粉碎，在0.5％膠原酶溶液(含有0.5％(w/v)膠原酶的DMEM)中浸泡，在37℃振蕩使結(jié)締組織溶解。其次在約200～1000×g下離心分離，回收真皮成纖維細(xì)胞。得到的成纖維細(xì)胞在添加了FBS(胎牛血清)達(dá)到10％(v/v)等的DMEM(以下稱DMEM+10％FBS)等作為培養(yǎng)液，在37℃進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)情況，可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶溶液(含有0.25％(w/v)胰蛋白酶以及0.005mM乙二胺四乙酸鈉(EDTA)的磷酸緩沖液)使其從培養(yǎng)瓶剝離，經(jīng)離心分離回收。將得到的成纖維細(xì)胞的沉淀在DMEM等中進(jìn)行懸浮調(diào)制成纖維細(xì)胞懸浮液。得到的成纖維細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞濃度用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板等進(jìn)行測(cè)定。再其次是再次離心分離回收成纖維細(xì)胞，使用含有甘油等冷凍保護(hù)劑的冷凍保存液，調(diào)制密度為1×104～5×106細(xì)胞/ml，優(yōu)選5×105～2×106細(xì)胞/ml的懸浮液。在來(lái)自豬或者牛的不全膠原蛋白溶液膠化以及冷凍干燥得來(lái)的、具有縱向空孔的膠原蛋白海綿中，以1×102～1×106細(xì)胞/cm2，優(yōu)選1×104～2×105細(xì)胞/cm2的細(xì)胞密度接種上述成纖維細(xì)胞懸浮液。等細(xì)胞懸浮浸透海綿并靜置后，得到組織等效物。
人造肝臟的情況下，作為細(xì)胞的分離法舉例可以用膠原酶溶液灌流肝組織，使細(xì)胞分散的膠原酶灌流法，但是本發(fā)明并不依賴這些分離技術(shù)。還有，使用的培養(yǎng)基可舉在DMEM、Cheese必需培養(yǎng)基、改良Eagle氏培養(yǎng)基、Leibovitz氏培養(yǎng)基、Waymouth氏培養(yǎng)基、Kreb氏培養(yǎng)基、Green氏培養(yǎng)基、L-15培養(yǎng)基等中添加了10％(v/v)FBS的培養(yǎng)基等，具體地優(yōu)選在Green氏培養(yǎng)基中添加了10％(v/v)FBS、10ng/ml人FGF以及13μg/ml肝素鈉的培養(yǎng)基。
人造角膜的情況下，作為角膜上皮、角膜實(shí)質(zhì)、角膜內(nèi)皮細(xì)胞從組織分離方法例，首先在分散酶溶液中浸泡、通過(guò)加溫·振蕩使角膜內(nèi)皮細(xì)胞剝離，其次用剪刀或者剃刀在顯微鏡下從角膜上剝離角膜上皮，仔細(xì)切碎分離使角膜上皮細(xì)胞、得到除去角膜內(nèi)皮以及角膜上皮細(xì)胞的角膜在盤子上進(jìn)行培養(yǎng)，回收從組織上脫離的細(xì)胞而分離角膜實(shí)質(zhì)細(xì)胞的方法(Adclheid I.Schneider等，In Vitro Cell.Dev.Biol-Animal，Vol.35.515-526(1999)和Yoichi Minami等，InvestigativeOphthalmology & Visual Science，Vol.34.2316-2324(1993))雖然以上方法是為人所知的，但本發(fā)明并不依賴于這些分離技術(shù)。還有，使用的培養(yǎng)基在角膜實(shí)質(zhì)細(xì)胞的情況下，可舉在DMEM，改良Eagle氏培養(yǎng)基、Eagle氏最小必須培養(yǎng)基、以及改良Eagle氏培養(yǎng)基等中添加了10％(v/v)FBS的培養(yǎng)基等，優(yōu)選DMEM+10％FBS。還有，角膜上皮細(xì)胞的情況下，優(yōu)選在Green氏培養(yǎng)基等中添加了10％(v/v)FBS的培養(yǎng)基。
以下，通過(guò)實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1-1來(lái)自人成纖維細(xì)胞的人造皮膚的緩冷冷凍保存A按照本發(fā)明的方法進(jìn)行人造皮膚的冷凍保存使用培養(yǎng)瓶(培養(yǎng)面積80cm2)，在DMEM+10％FBS中培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞。對(duì)數(shù)增殖期中的成纖維細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶處理并回收。分別在FBScryo(含有20％(v/v)FBS和10％(v/v)甘油的DMEM)、Cell Banker-II(日本全藥工業(yè)(株)制)、Cellvation(ICN生物醫(yī)學(xué)公司制)三種類的冷凍保存液中將細(xì)胞懸浮，制成9.0×105細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸浮液。事先在12孔板放入直徑22mm的圓形膠原蛋白海綿，各接種0.5ml細(xì)胞懸浮液(1.2×105細(xì)胞/cm2)。靜置至細(xì)胞懸浮液浸透海綿后，將12孔板以-0.5～-2℃/分的速度冷卻冷凍。A-1)人造皮膚的融解以及存活率測(cè)定在-80℃保存一定期間后的人造皮膚，用5％二氧化碳、37℃的條件下靜置10～15分鐘使其融解。吸取除去培養(yǎng)基后，用2ml DMEM+10％FBS或者DMEM洗2次。添加2ml DMEM+10％FBS或者DMEM后，在5％二氧化碳、37℃條件下進(jìn)行15小時(shí)以上培養(yǎng)。其次將得到的人造皮膚浸泡在5.0ml的0.5％膠原蛋白酶溶液中，37℃的水浴中振蕩5-10分鐘使該人造皮膚溶解。在約400×g、4℃的條件下，進(jìn)行5分鐘離心操作回收細(xì)胞、測(cè)定存活率。細(xì)胞的存活率在表1中表示。不管使用哪種冷凍保存液，在冷凍時(shí)存活率急劇下降，之后1個(gè)月左右存活率幾乎不變、或者呈緩慢下降。還有，1個(gè)月以上仍得到了50％以上的存活率。
表1

A-2)人造皮膚的融解以及生物活性的測(cè)定A-2-1細(xì)胞增殖率在-80℃保存的人造皮膚用5％二氧化碳、37℃條件下靜置10～15分鐘使其融解。吸取除去培養(yǎng)基后，用2ml DMEM+10％FBS或者DMEM洗2次。添加2ml DMEM+10％FBS或者DMEM后，在5％二氧化碳、37℃條件下進(jìn)行3日或7日培養(yǎng)。其次將得到的人造皮膚浸泡在5.0ml的0.5％膠原蛋白酶溶液中，37℃的水浴中振蕩5-10分鐘使該組織等效物溶解。在約400×g、4℃的條件下，進(jìn)行5分鐘離心操作回收細(xì)胞、用臺(tái)盼藍(lán)色素排除法對(duì)總細(xì)胞數(shù)、活細(xì)胞數(shù)以及細(xì)胞存活率進(jìn)行計(jì)數(shù)。特別是在DMEM+10％FBS培養(yǎng)情況下，培養(yǎng)3日后-7日后活細(xì)胞數(shù)增加到1.4倍。表2中表示融解后人造皮膚中的活細(xì)胞數(shù)。
表2

A-2-2血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖因子(VEGF)產(chǎn)生能力在-80℃保存的人造皮膚用5％二氧化碳、37℃條件下靜置10～15分鐘使其融解。吸取除去培養(yǎng)基后，用2ml DMEM+10％FBS或者DMEM洗2次。分別添加各培養(yǎng)液2ml后，在5％二氧化碳、37℃的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)3日后回收培養(yǎng)上清液，用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)法測(cè)定上清液中的VEGF量。做為對(duì)照，對(duì)沒有進(jìn)行冷凍的人造皮膚進(jìn)行同樣的測(cè)定。在活細(xì)胞的VEGF產(chǎn)生量方面，冷凍的人造皮膚(表3中的①和②)和不冷凍的人造皮膚(表3的③和④)之間幾乎沒有差異。表3表示培養(yǎng)3日后人造皮膚的VEGF產(chǎn)生量(pg/ml/105活細(xì)胞)。
表3

A-2-3膠原蛋白型I產(chǎn)生能力在-80℃保存的人造皮膚，用5％二氧化碳、37℃的條件下靜置10～15分鐘使其融解。吸取除去培養(yǎng)基后，用2ml DMEM洗2次。添加2ml DMEM后，在5％二氧化碳、37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)3日后回收培養(yǎng)上清液，用ELISA法測(cè)定上清液中的膠原蛋白I型的量。作為對(duì)照，對(duì)沒有進(jìn)行冷凍的人造皮膚進(jìn)行同樣的測(cè)定。由于本發(fā)明人使用的抗膠原蛋白I型抗體和培養(yǎng)基含有血清中的牛膠原蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，所以僅對(duì)在DMEM上培養(yǎng)的人造皮膚進(jìn)行了膠原蛋白I型的定量。培養(yǎng)3日后活細(xì)胞的膠原蛋白產(chǎn)生量和非冷凍的人造皮膚幾乎一樣。表4表示培養(yǎng)3日后人造皮膚的膠原蛋白型I產(chǎn)生量(ng/ml/105活細(xì)胞)。
表4

B利用現(xiàn)有方法的人造皮膚的冷凍保存使用培養(yǎng)瓶(培養(yǎng)面積80cm2)，在DMEM+10％FBS中培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞。對(duì)數(shù)增殖期中的成纖維細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶溶液處理并回收。用DMEM+10％FBS調(diào)制9.0×105細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸浮液。事先在12孔板放入直徑22mm的圓形膠原蛋白海綿，各接種0.5ml細(xì)胞懸浮液(1.2×105細(xì)胞/cm2)。將12孔板在5％二氧化碳、37℃條件下進(jìn)行15小時(shí)以上培養(yǎng)。在確認(rèn)細(xì)胞已經(jīng)粘附時(shí)，吸取除去培養(yǎng)基后，用冷凍保存液(FBScryo、Cell BonkerII、Cellvation)2ml分別洗2次。各孔中分別添加冷凍保存液2ml，將12孔板以-0.5～2℃/分的速度進(jìn)行冷卻冷凍。B-1)人造皮膚的融解以及存活率測(cè)定在-80℃保存必要期間的人造皮膚用5％二氧化碳、37℃條件下靜置10～15分鐘使其融解。吸取除去培養(yǎng)基后，用2ml DMEM+10％FBS或者DMEM洗2次。添加2ml DMEM+10％FBS或者DMEM后，在5％二氧化碳、37℃條件下進(jìn)行15小時(shí)以上培養(yǎng)。其次將得到的人造皮膚浸泡在5.0ml的0.5％膠原蛋白酶溶液中，37℃的水浴中振蕩5-10分鐘使該組織等效物溶解。在約400×g、4℃的條件下，進(jìn)行5分鐘離心操作回收細(xì)胞。冷凍1日后溶解人造皮膚測(cè)定總細(xì)胞數(shù)、活細(xì)胞數(shù)以及細(xì)胞的存活率。細(xì)胞和膠原蛋白海綿粘附狀態(tài)下緩冷冷凍，與冷凍保存液的種類無(wú)關(guān)，細(xì)胞的存活率非常低，僅10～20％。表5表示細(xì)胞的存活率。
表5

C冷凍時(shí)細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞存活率的相互關(guān)系在細(xì)胞與膠原蛋白海綿粘附狀態(tài)冷凍人造皮膚的現(xiàn)有方法中，與冷凍保存液的種類無(wú)關(guān)，細(xì)胞存活率非常低。在用本發(fā)明方法的人造皮膚與細(xì)胞和膠原蛋白海綿呈粘附狀態(tài)冷凍的人造皮膚之間被確認(rèn)存活率有差異，作為其原因可以認(rèn)為是由冷凍時(shí)細(xì)胞形態(tài)的不同而造成的。因此，為了明確人造皮膚冷凍時(shí)細(xì)胞形態(tài)與存活率之間關(guān)系，改變冷凍前的培養(yǎng)時(shí)間，其它和實(shí)施例1-1的A同樣順序制作人造皮膚，測(cè)定冷凍和融解后細(xì)胞存活率。具體是靜置到細(xì)胞懸浮液浸透海綿后(本發(fā)明)，或者在37℃培養(yǎng)2小時(shí)或者15小時(shí)后和實(shí)施例1-1的A同樣順序制作冷凍人造皮膚。還有，作為對(duì)照，對(duì)細(xì)胞接種后在37℃培養(yǎng)48小時(shí)的人造皮膚進(jìn)行同樣的細(xì)胞存活率測(cè)定。細(xì)胞接種后培養(yǎng)2小時(shí)-15小時(shí)的人造皮膚的存活率低，但細(xì)胞接種后立即冷凍的人造皮膚得到了非常高的存活率。冷凍前用顯微鏡進(jìn)行觀察確認(rèn)了在接種后2小時(shí)培養(yǎng)的人造皮膚中有一半以上的細(xì)胞、15小時(shí)以上培養(yǎng)的人造皮膚中全部的細(xì)胞，和海綿粘附著。即，可以認(rèn)為細(xì)胞的存活率因冷凍時(shí)細(xì)胞形態(tài)的不同而異。細(xì)胞在沒有粘附狀態(tài)冷凍人造皮膚的細(xì)胞回收率和沒有冷凍的人造皮膚相比在90％以上。因此，人造皮膚融解后既使進(jìn)行洗的操作，仍可以認(rèn)為細(xì)胞還滯留在海綿上。表6表示細(xì)胞的存活率和總細(xì)胞數(shù)。
表6

實(shí)施例1-2來(lái)自人成纖維細(xì)胞的人造皮膚的快速冷凍保存A利用本發(fā)明的方法進(jìn)行人造皮膚的冷凍保存使用培養(yǎng)瓶(培養(yǎng)面積80cm2)，在DMEM+10％FBS中培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞。對(duì)數(shù)增殖期中的成纖維細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶處理并回收。使細(xì)胞懸浮在FBScryo中，調(diào)制成9.0×105細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸浮液。事先在12孔板放入直徑22mm的圓形膠原蛋白海綿，各接種0.5ml細(xì)胞懸浮液(1.2×105細(xì)胞/cm2)。靜置至細(xì)胞懸浮液浸透海綿時(shí)，用塑料帶密封。保持12孔板原樣直接放入-152℃的超低溫冰箱中冷凍保存。A-1)人造皮膚的融解以及存活率測(cè)定冷凍1日后，在-152℃保存的人造皮膚在37℃水浴中浸泡3分鐘使其融解，吸取去除FBScryo培養(yǎng)基，用2ml DMEM+10％FBS洗2次。添加2mlDMMEM+10％FBS后，在5％二氧化碳、37℃條件下進(jìn)行15小時(shí)以上培養(yǎng)。其次將得到的人造皮膚浸泡在5.0ml的0.5％膠原蛋白酶溶液中，37℃的水浴中振蕩5-10分鐘使該人造皮膚溶解。在約400×g、4℃的條件下，進(jìn)行5分鐘離心操作回收細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)色素排除法測(cè)定總細(xì)胞數(shù)，活細(xì)胞數(shù)以及存活率。作為對(duì)照，對(duì)沒有進(jìn)行冷凍的人造皮膚也同樣測(cè)定了存活率。在-152℃的快速冷凍人造皮膚中，獲得了77.4％高存活率。這個(gè)結(jié)果可以說(shuō)和緩冷冷凍時(shí)相同。還有，本發(fā)明方法冷凍的人造皮膚融解后，培養(yǎng)過(guò)夜時(shí)確認(rèn)了細(xì)胞伸長(zhǎng)偽足和膠原蛋白海綿粘附。表7表示細(xì)胞的存活率。
表7

實(shí)施例2來(lái)自表皮細(xì)胞的人造皮膚的冷凍保存A由本發(fā)明的方法制作人造皮膚及冷凍方法使用培養(yǎng)瓶(培養(yǎng)面積80cm2)在含有3％(V/V)FBS的Green氏培養(yǎng)基(以下寫作Green氏培養(yǎng)基+3％FBS)上培養(yǎng)人表皮細(xì)胞。人表皮細(xì)胞用調(diào)制成1000單位/ml分散酶(合同酒精(株)制)的PBS(-)(磷酸緩沖液)溶液2ml進(jìn)行處理并回收?；厥盏谋砥ぜ?xì)胞進(jìn)一步用0.25％胰蛋白酶溶液處理使其單細(xì)胞化。在冷凍保存液A(含有10％(v/v)甘油、20％(v/v)FBS的Green氏培養(yǎng)基)懸浮調(diào)制成2.5×106細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸浮液。將其以各0.5ml接種在事先放入12孔板的直徑為22mm的圓形膠原蛋白海綿(3.3×105細(xì)胞/cm2)。其次，按以下方法制作人造皮膚。
①接種后，靜置至細(xì)胞充分浸透海綿后，以-0.2～-5℃/分的速度冷卻至-80℃冷凍(緩冷冷凍法)。
②接種后，靜置至細(xì)胞充分浸透海綿后，放入-80℃超低溫冰箱中冷凍(快速冷凍法)。
③接種后，靜置至細(xì)胞充分浸透海綿后，放入-152℃超低溫冰箱中冷凍(快速冷凍法)。B由現(xiàn)有方法制作的人造皮膚以及對(duì)照用人造皮膚的制作方法使用培養(yǎng)燒瓶(培養(yǎng)面積80cm2)在Green氏培養(yǎng)基+3％FBS上培養(yǎng)人表皮細(xì)胞。人表皮細(xì)胞用調(diào)制成1000單位/ml分散酶(合同酒精(株)制)的PBS(-)(磷酸緩沖液)溶液2ml進(jìn)行處理并回收?；厥盏谋砥ぜ?xì)胞進(jìn)一步用0.25％胰蛋白酶溶液處理使其單細(xì)胞化。調(diào)制Green氏培養(yǎng)基+3％FBS中懸浮的2.5×106細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸浮液。將其以各0.5ml接種在事先放入12孔板的直徑為22mm的圓形膠原蛋白海綿(3.3×105細(xì)胞/cm2)。其次，按以下方法制作人造皮膚。
④接種后用5％二氧化碳、37℃下培養(yǎng)過(guò)夜(15小時(shí)以上)。吸取去除培養(yǎng)基后，用冷凍保存液A洗2次。往各孔中添加冷凍保存液A 1.5ml，以-0.2～-5℃/分的速度冷卻至-80℃冷凍(緩冷冷凍法)。
⑤不經(jīng)冷凍培養(yǎng)2日，用C的方法(后述)測(cè)定細(xì)胞的存活率。C人造皮膚的融解以及存活率測(cè)定上述實(shí)施例2的A、B制作的人造皮膚中細(xì)胞存活率以下述方法進(jìn)行測(cè)定。
在-80℃或-152℃的超低溫冰箱中保存了1～7日的人造皮膚，在37℃水浴中浸泡5-10分鐘使其融解。吸取去除培養(yǎng)基后，用2.0ml Green氏培養(yǎng)基+3％FBS洗人造皮膚2次。再添加上述的培養(yǎng)基1.5ml，在5％二氧化碳、37℃條件下培養(yǎng)過(guò)液(15小時(shí)以上)。其次，將得到的人造皮膚浸泡在0.5％膠原蛋白酶溶液5ml中，在37℃水浴中振蕩5～10分鐘使膠原蛋白海綿溶解。用約100×g、4℃、5分鐘的離心操作回收細(xì)胞。除去上清液后，加0.25％胰蛋白酶溶液3.0ml到細(xì)胞中，在37℃水浴中振蕩5-10分鐘。再一次用約400×g、4℃、5分鐘的離心操作回收細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮在Green氏培養(yǎng)基+3％FBS中，用臺(tái)盼藍(lán)色素排除法測(cè)定細(xì)胞的存活率。
其結(jié)果是在膠原蛋白海綿上接種細(xì)胞后，在細(xì)胞發(fā)生粘附前緩冷冷凍(本發(fā)明，表8中的①)或者快速冷凍(本發(fā)明，表8中的②和③)的人造皮膚，得到了高存活率。與此相對(duì)，細(xì)胞接種并培養(yǎng)15小時(shí)后緩冷冷凍的人造皮膚(現(xiàn)有方法，表8中的④)，其存活率低。表8表示細(xì)胞的存活率。
表8

實(shí)施例3來(lái)自血管內(nèi)皮細(xì)胞的人造血管的冷凍保存A由本發(fā)明方法制作人造血管以及冷凍方法使用培養(yǎng)瓶(培養(yǎng)面積80cm2)在含有10％(v/v)FBS以及10ng/ml人FGF(人成纖維細(xì)胞增殖因子)的Green氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)人血管內(nèi)皮細(xì)胞。人血管內(nèi)皮細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶溶液處理并回收。在冷凍保存液B(含有10％(v/v)甘油、20％(v/v)FBS和10ng/ml人FGF的Green氏培養(yǎng)基)中懸浮，調(diào)制成1.4×106細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸浮液。將其以各0.6ml接種在事先放入12孔板的直徑為22mm的圓形膠原蛋白海綿(2.2×105細(xì)胞/cm2)。
其次，按以下方法制作人造血管。
①接種后，靜置至細(xì)胞充分浸透海綿后，以-0.2～-5℃/分的速度冷卻至-80℃冷凍(緩冷冷凍法)。B由現(xiàn)有方法制作人造血管以及對(duì)照用人造血管的制作方法使用培養(yǎng)瓶(培養(yǎng)面積80cm2)在含有10％(v/v)FBS和10ng/ml人FGF(人成纖維細(xì)胞增殖因子)的Green氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)人血管內(nèi)皮細(xì)胞。人血管內(nèi)皮細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶溶液處理并回收。在含有10％(v/v)FBS和10ng/ml人FGF的Green氏培養(yǎng)基中懸浮，調(diào)制成1.4×106細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸浮液。將其以各0.6ml接種在事先放入12孔板的直徑為22mm的圓形膠原蛋白海綿(2.2×105細(xì)胞/cm2)。
其次，按以下方法制作人造血管。
②接種后培養(yǎng)過(guò)夜，用冷凍保存液B洗2次后，以-0.2～-5℃/分的速度冷卻至-80℃冷凍(緩冷冷凍法)。
③不經(jīng)冷凍培養(yǎng)2日，用C的方法(后述)測(cè)定細(xì)胞的存活率。C人造血管的融解以及存活率測(cè)定上述實(shí)施例3的A、B制作的人造血管中的細(xì)胞存活率以下述方法進(jìn)行測(cè)定。
在-80℃的超低溫冰箱中保存了1～7日的人造血管，在37℃水浴中浸泡5-10分鐘使其融解。吸取去除培養(yǎng)基后，用2.0ml含10％(v/v)FBS和10ng/ml人FGF的Green氏培養(yǎng)基洗人造血管2次。再添加上述的培養(yǎng)基1.5ml，在5％二氧化碳、37℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜(15小時(shí)以上)。其次，將得到的人造血管浸泡在0.5％膠原蛋白酶溶液5ml中，在37℃水浴中振蕩5～10分鐘使膠原蛋白海綿溶解。用約400×g、4℃、5分鐘的離心操作回收細(xì)胞。除去上清液后，加0.25％胰蛋白酶溶液3.0ml到細(xì)胞中，在37℃水浴中振蕩5-10分鐘。再一次用約400×g、4℃、5分鐘的離心操作回收細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮在含有10％(v/v)FBS和10ng/ml人FGF的Green氏培養(yǎng)基中，用臺(tái)盼藍(lán)色素排除法測(cè)定細(xì)胞的存活率。
其結(jié)果是在膠原蛋白海綿接種細(xì)胞后，細(xì)胞發(fā)生粘附前緩冷冷凍(本發(fā)明，表9中的①)的人造血管，得到了高存活率。與此相對(duì)，細(xì)胞接種并培養(yǎng)15小時(shí)后緩冷冷凍的人造血管(現(xiàn)有方法，表9中的②)，其存活率低。表9表示細(xì)胞的存活率。
表9

實(shí)施例4來(lái)自肝細(xì)胞的人造肝臟的冷凍保存A由本發(fā)明方法制作人造肝臟以及冷凍方法使用培養(yǎng)燒瓶(培養(yǎng)面積80cm2)在含有10％(v/v)FBS、10ng/ml人FGF以及13μg/ml肝素鈉的Green氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)人肝細(xì)胞。人肝細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶溶液處理并回收。在冷凍保存液C(含有10％(v/v)甘油、20％(v/v)FBS、10ng/ml人FGF以及13μg/ml肝素鈉的Green氏培養(yǎng)基)中懸浮，調(diào)制成1.5×106細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸浮液。將其以各0.5ml接種在事先放入12孔板的直徑為22mm的圓形膠原蛋白海綿(2.0×105細(xì)胞/cm2)。其次，按以下方法制作人造肝臟。
①接種后，靜置至細(xì)胞充分浸透海綿后，以-0.2～-5℃/分的速度冷卻至-80℃冷凍(緩冷冷凍法)。
②接種后，靜置至細(xì)胞充分浸透海綿后，放入-80℃超低溫冰箱中冷凍(快速冷凍法)。
③接種后，靜置至細(xì)胞充分浸透海綿后，放入-152℃超低溫冰箱中冷凍(快速冷凍法)。B對(duì)照用人造肝臟的制作方法使用培養(yǎng)燒瓶(培養(yǎng)面積80cm2)在含有10％(v/v)FBS、10ng/ml人FGF以及13μg/ml肝素鈉的Green氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)人肝細(xì)胞。人肝細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶溶液處理并回收。在含有10％(v/v)FBS、10ng/ml人FGF以及13μg/ml肝素鈉的Green氏培養(yǎng)基中懸浮，調(diào)制成1.5×106細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸浮液。將其以各0.5ml接種在事先放入12孔板的直徑為22mm的圓形膠原蛋白海綿(2.0×105細(xì)胞/cm2)。其次，按以下方法制作人造肝臟。
④接種后，在5％二氧化碳、37℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜(15小時(shí)以上)。吸取除去培養(yǎng)基后，用冷凍保存液C洗2次。往各孔添加冷凍保存液C1.5ml，以-0.2～-5℃的速度冷卻至-80℃冷凍(緩冷冷凍法)。
⑤接種后，在5％二氧化碳、37℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜(15小時(shí)以上)。吸取除去培養(yǎng)基后，用冷凍保存液C洗2次。往各孔添加冷凍保存液C1.5ml，放入-80℃的超低溫冰箱中冷凍。
⑥不經(jīng)冷凍、培養(yǎng)2日，用C的方法(后述)測(cè)定細(xì)胞的存活率。C人造肝臟的融解以及存活率測(cè)定上述實(shí)施例4的A、B制作的人造肝臟中的細(xì)胞存活率以下述方法進(jìn)行測(cè)定。
在-80℃或-152℃的超低溫冰箱中保存了1～7日的人造肝臟，在37℃水浴中浸泡5-10分鐘使其融解。吸取去除培養(yǎng)基后，用含有10％(v/v)FBS、10ng/ml人FGF以及13μg/ml肝素鈉的2.0ml Green氏培養(yǎng)基洗人造肝臟2次。再添加同上的培養(yǎng)基1.5ml，在5％二氧化碳、37℃條件下培養(yǎng)過(guò)液(15小時(shí)以上)。其次，將得到的人造肝臟浸泡在0.5％膠原蛋白酶溶液5ml中，在37℃水浴中振蕩5～10分鐘使膠原蛋白海綿溶解。用約400×g、4℃、5分鐘的離心操作回收細(xì)胞。除去上清液后，加0.25％胰蛋白酶溶液3.0ml到細(xì)胞中，在37℃水浴中振蕩5-10分鐘。再一次用約400×g、4℃、5分鐘的離心操作回收細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮在含有10％(v/v)FBS、10ng/ml人FGF以及13μg/ml肝素鈉的Green氏培養(yǎng)基中，用臺(tái)盼藍(lán)色素排除法測(cè)定細(xì)胞的存活率。
其結(jié)果是在膠原蛋白海綿接種細(xì)胞后，細(xì)胞發(fā)生粘附前緩冷冷凍(本發(fā)明，表10中的①)或者快速冷凍(本發(fā)明，表10中的②和③)的人造肝臟，得到了高存活率。與此相對(duì)，細(xì)胞接種并培養(yǎng)15小時(shí)后緩冷冷凍的人造肝臟(現(xiàn)有方法，表10中的④和⑤)，其存活率低。表10表示細(xì)胞的存活率。
表10

實(shí)施例5來(lái)自角膜實(shí)質(zhì)細(xì)胞的人造角膜的冷凍保存A由本發(fā)明方法制作人造角膜以及冷凍方法使用培養(yǎng)燒瓶(培養(yǎng)面積80cm2)在DMEM+10％(v/v)FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)兔角膜實(shí)質(zhì)細(xì)胞。兔角膜實(shí)質(zhì)細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶溶液處理并回收。在冷凍保存液FBScryo中懸浮，調(diào)制成1.0×106細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸浮液。將其以各0.5ml接種在事先放入12孔板的直徑為22mm的圓形膠原蛋白海綿(1.3×105細(xì)胞/cm2)。其次，按以下方法制作人造角膜。
①接種后，靜置至細(xì)胞充分浸透海綿后，以-0.2～-5℃/分的速度冷卻至-80℃冷凍(緩冷冷凍法)。
②接種后，靜置至細(xì)胞充分浸透海綿后，放入-152℃超低溫冰箱中冷凍(快速冷凍法)。B對(duì)照用人造角膜的制作方法使用培養(yǎng)燒瓶(培養(yǎng)面積80cm2)在DMEM+10％(v/v)FBS培養(yǎng)基上培養(yǎng)兔角膜實(shí)質(zhì)細(xì)胞。兔角膜實(shí)質(zhì)細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶溶液處理并回收。在冷凍保存液DMEM+10％FBS中懸浮，調(diào)制成1.0×106細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸浮液。將其以各0.5ml接種在事先放入12孔板的直徑為22m的圓形膠原蛋白海綿(1.3×105細(xì)胞/cm2)。其次，按以下方法制作人造角膜。
③接種后，在5％二氧化碳、37℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜(15小時(shí)以上)。吸取除去培養(yǎng)基后，用FBScryo洗2次。往各孔添加FBScryo 1.5ml，以-0.2～-5℃的速度冷卻至-80℃冷凍(緩冷冷凍法)。
④接種后，在5％二氧化碳、37℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜(15小時(shí)以上)。吸取除去培養(yǎng)基后，用FBScryo洗2次。往各孔添加FBScryo 1.5ml，放入-80℃的超低溫冰箱中冷凍。
⑤不經(jīng)冷凍、培養(yǎng)2日，用C的方法(后述)測(cè)定細(xì)胞的存活率。C人造角膜的融解以及存活率測(cè)定上述實(shí)施例5的A、B制作的人造角膜中的細(xì)胞存活率以下述方法進(jìn)行測(cè)定。
在-80℃或-152℃的超低溫冰箱中保存了1～7日的人造角膜，在37℃水浴中浸泡5-10分鐘使其融解。吸取去除培養(yǎng)基后，用2.0ml 10％(v/v)FBS洗人造角膜2次。再添加上述的培養(yǎng)基1.5ml，在5％二氧化碳、37℃條件下培養(yǎng)過(guò)液(15小時(shí)以上)。其次，將得到的人造角膜浸泡在0.5％膠原蛋白酶溶液5ml中，在37℃水浴中振蕩5～10分鐘使膠原蛋白海綿溶解。由約400×g、4℃、5分鐘的離心操作回收細(xì)胞。除去上清液后，加0.25％胰蛋白酶溶液3.0ml到細(xì)胞中，在37℃水浴中振蕩5-10分鐘。再一次由約400×g、4℃、5分鐘的離心操作回收細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮在DMEM+10％FBS中，用臺(tái)盼藍(lán)色素排除法測(cè)定細(xì)胞的存活率。
其結(jié)果是在膠原蛋白海綿接種細(xì)胞后，細(xì)胞發(fā)生粘附前緩冷冷凍(本發(fā)明，表11中的①)或者快速冷凍(本發(fā)明，表11中的②)的人造角膜，得到了高存活率。與此相對(duì)，細(xì)胞接種并培養(yǎng)15小時(shí)后緩冷冷凍的人造角膜(現(xiàn)有方法，表11中的③和④)，其存活率低。表11表示細(xì)胞的存活率。
表11

本發(fā)明的冷凍保存方法由于可以使細(xì)胞的存活率比現(xiàn)有方法高，所以可以長(zhǎng)期地保存對(duì)創(chuàng)傷愈合有效的組織等效物。還有，本方法省去了冷凍前的預(yù)培養(yǎng)以及清洗工序、而且融解后的清洗操作簡(jiǎn)單，所以比現(xiàn)有方法又簡(jiǎn)便，又經(jīng)濟(jì)。進(jìn)一步，本發(fā)明用簡(jiǎn)單的冷凍裝置(-85℃～-20℃)使組織等效物的冷凍保存成為可能，因此可以在更多的醫(yī)療設(shè)施保存。此外，由本方法冷凍保存的組織等效物無(wú)毒、安全性高，所以可以立即應(yīng)用在臨床上。
權(quán)利要求
1.組織等效物的冷凍保存方法，是由在冷凍保存液中懸浮細(xì)胞的工序、在基材上接種細(xì)胞的工序、以及將所得到的組織等效物在細(xì)胞與基材粘附之前使其冷凍的工序構(gòu)成的。
2.權(quán)利要求1記載的方法，其細(xì)胞是選自來(lái)自哺乳動(dòng)物的成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、朗格爾漢斯細(xì)胞、黑素細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、毛母細(xì)胞、毛乳頭細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、角膜實(shí)質(zhì)細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞以及角膜內(nèi)皮細(xì)胞中的一種以上。
3.權(quán)利要求1記載的方法，其冷凍工序是通過(guò)緩冷冷凍法進(jìn)行的。
4.權(quán)利要求1記載的方法，其冷凍工序是通過(guò)快速冷凍法進(jìn)行的。
5.權(quán)利要求1記載的方法，其冷凍工序是通過(guò)玻璃化冷凍法進(jìn)行的。
6.權(quán)利要求1記載的方法，其冷凍后的保存溫度為-196℃以上-20℃以下。
7.權(quán)利要求1記載的方法，其組織等效物是人造皮膚，人造血管、人造肝臟或人造角膜。
8.冷凍保存的組織等效物，是將在冷凍保存液中懸浮的細(xì)胞接種在基材上，在細(xì)胞和基材發(fā)生粘附前進(jìn)行冷凍而得到的。
9.權(quán)利要求8記載的組織等效物，該組織等效物是由人造皮膚、人造血管、人造肝臟或人造角膜組成的。
10.權(quán)利要求8記載的組織等效物，其中基材和細(xì)胞的組合是由不全膠原蛋白構(gòu)成的海綿和來(lái)自人的成纖維細(xì)胞的組合。
11.權(quán)利要求10記載的組織等效物，其中由不全膠原蛋白構(gòu)成的海棉具有縱向空孔。
全文摘要
本發(fā)明提供組織等效物的冷凍保存方法可以提高冷凍細(xì)胞的存活率以及融解細(xì)胞的生物活性。進(jìn)一步提供由本發(fā)明方法而制得的冷凍保存的組織等效物。將在冷凍保存液中懸浮的細(xì)胞接種在基材上，在細(xì)胞和基材發(fā)生粘附之前進(jìn)行冷凍。
文檔編號(hào)A61L27/60GK1419410SQ01807113
公開日2003年5月21日 申請(qǐng)日期2001年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月24日
發(fā)明者山本直香, 野村昌代, 森山剛 申請(qǐng)人:株式會(huì)社美你康