專利名稱：用于修復(fù)和再生軟骨和其它組織的組合物和方法
背景技術(shù)：
(a)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于改善軟骨組織和其它組織的修復(fù)并使它們再生的組合物和方法，所述的其它組織包括但不限于半月板、韌帶、腱、骨、皮膚、角膜、牙周組織、膿腫、切除的腫瘤和潰瘍。
(b)現(xiàn)有技術(shù)的描述1)軟骨的修復(fù)問題軟骨結(jié)構(gòu)、功能、發(fā)育、病理學(xué)關(guān)節(jié)軟骨覆蓋動關(guān)節(jié)內(nèi)的骨端以使運(yùn)動力分布在骨結(jié)構(gòu)下面，同時使關(guān)節(jié)具有幾乎不產(chǎn)生摩擦的接觸面。這些特性是由II型膠原蛋白和其它小膠原蛋白成分和高含量蛋白聚糖的軟骨聚集蛋白聚糖組成的胞外基質(zhì)所提供的。一般來說，纖維膠原蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)耐拉伸和剪切力，而高度帶電荷的軟骨聚集蛋白聚糖耐壓縮和間隙液流。低摩擦特性是關(guān)節(jié)表面和滑液的特定分子組成以及組織液加載在關(guān)節(jié)表面的過程中滲出的結(jié)果(Ateshian，1997；Higaki等，1997；Schwatz和Hills，1998)。
關(guān)節(jié)軟骨是在前軟骨間充質(zhì)細(xì)胞凝聚和主要誘導(dǎo)表型從I型膠原蛋白轉(zhuǎn)換成II型膠原蛋白后的長骨發(fā)育過程中形成的(Hall，1983；Pechak等，1986)。當(dāng)軟骨細(xì)胞肥大并轉(zhuǎn)變成X型膠原蛋白表達(dá)時由軟骨形成骨，同時伴有血管侵害、基質(zhì)鈣化、成骨細(xì)胞出現(xiàn)和骨基質(zhì)形成。在成年人中，薄層關(guān)節(jié)軟骨保留在骨端并由軟骨細(xì)胞通過合成、裝配和更新胞外基質(zhì)來持續(xù)支持(Kuettner，1992)。當(dāng)因物理性創(chuàng)傷而發(fā)生骨折時或當(dāng)更加劇的侵蝕(作為許多類型關(guān)節(jié)炎的特征)與軟骨下的骨接觸而產(chǎn)生關(guān)節(jié)痛癥狀時，發(fā)生關(guān)節(jié)軟骨疾病(McCarty和Koopman，1993)。除關(guān)節(jié)軟骨外，關(guān)節(jié)組織保留在成年人體內(nèi)的幾個身體部位上，諸如耳和鼻，這些區(qū)域通常是實施重建手術(shù)的主體。
2)軟骨的修復(fù)天然反應(yīng)成年人對關(guān)節(jié)軟骨的損傷具有有限的反應(yīng)，這主要因缺乏血管化作用和存在致密的富含蛋白聚糖的胞外基質(zhì)(Newman，1998；Buckwalter和Mankin，1997；Minas和Nehrer，1997)。前者抑制炎癥和發(fā)生多能性修復(fù)細(xì)胞，而后者使非遷移的基質(zhì)內(nèi)居留的軟骨細(xì)胞中毒。然而，透過軟骨下骨的損害產(chǎn)生一個導(dǎo)管與高度血管化的骨連接而形成血纖蛋白凝塊，俘獲產(chǎn)生顆?；M織損害中骨和骨髓源的細(xì)胞。所述顆粒化組織中較深的部分重建軟骨下的骨板，而上部轉(zhuǎn)化成纖維軟骨修復(fù)組織。這種組織可以短暫具有透明軟骨的組織學(xué)外觀，不過沒有其力學(xué)性能(Wei等，1997)且由此不能夠抵御損傷后第一年結(jié)束前產(chǎn)生變性外觀的局部受力。因此，成年人關(guān)節(jié)軟骨中對修復(fù)的自然反應(yīng)在部分厚度的損害不具有修復(fù)反應(yīng)(而不是軟骨流動和本位的軟骨細(xì)胞克隆)，而帶有骨穿孔的全厚度損害顯示出有限的和斷裂的反應(yīng)。然而，年齡是一個重要因素，因為全厚度損害在未成熟關(guān)節(jié)軟骨中愈合得情況好于在成年人關(guān)節(jié)軟骨中的愈合情況(DePalma等，1966；Wei等，1997)且胎兒關(guān)節(jié)軟骨中的淺撕裂傷在1個月內(nèi)完全愈合而不涉及任何維管系統(tǒng)或骨衍生的細(xì)胞(Namba等，1998)。
3)用于輔助軟骨修復(fù)的最新手段用于癥狀性軟骨缺損的最新臨床處理手段包括目的如下的技術(shù)1)通過修整和清創(chuàng)術(shù)除去表面的不規(guī)則損害；2)通過鉆孔、折斷或摩擦而穿透軟骨下骨以便增加上述天然修復(fù)反應(yīng)(屬于骨髓刺激技術(shù))；3)用于保留連接用軟骨的關(guān)節(jié)改造或開放式楔形截骨術(shù)；4)藥理調(diào)節(jié)；5)組織移植；和6)細(xì)胞移植(Newman，1998；BuckWalter和Mankin，1997)。已經(jīng)證實這些方法中的大多數(shù)在減輕癥狀方面具有一定短期的療效(幾個月-幾年)，而沒有人能夠證明可持續(xù)在前幾年后成功地修復(fù)關(guān)節(jié)損害。修整、清創(chuàng)、鉆孔、折斷和摩擦關(guān)節(jié)成形術(shù)的骨髓刺激技術(shù)使得癥狀得到短暫緩解而產(chǎn)生最終降解的次級功能的纖維軟骨組織。對缺損部位提供生長因子的藥理調(diào)節(jié)可以增加天然修復(fù)，但迄今為止仍不足以做到(Hunziker和Rosenberg，1996；Sellers等，1997)。含有存活軟骨細(xì)胞的同種異體移植和自體組織移植骨軟骨組織移植物可以使修復(fù)更為成功，但供體極為有限(Mahomed等，1992；Outerbridge等，1995)。
4)骨髓刺激骨髓刺激技術(shù)的種類包括清創(chuàng)術(shù)、修整、鉆孔、顯微斷裂和摩擦關(guān)節(jié)成形術(shù)。它們目前廣泛用于矯形臨床實踐來治療屬于全厚度的即達(dá)到軟骨下的骨且大小有限、一般為小于3cm2區(qū)域的關(guān)節(jié)軟骨病灶損害。Pridie等人開始應(yīng)用這些方法(Pridie，1959；Install，1967；DePalma等，1966)，他們推斷，因侵害軟骨/骨接觸面而誘發(fā)骨出血進(jìn)入無血管的軟骨缺損處由此可能在關(guān)節(jié)軟骨損害的區(qū)域內(nèi)形成血塊。然后這種血腫可以啟動傳統(tǒng)的傷口愈合情況串聯(lián)發(fā)生，這些情況導(dǎo)致血管化組織的傷口內(nèi)成功愈合或至少形成瘢痕(Clark，1996)。后來提出了對Pridie鉆孔技術(shù)的改進(jìn)技術(shù)，包括摩擦關(guān)節(jié)成形術(shù)(Childers和Ellwood，1979；Johnson，1991)和顯微壓裂(Rodrigo等，1993；Steadman等，1997)。摩擦關(guān)節(jié)成形術(shù)應(yīng)用機(jī)械化設(shè)備以便研磨掉異常的致密軟骨下骨而達(dá)到較軟較深骨內(nèi)的供血處。顯微折斷技術(shù)應(yīng)用尖銳的小工具或錐鉆在軟骨下骨板上鉆足夠深的孔(一般3-4mm)，再次達(dá)到血管處并在軟骨損害的內(nèi)部形成血塊。使用顯微折斷技術(shù)的醫(yī)師要求觀察到高于鉆孔的成功率，這是因缺乏任何加熱誘發(fā)的壞死和軟骨下板生物力學(xué)去穩(wěn)定程度較低所造成的，所述的軟骨下骨板帶有大量較小的骨折孔而不是鉆孔在板內(nèi)產(chǎn)生的大縫隙(Steadman等，1998)。另一種用于治療關(guān)節(jié)軟骨病灶損害的相關(guān)技術(shù)是鑲嵌式成形術(shù)(mosaicplasty)或骨軟骨自體組織移植(OATS)，其中軟骨/骨圓柱體可從外周“未使用的”關(guān)節(jié)區(qū)轉(zhuǎn)至含有軟骨損害的高度負(fù)載的區(qū)域(Hangody等，1997)。
在矯形專家中對于關(guān)節(jié)軟骨各種損害應(yīng)接受的治療類型沒有普遍一致的意見。也缺乏嚴(yán)格科學(xué)研究來證明這些特定適應(yīng)證的治療功效。因此，對軟骨損害治療的選擇主要取決于醫(yī)師的訓(xùn)練、傾向和個人經(jīng)驗。缺乏一致意見的原因是多方面的，但包括所治療損害類型的可變性，且如果“良好質(zhì)量”血塊形成可以成功地控制，所治療的損害也是可變的。與使用這些方法形成良好質(zhì)量血塊相關(guān)的某些問題在于1)不受控制的骨出血性質(zhì)，這種出血始終沒有完全充滿軟骨損害處；2)在血塊形成幾分鐘內(nèi)發(fā)生的血小板介導(dǎo)的血塊收縮減小了血塊大小且可以使其從周圍軟骨中分離(Cohen等，1975)；3)滑液或循環(huán)關(guān)節(jié)液稀釋骨血；和4)滑液纖溶或血塊溶解活性(Mankin，1974)。這些問題中的某些是在體外形成血塊、然后將其切成一定大小并包入半月板缺損(Amoczky等，1988)或骨軟骨缺損(Palette等，1992)的研究后解決的。與傳統(tǒng)傷口愈合級聯(lián)發(fā)生相類似的某些方法隨后確實有助于缺損的愈合。這種方法確實使缺損更多地充滿修復(fù)組織，然而，這種修復(fù)組織的質(zhì)量一般是不可接受的，因它們主要是纖維性的而沒有足夠的力學(xué)性能。使用這種手段修復(fù)組織的安全性能低，其原因可能是1)血小板介導(dǎo)的血塊持續(xù)收縮；2)因廣泛體外操作而導(dǎo)致某些血液成分缺乏活力；和3)體外血塊的固化防止了與軟骨缺損周圍的所有組織表面粘連并限制了缺損的填充。概括地說，目前由矯形專家實施的用于治療關(guān)節(jié)軟骨病灶損害的臨床方法大多數(shù)與損傷內(nèi)部血塊的形成情況有關(guān)。然而，能形成良好質(zhì)量的血塊，充滿損傷處并含有用于存活態(tài)傷口愈合的所有適宜成分(血小板、單核細(xì)胞、血纖蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)等)，因而產(chǎn)生了不持久且通常是不令人滿意的結(jié)果。本發(fā)明的一個實施方案是提供一種組合物和方法用于將全體積的非收縮基質(zhì)中傷口愈合處的這些血液轉(zhuǎn)運(yùn)至關(guān)節(jié)軟骨損傷部位從而改善了上述這種情況。
5)生物材料和生長因子已經(jīng)提出了使用生物材料和生長因子來修復(fù)軟骨損傷的幾種實驗性技術(shù)，有時單獨(dú)使用它們，但通常將它們組合起來使用。與上述這類骨髓刺激技術(shù)類似的技術(shù)是顯而易見的。血纖蛋白支架可以被預(yù)制成的生物材料支架取代且血塊中的天然促分裂因子和趨化因子可以被諸如重組生長因子這樣的受使用者控制質(zhì)量和種類的可溶性成分取代。這種手段的實例包括將血纖蛋白粘性物用于轉(zhuǎn)運(yùn)諸如胰島素樣生長因子(Nixon等，1999)和轉(zhuǎn)化生長因子(Hunziker和Rosenberg，1996)這樣的重組蛋白。已經(jīng)將其它生物制劑與諸如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、膠原蛋白基質(zhì)和血纖蛋白粘性物包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白這樣的遺傳生物材料(Sellers等，1997；Sellers，2000；Zhang等，專利WO00/44413，2000)、血管緊張肽樣肽類(Rodgers和Dizerega，專利WO00/02905，2000)、和含有稱作骨蛋白或BP的多重蛋白質(zhì)的骨提取物(Atkinson，Patent WO00/48550，2000)合并。在后一種方法中，需要使用其它的血纖蛋白/凝血酶粘合劑使BP浸漬的膠原蛋白海綿體保持在軟骨缺損內(nèi)，從而產(chǎn)生相當(dāng)?shù)膹?fù)合物且難以再生傷口愈合環(huán)境。已經(jīng)為輔助細(xì)胞粘連和細(xì)胞遷移而給生物材料包被纖連蛋白或RGD肽類(Breckke和Coutts，專利6,005,161，1999)。某些上述方法已經(jīng)將骨髓刺激與手術(shù)后在滑液空間注入生長激素結(jié)合起來使用并取得了局部的成功(Dunn和Dunn，專利5,368,051，1994)。還提出了特定的生物材料組合物，諸如膠原蛋白、脫乙酰殼多糖和葡糖胺聚糖類的混合物(Collombel等，專利5,166,187，1992；Suh等，專利WO99/47186，1999)、粉碎的軟骨和骨漿膏(Stone，專利6,110,209，2000)、基于多成分膠原蛋白的構(gòu)建體(Pahcence等，專利6,080,194，2000)和可硫化的化學(xué)反應(yīng)性的甲基丙烯酸酯樹脂(Braden等，專利5,468,787，1995)。這些手段中沒有一種已經(jīng)達(dá)到臨床應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)，這是由于它們不能克服下列這些問題1)在軟骨缺損中生物材料不能保留和粘連；2)缺乏活性分子以有效的濃度長期緩釋；3)轉(zhuǎn)運(yùn)分子的多種和未加控制的生物活性；4)PGA和PLA的酸性降解產(chǎn)物的細(xì)胞毒性；5)載體生物材料不適宜的降解動力學(xué)特性或免疫原性；和6)活性生物制劑不需要的全身或異位影響(器官鈣化)。成功實施這些手段需要解決這些問題中的某些或全部。
6)細(xì)胞移植近來對于涉及細(xì)胞移植的技術(shù)已引起了較多的關(guān)注，這是因為它能通過將大量的下列這幾種細(xì)胞在體外傳代和操作后導(dǎo)入關(guān)節(jié)缺損處。這些細(xì)胞是自體軟骨細(xì)胞(Grande等，1989；Brittberg等，1994和1996；Breinan等，1997)、異源軟骨細(xì)胞(Chesterman和Smith，1968；Bently和Greer，1971；Green，1977；Aston和Bently，1986；Itay等，1987；Wakatini等，1989；Robinson等，1990；Freed等，1994；Noguchi等，1994；Hendrickson等，1994；Kandel等，1995；Sams和Nixon，1995；Specchia等，1996；Frankel等，1997；Hyc等，1997；Kawamura等，1998)、異種軟骨細(xì)胞(Homminga等，1991)、軟骨膜細(xì)胞(Chu等，1995；Chu等，1997)或同源和異源骨髓衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞(Wakatini等，1994；Butnariu-Ephrat，1996；Caplan等，1997；Nevo等，1998)。細(xì)胞移植手段具有超過其它軟骨修復(fù)技術(shù)的某些潛在優(yōu)點在于它們1)最大程度地減輕其它軟骨和骨的損傷；2)由于體外細(xì)胞產(chǎn)生而減少了對供體的依賴；3)可以模擬軟骨發(fā)育的天然生物過程；和4)可以提供經(jīng)處理的細(xì)胞以便進(jìn)行更好的修復(fù)。使用自體固有的軟骨細(xì)胞的一種技術(shù)屬于公眾已知領(lǐng)域且是已經(jīng)用于幾千美國和瑞典患者的可得到的技術(shù)(http//www.genzyme.com)。在這項技術(shù)中，從帶有未加載區(qū)域的軟骨活檢組織分離軟骨細(xì)胞，在幾周內(nèi)增殖，且在從患者脛骨收集的縫合和血纖蛋白密封的骨膜膜片下通過注射而重新導(dǎo)入軟骨損害處。對其療效提出了疑問(Messner和Gillquist，1996；Brittberg，1997；Newman，1998)且令人遺憾地不得而知，因缺乏完整的FDA所要求的受控的和隨機(jī)的臨床試驗。近來的動物研究表明，注射了傳代的自體軟骨細(xì)胞幾乎沒有觀察到愈合，其結(jié)果類似于試驗骨髓刺激所觀察到的結(jié)果(Breinan等，1997和Breinan等，2000)。因此，對缺損進(jìn)行手術(shù)可能在該方法中同樣是誘導(dǎo)修復(fù)的主要因素。不過，由于細(xì)胞移植存在許多潛在的效益，所以在過去兩年中已經(jīng)授于了大量專利來保護(hù)自體固有的軟骨細(xì)胞處理的有關(guān)方法(Tubo等，專利5,723,331，1998；Villeneuve，專利5,866,415，1999)以及下列這些細(xì)胞的用途和制備脂肪細(xì)胞(Meuller和Thaler，專利5,837,235，1998；Halvorsen等，專利EP 1077 253，2001)、造血前體(Peterson和Nousek-Goebl，專利6,200,606，2001)、羊膜細(xì)胞(Saciker，1997)、間充質(zhì)干細(xì)胞(Caplan和Hyanesworth，專利5,811,094，1998；Naughton和Naughton，專利5,785,964，1998；Naughton和Willoughby，專利5,842,477，1998；Grande和Lucas，專利5,906,934，1999；Johnstone和Yoo，專利5,908,784，1999)。并保護(hù)那些使用軟骨細(xì)胞/成纖維細(xì)胞及它們的先祖細(xì)胞、上皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、胎盤細(xì)胞和臍帶血細(xì)胞的一般技術(shù)(Purchio等，專利5,902,741，1999)，所有這些均用于軟骨的修復(fù)。
7)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)問題用于輔助軟骨修復(fù)的細(xì)胞移植必不可少地涉及一種技術(shù)使存活的和功能性移植細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至并保留在損傷部位。當(dāng)使用或不用支持物基質(zhì)使細(xì)胞在體外生長時，可以通過制備稍大于傷口的植入物并對其施加壓力固定(Aston和Bentley 1986；Wakatini等，1989；Freed等，1994；Chu等，1997；Frankel等，1997；Kawamura等，1998)。壓力固定要求應(yīng)用的一種組織是在體外形成的，由此對植入部位的幾何、物理和生物因素而言均不能做到最佳。縫合或固定植入物有助于它的保留(Sams和Nixon，1995)，然而已經(jīng)知道，縫合對關(guān)節(jié)表面是又一種損傷，另外還限制了修復(fù)過程(Breinan等，1997)。已經(jīng)嘗試使用生物粘性物，獲得了有限的成功(Kandel等，1995；Jurgenson等，1997)。當(dāng)植入物不適于壓力固定時如膠原蛋白凝膠或血纖蛋白凝塊進(jìn)行收縮，或當(dāng)植入不含支持物基質(zhì)的單獨(dú)細(xì)胞時，常使用骨膜或另一類似組織的縫合膜片來使植入物保留在缺損部位內(nèi)(Grande等，1989；Brittberg等，1994；Grande等，1989；Brittberg等，1996；Breinan等，1997)。這類技術(shù)的療效可能是由于骨膜能刺激軟骨的形成(O’Driscoll等，1988和1994)，但要再次經(jīng)歷縫合和骨膜采集和關(guān)節(jié)切開術(shù)所產(chǎn)生的復(fù)雜性的問題。還使用粘性透明質(zhì)酸溶液轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞深入至全厚度的損傷部位(Robinson等，1990；Butnariu-Ephrat，1996)。作為用于軟骨修復(fù)的細(xì)胞來源，近來公布了軟骨修復(fù)中的轉(zhuǎn)運(yùn)載體的幾項專利，其范圍是從凝膠基質(zhì)(Griffith等，1998；Caplan等，1999)到縫合線與纖維(Vacanti等，1998；Vacanti和Langer，1998a和1998b)，到螺型裝置(Schwartz，1998)和磁系統(tǒng)(Halpem，1997)。綜合上述可表明，目前用于軟骨修復(fù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)技術(shù)顯然還不是最佳的。理想的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)載體將是載有細(xì)胞的聚合物溶液，它在注入缺損部位時固化、粘連并充滿傷口且形成短暫的可生物降解的支架允許適宜的細(xì)胞分化并合成和裝配致密的具有力學(xué)功能的關(guān)節(jié)軟骨胞外基質(zhì)。
8)包括半月板、韌帶、腱、骨、皮膚、角膜、牙周組織、膿腫、切除的腫瘤和潰瘍在內(nèi)的其它組織的修復(fù)肌骨骼和其它組織的天然和輔助修復(fù)是非常寬的技術(shù)領(lǐng)域，具有大量復(fù)雜的生物過程且有多種途徑來促進(jìn)修復(fù)過程(如在骨修復(fù)中)在幾乎沒有內(nèi)在修復(fù)能力(正如在軟骨修復(fù)中)的組織中輔助修復(fù)并減少瘢痕形成(正如在燒傷治療中)(C1ark，1996)。盡管在所涉及的生物元件和過程必然是不同的，但是傷口修復(fù)中(非胎兒)的總體情況是相同的。這些情況包括在組織破損部位處形成血塊、從血小板中釋放趨化因子和促分裂因子、流入炎癥細(xì)胞和多能修復(fù)細(xì)胞、血管生成、和最終通過區(qū)分修復(fù)細(xì)胞和合成胞外基質(zhì)成分來完成修復(fù)過程。在一種成功的修復(fù)結(jié)果中，特定的局部組織環(huán)境和特定的局部多能性修復(fù)細(xì)胞群將會形成準(zhǔn)確形狀的組織、替換的骨、替換的皮膚等。由于得到了組織修復(fù)過程中一般成分的相似性，所以并不令人意外的是在一種組織中幫助修復(fù)的方法也可以在一定程度上成功地幫助其它組織的修復(fù)。這種可能性越來越有希望，只要幫助修復(fù)的方法和組合物是基于增加自然傷口愈合的級聯(lián)過程而不顯著區(qū)別于這種在不同程度上被優(yōu)化的修復(fù)結(jié)果。在本發(fā)明中，提出了特定的組合物和方法來為組織的修復(fù)部位提供更有效的、更具粘連性和非收縮的血塊。本發(fā)明對最難以修復(fù)的組織之一即軟骨的修復(fù)列出了實施例和優(yōu)選實施方案。然而，保持相同基本原理來應(yīng)用該組合物和方法及其改進(jìn)來修復(fù)其它組織包括半月板、韌帶、腱、骨、皮膚、角膜、牙周組織、膿腫、切除的腫瘤和潰瘍，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。
9)脫乙酰殼多糖在制藥、傷口愈合、組織修復(fù)和作為止血劑的應(yīng)用主要由蝦和螃蟹殼的天然成分殼多糖的堿性脫乙?；a(chǎn)生的脫乙酰殼多糖是一族含有1-4個連接的葡糖胺(占主要部分)和N-乙?；?葡糖胺單體的直鏈多糖(Austin等，1981)。脫乙酰殼多糖及其氨基取代的衍生物是pH依賴性的、可生物蝕解的和生物相容性的陽離子型聚合物，已經(jīng)將它們用于傷口愈合和骨感應(yīng)的生物醫(yī)學(xué)工業(yè)(Denuziere等，1998；Muzzarelli等，1993和1994)、藥物和基因轉(zhuǎn)運(yùn)(Garreno-Gomez和Duncan，1997；Schipper等，1997；Lee等，1998；Bemkop-Schnurch和Pasta，1998)細(xì)胞生長和細(xì)胞包囊用的支架(Yagi等，1997，Eser Elcin等，1998；Dillon等，1998；Koyano等，1998；Sechriest等，2000；Lahiji等，2000；Suh等，2000)。脫乙酰殼多糖稱作粘性(mucoadhesive)聚合物(Bemkop-Schnurch和Krajicek，1998)，因為它通過離子和疏水作用與胃腸道上皮的粘液層粘連，由此有利于口服藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)。脫乙酰殼多糖的生物降解作用是通過其對由殼多糖酶(Fukamizo和Brzezinski，1997)、溶菌酶(Sashiwa等，1990)、纖維素酶(Yalpani和Pantaleone，1994)、蛋白酶(Terbojevich等，1996)和脂酶(Muzzarelli等，1995)產(chǎn)生的酶裂解的敏感而發(fā)生的。近來已經(jīng)證實軟骨細(xì)胞能夠表達(dá)人的脫乙酰殼多糖酶類似物chitotriosidase(Vasios等，1999)；其生理作用可能發(fā)生在透明質(zhì)素的降解過程中，這是一種與脫乙酰殼多糖具有一定相似性的直鏈多糖加工過程，因為它由N-乙?；?葡糖胺的二糖和葡糖醛酸組成。
在許多報導(dǎo)(Sall等，1987；Bartone和Adickes，1988；Okamoto等，1995；Inui等，1995；Shigemasa和Minami，1996；Ueno等，1999；Cho等，1999；Stone等，2000；Lee等，2000)和發(fā)明(Sparkes和Murray，專利4,572,906，1986；Mosbey，專利4,956,350，1990；Hansson等，專利5,894,070，1999；Gouda和Larm，專利5,902,798，1999；Drohan等，專利6,124,273，2000；JorgensenWO98/22114，1998)中已經(jīng)提出脫乙酰殼多糖單獨(dú)和含有其它成分的不同制劑可以刺激真皮、角膜和硬組織的修復(fù)。最常引用作為有益于傷口修復(fù)過程的脫乙酰殼多糖的特性是其生物降解性、粘連性、防脫水和作為細(xì)菌侵襲的屏障。已經(jīng)聲稱的其它特性是其細(xì)胞活化和趨化性(Peluso等，1994；Shigemasa和Minami，1996；Inui等，1995)、其止血活性(Malette等，1983；Malette和Quig1ey，專利4,532,134，1985)和明顯能通過增加顆粒組織疏松而限制纖維組織形成和瘢痕形成(Bartone和Adickes，1988；Stone等，2000)。盡管普遍認(rèn)為脫乙酰殼多糖在傷口愈合中的有益作用是很顯然的，但是對其確切的作用機(jī)理尚不了解，也沒有最有效的施用方式，即作為粉末、混懸液、海綿體、膜、固體凝膠等。其作用機(jī)理不明確的部分原因可能是許多預(yù)先的研究使用了化學(xué)上不確定(乙?；亢头植?、分子量)且純度不明的脫乙酰殼多糖。脫乙酰殼多糖有意義的止血能力還導(dǎo)致了將其直接用于減少移植物和傷口部位處的出血(Malette等，1983；Malette和Quig1ey，專利4,532,134，1985)。一些研究指出脫乙酰殼多糖的止血活性僅來源于其粘著紅細(xì)胞的能力(Rao和Sharma，1997)，而其它研究認(rèn)為聚陽離子型胺的性質(zhì)可以激活血小板而釋放凝血酶并啟動傳統(tǒng)的凝固級聯(lián)機(jī)制，由此使其可用作混有血纖蛋白原和純化的自體血小板的止血劑(Cochrum等，專利5,773,033，1998)。在本發(fā)明的上下文中，重要的是注意到在這些報導(dǎo)和發(fā)明中完全沒有任何實施例來說明血液與脫乙酰殼多糖溶液混合并在治療上使修復(fù)部位形成含有血塊的脫乙酰殼多糖從而幫助組織修復(fù)。
脫乙酰殼多糖在生理pH和離子強(qiáng)度下的低溶解性是通常存在的一種技術(shù)上的困難，由此限制了其以溶液態(tài)的應(yīng)用。因此一般說來，脫乙酰殼多糖的溶解是通過在3.0-5.6pH的酸性水溶液中的胺基團(tuán)質(zhì)子化而實現(xiàn)的。這類脫乙酰殼多糖溶液保持可溶性至pH接近6.2，其中對胺基團(tuán)的中和減少了鏈間靜電排斥并使氫鍵、疏水鍵和范德華力的吸引力在pH接近6.3-6.4下能產(chǎn)生聚合物沉淀。在先一項發(fā)明(Chenite專利WO99/07416；Chenite等，2000)已經(jīng)指出了將多元醇-磷酸二鹽(即甘油-磷酸鹽)與脫乙酰殼多糖水溶液混合可以提高溶液的pH，同時避免沉淀。在這些特定鹽存在的情況下，基本濃度(0.5-3％)和高分子量(＞幾百kDa)的脫乙酰殼多糖溶液在pH為6.8-7.2的生理上可接受的中性區(qū)域內(nèi)在室溫下可長時間期限保持液體狀態(tài)。這一方面有利于脫乙酰殼多糖與存活的細(xì)胞進(jìn)行混合。另一種重要特性在于這類脫乙酰殼多糖/多元醇-磷酸鹽(C/PP)水溶液在加熱至適宜溫度下時固化或膠凝，其中所述的適宜溫度可使注入身體各部位(例如其中可以在裸鼠皮下空間內(nèi))的混合脫乙酰殼多糖/細(xì)胞溶液形成軟骨結(jié)節(jié)Chenite等，1999)。重要的是注意到某些其它研究已經(jīng)使脫乙酰殼多糖在生理pH下保持可溶性狀態(tài)，而這些研究必須降低脫乙酰殼多糖的濃度(在Lu等的Biomateials 1999中達(dá)到0.1％)或降低脫乙酰殼多糖分子量和脫乙?；某潭?在Cho等的Biomateials 1999中分別達(dá)到了～350kD和50％)。其它研究也證實脫乙酰殼多糖提供了支持軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞表型的微環(huán)境(Suh等，2000；Lahiji等，2000；Seichrist等，2000)，然而，這些研究并非基于可以與細(xì)胞混合并注射形式的液體脫乙酰殼多糖。最終用BMP7浸漬NN-二羧甲基脫乙酰殼多糖海綿體并將其放入家兔的骨軟骨缺損中(Mattioli-Belmonte，1999)。在此再次觀察到了一些改善的組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)的結(jié)果，然而，修復(fù)組織沒有完全填充缺損且在該缺損內(nèi)顯然難以保留該結(jié)構(gòu)，看起來這是難以克服的難題。本發(fā)明克服了這些問題并為提供了幾種新型溶液用于轉(zhuǎn)運(yùn)修復(fù)軟骨和其它組織用的成分。
10)現(xiàn)有技術(shù)的概述在對輔助軟骨修復(fù)的現(xiàn)有技術(shù)的概述中，已經(jīng)提出了并實驗測試了用于改善極為有限的關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)反應(yīng)的許多技術(shù)。這些技術(shù)中的某些已經(jīng)達(dá)到了臨床實踐可接受的程度，但這主要是由于沒有任何實際和顯著有效的改善修復(fù)反應(yīng)的方法可與應(yīng)用骨髓刺激技術(shù)時發(fā)現(xiàn)的情況相比較。本發(fā)明在應(yīng)用細(xì)胞和血液成分修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨中提出并解決了幾種主要疑難問題。對開發(fā)有效的軟骨修復(fù)方法的一個主要阻礙在于沒有一種組合物和方法可在需要進(jìn)行軟骨生長的空間(需要組織形成整體或重建的軟骨缺損或其它部位)內(nèi)提供一種適宜的大分子環(huán)境。這種大分子環(huán)境或基質(zhì)應(yīng)當(dāng)是1)適宜裝載液態(tài)的活性生物成分(細(xì)胞、蛋白質(zhì)、基因、血液、血液成分)；2)然后可注入缺損部位以便填充需要軟骨生長的整個缺損或區(qū)域；3)有一個主要的非蛋白質(zhì)環(huán)境以便限制細(xì)胞粘連和細(xì)胞介導(dǎo)的基質(zhì)收縮，這兩者均可誘導(dǎo)纖維細(xì)胞表型(纖維組織產(chǎn)生)而不是軟骨細(xì)胞表型(軟骨組織產(chǎn)生)且還可能使基質(zhì)與缺損壁脫離；4)有細(xì)胞相容性，從而具有生理水平的pH和滲透壓且不含任何細(xì)胞毒性成分；5)是可降解的，但有足夠長的時間以便使包括的生物活性成分完全再構(gòu)建一個能夠支持力學(xué)負(fù)載而不會降解的軟骨組織。此外，可以應(yīng)用這些特性的組合以最少的改變?nèi)バ迯?fù)其它組織諸如半月板、韌帶、腱、骨、皮膚、角膜、牙周組織、膿腫、切除的腫瘤和潰瘍，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的。
因此需要有一種新的組合物用于修復(fù)和再生軟骨組織。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供一種用于修復(fù)和再生軟骨組織的新型組合物。
本發(fā)明提供了一種用于軟骨組織或諸如半月板、韌帶、腱、骨、皮膚、角膜、牙周組織、膿腫、切除的腫瘤、和潰瘍這樣的其它組織的修復(fù)、再生、重建或形成整體的組合物。
本發(fā)明還涉及一種可與生物成分混合并置于或注入體內(nèi)部位的聚合物溶液的應(yīng)用，其中所述的混合物幫助組織的修復(fù)、再生、重建或形成整體。修復(fù)的組織例如包括但不限于軟骨、半月板、韌帶、腱、骨、皮膚、角膜、牙周組織、膿腫、切除的腫瘤和潰瘍。
所述的生物成分優(yōu)選是血液、血液成分或分離的細(xì)胞，均來源于自體或非自體。
本發(fā)明還提供了一種修復(fù)患者組織的方法，所述的方法包括將溫度依賴性聚合物凝膠組合物導(dǎo)入所述組織的步驟，使得所述的組合物與該組織粘連并促進(jìn)對修復(fù)該組織的細(xì)胞增殖的支持。
所述的組合物優(yōu)選包括至少一種血液成分。
本發(fā)明還提供了一種修復(fù)患者組織的方法，所述的方法包括將聚合物組合物導(dǎo)入所述組織的步驟，所述的聚合物組合物可與至少一種血液成分混合，所述的聚合物組合物在與所述血液成分混合時產(chǎn)生一種混合物，所述的混合物此時或在加熱時轉(zhuǎn)變成非液態(tài)，所述的混合物保留在導(dǎo)入部位并與其粘連而用于修復(fù)所述組織。
所述的聚合物可以是修飾或天然的多糖，諸如脫乙酰殼多糖、殼多糖、透明質(zhì)素、葡糖胺聚糖、硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素、硫酸皮膚素、肝素和硫酸肝素。
所述的聚合物組合物可以包括諸如可溶性膠原蛋白或可溶性明膠這樣天然的、重組的或合成的蛋白質(zhì)或諸如例如聚賴氨酸這樣的聚氨基酸。
所述的聚合物組合物可以包括聚乳酸、聚乙醇酸、含有羧酸、氨基、磺酸、膦酸、氧次膦酸官能團(tuán)的含或不含其它官能團(tuán)的合成均聚物和嵌段共聚物，所述的其它官能團(tuán)諸如例如但不限于羥基、硫羥基、烷氧基、芳氧基、酰氧基和芳酰氧基。
將所述的聚合物組合物優(yōu)選最初溶于或懸浮于含有無機(jī)鹽的緩沖液中，所述的無機(jī)鹽諸如有氯化鈉、鉀、鈣、鎂的磷酸鹽、硫酸鹽和羧酸鹽。
可以將所述的聚合物組合物溶于或懸浮于含有有機(jī)鹽的緩沖液中，所述的有機(jī)鹽諸如有甘油磷酸鹽、果糖磷酸、葡糖磷酸、L-絲氨酸磷酸、腺苷磷酸、葡糖胺、半乳糖胺、HEPES、PIPES和MES。
所述的聚合物組合物優(yōu)選具有6.5-7.8的pH和調(diào)節(jié)至250mOsm/L-600mOsm/L之間生理值的摩爾滲透壓濃度。
所述的血液成分例如可以是(但不限于)全血、經(jīng)處理的血液、靜脈血、動脈血、來自骨的血液、來自骨髓的血液、骨髓、臍帶血或胎盤血。它還可以包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板、血纖蛋白原、凝血酶或富含血小板的不含紅細(xì)胞的血漿。
所述的血液成分還可以包括諸如檸檬酸鹽、肝素或EDTA這樣的抗凝劑。與此相反的是所述的血液成分可以包括用于導(dǎo)入部位改善凝固/固化的原凝血劑，所述的前凝血劑諸如有凝血酶、鈣、膠原蛋白、鞣花酸、腎上腺素、腺苷二磷酸、組織因子、磷脂和類似于因子VII這樣的凝固因子。
所述的血液成分可以是自體固有的或非自體固有的。
所述的聚合物組合物與所述血液成分的應(yīng)用比例優(yōu)選在1∶100-100∶1之間改變。
優(yōu)選使用聲波、攪拌、渦旋或用注射器多次注射將所述的聚合物組合物與血液成分以機(jī)械方式混合。
可以修復(fù)或再生的組織例如有(但不限于)軟骨、半月板、韌帶、腱、骨、皮膚、角膜、牙周組織、上頜面組織、顳下頜組織、膿腫、切除的腫瘤、或潰瘍。在某些情況中，可以以手術(shù)方式取出異常組織來制備體內(nèi)的導(dǎo)入部位。這類過程可以通過穿刺、摩擦或鉆孔進(jìn)入相鄰組織區(qū)域或血管生成區(qū)域來進(jìn)行使其產(chǎn)生通道用于將所述的組合物聚合物遷移入需要修復(fù)的部位。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種脫乙酰殼多糖溶液，用于細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)以便在體內(nèi)修復(fù)或再生組織，所述的脫乙酰殼多糖溶液包括0.5-3％w/v的脫乙酰殼多糖并將該溶液配制成熱膠凝的溶液，使所述的溶液在注入所修復(fù)或再生組織前與細(xì)胞混合。將溶液形成熱凝膠的方法，僅舉幾個例子，如可以通過添加磷酸鹽、甘油磷酸鹽或葡糖胺。優(yōu)選的是，該脫乙酰殼多糖溶液具有6.5-7.8的pH。
所述的細(xì)胞可以選自例如由初級細(xì)胞、傳代細(xì)胞、選擇的細(xì)胞、血小板、基質(zhì)細(xì)胞、干細(xì)胞和遺傳修飾的細(xì)胞組成的組。優(yōu)選將所述細(xì)胞懸浮于載體溶液中，所述的載體溶液諸如有含有透明質(zhì)酸、羥乙基纖維素、膠原蛋白、藻酸鹽或水溶性聚合物的溶液。
本發(fā)明還提供了一種用于體外培養(yǎng)細(xì)胞的膠凝化脫乙酰殼多糖溶液，所述的脫乙酰殼多糖溶液包括0.5-3％w/v的脫乙酰殼多糖并將該溶液配制成熱膠凝的溶液，使所述的溶液在體外培養(yǎng)前與細(xì)胞混合。
優(yōu)選的是，所述的聚合物組合物含有0.01-10％w/v的平均分子量為1kDa-10Mda的20％-100％的脫乙?；拿撘阴ざ嗵呛鸵环N血液成分。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種用于修復(fù)組織的聚合物組合物及其應(yīng)用。還可以將該組合物用于制備組織修復(fù)用的藥物。
為了本發(fā)明的目的，下面定義了下列術(shù)語。
術(shù)語“聚合物”或“聚合物溶液”兩者在本申請中是可以互換使用的。它們是指(但不限于)聚合物溶液、聚合物混懸液、聚合物顆?；蚍勰┖途酆衔锬z束混懸液。
術(shù)語“修復(fù)”在用于軟骨和其它組織時是指(但不限于)組織的修復(fù)、再生、改造、重建或形成整體。
附圖簡述附

圖1A-1F是聚合物溶液與細(xì)胞混合并在體外固化以及軟骨生長培養(yǎng)的示意圖；附圖2A-2C說明了包囊在脫乙酰殼多糖/甘油-磷酸鹽凝膠中和培養(yǎng)后軟骨細(xì)胞的存活力；附圖3A-3E說明了根據(jù)葡糖胺聚糖(GAG)累積所確定的體外脫乙酰殼多糖凝膠內(nèi)的軟骨形成情況；附圖4解釋了在脫乙酰殼多糖凝膠中培養(yǎng)0、14和20天的初級軟骨細(xì)胞對由其所表達(dá)的軟骨特異性mRNAs進(jìn)行的RNA酶保護(hù)性分析；附圖5解釋了在脫乙酰殼多糖凝膠中培養(yǎng)0、14和20天的初級軟骨細(xì)胞對由其所表達(dá)的軟骨特異性蛋白質(zhì)進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡分析；附圖6說明了與和不與軟骨細(xì)胞一起培養(yǎng)的凝膠圓月的力學(xué)性能；附圖7是聚合物與細(xì)胞混合并注入小鼠皮下的示意圖；附圖8A和8B說明了對在裸鼠皮下生長的軟骨進(jìn)行的甲苯胺藍(lán)組織學(xué)分析；附圖9解釋了對于含有或不含初級軟骨細(xì)胞的脫乙酰殼多糖凝膠的體內(nèi)植入物中表達(dá)的軟骨特異性蛋白質(zhì)進(jìn)行的RNA酶保護(hù)性分析；附圖10解釋了對用含有初級軟骨細(xì)胞的脫乙酰殼多糖凝膠的小鼠植入物在體內(nèi)表達(dá)的軟骨特異性蛋白質(zhì)進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡分析；附圖11說明了在裸鼠皮下生長的軟骨植入物的力學(xué)性能；附圖12A和12B說明了熱膠凝脫乙酰殼多糖溶液與體外豬完整關(guān)節(jié)的股骨髁內(nèi)只有軟骨缺損的粘連。
附圖13A和13B說明了將熱膠凝脫乙酰殼多糖溶液加載在家兔體內(nèi)的軟骨缺損上和24小時的體內(nèi)保留情況；附圖14說明了使熱膠凝脫乙酰殼多糖溶液在注射后24小時在家兔的軟骨缺損中的保留情況；附圖15A是表示血液/聚合物混合物制備、混合和體外固化的示意圖；附圖15B和15C說明了液體血液/聚合物在瓊脂糖孔(附圖15B)或由玻璃或塑料制成的管(附圖15C)中的體外固化情況；附圖16說明了使用來自三個不同種類的血液的血液/脫乙酰殼多糖混合物與單獨(dú)的血液相比的平均固化時間；附圖17A說明了根據(jù)在玻璃小瓶中沉積后血漿隨時間釋放所確定的血液或血液/聚合物混合物的血塊收縮情況；附圖17B和17C說明了固體血液和血液/聚合物混合物收縮后28小時在玻璃管內(nèi)(附圖17B)的或注在瓊脂糖孔內(nèi)且在蒂羅德緩沖液中保溫(附圖17C)的未溶脹圓片的物理外觀；附圖18說明了液體脫乙酰殼多糖混合物而非其它液體多糖溶液使肝素介導(dǎo)的抗凝逆轉(zhuǎn)；附圖19A-19C解釋了血液/聚合物混合物的組織學(xué)情況；
附圖20A和20B說明了與脫乙酰殼多糖溶液混合后白細(xì)胞和血小板的存活力；附圖21解釋了血液蛋白從體外形成的血液/聚合物混合物中和單獨(dú)的血液中的長期釋放情況；附圖22錒2C說明了用于改善軟骨缺損愈合的聚合物/血液混合物的制備、混合和注射；附圖22D和22E是治療人體關(guān)節(jié)軟骨使之愈合的示意圖；附圖23A和23B解釋了血液/聚合物混合物轉(zhuǎn)運(yùn)至帶有穿透骨的孔的軟骨缺損后1周時，來源于骨髓并遷移至該軟骨缺損處的修復(fù)細(xì)胞增強(qiáng)的趨化性；和附圖24A和24B說明了用血液/聚合物混合物處理的缺損內(nèi)透明軟骨的生長情況與未處理的缺損內(nèi)纖維組織的生長情況的比較。
發(fā)明詳述當(dāng)與血液或血液成分合并時，聚合物可以是水溶液形式或含水混懸液形式或顆粒態(tài)，該聚合物制劑的主要特征在于1)它可與血液或血液的選擇成分混合；2)所得混合物是可注射的或可以將其放置在需要進(jìn)行組織修復(fù)、再生、重建或形成整體的身體某一部位上或其內(nèi)；和3)該混合物對放置部位上的組織的修復(fù)、再生、重建或形成整體具有有益作用。
優(yōu)選的實施方案如實施例5中所示，其中使用的天然多糖脫乙酰殼多糖溶液的濃度為1.5％w/v且它溶于pH為6.8的0.135摩爾/升甘油磷酸二鈉緩沖液。按照1份聚合物溶液與3份血液的比例將該溶液與家兔外周血液混合。然后將這種聚合物/血液混合物注入經(jīng)外科手術(shù)制備的家兔關(guān)節(jié)軟骨缺損，其中它在5分鐘內(nèi)固化(附圖22)。對愈合過程的組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，在6-8周后產(chǎn)生透明軟骨即促進(jìn)了修復(fù)(附圖24)。不接受聚合物/血液混合物的對照組缺損不完全愈合或非功能性纖維或纖維軟骨組織愈合(附圖24)。該實施例表明聚合物/血液混合物的應(yīng)用可以使所修復(fù)的組織比單純在傷口部位上誘導(dǎo)放血更有效地愈合且功能性更強(qiáng)。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯然可以對本發(fā)明稍加改變?？梢杂闷渌酆衔锖推渚酆衔锘蚓酆衔锕不煳锏钠渌苿┤〈撘阴ざ嗵侨芤?，條件是它們保持上一段落中所述的三個特征。顯然，這一方法可以平凡地用于修復(fù)軟骨以外的組織，諸如半月板、韌帶、腱、骨、皮膚、角膜、牙周組織、膿腫、切除的腫瘤、和潰瘍。將其用在使組織形成整體和組織重建中也是顯而易見的。
我們提出一些實施例和實驗證據(jù)來說明本發(fā)明可能的作用機(jī)理，它們包括1)使血液在固化前與聚合物混合由此來抑制典型的血小板介導(dǎo)的血凝塊收縮(附圖17)；2)產(chǎn)生維持整體的支架且由此更好地充滿缺損以便于組織修復(fù)(附圖18)；3)固化聚合物/血液混合物與周圍組織粘連(附圖22A)；4)趨化和促分裂蛋白因子從聚合物/血液混合物中釋放比從簡單的血凝塊中釋放較為緩慢(附圖21)；5)白細(xì)胞和血小板在所述的聚合物/血液混合物中維持存活(附圖20)；和6)在修復(fù)部位中提供的多糖環(huán)境比純蛋白基質(zhì)更有助于軟骨形成(附圖2-6、8-10、24)。經(jīng)證實這些現(xiàn)象在我們的實施例中均出現(xiàn)了。然而，這些證明并不排斥其它重要情況發(fā)生的可能性，諸如那些涉及聚合物的細(xì)胞降解動力學(xué)和脫乙酰殼多糖的內(nèi)源性因子結(jié)合/濃度的情況。
本發(fā)明的第二個優(yōu)選的實施方案如實施例1和2中所示，其中將熱膠凝脫乙酰殼多糖溶液用于將初級軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至小鼠皮下區(qū)域或體外轉(zhuǎn)運(yùn)至培養(yǎng)室。在這種情況中，沒有血液成分必須在部分的單獨(dú)脫乙酰殼多糖溶液上具有膠凝能力且這一特性是使用甘油磷酸鹽和其它類似緩沖液的脫乙酰殼多糖溶液的特定制劑所具有的。在我們的實施例中，我們證實可以將所述的聚合物溶液與細(xì)胞混合并將這種聚合物/細(xì)胞溶液在體內(nèi)和體外進(jìn)行注射，此時它會膠凝，從而維持細(xì)胞的功能性和存活力(附圖1-11)。可以在與脫乙酰殼多糖溶液混合前將細(xì)胞重新懸浮于生理緩沖液或諸如纖維素的等滲緩沖液這樣的其它細(xì)胞載體混懸液中。當(dāng)將初級軟骨細(xì)胞與本聚合物溶液一起注射時，我們列出的數(shù)據(jù)表明軟骨組織在體外(附圖2-6)和體內(nèi)(附圖8-11)形成。將本發(fā)明的該實施方案稍加修改和擴(kuò)展，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，例如，其中可以使用其它細(xì)胞類型且可以改變脫乙酰殼多糖和緩沖液的濃度而獲得相同的結(jié)果。
通過參照下面的實施例可以更容易地理解本發(fā)明，給出這些實施例是用于解釋本發(fā)明而不是用來限定本發(fā)明的范圍。
實施例1將熱膠凝脫乙酰殼多糖溶液與初級軟骨細(xì)胞混合以用于軟骨的體外生長將脫乙酰殼多糖(0.22g，85％脫乙?；?的HCl鹽粉末暴露在紫外線照射的生物層流式通風(fēng)櫥內(nèi)滅菌，然后將其溶于7.5ml H2O使pH近似為5.0。將D(+)-葡糖胺(0.215g，MW215.6)溶于10ml的0.1M NaOH并使用22μm孔大小的盤式濾器進(jìn)行過濾滅菌。將甘油磷酸鹽(0.8g，MW 297，包括4.5摩爾水/摩爾甘油磷酸鹽)溶于2.0ml的H2O并使用22μm孔大小的盤式濾器進(jìn)行過濾滅菌。在無菌條件下將2.25ml的葡糖胺溶液逐滴加到脫乙酰殼多糖溶液中，同時在4℃的溫度下攪拌。然后在相同條件下加入1ml的甘油磷酸鹽。這一最終溶液仍然是液體且由此可以長期保存(即數(shù)天)，條件是將溫度保持足夠低、即接近4℃。該溶液的pH在6.8的生理pH下且摩爾滲透壓濃度也是生理條件下的約為376mOsm/kg-H2O。將這兩個參數(shù)保持在需要維持細(xì)胞存活力的限度內(nèi)是很重要的。這些限度隨細(xì)胞類型的不同而改變，不過一般為6.6＜pH＜7.8和250mOsm/kg-H2O＜摩爾滲透壓濃度＜450mOsm/kg-H2O。通過溶解150mg羥乙基纖維素(Fluka)和6ml DMEM(Dulbecco改進(jìn)的Eagles培養(yǎng)基)來制備一種溶液并使用22μm孔大小的盤式濾器進(jìn)行過濾滅菌。使用2ml羥乙基纖維素-DMEM溶液重新懸浮細(xì)胞沉淀物并將其混入脫乙酰殼多糖-甘油磷酸鹽溶液。作為陰性對照，制備混有2ml羥乙基纖維素-DMEM溶液但不含細(xì)胞的脫乙酰殼多糖溶液。當(dāng)將該溶液加熱至37℃下時，它轉(zhuǎn)化成類似于在先發(fā)明(Chenite等專利號WO99/07416)中公開的熱膠凝溶液的固體水凝膠。最重要的是，這一在先發(fā)明沒有證實在整個熱膠凝過程中在這種脫乙酰殼多糖溶液中可以維持細(xì)胞存活力且由此不能為細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、組織修復(fù)和組織再生而應(yīng)用這種脫乙酰殼多糖溶液。
將4℃下呈液態(tài)的上述溶液與以酶促方式分離的初級軟骨細(xì)胞混合(Buschmann等，1992)且然后傾入塑料培養(yǎng)皿(附圖1A-1F)。在附圖1A中，將細(xì)胞沉淀物在4℃下重新懸浮并混(附圖1B)入液體脫乙酰殼多糖凝膠溶液。在附圖1C和1D中，將這種液體溶液傾入組織培養(yǎng)皿并使其在37℃下固化30分鐘，此后用DMEM洗滌含有細(xì)胞的固體凝膠并使用活檢鉆孔器給圓片中心打孔。在附圖1E中，將1000μm網(wǎng)孔的柵板放置在48孔平板上。在附圖1F中，將含有細(xì)胞的脫乙酰殼多糖凝膠圓片置于各孔內(nèi)的培養(yǎng)物中。
隱藏細(xì)胞的凝膠在37℃下的20分鐘保溫后形成。使用活檢鉆孔器在該凝膠中心打成6mm直徑和1mm厚度的圓片并置于培養(yǎng)物中達(dá)3周。將圓片各自在含有1000μM目以下的無菌尼龍的48孔組織培養(yǎng)板上培養(yǎng)以使培養(yǎng)基進(jìn)入所有表面。超過90％的包囊細(xì)胞在包囊后立即存活且在整個培養(yǎng)期限過程中存活(附圖2A-2C)。將樣品在鈣綠黃素AM和乙錠同型二聚體-1中保溫以便顯示存活(綠色)和死亡(紅色)的細(xì)胞。將新近分離的軟骨細(xì)胞(附圖2A)包囊入凝膠、固化并即刻檢測存活力(附圖2B)或在該凝膠中培養(yǎng)20天后檢測存活力(附圖2C)。附圖2C表示典型軟骨細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞來自所述凝膠的中部。
幾種不同的細(xì)胞類型在包囊和包括Rat-1、COS、293T和去分化牛關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)后顯示出相同的高度存活力，從而證實膠凝化過程維持了細(xì)胞存活力且由此可以將其用于通過注射在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞。在培養(yǎng)22天后對含有細(xì)胞的凝膠進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色在包囊的初級軟骨細(xì)胞周圍顯示出染色的異染環(huán)，從而表明累積了蛋白聚糖或GAG，它使接近相鄰的細(xì)胞之間開始融合(附圖3D)。還用對軟骨聚集蛋白聚糖、II型膠原蛋白和連接蛋白增加的抗體對這些區(qū)域進(jìn)行染色。還發(fā)現(xiàn)脫乙酰殼多糖凝膠基質(zhì)與甲苯胺藍(lán)結(jié)合(附圖3C)。這一特性使得能夠在使用醛固定后觀察到該凝膠的點陣結(jié)構(gòu)。令人感興趣的是，在軟骨細(xì)胞周圍觀察到的GAG細(xì)胞周環(huán)幾乎不含脫乙酰殼多糖基質(zhì)，后者看起來已經(jīng)被軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的因子所降解(附圖3D)。以2×107個初級軟骨細(xì)胞/ml將初級牛軟骨細(xì)胞包囊入脫乙酰殼多糖凝膠并作為6mm圓片培養(yǎng)達(dá)20天。將初級牛軟骨細(xì)胞包囊并在2％瓊脂糖中培養(yǎng)且進(jìn)行并聯(lián)分析。通過石蠟切片并對瓊脂糖凝膠培養(yǎng)物(附圖3A和3B)和脫乙酰殼多糖凝膠培養(yǎng)物(附圖3C和3D)進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色來處理第0天和第20天的培養(yǎng)物。在第0天時，核染成深藍(lán)色(附圖3A和3C)，而累積的細(xì)胞周GAG染成異染性藍(lán)紫色(附圖3B和3D，大箭頭)。這些細(xì)胞周區(qū)域?qū)浌蔷奂鞍拙厶?、膠原蛋白(II)和軟骨連接蛋白而言是免疫陽性的。在附圖3E中的40X放大倍數(shù)下，使用DMMB試驗對第0天、第14天和第20天培養(yǎng)物中存在GAG進(jìn)行的定量生化分析顯示與瓊脂糖凝膠相比GAG在脫乙酰殼多糖凝膠中的累積相似。
對由包囊的軟骨細(xì)胞表達(dá)的II型膠原蛋白和軟骨聚集蛋白聚糖mRNA進(jìn)行的RNA分析，在14天和22天培養(yǎng)物顯示的高水平(附圖4的分道4和5)可與那些在軟骨中關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)觀察到的細(xì)胞水平相比(附圖4的分道6)。使與牛II型膠原蛋白、軟骨聚集蛋白聚糖和GAPDH互補(bǔ)的反義32P-標(biāo)記的RNA探針的混合物與tRNA(分道1)雜交，或與來自牛腎(分道2)、來自在脫乙酰殼多糖凝膠中培養(yǎng)0天(分道3)、14天(分道4)或20天(分道5)的初級軟骨細(xì)胞(107/ml)或成年牛關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(分道6)的總RNA雜交。將樣品用RNA酶A和T1處理，然后使其進(jìn)行凝膠電泳和放射自顯影。顯示出了表明存在各轉(zhuǎn)錄物的被保護(hù)帶。通過軟骨聚集蛋白聚糖和II型膠原蛋白的連續(xù)表達(dá)證實了在脫乙酰殼多糖/甘油磷酸鹽凝膠中維持了軟骨細(xì)胞表型。
對由包囊細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡分析證實在培養(yǎng)的2-3周之間累積了軟骨基質(zhì)連接蛋白(圖5)。提取總蛋白、通過SDS-PAGE分離并用識別波形蛋白、PCNA、II型膠原蛋白的C-前肽、或軟骨連接蛋白的抗血清進(jìn)行免疫印跡。所分析的樣品包括不含細(xì)胞的脫乙酰殼多糖凝膠(分道1)、牛腎(分道2)、一式兩份在第0天(分道3和4)、第14天(分道5和6)或第20天(分道7和8)的脫乙酰殼多糖凝膠中培養(yǎng)的初級軟骨細(xì)胞(107/ml)樣品、2周牛關(guān)節(jié)軟骨(分道9)、或成年牛軟骨(分道10)。結(jié)果表明在14天和20天時累積了軟骨特異性蛋白CP2和連接蛋白且PCNA持續(xù)表達(dá)至培養(yǎng)的第20天作為細(xì)胞增殖的標(biāo)記。
使用單軸無限制壓縮應(yīng)力松弛試驗在培養(yǎng)的第4天和第13天從力學(xué)上評價含有初級牛關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的圓片。通過與不含細(xì)胞的對照凝膠比較發(fā)現(xiàn)即使在第4天也觀察到了顯著的細(xì)胞依賴性勁度且在第13天時變得更為顯著(圖6)。通過在10秒過程中給10％圓片厚度(～1.5mm)施用5個斜面(ramp)并在隨后的應(yīng)力松弛過程中保持那個位移(第2個來自10-20％的斜面如圖中所示)而在無限制壓縮中從力學(xué)上測試來自第4天、第13天和第19天培養(yǎng)物的圓片(～5mm直徑)。不含細(xì)胞的凝膠圓片表現(xiàn)的性能較弱，而加載細(xì)胞的凝膠在培養(yǎng)過程中隨時間而變得顯然更有勁度且在特征上更具粘彈性、類似于關(guān)節(jié)軟骨。
通過使用復(fù)合孔彈性模型分析這些數(shù)據(jù)(Soulhat等，1999)發(fā)現(xiàn)非原纖基質(zhì)模數(shù)(2.5？5kPa)加倍，還發(fā)現(xiàn)原纖基質(zhì)模數(shù)(100？500kPa)增加5？且液壓滲透性(5？0.08？10-12N-s/m4)接近降低100？，因僅在體外培養(yǎng)的13天過程中在這些凝膠中存在初級軟骨細(xì)胞。這些結(jié)果合起來表明脫乙酰殼多糖凝膠是細(xì)胞相容的和可細(xì)胞降解的，適于維持軟骨細(xì)胞表型，且這種凝膠可以將新軟骨細(xì)胞基質(zhì)加工成具有顯著提高的體外力學(xué)勁度。
實施例2用于體內(nèi)軟骨生長的熱膠凝脫乙酰殼多糖溶液與初級軟骨細(xì)胞的混合與皮下注射為了證實可以將這種原位膠凝系統(tǒng)用于動物，給無胸腺小鼠(CD1 nu/nu)背側(cè)皮下注射100-300μl實施例1中所述的含有1千萬個牛關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞/ml的脫乙酰殼多糖凝膠(圖7)。在4℃下將初級牛軟骨細(xì)胞的細(xì)胞沉淀與液體脫乙酰殼多糖凝膠混合而得到1-2×107個細(xì)胞/ml的濃度并以液體形式的100μl皮下背側(cè)植入物注入麻醉的裸鼠。通過在注射后叩擊5-10分鐘使原位膠凝化明顯。
給對照組小鼠以類似方式注射單獨(dú)的脫乙酰殼多糖凝膠。在注射的10分鐘內(nèi)有明顯的凝膠形成。在注射后21天、48天和63天時回收植入物。甲苯胺藍(lán)染色顯示由含有細(xì)胞的植入物大量產(chǎn)生富含GAG的胞外基質(zhì)(圖8A)。在單獨(dú)的脫乙酰殼多糖凝膠植入物中沒有觀察到GAG累積(圖8B)。以2×107個細(xì)胞/ml液體凝膠將初級牛軟骨細(xì)胞以液體形式作為100μl皮下背側(cè)植入物注入麻醉的裸鼠。對照組小鼠接受100μl單獨(dú)的液體脫乙酰殼多糖凝膠的皮下背側(cè)植入物。注射后48小時收集植入物并加工用于石蠟組織學(xué)檢查和甲苯胺藍(lán)染色。異染性紫染色顯示在使用軟骨細(xì)胞的植入物中有GAG累積(圖8A)。在僅使用脫乙酰殼多糖凝膠的植入物中沒有檢測到GAG累積。
在注射后第48天時在體內(nèi)使用初級軟骨細(xì)胞的植入物中檢測到了軟骨特異性mRNA表達(dá)、II型膠原蛋白和軟骨聚集蛋白聚糖。
在僅有脫乙酰殼多糖凝膠的植入物中沒有檢測到II型膠原蛋白或軟骨聚集蛋白聚糖表達(dá)(附圖9)。使與牛II型膠原蛋白、軟骨聚集蛋白聚糖和GAPDH互補(bǔ)的反義32P-標(biāo)記的RNA探針的混合物與tRNA(分道1)雜交，或與來自牛腎(分道2)、來自僅有脫乙酰殼多糖凝膠的體內(nèi)裸鼠植入物的第48天(分道3)或2×107個細(xì)胞/ml的使用初級軟骨細(xì)胞的脫乙酰殼多糖凝膠的體內(nèi)植入物的第48天(分道4)、或成年牛關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(分道5)的總RNA雜交。將樣品用RNA酶A和T1處理，然后使其進(jìn)行凝膠電泳和放射自顯影。顯示出了表明存在各轉(zhuǎn)錄物的被保護(hù)帶。通過軟骨聚集蛋白聚糖和II型膠原蛋白的表達(dá)證實了在脫乙酰殼多糖/甘油磷酸鹽凝膠中體內(nèi)維持了軟骨細(xì)胞表型。
在使用來自注射后48天和63天的初級軟骨細(xì)胞的體內(nèi)植入物中檢測到了軟骨特異性蛋白(圖10)。在僅使用脫乙酰殼多糖凝膠的植入物中沒有檢測到軟骨特異性蛋白(圖10)。提取總蛋白質(zhì)、通過SDS-PAGE分離并使用識別波形蛋白、PCNA、II型膠原蛋白C-前肽、或軟骨連接蛋白的抗血清進(jìn)行免疫印跡。所分析的樣品包括不含細(xì)胞的脫乙酰殼多糖凝膠(分道1)、牛腎(分道2)、兩種不同的第63天的僅有脫乙酰殼多糖凝膠的裸鼠體內(nèi)植入物(分道3和4)、48天(分道5)或63天(分道6)的2×107個牛軟骨細(xì)胞/ml凝膠的脫乙酰殼多糖凝膠體內(nèi)植入物、2周牛軟骨(分道7)、或成年牛軟骨(分道8)。結(jié)果表明僅在那些攜帶軟骨細(xì)胞的脫乙酰殼多糖凝膠植入物中累積了軟骨特異性胞外基質(zhì)蛋白CP2和連接蛋白。首字母縮寫PCNA指的是“增殖的細(xì)胞核抗原”。CP指的是2型膠原蛋白C前肽且連接蛋白指的是軟骨連接蛋白。
不含細(xì)胞的體內(nèi)植入物具有糊狀稠度，而可以在含有細(xì)胞的植入物中心打成3-5mm的圓片并進(jìn)行力學(xué)測試以便顯示出在不含細(xì)胞的體外圓片上沒有發(fā)現(xiàn)高的力學(xué)勁度(圖11)。這些數(shù)據(jù)表明可以通過注射在原位轉(zhuǎn)運(yùn)軟骨細(xì)胞，其中使用脫乙酰殼多糖熱凝膠溶液作為載體。經(jīng)注射的軟骨細(xì)胞保持存活且合成并裝配了顯著水平的富含蛋白聚糖的胞外基質(zhì)，它在一定時間內(nèi)固化形成功能性軟骨組織。在圖11中，將初級牛軟骨細(xì)胞的細(xì)胞以2×107個細(xì)胞/ml的液體形式作為100μl背側(cè)皮下植入物注入麻醉的裸鼠。對照組小鼠接受100μl單獨(dú)的液體脫乙酰殼多糖凝膠的背側(cè)皮下植入物。注射后48天收集植入物。脫乙酰殼多糖凝膠植入物僅具有糊樣稠度且可以進(jìn)行力學(xué)測試。含有初級軟骨細(xì)胞的植入物具有軟骨外觀且在距植入物的中心打上3mm活檢組織的孔并使用2.5％厚度壓縮與0.05g/分鐘的松弛標(biāo)準(zhǔn)的無限制壓縮進(jìn)行測試。就與42天期限過程中體外遺留的對照圓片相比較的含有細(xì)胞的48天植入物而言，顯示了在20-50％壓縮偏置下的平衡模數(shù)。在48天過程中加載體內(nèi)生長的軟骨細(xì)胞的凝膠因合成并裝配了功能性軟骨基質(zhì)而已經(jīng)顯示出了主要力學(xué)勁度(附圖8A)。
實施例3
熱膠凝脫乙酰殼多糖溶液與軟骨和骨表面的粘連用于軟骨修復(fù)的這種脫乙酰殼多糖熱膠凝制劑的最顯著優(yōu)點之一在于其適應(yīng)并粘連不規(guī)則軟骨缺損和體內(nèi)需要組織修復(fù)、再生、重建或形成整體的其它不規(guī)則形狀腔的能力。許多目前的組織修復(fù)過程在這方面作得并不徹底。將不含細(xì)胞的脫乙酰殼多糖-甘油磷酸鹽液體凝膠經(jīng)體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至豬股骨髁軟骨內(nèi)(不包括骨)缺損。使用活檢鉆孔器在關(guān)節(jié)軟骨中生成圓片形缺損(圖12A)并將實施例1中所述的脫乙酰殼多糖溶液注入這些缺損并使之在37℃下的培養(yǎng)箱中固化。與關(guān)節(jié)連接的軟骨表面相對并進(jìn)行經(jīng)刺激的關(guān)節(jié)運(yùn)動，此后觀察到該凝膠在軟骨缺損中保留(圖12B)。該凝膠不僅保留在缺損內(nèi)，而且與周圍的骨和軟骨表面粘連且不會收縮。在圖12A和12B中，使液體脫乙酰殼多糖凝膠沉積在6mm直徑的完整厚度的軟骨缺損中(圖12A)并使之在37℃下在加濕培養(yǎng)箱中固化30分鐘。然后使關(guān)節(jié)閉合并將關(guān)節(jié)運(yùn)動刺激幾分鐘。脫乙酰殼多糖凝膠與刺激的關(guān)節(jié)運(yùn)動后的全部缺損粘連并保留在其中(圖12B)。
另外在家兔髕骨溝上軟骨內(nèi)缺損處進(jìn)行體內(nèi)填充。通過用微型手術(shù)刀從較硬的鈣化軟骨層上刮下軟骨來形成矩形(4mm×5mm)缺損。使用16號計量針導(dǎo)入幾個微型骨折孔。將實施例1中所述的熱膠凝脫乙酰殼多糖溶液注入該缺損并使之固化5分鐘(圖13A)且將家兔的膝關(guān)節(jié)縫合上。使家兔自由行走并在第2天實施安樂死且制備經(jīng)處理的膝關(guān)節(jié)用于組織學(xué)分析(圖13B)。將活的新西蘭白色家兔麻醉并在股骨髕骨溝的滑車內(nèi)形成3×4mm的只有軟骨缺損。使用16號計量針導(dǎo)入微型骨折孔。使液體熱膠凝脫乙酰殼多糖加載在缺損上并使之在原位膠凝5分鐘(圖13A)。使關(guān)節(jié)閉合并恢復(fù)使家兔恢復(fù)不受限制地運(yùn)動24小時，此后處死并進(jìn)行關(guān)節(jié)解剖(圖13B)。
組織學(xué)分析(圖14)顯示這種熱膠凝脫乙酰殼多糖凝膠保留在家兔的極薄的軟骨層內(nèi)(僅約0.8mm薄)。該凝膠與周圍的骨和軟骨組織堅固地粘連，從而證明了良好的保留特性，由此能夠?qū)⑵渥鳛橛糜谛迯?fù)軟骨和其它組織的可注射的熱膠凝聚合物轉(zhuǎn)運(yùn)載體。將圖13B中所示的關(guān)節(jié)和缺損(填充了熱膠凝脫乙酰殼多糖并在體內(nèi)保留24小時)固定、包埋在IR白色塑料樹脂內(nèi)、切片并用甲苯胺藍(lán)染色。缺損的橫截面顯示在原位保留了所述的脫乙酰殼多糖凝膠且與缺損內(nèi)的軟骨和骨表面粘連。
實施例4血液/聚合物混合物的制備、混合和體外固化將幾種不同的混合方法用于使血液與聚合物水溶液混合(圖15A)。將血液和聚合物在接受器中混合，從而產(chǎn)生血液與聚合物的均勻液體混合物。
一般來說，將3個體積的血液與1個體積的1.5％的多糖等滲和摩爾滲透壓濃度溶液混合。就脫乙酰殼多糖凝膠而言，將1.5％的脫乙酰殼多糖溶于70mM HCl和135mMβ-甘油磷酸鹽。在第一種血液/聚合物混合方法中，給一支1cc注射器加入750μl外周全血并給第二支1cc注射器加入250μl液體聚合物溶液。使注射器相互連接并通過將兩相來回抽吸40次進(jìn)行混合，直到明顯均勻為止。在第二種混合方法中，使625μl液體聚合物溶液沉積在2.0ml帶有幾個3mm-6mm鋼珠的冷凍管(Coming)中。給該冷凍管充入1.875ml全血、旋上螺帽并將小瓶劇烈振搖10秒。在第三種混合方法中，使2ml液體聚合物溶液沉積在無菌的12ml硼硅酸鹽玻璃小瓶(InterGlass 5cc血清小瓶)中。用橡膠塞和金屬卷邊器將小瓶密封并用10ml注射器和20號針頭，將小瓶抽25ml空氣真空。使用適當(dāng)?shù)撵o脈切開放血技術(shù)將來自家兔動脈或人或馬的靜脈中的外周血液抽入無菌的10ml注射器。使20號針頭與該注射器連接并通過橡膠塞插入小瓶。將6ml外周血液抽入小瓶。以全速率將小瓶內(nèi)含物渦旋混合10秒。在實施這些混合技術(shù)中的任意一種后，在室溫下使所得混合物沉積入4ml硼硅酸鹽玻璃小瓶(37℃下的塑料小瓶)或瓊脂糖孔(圖15B和15C)或體內(nèi)的關(guān)節(jié)軟骨缺損。作為對照組，僅用外周全血進(jìn)行相同的處理。作為另一個對照組，將經(jīng)EDTA處理的血液抽入采血管小瓶以便測定CBC和血小板數(shù)量。經(jīng)測試的所有血樣品對相應(yīng)的種類顯示了正常的CBC和血小板計數(shù)。不管是什么種類，所制備的血液/聚合物在混合后2.5-18分鐘內(nèi)在玻璃小瓶壁上固化并強(qiáng)力粘連(圖16)。混合的外周全血比血液/脫乙酰殼多糖凝膠固化得更為緩慢(圖16)。將各血液樣品與或不與液體脫乙酰殼多糖凝膠混合并根據(jù)混合與獲得原始混合小瓶或第二個接受器內(nèi)的固體粘連團(tuán)之間所經(jīng)過的分鐘數(shù)來確定固化時間。
對包括血液/透明質(zhì)酸、血液/羥乙基纖維素和血液/藻酸鹽在內(nèi)的其它血液/聚合物溶液的測試顯示這些混合物也在與單獨(dú)的血液相差無幾的時間期限內(nèi)固化(圖17A)。由此得出結(jié)論是，將脫乙酰殼多糖凝膠混入外周全血加速了血塊形成且血液/脫乙酰殼多糖凝膠固化時間在臨床應(yīng)用上是可接受的。對混合的新鮮外周家兔血液或混合了PBS或包括脫乙酰殼多糖的甘油磷酸鹽緩沖液在內(nèi)的各種1.5％多糖溶液上測試了收縮情況。還分析了不進(jìn)行混合的新鮮血液。也分析了肝素血/脫乙酰殼多糖的甘油磷酸鹽緩沖液混合物。在37℃下使500μl各樣品沉積在4ml玻璃管中。在不同時間點時從各管中取出不包括血漿的所有樣品并稱重以便測定血塊收縮的量。除血液/脫乙酰殼多糖甘油磷酸鹽混合物外的所有樣品均收縮至其原始體積的30-50％。血液/脫乙酰殼多糖混合物最低可收縮至維持其原始體積的約90％。
為了測試固化血液/聚合物混合物相對于凝固全血的收縮程度，使用幾個對照物對一系列血液/聚合物樣品進(jìn)行血塊收縮試驗(附圖17A、17B和17C)。一組對照物由未攪拌的外周全血或攪拌的外周全血或與磷酸鹽緩沖鹽水按3∶1(體積∶體積)攪拌的外周全血組成。將這些樣品與含有3個體積的拌有1個體積的溶于PBS的不同1.5％多糖溶液的幾個實驗樣品(藻酸鹽、羥乙纖維素或透明質(zhì)酸)進(jìn)行比較。另一個樣品由3個體積的混有1個體積的脫乙酰殼多糖-甘油磷酸鹽溶液的外周全血組成。固化后間隔達(dá)18小時時，一式三份測定每種條件下排除的血清作為收縮程度的指示。含有外周血液、+PBS的樣品收縮至原始團(tuán)塊的30％(圖17A)?；煊卸嗵恰⒃逅猁}、羥乙基纖維素或透明質(zhì)酸的外周血液收縮至原始團(tuán)塊的40％-50％(圖17A)。血液/脫乙酰殼多糖凝膠樣品表現(xiàn)出的收縮可忽略不計，其中收縮至原始團(tuán)塊的90％(圖17A)。肝素化血液/脫乙酰殼多糖凝膠樣品也耐收縮，達(dá)到原始團(tuán)塊的85％(圖17A)。從這些數(shù)據(jù)中可以推斷出血液/脫乙酰殼多糖凝膠耐收縮并在軟骨缺損內(nèi)部形成了支撐的空間充滿更多的血纖蛋白。在圖17B和17C中，所示的樣品包括血液(1)或混合的血液(2)、血液/PBS(3)、血液/脫乙酰殼多糖的甘油-磷酸鹽溶液(4)、肝素血/脫乙酰殼多糖(5)、血液/藻酸鹽(6)、血液/羥乙基纖維素(7)和血液/透明質(zhì)酸(8)。
為了測試是否可以將抗凝血液用于生產(chǎn)血液/多糖原位固化植入物，將用1.5mM EDTA、0.38％檸檬酸鹽、酸-0.38％葡糖檸檬酸或肝素鈉(BectonDickinson)處理的3個體積的血液與1個體積的脫乙酰殼多糖-甘油磷酸鹽溶液混合。脫乙酰殼多糖-甘油-磷酸鹽溶液能夠使肝素-介導(dǎo)的(附圖18)、EDTA-介導(dǎo)的和檸檬酸鹽-介導(dǎo)的抗凝逆轉(zhuǎn)。以1個體積的多糖溶液與3份的外周全血的比例混合1.5％脫乙酰殼多糖的甘油-磷酸鹽溶液或三種不同的1.5％多糖溶液。使500μl的各樣品沉積入硼硅酸鹽玻璃管并使之在37℃下固化60分鐘。不同的多糖包括透明質(zhì)酸-PBS(1)、羥乙基纖維素-PBS(2)、藻酸鹽-PBS(3)和脫乙酰殼多糖-甘油磷酸鹽(4)。作為對照，僅分析肝素血(5)。60分鐘后，將各管水平放置并拍照記錄。僅脫乙酰殼多糖-甘油磷酸鹽和肝素化血的混合物變成固體。
使用羥乙基纖維素、藻酸鹽或透明質(zhì)酸的肝素血/多糖難以固化(圖18)。從這些數(shù)據(jù)中推斷出可以使用抗凝血生產(chǎn)血液/脫乙酰殼多糖的原位固化植入物。
對固體血液/聚合物樣品的組織切片顯示混合物是均勻的、紅細(xì)胞在混合或固化后不會溶血，且血小板是活化的并且是功能性的(正如因生成致密血纖蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)所證實的)(圖19A-19C)。將固化的血液/脫乙酰殼多糖混合物固定、包埋入LR白色塑料、切片并用甲苯胺藍(lán)染色。(在圖19A中，以20x放大倍數(shù)觀察到混合顯然總體上均勻。在圖19B中，以100x放大倍數(shù)觀察到明顯存在紅細(xì)胞與脫乙酰殼多糖的相互混合體)。以2000x放大倍數(shù)觀察(通過環(huán)境掃描電子顯微鏡)在血液/脫乙酰殼多糖復(fù)合物中顯然存在血纖蛋白纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
在混合和固化后一定的白細(xì)胞可以保持存活數(shù)小時(圖20)。將外周全血與脫乙酰殼多糖凝膠混合并使之固化。在圖20A中，固化后60分鐘放置填料用于使用鈣綠黃素AM/乙錠-1同型二聚體進(jìn)行的存活力染色以便顯示活的白細(xì)胞(綠色細(xì)胞，大箭頭)、活的血小板(綠色細(xì)胞，小箭頭)和死亡的白細(xì)胞(紅色核)。在圖20B中，將不同的樣品在固化后180分鐘時固定、包埋入LR-White并使其經(jīng)過透射式電子顯微鏡。反映出細(xì)胞存活力的外周單核細(xì)胞(箭頭)的活性吞噬在混合后3小時且固化時的TEM顯微照片上是明顯的。
在固化后對從血液或血液/脫乙酰殼多糖中失去的總血清蛋白進(jìn)行分析。使等體積的血液或血液/脫乙酰殼多糖凝膠在瓊脂糖孔中固化。將圓片轉(zhuǎn)入含有1ml PBS的48孔平板中的各孔并在37℃下保溫3小時。在37℃下和4、5、7和19小時時將圓片依次改變成新制的PBS溶液。在分析前將PBS洗滌液輕度離心以便除去任何細(xì)胞。在PBS中3小時或19小時后對幾個圓片提取總蛋白。通過SDS-PAGE和使用Sypro Orange進(jìn)行總蛋白染色來分析存在于圓片或PBS洗滌物中的總蛋白。使血清蛋白從血液/脫乙酰殼多糖樣品中比從血液樣品更為緩慢地釋放出來(圖21)。這些數(shù)據(jù)提示與填充血塊的缺損相比，涉及傷口愈合的血液和血小板衍生蛋白以更為緩慢和延長釋放的方式從血液/脫乙酰殼多糖填充的缺損中釋放出來。由150μl起始液體體積生產(chǎn)血液/脫乙酰殼多糖凝膠的固體圓片或僅有血液的圓片。將所得的圓片用1ml PBS洗滌3小時，然后在4、5、7和19小時時依次轉(zhuǎn)移總計另外4個1ml PBS洗滌物。在3或19小時洗滌后，用GuCl提取有代表性的圓片以便保留的全部蛋白質(zhì)溶解。可溶性蛋白質(zhì)從等體積的GuCl提取物或PBS洗滌物中沉淀、將其在SDS-PAGE凝膠上分離并使用SyproOrange對全部蛋白質(zhì)進(jìn)行染色。在整個19小時洗滌期限過程中，更多的蛋白質(zhì)以相差無幾的方式保留在血液/聚合物圓片中而非血液圓片中。從血液/脫乙酰殼多糖而非血液觀察到在19小時洗滌期限過程中，血清蛋白較緩慢和長時間釋放入PBS洗滌物。
實施例5用于改善關(guān)節(jié)軟骨缺損愈合的血液/聚合物混合物的制備、混合和注射用作為液體轉(zhuǎn)運(yùn)的外周血液/脫乙酰殼多糖-甘油磷酸鹽混合物處理帶有軟骨下的骨穿破的軟骨缺損并使之在原位固化(圖22A-22C)。在圖22A中，在成年(大于7個月)的新西蘭白色家兔的股骨髕骨溝內(nèi)形成完整厚度的軟骨缺損(3×4mm方形)。在骨上鉆4個1mm直徑的微孔，直到觀察到出血為止。在圖22B中，以3個體積血液與1個體積脫乙酰殼多糖的甘油磷酸鹽溶液的比例混合液體全血并使之沉積以充滿缺損。在圖22C中，看起來5分鐘后血液/脫乙酰殼多糖植入物在原位固化?？p合囊與皮膚并恢復(fù)使動物可不受限制的運(yùn)動。
將在人體患者中的進(jìn)行的類似處理繪制在圖22D中，其中制備的軟骨缺損接受原位固化的液體血液/聚合物的關(guān)節(jié)鏡注射。另一方面，使關(guān)節(jié)鏡注射的液體聚合物與骨衍生的血液在缺損部位混合(圖22E)。在圖22D中，使患者血液與聚合物在體外混合并通過關(guān)節(jié)鏡注射轉(zhuǎn)運(yùn)至制備的缺損或(附圖22E)使用從缺損中流出的患者血液將該聚合物經(jīng)關(guān)節(jié)鏡或在開放性膝手術(shù)過程中轉(zhuǎn)運(yùn)至缺損部位。
作為概念驗證研究，在家兔體內(nèi)測試血液/脫乙酰殼多糖處理的作用。用噻拉嗪-氯胺酮麻醉成年骨骼成熟的新西蘭白色家兔(7個月和7個月以上)，隨后用異氟醚(isofluorene)/氧氣麻醉。對股骨髕骨溝的滑車實施副髕骨切開和髕骨移位。使用微型手術(shù)刀在股骨髕骨溝滑車內(nèi)切成達(dá)4×5mm的完整厚度的軟骨缺損。通過在4℃下用PBS恒定灌洗微型鉆孔或通過用定制的鉆子和錘穿刺而形成4個4mm深的1mm直徑的穿透骨的孔。用PBS沖洗缺損且隨著出血程度的不同，將達(dá)200μl的無菌腎上腺素(2μg/ml)的磷酸緩沖鹽水溶液注入出血的孔。給軟骨缺損覆蓋浸有PBS的無菌紗布。用來自Becton Dickison的vacutainerTM針頭和未處理的硅化玻璃4cc vacutainerTM小瓶從耳部中樞動脈中取家兔的外周血液。
在一種處理中，將750μl血液抽入無菌的1cc注射器。使裝有250μl脫乙酰殼多糖-甘油磷酸鹽溶液(1.5％脫乙酰殼多糖/70mM HCl/135mM？-甘油磷酸鹽)的第二支注射器與帶有無菌塑料連接器的含有血液的注射器相互連接。將注射器反復(fù)抽拉40次。將混合物抽入一支連接有20號針頭的注射器。在排空半數(shù)混合物后使1滴(約25μl)沉積入缺損。在一種單獨(dú)的處理中，將2ml血液加入的含有667μl 1.5％脫乙酰殼多糖/70mM HCl/135mM ？-甘油磷酸鹽和6個無菌的3.2mm直徑的不銹鋼珠的聚丙烯冷凍管中。給該管加帽并劇烈振搖10秒(約40-50次)。通過用1cc無菌注射器從小瓶中抽出所得的液體血液/脫乙酰殼多糖混合物并使20g針頭與該注射器連接。在從該注射器中排空200μl后使1滴(約25μl)沉積以便填充軟骨缺損。使血液/脫乙酰殼多糖混合物固化5分鐘，此后縫合囊與皮膚并給傷口消毒。在1周時(n＝1，雄性)或在51天或56天時(n＝2，1只雄性，1只雌性)處死家兔。將關(guān)節(jié)固定、脫鈣化、包埋入LR/White塑料、切片并用甲苯胺藍(lán)染色。在愈合1周時血液/脫乙酰殼多糖處理的缺損顯示有大量趨化細(xì)胞遷移至血液/脫乙酰殼多糖填充的區(qū)域(圖23A)。未處理的缺損對位于缺損上部的血凝塊具有相對弱的趨化反應(yīng)(圖23B)。在成年新西蘭白色家兔的股骨髕骨溝中形成帶有微型鉆孔的軟骨缺損，所述家兔中的1只填充有血液/脫乙酰殼多糖凝膠，而對另一只保持不做處理。愈合后1周將關(guān)節(jié)固定、用LR-White處理并進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色。在軟骨表面下2-3mm處有大量細(xì)胞明顯遷移至充滿血液/脫乙酰殼多糖的缺損的細(xì)胞(圖23A)，而在未處理的缺損中的相同區(qū)域上觀察到較少的遷移細(xì)胞(圖23B)。
在愈合5-8周后，給血液/脫乙酰殼多糖處理的缺損填充2只家兔體內(nèi)的透明修復(fù)組織(1只雄性，1只雌性)(圖24A)。這種基于血液/脫乙酰殼多糖的修復(fù)組織具有透明的富含GAG的軟骨修復(fù)組織的外觀。來自來處理的或僅血液處理的微型骨折缺損的修復(fù)組織具有纖維軟骨外觀(圖24B)。在轉(zhuǎn)運(yùn)后3周或3周以上在缺損部位內(nèi)沒有持續(xù)存在血液/脫乙酰殼多糖或血凝塊的組織學(xué)證據(jù)。在成年新西蘭白色家兔的股骨髕骨溝中形成帶有微型鉆孔的軟骨缺損，所述家兔中的1只填充有血液/脫乙酰殼多糖凝膠，而對另一只保持不做處理。愈合后51天或56天時將關(guān)節(jié)固定、用LR-White處理并進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色。在附圖24A中，來自血液/脫乙酰殼多糖處理的缺損的修復(fù)組織具有粘連缺損表面并填充該缺損的異染性染色的透明軟骨的外觀。在附圖24B中，來自未處理的缺損的修復(fù)組織具有纖維軟骨外觀，其中實際上沒有對GAG的異染性染色且僅填充了部分缺損。
盡管已經(jīng)具體參照解釋性實施方案描述了本發(fā)明，但是可以理解的是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然可以對其進(jìn)行許多改變。因此，應(yīng)將上述描述和附圖看作是對本發(fā)明的解釋而不是限制。例如，我們已經(jīng)證實將脫乙酰殼多糖溶液與血液混合可以形成不會顯著收縮的聚合物/血凝塊、表明了趨化和促分裂血液蛋白的緩慢釋放、維持了血細(xì)胞存活力并顯著改善了關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯然可以以不同方式制備脫乙酰殼多糖溶液而獲得相同的結(jié)果。實例包括1)改變的脫乙酰殼多糖濃度和與血液的混合比例；2)通過改變緩沖液類型和種類的濃度而改變對水溶液的選擇；3)脫乙酰殼多糖的含水混懸液聚集；4)使用適當(dāng)?shù)幕旌霞夹g(shù)合并顆粒狀脫乙酰殼多糖粉末以便使這些顆粒充分分布入血液并使它們部分溶解?？梢允褂闷渌酆衔?，諸如1)另一種類似于透明質(zhì)素的多糖，條件是通過將其配制成前凝固態(tài)來克服它的抗凝作用(諸如通過使用低濃度或?qū)⑵渑c凝血酶合并)；和2)可以將諸如聚賴氨酸或膠原蛋白這樣的蛋白質(zhì)聚合物用于獲得類似的結(jié)果。盡管因免疫原性、毒性和細(xì)胞粘附/收縮作用的原因而并不認(rèn)為后面這些手段與我們優(yōu)選的實施方案可以同樣成功，但是可以將這些和其它制劑看作本發(fā)明的部分，這是因為它們具有本發(fā)明的聚合物制劑的特征，即1)它可與血液或選擇的血液成分混合；2)所得混合物是可注射的或可以將其置于需要組織修復(fù)、再生、重建或形成整體的身體部位上或其內(nèi)；和3)該混合物對所放置的部位上的組織修復(fù)、再生、重建或形成整體具有有益作用。
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權(quán)利要求
1.修復(fù)患者組織的方法，所述的方法包括將溫度依賴性聚合物凝膠組合物導(dǎo)入所述組織的步驟，使所述的組合物與該組織粘連并促進(jìn)對修復(fù)該組織的細(xì)胞增殖的支持。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的組合物包括至少一種血液成分。
3.修復(fù)患者組織的方法，所述的方法包括將聚合物組合物導(dǎo)入所述組織的步驟，所述的聚合物組合物可與至少一種血液成分混合，所述的聚合物組合物在與所述血液成分混合時產(chǎn)生一種混合物，所述的混合物此時或在加熱時轉(zhuǎn)變成非液態(tài)，所述的混合物保留在導(dǎo)入部位并與其粘連而用于修復(fù)該組織。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的聚合物是修飾的或天然的多糖。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的多糖選自由脫乙酰殼多糖、殼多糖、透明質(zhì)素、葡糖胺聚糖、硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素、硫酸皮質(zhì)素、肝素和硫酸肝素組成的組。
6.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的聚合物組合物包括一種天然的、重組的或合成的蛋白質(zhì)或一種聚氨基酸。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的聚氨基酸是聚賴氨酸。
8.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的天然蛋白質(zhì)是可溶性膠原蛋白或明膠。
9.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的聚合物組合物包括聚乳酸、聚乙醇酸、含有羧酸、氨基、磺酸、膦酸、氧次膦酸官能團(tuán)的含或不含其它官能團(tuán)的合成均聚物和嵌段共聚物。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的其它官能團(tuán)選自羥基、硫羥基、烷氧基、芳氧基、酰氧基和芳酰氧基組成的組。
11.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的聚合物組合物起初溶于或懸浮于含有無機(jī)鹽的緩沖液中。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的無機(jī)鹽選自包括氯化鈉、鉀、鈣、鎂的磷酸鹽、硫酸鹽和羧酸鹽組成的組。
13.權(quán)利要求3所述的方法，其中將所述的聚合物組合物溶于或懸浮于含有有機(jī)鹽的緩沖液中，所述的有機(jī)鹽選自由甘油磷酸、果糖磷酸、葡糖磷酸、L-絲氨酸磷酸、腺苷磷酸、葡糖胺、半乳糖胺、HEPES、PIPES和MES組成的組。
14.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的聚合物組合物具有6.5-7.8的pH。
15.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的聚合物溶液具有調(diào)節(jié)至250mOsm/L-600mOsm/L之間生理值的摩爾滲透壓濃度。
16.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的血液成分選自由全血、經(jīng)處理的血液、靜脈血、動脈血、來自骨的血液、來自骨髓的血液、骨髓、臍帶血和胎盤血組成的組。
17.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的血液成分選自由紅細(xì)胞、白細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板、血纖蛋白原和凝血酶組成的組。
18.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的血液成分包括富含血小板的不含紅細(xì)胞的血漿。
19.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的血液成分是抗凝的。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的血液成分含有選自檸檬酸鹽、肝素或EDTA的抗凝劑。
21.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的血液成分包括用于改善導(dǎo)入部位上的凝固/固化的原凝血劑。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的原凝血劑選自由凝血酶、鈣、膠原蛋白、鞣花酸、腎上腺素、腺苷二磷酸、組織因子、磷脂和凝固因子組成的組。
23.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的凝固因子是因子VII。
24.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的血液成分是自體固有的或非自體固有的。
25.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的聚合物組合物相對于所述血液成分的使用比例在1∶100-100∶1之間改變。
26.權(quán)利要求3所述的方法，其中使用聲波、攪拌、渦旋或用注射器多次抽吸將所述的聚合物組合物與血液成分以機(jī)械方式混合。
27.權(quán)利要求3-26中任意一項所述的方法，其中所述的組織選自由軟骨、半月板、韌帶、腱、骨、皮膚、角膜、牙周組織、上頜面組織、顳下頜組織、膿腫、切除的腫瘤和潰瘍組成的組。
28.用于修復(fù)組織的聚合物組合物，所述的聚合物組合物包括聚合物和血液成分。
29.用于修復(fù)患者組織的聚合物組合物，所述的聚合物組合物可與至少一種血液成分混合，所述的聚合物組合物在與所述血液成分混合時產(chǎn)生一種混合物，所述的混合物此時或在加熱時轉(zhuǎn)變成非液態(tài)，所述的混合物保留在導(dǎo)入部位并與其粘連而用于修復(fù)該組織。
30.權(quán)利要求29所述的聚合物組合物，其中所述的聚合物是改性的或天然的多糖。
31.權(quán)利要求29所述的聚合物組合物，其中所述的多糖選自由脫乙酰殼多糖、殼多糖、透明質(zhì)素、葡糖胺聚糖、硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素、硫酸皮質(zhì)素、肝素和硫酸肝素組成的組。
32.權(quán)利要求29所述的聚合物組合物，其中所述的聚合物組合物包括一種天然的、重組的或合成的蛋白質(zhì)或一種聚氨基酸。
33.權(quán)利要求32所述的聚合物組合物，其中所述的聚氨基酸是聚賴氨酸。
34.權(quán)利要求32所述的聚合物組合物，其中所述的天然蛋白質(zhì)是可溶性膠原蛋白或明膠。
35.權(quán)利要求29所述的聚合物組合物，其中所述的聚合物組合物包括聚乳酸、聚乙醇酸、含有羧酸、氨基、磺酸、膦酸、氧次膦酸官能團(tuán)的含或不含其它官能團(tuán)的合成的均聚物和嵌段共聚物。
36.權(quán)利要求35所述的聚合物組合物，其中所述的其它官能團(tuán)選自由羥基、硫羥基、烷氧基、芳氧基、酰氧基和芳酰氧基組成的組。
37.權(quán)利要求29所述的聚合物組合物，其中所述的聚合物組合物起初溶于或懸浮于含有無機(jī)鹽的緩沖液中。
38.權(quán)利要求37所述的聚合物組合物，其中所述的無機(jī)鹽選自由包括氯化鈉、鉀、鈣、鎂的磷酸鹽、硫酸鹽和羧酸鹽在內(nèi)的鹽組成的組。
39.權(quán)利要求29所述的聚合物組合物，其中將所述的聚合物組合物溶于或懸浮于含有有機(jī)鹽的緩沖液中，所述的有機(jī)鹽選自由甘油磷酸、果糖磷酸、葡糖磷酸、L-絲氨酸磷酸、腺苷磷酸、葡糖胺、半乳糖胺、HEPES、PIPES和MES組成的組。
40.權(quán)利要求29所述的聚合物組合物，其中所述的聚合物組合物具有6.5-7.8的pH。
41.權(quán)利要求29所述的聚合物組合物，其中所述的聚合物溶液具有調(diào)節(jié)至250mOsm/L-600mOsm/L之間生理值的摩爾滲透壓濃度。
42.權(quán)利要求29所述的聚合物組合物，其中所述的血液成分選自由全血、經(jīng)處理的血液、靜脈血、動脈血、來自骨的血液、來自骨髓的血液、骨髓、臍帶血和胎盤血組成的組。
43.權(quán)利要求29所述的聚合物組合物，其中所述的血液成分選自由紅細(xì)胞、白細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板、血纖蛋白原和凝血酶組成的組。
44.權(quán)利要求29所述的聚合物組合物，其中所述的血液成分包括富含血小板的不含紅細(xì)胞的血漿。
45.權(quán)利要求29所述的聚合物組合物，其中所述的血液成分是抗凝的。
46.權(quán)利要求45所述的聚合物組合物，其中所述的血液成分含有選自檸檬酸鹽、肝素或EDTA的抗凝劑。
47.權(quán)利要求29所述的聚合物組合物，其中所述的血液成分包括用于改善導(dǎo)入部位上的凝固/固化的原凝血劑。
48.權(quán)利要求47所述的聚合物組合物，其中所述的原凝血劑選自由凝血酶、鈣、膠原蛋白、鞣花酸、腎上腺素、腺苷二磷酸、組織因子、磷脂和凝固因子組成的組。
49.權(quán)利要求48所述的聚合物組合物，其中所述的凝固因子是因子VII。
50.權(quán)利要求29所述的聚合物組合物，其中所述的血液成分是自體固有的或非自體固有的。
51.權(quán)利要求29所述的聚合物組合物，其中所述的聚合物組合物相對于所述血液成分的使用比例在1∶100-100∶1之間改變。
52.權(quán)利要求29所述的聚合物組合物，其中使用聲波、攪拌、渦旋或用注射器多次抽吸將所述的聚合物組合物與血液成分以機(jī)械方式混合。
53.權(quán)利要求29-52中任意一項所述的聚合物組合物，其中所述的組織選自由軟骨、半月板、韌帶、腱、骨、皮膚、角膜、牙周組織、膿腫、切除的腫瘤和潰瘍組成的組。
54.溫度依賴性聚合物凝膠組合物在組織修復(fù)中的應(yīng)用。
55.權(quán)利要求54所述的應(yīng)用，其中所述的組合物包括至少一種血液成分。
56.聚合物組合物在修復(fù)組織中的應(yīng)用，所述的聚合物組合物可與至少一種血液成分混合，所述的聚合物組合物在與所述血液成分混合時產(chǎn)生一種混合物，所述的混合物此時或在加熱時轉(zhuǎn)變成非液態(tài)，所述的混合物保留在導(dǎo)入部位并與其粘連而用于修復(fù)該組織。
57.權(quán)利要求56所述的應(yīng)用，其中所述的聚合物是改性的或天然的多糖。
58.權(quán)利要求57所述的應(yīng)用，其中所述的多糖選自由脫乙酰殼多糖、殼多糖、透明質(zhì)素、葡糖胺聚糖、硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素、硫酸皮質(zhì)素、肝素和硫酸肝素組成的組。
59.權(quán)利要求56所述的應(yīng)用，其中所述的聚合物組合物包括一種天然的、重組的或合成的蛋白質(zhì)或一種聚氨基酸。
60.權(quán)利要求59所述的應(yīng)用，其中所述的聚氨基酸是聚賴氨酸。
61.權(quán)利要求59所述的應(yīng)用，其中所述的天然蛋白質(zhì)是可溶性膠原蛋白或明膠。
62.權(quán)利要求56所述的應(yīng)用，其中所述的聚合物組合物包括聚乳酸、聚乙醇酸、含有羧酸、氨基、磺酸、膦酸、氧次膦酸官能團(tuán)的含或不含其它官能團(tuán)的合成的均聚物和嵌段共聚物。
63.權(quán)利要求62所述的應(yīng)用，其中所述的其它官能團(tuán)選自由羥基、硫羥基、烷氧基、芳氧基、酰氧基和芳酰氧基組成的組。
64.權(quán)利要求56所述的應(yīng)用，其中將所述的聚合物組合物起初溶于或懸浮于含有無機(jī)鹽的緩沖液中。
65.權(quán)利要求64所述的應(yīng)用，其中所述的無機(jī)鹽選自由包括氯化鈉、鉀、鈣、鎂的磷酸鹽、硫酸鹽和羧酸鹽在內(nèi)的鹽組成的組。
66.權(quán)利要求56所述的應(yīng)用，其中將所述的聚合物組合物溶于或懸浮于含有有機(jī)鹽的緩沖液中，所述的有機(jī)鹽選自由甘油磷酸、果糖磷酸、葡糖磷酸、L-絲氨酸磷酸、腺苷磷酸、葡糖胺、半乳糖胺、HEPES、PIPES和MES組成的組。
67.權(quán)利要求56所述的應(yīng)用，其中所述的聚合物組合物具有6.5-7.8的pH。
68.權(quán)利要求56所述的聚合物組合物，其中所述的聚合物溶液具有調(diào)節(jié)至250mOsm/L-600mOsm/L之間生理值的摩爾滲透壓濃度。
69.權(quán)利要求56所述的應(yīng)用，其中所述的血液成分選自全血、經(jīng)處理的血液、靜脈血、動脈血、來自骨的血液、來自骨髓的血液、骨髓、臍帶血和胎盤血組成的組。
70.權(quán)利要求56所述的應(yīng)用，其中所述的血液成分選自由紅細(xì)胞、白細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板、血纖蛋白原和凝血酶組成的組。
71.權(quán)利要求56所述的應(yīng)用，其中所述的血液成分包括富含血小板的不含紅細(xì)胞的血漿。
72.權(quán)利要求54所述的應(yīng)用，其中所述的血液成分是抗凝的。
73.權(quán)利要求72所述的應(yīng)用，其中所述的相應(yīng)成分含有選自檸檬酸鹽、肝素或EDTA的抗凝劑。
74.權(quán)利要求56所述的應(yīng)用，其中所述的血液成分包括用于改善導(dǎo)入部位上的凝固/固化的原凝血劑。
75.權(quán)利要求74所述的應(yīng)用，其中所述的原凝血劑選自由凝血酶、鈣、膠原蛋白、鞣花酸、腎上腺素、腺苷二磷酸、組織因子、磷脂和凝固因子組成的組。
76.權(quán)利要求75所述的應(yīng)用，其中所述的凝固因子是因子VII。
77.權(quán)利要求56所述的應(yīng)用，其中所述的血液成分是自體固有的或非自體固有的。
78.權(quán)利要求56所述的應(yīng)用，其中所述的聚合物組合物相對于所述血液成分的使用比例在1∶100-100∶1之間改變。
79.權(quán)利要求56所述的應(yīng)用，其中使用聲波、攪拌、渦旋或用注射器多次抽吸將所述的聚合物組合物與血液成分以機(jī)械方式混合。
80.權(quán)利要求56-79中任意一項所述的應(yīng)用，其中所述的組織選自由軟骨、半月板、韌帶、腱、骨、皮膚、角膜、牙周組織、膿腫、切除的腫瘤和潰瘍組成的組。
81.脫乙酰殼多糖溶液在細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)以修復(fù)或再生體內(nèi)組織中的應(yīng)用，所述的脫乙酰殼多糖溶液包括0.5-3％w/v的脫乙酰殼多糖并將該溶液配制成熱膠凝的溶液，使所述的溶液在注入被修復(fù)或再生的組織之前與細(xì)胞混合。
82.權(quán)利要求81所述的應(yīng)用，其中通過添加磷酸鹽、甘油磷酸或葡糖胺誘導(dǎo)所述的脫乙酰殼多糖組合物成為熱凝膠。
83.權(quán)利要求81所述的應(yīng)用，其中所述的脫乙酰殼多糖溶液具有6.5-7.8的pH。
84.權(quán)利要求81所述的應(yīng)用，其中所述的細(xì)胞是自體固有的或非自體固有的。
85.權(quán)利要求81所述的應(yīng)用，其中所述的細(xì)胞選自初級細(xì)胞、傳代細(xì)胞、選擇的細(xì)胞、血小板、基質(zhì)細(xì)胞、干細(xì)胞和遺傳修飾的細(xì)胞。
86.權(quán)利要求81所述的應(yīng)用，其中將所述的細(xì)胞懸浮于載體溶液中。
87.權(quán)利要求86所述的應(yīng)用，其中所述的載體溶液包括透明質(zhì)酸、羥乙基纖維素、膠原蛋白、藻酸鹽或水溶性聚合物。
88.膠凝脫乙酰殼多糖溶液在體外培養(yǎng)細(xì)胞中的應(yīng)用，所述的脫乙酰殼多糖溶液包括0.5-3％w/v的脫乙酰殼多糖并將該溶液配制成熱膠凝的溶液，使所述的溶液在體外培養(yǎng)前與細(xì)胞混合。
89.權(quán)利要求88所述的應(yīng)用，其中通過添加磷酸鹽、甘油磷酸或葡糖胺誘導(dǎo)所述的脫乙酰殼多糖組合物成為熱凝膠。
90.權(quán)利要求89所述的應(yīng)用，其中所述的脫乙酰殼多糖溶液具有6.5-7.8的pH。
91.權(quán)利要求89所述的應(yīng)用，其中所述的細(xì)胞選自初級細(xì)胞、傳代細(xì)胞、選擇的細(xì)胞、血小板、基質(zhì)細(xì)胞、干細(xì)胞和遺傳修飾的細(xì)胞。
92.權(quán)利要求89所述的應(yīng)用，其中將所述的細(xì)胞懸浮于載體溶液中。
93.權(quán)利要求91所述的應(yīng)用，其中所述的載體溶液包括透明質(zhì)酸、羥乙基纖維素、膠原蛋白、藻酸鹽或水溶性聚合物。
94.聚合物組合物，它含有0.01-10％w/v的20％-100％的脫乙?；拿撘阴ざ嗵瞧淦骄肿恿吭?kDa-10MDa范圍和一種血液成分。
95.權(quán)利要求94所述的聚合物組合物，其中將所述的脫乙酰殼多糖溶于有機(jī)或無機(jī)磷酸鹽緩沖液。
96.權(quán)利要求95所述的聚合物組合物，其中所述的有機(jī)或無機(jī)磷酸鹽緩沖液是含有磷酸鹽或甘油磷酸鹽的緩沖液。
97.權(quán)利要求95所述的聚合物組合物，其中所述的脫乙酰殼多糖在所述組合物中是可溶態(tài)，所述的組合物具有6.5-7.4的pH。
98.權(quán)利要求3所述的方法，其中體內(nèi)導(dǎo)入的部位是已經(jīng)手術(shù)方法除去異常組織而制備的。
99.權(quán)利要求98所述的方法，其中需要修復(fù)的組織經(jīng)手術(shù)方法通過穿刺、摩蝕或打孔使相鄰組織區(qū)或血管化區(qū)形成通道用于該聚合物組合物遷移入需要修復(fù)的部位。
全文摘要
本發(fā)明涉及修復(fù)人或動物的組織諸如軟骨、半月板、韌帶、腱、骨、皮膚、角膜、牙周組織、膿腫、切除的腫瘤和潰瘍等的新方法。該方法包括將溫度依賴性聚合物凝膠組合物導(dǎo)入所述組織的步驟，使得所述組合物與該組織粘連并促進(jìn)對修復(fù)該組織的細(xì)胞增殖的支持。所述的組合物除聚合物外優(yōu)選包括血液成分，諸如全血、經(jīng)處理的血液、靜脈血、動脈血、來自骨的血液、來自骨髓的血液、骨髓、臍帶血、胎盤血、紅細(xì)胞、白細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板、血纖蛋白原、凝血酶和富含血小板的血漿。本發(fā)明還涉及用于本發(fā)明方法的新組合物。
文檔編號A61L27/50GK1471412SQ01814068
公開日2004年1月28日 申請日期2001年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月29日
發(fā)明者卡羅琳·D·霍曼, 卡羅琳 D 霍曼, D 布希曼, 邁克爾·D·布希曼, D 麥基, 馬克·D·麥基 申請人:生物合成技術(shù)加拿大公司