專利名稱：神經(jīng)性和神經(jīng)心理性疾病的治療方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及通過施用二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidaseIV，DPIV)以及類DP IV酶的抑制劑來維持或增強腦內(nèi)神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)的內(nèi)源性神經(jīng)學(xué)和神經(jīng)心理學(xué)效應(yīng)。本發(fā)明還涉及在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)內(nèi)通過增強NPY Y1受體介導(dǎo)的效應(yīng)來治療高血壓病、發(fā)熱、睡眠障礙、厭食癥、包括抑郁癥在內(nèi)的焦慮相關(guān)性疾病、癲癇、藥物戒斷(drug withdrawal)和酗酒、包括認(rèn)知障礙和癡呆癥在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病、以及包括精神分裂癥在內(nèi)的神經(jīng)精神性疾病。
背景技術(shù)：
DP IV和NPYDP IV(CD26；EC 3.4.14.5)是一種具有三重功能的外肽酶(exopeptidase)。DP IV參與了在T細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答(Kahne等，1999；Korom等，1997)和腫瘤轉(zhuǎn)移(Cheng等，1998；2000)過程中Xaa-Pro二肽自多肽、循環(huán)中的激素和趨化因子的N端的釋放(Mentlein等，1999；Pauly等，1999)。DP IV選擇性地在N端倒數(shù)第二個的脯氨酸和丙氨酸殘基之后裂解肽。其內(nèi)源性底物包括腸降血糖素，例如葡萄糖依賴性促胰島素多肽，如GIP和GLP-1。在DP IV存在的情況下，這些激素被酶性降解為無活性的形式。NPY的發(fā)現(xiàn)過程神經(jīng)肽Y(NPY)是一種36個氨基酸的肽，屬于胰多肽家族(pancreatic polypeptide family)，最初于1982年在豬腦中被分離出來(Tatemoto和Mutt，1982)。NPY存在于所有支配心血管系統(tǒng)的交感神經(jīng)中，并且是腦和心臟中含量最豐富的肽。此外，在大鼠而非人類，NPY也存在于神經(jīng)系統(tǒng)以外的血小板和內(nèi)皮中(Zukovska-Grojec等，1993)。最初認(rèn)為NPY是有效的血管收縮劑和神經(jīng)調(diào)節(jié)劑。由于NPY在應(yīng)激、運動、以及心肌缺血時釋放，因此其被認(rèn)為參與了冠心病、充血性心力衰竭、以及高血壓的發(fā)病(Zukovska-Grojec等，1998)。由于近期發(fā)現(xiàn)NPY對食物攝取具有很強的刺激能力，因而猜測其在肥胖和糖尿病的發(fā)病中起了一定的作用(Kalra等，1999)。最近的研究提示NPY還是大鼠主動脈血管平滑肌細(xì)胞的一種有絲分裂原(Zukovska-Grojec等，1999)。
NPY相關(guān)性研究至少集中在三個主要方向(1)共傳遞(co-transmission)和交感縮血管作用，這是由于其與去甲腎上腺素共表達(dá)；(2)CNS內(nèi)的神經(jīng)傳遞和功能，這是由于其強效的consummatory作用；以及(3)NPY的演化，這是由于NPY是已知的最為保守的生物活性肽之一(Colmers和Wahlestedt，1993；Lundberg，1996；Wahlestedt和Reis，1993；Wettstein等，1996)。NPY作用于至少6種受體(Y1-Y6)，具有不同的肽藥理學(xué)并在CNS中具有截然不同的分布(Gehlert，1998)(表1)。NPY、NPY受體的亞型和mRNA的分布NPY、NPY受體蛋白及其mRNA在人的CNS和大鼠腦內(nèi)的分布最近已得到綜述(Dumont Y，Jacques D，St-Pierre，J.-A，Tong，Y，Parker，R，Herzog H.和Qurion，R，2000；化學(xué)神經(jīng)解剖學(xué)手冊，16卷肽受體，部分I；Quirion，R，Bjorklund，A和Hkfeld，T，編者)。簡要概括于表1。
含有NPY的神經(jīng)元在包括人在內(nèi)的多種動物的鼻粘膜有明顯的分布，并通常與腺泡和血管相關(guān)聯(lián)(Baraniuk等，1990；Grunditz等，1994)。對支配狗的鼻粘膜的副交感神經(jīng)(翼管神經(jīng)，vidian nerve)進(jìn)行刺激可增加該區(qū)域的血流量，并主要引起阿托品抗性。靜脈施用NPY可減少由于副交感神經(jīng)刺激所引起的血管擴(kuò)張，該作用不能被NPY Y1選擇性激動劑[Leu31，Pro34]NPY所模擬，但可通過施用NPYY2受體激動劑N-乙酰[Leu28，Leu31]NPY(24-36)而模擬(Lacroix等，1994)。這與一種結(jié)合點前型(prejunctional)NPY Y2樣受體所介導(dǎo)的對遞質(zhì)自副交感神經(jīng)末端的釋放的抑制作用相一致。NPY受體功能NPY無疑是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的最為豐富的神經(jīng)肽，其在CNS和外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)具有廣泛的分布。NPY與肽YY(PYY)(兩者大約具有70％的同源性)和胰多肽(pancreatic polypeptide，PP)(兩者大約具有50％的同源性)一同形成一種肽家族；NPY和PYY的生物活性尤其顯著，而PP的活性通常弱的多(Gehlert，1998；Wahlestedt和Reis，1993)(表2)。
根據(jù)在體外分析系統(tǒng)中(Wahlestedt等，1986)與神經(jīng)肽Y相比對一種截短的相關(guān)的肽YY-(13-36)的類似物的不同的反應(yīng)性，將NPY的兩種受體亞型稱為神經(jīng)肽Y Y1(結(jié)合點后型，postjunctional)和神經(jīng)肽Y Y2(結(jié)合點前型，prejunctional)。神經(jīng)元的結(jié)合點前型NPY受體的激活通常抑制神經(jīng)活性，降低作為對神經(jīng)沖動的應(yīng)答和作為對促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的局部因子的應(yīng)答的神經(jīng)遞質(zhì)的釋放(Wahlestedt等，1986)。所述結(jié)合點前型或神經(jīng)肽Y Y2受體的分類是基于肽YY(13-36)的作用，但在多種系統(tǒng)中，該分子以及神經(jīng)肽Y-(13-36)確實具有血管收縮活性(Rioux等，1986；Lundberg等，1988；Potter等，1989)。一些觀點認(rèn)為這代表一些血管床的結(jié)合點后膜具有兩種類型的神經(jīng)肽Y受體(神經(jīng)肽Y yj和神經(jīng)肽Y2)(Schwartz等，1989)。而這些分子之所以缺乏選擇性可能是因為其在Yj受體上保持了部分的激動劑活性，這使得它們引起了一種減弱了的功能性應(yīng)答。以往曾描述了一種神經(jīng)肽Y的13-36類似物(Leu 17，Glu″，Ala21，Ala 22，Glu 23，LeU28，LeU31)，即神經(jīng)肽Y-(13-36)(ANA神經(jīng)肽Y-(13-36))，其在體內(nèi)研究中具有相當(dāng)于完整神經(jīng)肽Y分子的結(jié)合點前活性(Potter等，1989)。
除卻這些過去已經(jīng)被詳細(xì)說明的神經(jīng)肽Y受體，藥理學(xué)依據(jù)提示存在一些其他的亞型(Y3、Y4、Y5以及Y6)(Michel等，1998)，并且已經(jīng)分別發(fā)表了克隆Y1、Y2、Y4和Y5受體的詳細(xì)情況(Herzog等，1992；Gerald等，1995；Bard等，1995；Gerald等，1996)(表1)。這些不同的受體亞型的分布以及生理學(xué)意義還有待進(jìn)一步確定。盡管對于神經(jīng)肽Y的截短的形式對一種或另一種受體亞型的選擇性一直存在爭議(Potter等，1989)，但研究進(jìn)展支持最初的結(jié)合點前和結(jié)合點后的受體亞型分類。已經(jīng)建立了特異性表達(dá)一種神經(jīng)肽Y受體亞型的細(xì)胞系，而具有受體選擇性的神經(jīng)肽Y類似物方面的進(jìn)展主要集中于其在這些細(xì)胞系中的結(jié)合特征(Sheikh等，1989；Aakerlund等，1990；Fuhlendorff等，1990)。最近，一種編碼神經(jīng)肽YYI受體的cDNA已被克隆，而表達(dá)所述已被克隆的受體的細(xì)胞系已經(jīng)被用于分析神經(jīng)肽Y類似物的特異性結(jié)合(Herzog等，1992)以及由特異性類似物所引發(fā)的功能性應(yīng)答。從這些有關(guān)結(jié)合性的研究中，并結(jié)合隨后的體內(nèi)研究，已有兩種類似物被歸類為可特異性作用于結(jié)合點后的神經(jīng)肽YY1受體。這些具有神經(jīng)肽YY受體選擇性的類似物，(Pro34)神經(jīng)肽Y和(Leu″，Pro34)神經(jīng)肽Y，模擬了神經(jīng)肽Y的升高血壓的作用，并同樣具有與僅表達(dá)神經(jīng)肽YY受體的細(xì)胞系的結(jié)合，所述細(xì)胞系例如為表達(dá)克隆的神經(jīng)肽YY受體的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SK-N-MC以及成纖維細(xì)胞系(Herzog等，1992)。兩者均未顯示出神經(jīng)肽Y Y2受體作用，即在體內(nèi)抑制心臟迷走神經(jīng)的作用)，一種抑制乙酰膽堿釋放的表現(xiàn)(Potter等，1991；Potter和McCloskey，1992)。表1；NPY受體亞型在CNS內(nèi)的分布和功能

具有高親和性的、非肽類NPY拮抗劑BIBP3226和BIB03304的出現(xiàn)，十分有助于對NPY受體的功能性研究，這是由于該化合物對Y1R具有選擇性，而至少對Y2R、Y3R和Y4R不具有活性(Doods等，1996)。近來報道了兩種Y2受體拮抗劑。一種為TASP分子(Grouzmann等，1997)，另一種為非肽類拮抗劑(Wieland等，1999)，其他的非肽類的受體特異性化合物也已出現(xiàn)(Daniels等，1995)。因此，通過在腦內(nèi)阻斷特異性的受體，可以對由中樞性NPY受體介導(dǎo)的行為學(xué)和生理學(xué)效應(yīng)進(jìn)行功能性研究。此外，缺乏Y1R的小鼠也已經(jīng)產(chǎn)生并可獲得(Pedrazzini等，1998)。具有NPY樣免疫反應(yīng)性和NPY受體表達(dá)的神經(jīng)元在CNS中含量豐富(表1)，且可能在下丘腦以及所謂的邊緣結(jié)構(gòu)(limbic structure)中最為明顯，但其同樣共定位于腦干單胺能性神經(jīng)元(monoaminergic neuron)和皮質(zhì)GABA能性神經(jīng)元(GABA-ergic neuron)(Chronwall，1985；Dumont等，1996)。表2受體亞型肽選擇性

NPY，焦慮和抑郁NPY的抗焦慮樣作用(anxiolytic-like effect)已通過使用elevatedplus maze test(Montgomery)、懲罰性飲水試驗(punished drinking test，Vogel)、和懲罰性反應(yīng)試驗(punished responding test，Geller-Seifter)所證實，其效力和作用可與苯并二氮(benzodiazepine)相當(dāng)(Griebel，1999；Heilig等，1989；Wettstein等，1995)。NPY在對新奇事物的應(yīng)答(response to novelty)中發(fā)揮抗焦慮樣作用(Heilig和Murison，1987；von B orsten等，1998b)，并在elevated plus maze和其他的焦慮相關(guān)性試驗中產(chǎn)生抗焦慮樣效應(yīng)(Wahlstedt和Reis，1993；Wahlestedt等，1993)。有趣的是，經(jīng)Y1受體的反義處理的大鼠(antisense-treated rat)表現(xiàn)出明顯的焦慮相關(guān)性行為，但不出現(xiàn)運動和攝食的改變(Wahlestedt等，1993)。此外，在一種Flinder大鼠抑郁癥模型上，Y1受體的mRNA表達(dá)在不同的皮質(zhì)區(qū)域和海馬齒狀回(dentate gyrus of the hippocampus)是減低的，而Y2受體的mRNA表達(dá)與對照無區(qū)別(Caberlotto等，1998)。通過給大鼠進(jìn)行嗅球切除術(shù)(Olfactory bulbectomy)建立了一種抑郁癥模型(Leonard和Tuite，1981)。在該模型中出現(xiàn)的絕大多數(shù)的變化與抑郁癥患者的癥狀相似(Song等，1996)。給切除嗅球的大鼠腦室內(nèi)注射(i.c.v.)施用為期7天的NPY可減輕該動物模型的行為學(xué)和神經(jīng)遞質(zhì)的缺陷(Song等，1996)。NPY Y1、Y2、以及可能Y5受體似乎參與調(diào)節(jié)了嚙齒動物的焦慮水平，其中Y1介導(dǎo)的效應(yīng)被研究地最為深入(Heilig等，1993；Kask等，1998b)。因此可以認(rèn)為，內(nèi)源性NPY可對抗應(yīng)激和焦慮(Heilig等，1994)。不僅如此，這些結(jié)果還提示Y1受體亞型可能參與了焦慮和抑郁相關(guān)性行為。此外，Kask等(1996)報道了腦室內(nèi)注射Y1拮抗劑BIBP3226可在elevated plus-maze test中產(chǎn)生致焦慮樣效應(yīng)(anxiogenic-like effect)，但不出現(xiàn)任何運動異常。通過在背側(cè)的導(dǎo)水管周邊灰質(zhì)(dorsal periaqueductal gray matter)施用BIBP3226也可產(chǎn)生此效應(yīng)，但在籃斑(locus coeruleus)或視丘的腦室周邊核施用卻不能(Kask等，1998c)。此外，將BIBP3226和GR231118施用于背側(cè)的導(dǎo)水管周邊灰質(zhì)，使大鼠的主動性社交活動減少(Kask等，1998d)。對于NPY發(fā)揮抗應(yīng)激作用具有重要意義的腦部區(qū)域包括但不限于扁桃體(Sajdyk等，1999；Thorsell等，1999)，籃斑(Kask等，1998c)和背側(cè)的導(dǎo)水管周邊灰質(zhì)(Kask等，1998a、b)。當(dāng)用BIBP3226或BIB03304阻斷NPY Y1R后，elevated plus maze和社交活動試驗并未發(fā)現(xiàn)焦慮加重，因此扁桃體NPY在低應(yīng)激條件下并不釋放(Kask等，1998b；Sajdyk，1999)。但是在背側(cè)的導(dǎo)水管周邊灰質(zhì)似乎存在持續(xù)性NPY能性緊張度，在兩個實驗性焦慮模型中NPY Y1R拮抗劑均產(chǎn)生了致焦慮樣效應(yīng)(Kask等，1998a、b)。因此，在特定的腦部區(qū)域可能存在通過NPY系統(tǒng)對焦慮的緊張度調(diào)節(jié)。CNS NPY系統(tǒng)的神經(jīng)學(xué)和精神生理學(xué)效應(yīng)多效性(pleiotropy)因此，已有大量的研究致力于NPY及其同類物在CNS中的生理功能(見綜述Kalra和Crowley，1992；Dumont等，1992；Stanley，1993；Wahlestedt和Reis，1993；Grundemar等，1993；Gehlert，1994，1998；Colmers和Bleakman，1994；Wettstein等，1995；Heilig和Widerlow，1995；Munglani等，1996；Inui，1999；Bischoff和Michel，1999；Vezzani等，1999)并證明其具有廣泛的效應(yīng)。前，尚未出現(xiàn)利用這些不同的生理功能的藥理學(xué)方法。使用苯并二氮和NPY治療焦慮相關(guān)性疾病在當(dāng)前存在的問題當(dāng)前治療焦慮的方法伴隨若干問題被普遍用作抗焦慮藥物的苯并二氮類屬于低選擇性或無選擇性的非天然化合物。除了其抗焦慮活性，苯并二氮類還有鎮(zhèn)靜和抗癲癇的作用，并且還被認(rèn)為可影響肌肉的放松。但是，其也伴有一些有害的不良反應(yīng)，即疲勞、嗜睡、精力不集中、注意力和反應(yīng)性下降。長期應(yīng)用苯并二氮類會引起神經(jīng)性疾病，例如共濟(jì)失調(diào)、眩暈、腱反射喪失、肌肉和構(gòu)音障礙。據(jù)推測使用苯并二氮類進(jìn)行長期的治療可致藥物依賴和成癮。
將直接腦室內(nèi)注射施用神經(jīng)肽Y作為焦慮癥病人的長期治療措施缺乏可行性。哺乳動物腦內(nèi)的DP IV和DP IV樣酶活件1990年，Hartel-Schenk等研究了Wistar大鼠妊娠第10、16、和21天以及出生后第1、4、8、13、21和60天其器官內(nèi)DP IV的出現(xiàn)情況，其研究方法為免疫組化和活性組織化學(xué)。在所有經(jīng)研究的組織中，多克隆抗體的免疫反應(yīng)性早于DP IV活性出現(xiàn)，且早在妊娠第10天的胚胎及胚胎外(蛻膜)細(xì)胞的漿膜上出現(xiàn)。在這些以及其他部位，如腦血管內(nèi)皮和氣管或支氣管上皮，多克隆抗體的免疫反應(yīng)性在出生后下降或消失，而酶反應(yīng)性根本未出現(xiàn)。單克隆抗體的免疫反應(yīng)性晚于多克隆抗體的免疫反應(yīng)性出現(xiàn)，且最多見于隨后出現(xiàn)DP IV活性的那些結(jié)構(gòu)中。在附睪管、腎集合管和所有肝細(xì)胞的漿膜上顯示出抗表位D的單克隆抗體的高反應(yīng)性，而這些部位既未出現(xiàn)DP IV的活性，也未觀察到對其他抗體的免疫反應(yīng)性。這些結(jié)果同樣提示是先出現(xiàn)DP IV的分子然后再具有催化活性，并且出現(xiàn)免疫反應(yīng)性的部位多于DP IV活性部位。通過免疫組化技術(shù)，Bemstein等在1987年研究了在取自人的胎兒、新生兒和老年人的腦組織中，二肽氨基肽酶IV的免疫反應(yīng)性的存在情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該酶的蛋白在未成熟的人CNS中含量豐富。相反，成人腦中的二肽氨基肽酶IV的免疫反應(yīng)性要低的多。由此推測該酶在神經(jīng)元的增殖和/或分化方面可能具有重要的作用，特別是就其對于某些特定的神經(jīng)營養(yǎng)性(neuronotrophic)肽(IGF II，生長因子)所可能具有的作用而言。氨基肽酶M(APM)、氨基肽酶A(APA)、二肽基肽酶IV(DP IV)和γ谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)被組織化學(xué)的方法證實其在大鼠腦組織的冰凍切片中顯示為腦室膜、脈絡(luò)膜叢和軟腦膜的反應(yīng)特征。GGT僅在腦室膜細(xì)胞的細(xì)胞膜和軟腦膜中能夠檢測到；而APA、APM和DP IV在脈絡(luò)膜叢的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和軟腦膜顯示出不同的活性(Mitro和Lojda，1998)。1979年，Kato等發(fā)現(xiàn)在大鼠腦中存在X脯氨酰二肽氨基肽酶活性，并研究了其在不同時間的發(fā)育性改變。起初，每個腦的總酶活性增加，直到4周齡，然后在成熟過程中逐漸下降。低齡大鼠腦內(nèi)的特異性活性較成熟大鼠高。腦內(nèi)的酶具有與垂體及其他組織的酶所不同的特性。2000年，Nssel等研究了蟑螂組織的脯氨酸特性DP IV活性的出現(xiàn)情況。使用Gly-Pro-4-nitroanilide作為底物，自L.maderae的腦和中腸(midgut)鑒定出了部分純化的DP IV活性。最高的活性得自小腸的膜成分；而得自腦膜的活性(每毫克蛋白)較其低10倍。盡管有報道認(rèn)為豚鼠腦中的post-proline二肽氨基肽酶的總活性的55％與細(xì)胞的可溶性成分相關(guān)，其余的活性則廣泛分布于微粒成分中。而所述微?；钚缘囊粋€重要的部分與突觸膜(synaptosomal membrane)成分相關(guān)(O’Connor和O’Cuinn，1986)。光鏡和電鏡的組織化學(xué)檢查在短尾猿無毛皮膚(macaque glabrous skin)的邁斯納微粒(Meissnercorpuscle)中發(fā)現(xiàn)了二肽基肽酶IV活性。該酶活性存在于形成不完全的囊狀包繞邁斯納微粒的成纖維樣細(xì)胞內(nèi)。在包圍感覺軸突的無髓鞘部分的特化的Schwann細(xì)胞的漿膜上一致性分布著因二肽基肽酶IV活性而出現(xiàn)的明顯的電子致密反應(yīng)產(chǎn)物。這些細(xì)胞的軸膜(axolemma)則沒有二肽基肽酶IV的反應(yīng)產(chǎn)物(Dubovy，1988)。
De Bault和Mitro在1994年研究了大鼠的下穹隆器官(SFO)、覆蓋于SFO表面的室管膜以及鄰近的腦部結(jié)構(gòu)的血管中，谷氨酰氨基肽酶(EAP)、微體丙氨酰氨基肽酶(mAAP)、二肽基肽酶IV(DPIV)和γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GTP)等膜蛋白酶的定位。酶組織化學(xué)反應(yīng)的結(jié)果顯示EAP、mAAP、和γ-GTP具有強活性，但與上述發(fā)現(xiàn)相反，SOF的微血管中無DP IV活性。覆蓋于SFO表面的室管膜中γ-GTP反應(yīng)為陽性，但其他所研究的蛋白酶為陰性。我們的結(jié)果顯示SFO的血管中大部分的酶譜與鄰近的腦組織中的微血管相同，為EAP、mAAP、和γ-GTP陽性，但DP IV陰性。Hong等在1989年用抗DP IV的抗體和DP IV的cDNA通過分子生物學(xué)方法測定了DP IV在大鼠中的分布。免疫印跡分析證實DP IV高水平存在于腎臟、肺和小腸，中等水平存在于肝臟和脾，低水平存在于心臟。在腎臟和小腸檢測到最高的DP IV的mRNA水平，相對而言，肺、肝和脾為中等水平。胃、睪丸、心臟、肌肉和腦的DP IV的mRNA水平最低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種有益于神經(jīng)學(xué)和心理生理學(xué)效應(yīng)的藥物。本發(fā)明的一個特別的目的是提供一種有益于針對包括焦慮在內(nèi)的應(yīng)激而產(chǎn)生的行為和/或神經(jīng)學(xué)適應(yīng)性反應(yīng)性的藥物。
此外，本發(fā)明的一個目的是通過提供一種藥理學(xué)方法而克服或減少現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，并使哺乳動物腦內(nèi)的NPY的活性和/或作用得以維持或延長。
這些目的是通過一種二肽基肽酶IV(DP IV或CD 26)或DP IV樣酶的抑制劑在生產(chǎn)一種用于調(diào)節(jié)針對包括焦慮在內(nèi)的應(yīng)激而產(chǎn)生的行為和/或神經(jīng)學(xué)反應(yīng)性的藥物中的用途而解決的。
這導(dǎo)致由NPY Y1受體介導(dǎo)的內(nèi)源性神經(jīng)學(xué)或神經(jīng)心理學(xué)效應(yīng)增強，包括但不限于減輕焦慮、治療被診斷為患有高血壓、高血壓病、發(fā)熱、睡眠障礙、厭食癥、包括抑郁癥在內(nèi)的焦慮相關(guān)性疾病、包括癲癇在內(nèi)的抽搐、藥物戒斷和酗酒、包括認(rèn)知障礙和癡呆在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病、以及包括精神分裂癥在內(nèi)的神經(jīng)精神性疾病的對象。
附圖簡述

圖1所示為來自漢諾威(Hannover)、美國(USA)、德國(GER)和日本(JAP)種系的Fischer 344(F344)大鼠亞系的血清中的DP IV酶活性。結(jié)果為每個基因型的4-5只鼠齡相當(dāng)?shù)拇笫蟮钠骄?±SEM)。方差分析顯示出F(3，15)50.4的亞系的顯著性結(jié)果，p＜0.0001。星號代表相對于“野生型”F344USA和F344HAN亞系的顯著性PLSD post hoc結(jié)果(“***”＝p＜0.0001)。
圖2所示為來自日本(JAP)、美國(USA)和德國(GER)種系的Fischer 344(F344)大鼠亞系用于社交活動(SI)的時間。大鼠在焦慮社交活動測驗中用掉的時間增加可解釋為一種抗焦慮反應(yīng)。結(jié)果為每個基因型的12只鼠齡相當(dāng)?shù)拇笫蟮钠骄?±SEM)。方差分析顯示出F(2，32)8.8的亞系的顯著性結(jié)果，p＝0.0009。星號代表相對于“野生型”F344USA大鼠的顯著性PLSD post hoc結(jié)果(“**”＝p＜0.01；“***”＝p＜0.001)。
圖3所示為經(jīng)過連續(xù)3天的應(yīng)激后體重的變化。來自日本(JAP)、美國(USA)和德國(GER)種系的鼠齡相當(dāng)?shù)拇笫蟊华殏€地轉(zhuǎn)移至一個新的環(huán)境中并在該處停留達(dá)1小時，如此連續(xù)進(jìn)行3天。第一天使用新的裝有鋸屑的鼠籠，大鼠被放于標(biāo)準(zhǔn)動物架內(nèi)。第二天的采取同樣的過程，但鼠籠內(nèi)未裝鋸屑。第三天的應(yīng)激過程與第二天相同，但鼠籠被放置于新環(huán)境的底部。重復(fù)測定的方差分析顯示出F(2，30)13.5的亞系的顯著性結(jié)果，p＝0.0004。星號代表相對于“野生型”F344USA的顯著性PLSD post hoc結(jié)果(“*”＝p＜0.05；“**”＝p＜0.01)。
圖4所示為用腦室內(nèi)注射異亮氨酰噻唑烷(isoleucyl-thiazolidine)這一處理對于在連續(xù)4分鐘的開放場所測驗中行走的距離所產(chǎn)生的影響。重復(fù)測定的方差分析顯示出就此項活動參數(shù)而言，處理未能產(chǎn)生顯著性結(jié)果(F(3，78)0.7，p＝0.5；n.s.)。
圖5所示為用腦室內(nèi)注射異亮氨酰噻唑烷這一處理對于在連續(xù)4分鐘的開放場所測驗中總共的近墻時間(time spent close to the wall)所產(chǎn)生的影響。方差分析顯示出“處理”對于F(3，26)4.1的顯著性結(jié)果，p＝0.015。星號代表相對于“aCFS”對照的顯著性PLSD post hoc結(jié)果(“*”＝p＜0.05)。
圖6所示為用腦室內(nèi)注射異亮氨酰噻唑烷這一處理對于在elevated plus maze(EPM)的開放臂(open arm)所用時間的百分比的影響。方差分析顯示出“處理”對于F(3，26)3.0的顯著性結(jié)果，p＝0.048。星號代表相對于“aCFS”對照的顯著性PLSD post hoc結(jié)果(“*”＝p＜0.05)。
圖7所示為腦室內(nèi)聯(lián)合注射aCFS、異亮氨酰噻唑烷和NPY的不同劑量組合(異亮氨酰噻唑烷5pmol-500nmol；NPY50pmol-1.6nmol)所產(chǎn)生的影響。測量實驗動物在焦慮測驗的社交活動中用于積極社交活動中的時間(SI-時間)，SI-時間的增加代表抗焦慮樣作用。經(jīng)過對該測驗過程的適應(yīng)，再對實驗動物用隨機(jī)選擇的處理方法進(jìn)行重復(fù)測驗，且總是用新的交往伙伴。各測驗之間間隔至少4天。在各個測驗中，每種情況下觀察4組試驗動物，每組5-6只，方差分析顯示出如下的“處理”(aCFS+aCFS；aCFS+NPY；異亮氨酰噻唑烷+aCFS；異亮氨酰噻唑烷+NPY)的顯著性結(jié)果，從左至右異亮氨酰噻唑烷5pmol+NPY 50pmolF(3，18)0.25，p＝0.8，n.s.；異亮氨酰噻唑烷50pmol+NPY 100pmolF(3，18)22.4，p＜0.0001；異亮氨酰噻唑烷500pmol+NPY 200pmolF(3，20)8.6，p＝0.007；異亮氨酰噻唑烷50pmol+NPY 0.8nmolF(3，20)23.3，p＜0.0001；異亮氨酰噻唑烷500pmol+NPY 1.6nmolF(3，20)11.2，p＝0.008。星號代表相對于“aCFS+aCFS”對照的顯著性PLSD post hoc結(jié)果，如aCFS+NPY與異亮氨酰噻唑烷+NPY之間的橫杠所示(“*”＝p＜0.05)。
圖8所示為腦室內(nèi)聯(lián)合注射aCFS、異亮氨酰噻唑烷和NPY的不同劑量組合(異亮氨酰噻唑烷5pmol-500nmol；NPY50pmol-1.6nmol)所產(chǎn)生的影響。測量實驗動物在1小時內(nèi)的進(jìn)食量。對實驗動物用隨機(jī)選擇的處理方法進(jìn)行重復(fù)測驗。各測驗之間間隔至少4天。在各個測驗中，每種情況下觀察4組試驗動物，每組5-6只，方差分析顯示出如下的“處理”(aCFS+aCFS；aCFS+NPY；異亮氨酰噻唑烷+aCFS；異亮氨酰噻唑烷+NPY)的顯著性結(jié)果，從左至右異亮氨酰噻唑烷5pmol+NPY 50pmolF(3，18)7.0，p＝0.0025；異亮氨酰噻唑烷50pmol+NPY 100pmolF(3，20)4.5，p＝0.016；異亮氨酰噻唑烷500pmol+NPY 200pmolF(3，20)4.4，p＝0.015；異亮氨酰噻唑烷50pmol+NPY 0.8nmolF(3，20)6.6，p＝0.0027；異亮氨酰噻唑烷500pmol+NPY 1.6nmolF(3，20)13.7，p＜0.0001。星號代表相對于“aCFS+aCFS”對照的顯著性PLSD post hoc結(jié)果，如aCFS+NPY與異亮氨酰噻唑烷+NPY之間的橫杠所示(“*”＝p＜0.05)。
圖9所示為腦室內(nèi)聯(lián)合注射aCFS、異亮氨酰噻唑烷和NPY的不同劑量組合(異亮氨酰噻唑烷5pmol-500nmol；NPY50pmol-1.6nmol)所產(chǎn)生的影響。測量實驗動物在12小時內(nèi)的進(jìn)食量。在各個測驗中，每種情況下觀察4組試驗動物，每組5-6只，方差分析顯示出如下的“處理”(aCFS+aCFS；aCFS+NPY；異亮氨酰噻唑烷+aCFS；異亮氨酰噻唑烷+NPY)的顯著性結(jié)果，從左至右異亮氨酰噻唑烷5pmol+NPY 50pmolF(3，18)0.5，p＝0.7，n.s.；異亮氨酰噻唑烷50pmol+NPY 100pmolF(3，20)0.17，p＝0.9，n.s.；異亮氨酰噻唑烷500pmol+NPY 200pmolF(3，20)1.1，p＝0.34，n.s.；異亮氨酰噻唑烷50pmol+NPY 0.8nmolF(3，20)1.2，p＝0.3；異亮氨酰噻唑烷500pmol+NPY1.6nmolF(3，20)3.4，p＝0.039。星號代表相對于“aCFS+aCFS”對照的顯著性PLSD post hoc結(jié)果，如aCFS+NPY與異亮氨酰噻唑烷+NPY之間的橫杠所示(“*”＝p＜0.05)。
圖10所示為腦室內(nèi)聯(lián)合注射Y1R拮抗劑BIBP3226、異亮氨酰噻唑烷和NPY的組合(BIBP3226100nmol；異亮氨酰噻唑烷50nmol；NPY0.8nmol)所產(chǎn)生的影響。測量實驗動物在焦慮測驗的社交活動中用于積極社交活動中的時間(SI-時間)，SI-時間的增加代表抗焦慮樣作用。經(jīng)過對該測驗過程的適應(yīng)，將實驗動物隨機(jī)分配至腦室內(nèi)注射處理方案和相同處理的交往伙伴。每種情況進(jìn)行連續(xù)2個測驗，共6-8只實驗動物。方差分析顯示出對F(7，44)33.6的“處理”在如下各組的顯著性結(jié)果，p＜0.0001，各組為(1)aCFS+aCFS+aCFS；(2)BIBP+aCFS+aCFS；(3)aCFS+異亮氨酰噻唑烷+aCFS；(4)BIBP+異亮氨酰噻唑烷+aCFS；(5)aCFS+aCFS+NPY；(6)BIBP+aCFS+NPY；(7)aCFS+P32/89+NPY；(8)BIBP+異亮氨酰噻唑烷+NPY。相對于對照(aCFS+aCFS+aCFS)的PLSDpost hoc比較的顯著性水平以星號表示(其中“*”＝p＜0.05；“**”＝p＜0.01；“***”＝p＜0.001)，而相對于相應(yīng)的拮抗劑處理(BIBP+n.n.)的以#表示(“#”＝p＜0.05；“##”＝p＜0.01；“###”＝p＜0.001)。所有數(shù)據(jù)以平均值±SEM顯示。
圖11所示為腦室內(nèi)聯(lián)合注射Y1R拮抗劑BIBP3226、異亮氨酰噻唑烷和NPY的組合(BIBP3226100nmol；異亮氨酰噻唑烷50nmol；NPY0.8nmol)對于1小時的進(jìn)食量所產(chǎn)生的影響。經(jīng)過對該測驗過程的適應(yīng)，將實驗動物隨機(jī)分配至腦室內(nèi)注射處理方案和相同處理的交往伙伴。每種情況進(jìn)行連續(xù)2個測驗，共6-8只實驗動物。方差分析顯示出對F(7，44)5.4的“處理”在如下各組的顯著性結(jié)果，p＜0.0002，各組為(1)aCFS+aCFS+aCFS；(2)BIBP+aCFS+aCFS；(3)aCFS+異亮氨酰噻唑烷+aCFS；(4)BIBP+異亮氨酰噻唑烷+aCFS；(5)aCFS+aCFS+NPY；(6)BIBP+aCFS+NPY；(7)aCFS+P32/89+NPY；(8)BIBP+異亮氨酰噻唑烷+NPY。相對于對照(aCFS+aCFS+aCFS)的PLSD post hoc比較的顯著性水平以星號表示(其中“*”＝p＜0.05；“**”＝p＜0.01；“***”＝p＜0.001)，而相對于相應(yīng)的拮抗劑處理(BIBP+n.n.)的以#表示(“#”＝p＜0.05；“##”＝p＜0.01；“###”＝p＜0.001)。所有數(shù)據(jù)以平均值±SEM顯示。
發(fā)明詳述與本領(lǐng)域中所提及的其他方法不同，本發(fā)明提供了一種低分子量的二肽基肽酶IV或DP IV樣酶的抑制劑的口服治療法。這一方便的發(fā)明代表了一種用于治療哺乳動物的焦慮和其他神經(jīng)學(xué)或心理學(xué)疾病的新途徑。其使用方便，具有商業(yè)價值，并適合應(yīng)用于治療方案中，特別是對于人類疾病。
可口服的低分子量的二肽基肽酶IV抑制劑例如為N-(N’-取代的氨基乙酰)-2-氰基吡咯烷，L-蘇型-異亮氨酰噻唑烷，L-異-異亮氨酰噻唑烷(L-allo-isoleucyl thiazolidine)，L-蘇型-異亮氨酰吡咯烷，L-異-異亮氨酰噻唑烷(L-allo-isoleucyl thiazolidine)，和L-異-異亮氨酰吡咯烷(L-allo isoleucyl pyrrolidine)。相關(guān)描述見US 6,001,155，WO99161431，WO 99/67278，WO 99/67279，DE 198 34 591，WO 97/40832，DE 196 16 486 C 2，WO 98/19998，WO 00/07617，WO 99/38501，和WO 99/46272，其全文在此并入作為參考。此類抑制劑的目的是抑制DP IV，并通過此作用來降低血糖水平，由此優(yōu)選地治療高血糖癥以及伴隨血糖升高的相關(guān)疾病。
DP IV是一種外肽酶(exopeptidase)，其選擇性地在N端倒數(shù)第二的脯氨酸和丙氨酸殘基后裂解肽鏈。該酶的內(nèi)源性底物包括腸降血糖素(incretin)，例如葡萄糖依賴性促胰島素(insulintropic)多肽類，如GIP和截短的GLP-1。在DP IV存在時，這些激素被酶性降解為無活性形式。無活性的GIP和GLP-1和不能誘導(dǎo)胰島素分泌，因此可使血糖升高，特別是在高血糖血癥狀態(tài)時。血糖升高可伴發(fā)多種不同的病理情況，包括糖尿病(1型和2型)和糖尿病的并發(fā)癥。DP IV樣酶的選擇例如可以通過下面的試驗進(jìn)行對肽酶進(jìn)行選擇性在N端倒數(shù)第二的脯氨酸和丙氨酸殘基后裂解肽的試驗，選擇出能夠?qū)崿F(xiàn)此裂解的肽酶并分離該肽酶。
還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)DP IV在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用，例如器官移植。已經(jīng)證明抑制DP IV可延長心臟移植物。此外，抑制DP IV可抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。DP IV還在HIV穿透T細(xì)胞(T輔助細(xì)胞)中具有作用。
這些二肽基肽酶IV抑制劑的多種作用提示，當(dāng)其被用于治療發(fā)生病理變化的組織時，其會對正常健康組織和器官產(chǎn)生影響。本發(fā)明的目標(biāo)是開發(fā)定向于腦的藥劑，所述藥劑能夠維持、增強或延長NPY活性的效應(yīng)，以及具有很高的生物利用度和靶組織內(nèi)的可精確預(yù)測的活性時間。
具有靶器官特異性的、可口服的低分子量藥劑的例子為穩(wěn)定的和不穩(wěn)定的二肽基肽酶IV的抑制劑的前體藥物(prodrug)，其包含通式A-B-C，其中A代表一種氨基酸，B代表A和C之間的化學(xué)鍵或者一種氨基酸，而C代表一種穩(wěn)定的和不穩(wěn)定的二肽基肽酶IV的抑制劑。上述內(nèi)容見WO 99/67278和WO 99/67279所述，其全文在此并入作為參考。
本發(fā)明涉及一種新型的治療方法，其中通過施用哺乳動物腦內(nèi)的二肽基肽酶IV(DP IV或CD 26)或DP IV樣酶活性的抑制劑，由此而產(chǎn)生的結(jié)果是神經(jīng)肽Y(NPY)的降解減少。該治療可導(dǎo)致具有功能活性的NPY(1-36)的濃度的下降出現(xiàn)減少或延遲。
根據(jù)本發(fā)明可以看出，哺乳動物、特別是人的腦內(nèi)的NPY的效應(yīng)和/或活性可通過施用二肽基肽酶IV(DP IV)或DP IV樣酶的抑制劑而得以維持或延長。由此可減少腦內(nèi)NPY的降解。這可減輕或改善心身性、抑郁性和/或神經(jīng)精神性疾病。這一方便的發(fā)明特別代表了一種治療焦慮癥以及其他神經(jīng)學(xué)或心理學(xué)疾病的新型方法。其使用方便，具有商業(yè)價值，并適合應(yīng)用于治療方案中，特別是對于人類疾病。
施用二肽基肽酶IV或DP IV樣酶的抑制劑可防止或減慢腦內(nèi)NPY的降解這一發(fā)現(xiàn)因如下理由而特別令人驚異Hong等在1989年用抗DP IV的抗體和DP IV的cDNA通過分子生物學(xué)方法測定了DP IV在大鼠中的分布。免疫印跡分析證實DP IV高水平存在于腎臟、肺和小腸，中等水平存在于肝臟和脾，低水平存在于心臟。在腎臟和小腸檢測到最高的DP IV的mRNA水平，相對而言，肺、肝和脾為中等水平。胃、睪丸、心臟、肌肉和腦的DP IV的mRNA水平最低。
1990年，Hartel-Schenk等研究了Wistar大鼠妊娠第10、16、和2 1天以及出生后第1、4、8、13、21和60天其器官內(nèi)DP IV的出現(xiàn)情況，其研究方法為免疫組化和活性組織化學(xué)。在所有經(jīng)研究的組織中，多克隆抗體的免疫反應(yīng)性早于DP IV活性出現(xiàn)，且早在妊娠第10天的胚胎及胚胎外(蛻膜)細(xì)胞的漿膜上出現(xiàn)。在這些以及其他部位，如腦血管內(nèi)皮和氣管或支氣管上皮，多克隆抗體的免疫反應(yīng)性在出生后下降或消失，而酶反應(yīng)性根本未出現(xiàn)。單克隆抗體的免疫反應(yīng)性晚于多克隆抗體的免疫反應(yīng)性出現(xiàn)，且最多見于隨后出現(xiàn)DPIV活性的那些結(jié)構(gòu)中。在附睪管、腎集合管和所有肝細(xì)胞的漿膜上顯示出抗表位D的單克隆抗體的高反應(yīng)性，而這些部位既未出現(xiàn)DP IV的活性，也未觀察到對其他抗體的免疫反應(yīng)性。這些結(jié)果同樣提示是先出現(xiàn)DP IV的分子然后再具有催化活性，并且出現(xiàn)免疫反應(yīng)性的部位多于DP IV活性部位。通過免疫組化技術(shù)，Bernstein等在1987年研究了在取自人的胎兒、新生兒和老年人的腦組織中，二肽氨基肽酶IV的免疫反應(yīng)性的存在情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該酶的蛋白在未成熟的人CNS中含量豐富。相反，成人腦中的二肽氨基肽酶IV的免疫反應(yīng)性要低的多。由此推測該酶在神經(jīng)元的增殖和/或分化方面可能具有重要的作用，特別是就其對于某些特定的神經(jīng)營養(yǎng)性(neuronotrophic)肽(IGF II，生長因子)所可能具有的作用而言。De Bault和Mitro在1994年研究了大鼠的下穹隆器官(SFO)、覆蓋于SFO表面的室管膜以及鄰近的腦部結(jié)構(gòu)的血管中，谷氨酰氨基肽酶(EAP)、微體丙氨酰氨基肽酶(mAAP)、二肽基肽酶IV(DP IV)和γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GTP)等膜蛋白酶的定位。酶組織化學(xué)反應(yīng)的結(jié)果顯示EAP、mAAP、和γ-GTP具有強活性，但與上述發(fā)現(xiàn)相反，SOF的微血管中無DP IV活性。覆蓋于SFO表面的室管膜中γ-GTP反應(yīng)為陽性，但其他所研究的蛋白酶為陰性。他們的結(jié)果顯示SFO的血管中大部分的酶譜與鄰近的腦組織中的微血管相同，為EAP、mAAP、和γ-GTP陽性，但DP IV陰性。用抗DP IV的抗體和DP IV的cDNA。
與上述發(fā)現(xiàn)相反，本發(fā)明顯示，施用DP IV抑制劑如異亮氨酰噻唑烷可在大鼠產(chǎn)生抗焦慮效應(yīng)。令人驚異地，本發(fā)明顯示，施用DP IV抑制劑如異亮氨酰噻唑烷可在大鼠產(chǎn)生抗焦慮效應(yīng)。異亮氨酰噻唑烷在腦中的特異性靶向分子不是DP IV酶，后者由Mentlein(1993)在胎盤中分離得到并用于他的體外研究中。在大鼠腦室內(nèi)施用DP IV抑制劑異亮氨酰噻唑烷后可減輕焦慮，這一點提示，本發(fā)明的靶分子一種或一組DP IV樣酶。
作為施用DP IV抑制劑而引起的內(nèi)源性NPY(1-36)穩(wěn)定性增加的結(jié)果，NPY的活性被延長，這導(dǎo)致具有功能活性的NPY YI受體活性，而后者有益于抗抑郁、抗焦慮和抗高血壓效應(yīng)等(見上)。
本發(fā)明的用于治療動物包括人的焦慮癥的方法包含通過施用DPIV或相關(guān)的酶的抑制劑而強化NPY的效應(yīng)。在大多數(shù)情況下，DP IV抑制劑可優(yōu)選地通過口服施用。通過抑制DP IV或DP IV樣酶的活性，使活化形式的NPY的半衰期在生理條件下得以延長和維持，而延長活化NPY的存在可增強NPY Y1受體的活性。
本發(fā)明還提供了藥物組合物，所述組合物包含一種治療(或預(yù)防)有效量的所述抑制劑(和/或與DP IV抑制劑一同施用的糖丸)，以及一種藥用可接受的載體或賦形劑，其特別適合于定向于腦。合適的載體包括但不限于鹽、緩沖鹽、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。所述載體和組合物優(yōu)選地在良好的實驗操作條件下進(jìn)行，且最優(yōu)選為無菌條件下。配方的選擇在理論上要適合于施用方式，符合常規(guī)的操作。
適合的藥用可接受的載體包括但不限于水、鹽溶液(如NaCl)，酒精、阿拉伯樹膠、植物油、苯甲醇(benzyl alcohols)、聚乙二醇、凝膠、碳水化合物例如乳糖、直鏈淀粉或淀粉、硬脂酸鎂鹽、滑石粉、粘性石蠟、芳香油、脂肪酸酯、羥甲基纖維素、和聚乙烯吡咯烷酮等。所述藥用制劑可進(jìn)行無菌處理，并在需要時混合入輔助劑，例如潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑、用于影響滲透壓的鹽、緩沖劑、著色劑、調(diào)味劑和/或芳香物質(zhì)等等，其不應(yīng)與所述活性化合物發(fā)生有害反應(yīng)，但可改善其穩(wěn)定性、可加工性和/或外觀美感。
如果需要，所述組合物可以含有少量的濕潤劑或乳化劑，或者pH緩沖劑。此外，所述組合物可以是液體溶液、懸濁液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、控釋劑型、或粉劑。此外，所述組合物可以通過傳統(tǒng)的結(jié)合劑和載體如甘油三酯而配制成栓劑。口服配方可以包括標(biāo)準(zhǔn)的載體例如藥用等級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂鹽、聚乙烯吡咯烷酮、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。
進(jìn)一步，所述組合物可根據(jù)常規(guī)程序配制為適合于給人靜脈施用的藥用組合物。有代表性地，靜脈施用的組合物為無菌等滲緩沖溶液。必要時，所述組合物也可以包括溶劑以及局部麻醉劑，以減輕注射部位的疼痛。通常，所述成分可以單獨形式提供或混合成單位劑型，例如密封容器內(nèi)的凍干粉劑或無水濃縮物，所述容器例如為標(biāo)明活性化合物量的安瓿或藥囊(sachette)。若所述組合物以輸液方式施用，其可以被置于含有無菌藥用級水、鹽或葡萄糖/水的輸液瓶中。若所述組合物以注射方式施用，可提供一安瓿注射用水或鹽水以便在施用前將所述成分進(jìn)行混合。
最后，本發(fā)明的組合物可配制成中性或鹽的形式。藥用可接受的鹽包括與游離氨基反應(yīng)形成的鹽，如衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的鹽，以及衍生自鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組胺、普魯卡因等的鹽。
用于治療一種特定的疾病或病情的本發(fā)明的組合物的有效劑量取決于所述疾病或病情的性質(zhì)，并可通過標(biāo)準(zhǔn)的臨床技術(shù)加以確定。此外，可任選地通過體外和/或體內(nèi)分析來確定最佳劑量的范圍。配方中所用的確切劑量還將取決于施用途徑、疾病的嚴(yán)重程度，并應(yīng)根據(jù)醫(yī)療人員的判斷和每個病人的具體情況而決定。
本領(lǐng)域人員應(yīng)明白，對本發(fā)明在此給出的實施例和指導(dǎo)進(jìn)行的各種改動，包括產(chǎn)生不同的DP IV抑制劑和替代性治療組合物，均未脫離本發(fā)明的精神和范圍。
下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，重點在于其在DP IV缺陷遺傳模型中產(chǎn)生的抗焦慮樣和應(yīng)激保護(hù)性樣的作用(實施例1)，藥理學(xué)劑量的DP IV抑制劑在CNS中產(chǎn)生的抗焦慮效應(yīng)(實施例2)，NPY介導(dǎo)的抗焦慮效應(yīng)的相互作用和強化(實施例3)，以及基于NPYY1受體介導(dǎo)的效應(yīng)的強化的抗焦慮機(jī)制的表征(實施例4)。
實施例實施例1在Fischer(F344)大鼠的亞系中觀察到的DP IV基因的自發(fā)突變給研究DP IV在行為調(diào)節(jié)和應(yīng)激適應(yīng)的作用上提供了一個模型。F344大鼠的突變造成了DP IV樣酶的活性的缺失，來自德國(GER)和日本(JAP)的亞系中(Thompson等，1991；Tsuji等，1992)存在這種突變，而來自美國(USA)和漢諾威(HAN)種系的大鼠則表現(xiàn)出了顯著的酶的活性。在F344JAP大鼠，CD26蛋白上的G633R的取代造成了突變的無活性的酶的表達(dá)的極大減少(Tsuji等，1992；Cheng等，1999)，而其他的DP IV陰性的F344GER亞系表達(dá)無活性的突變的酶(Thompson等，1991)。F344JAP大鼠因此被認(rèn)為是一種“蛋白敲除”模型(Cheng等，1999)，同時F344GER亞系可以代表“蛋白過度表達(dá)”模型(Shingu，Helfritz，Meyer，Schmidt，Mentlein，von Horsten，已投稿)?；谶@些發(fā)現(xiàn)，突變的F344JAP和F344GER亞系和“野生型”的F344USA大鼠直接比較將看到DP IV的表達(dá)和活性在行為調(diào)節(jié)和體內(nèi)其他的神經(jīng)與心理生理的功能上的作用間的差異。在本實施例中我們報道了DP IV缺失的F344亞系是更少的焦慮和更少的對應(yīng)激誘導(dǎo)的生理學(xué)的改變的反應(yīng)。
動物F344USA，F(xiàn)344JAP和F344GER亞系通過Charles RiverGermany從不同國家獲得。F344Han，最初來源于F344USA亞系，從漢諾威醫(yī)學(xué)院的中心動物實驗室的繁殖克隆里獲得(進(jìn)一步信息見http/www.mh-hannover.de/institut/tierlabor/f344.htm)。所有的亞系在漢諾威的中心動物實驗室被飼養(yǎng)一代和被保持在一個在25℃在12h亮-12h暗周期下(亮在0700h)特殊的無病原體的設(shè)備內(nèi)，具有一個食物和水的添加通道。所有亞系的周齡匹配的次代被用于試驗。地方政府、漢諾威、德國均同意所有研究和動物保護(hù)程序。
F344亞系的組織中DP IV的活性的定量化血漿、肺和不同的其他組織被保存在-80℃直到使用。組織被勻漿，通過與底物，甘氨酰脯氨酸p-對硝基苯胺(gly-Pro-pNA，1mg/ml在PBS)(Bachem，德國)孵育，在405nm測定顏色變化。
社交活動(SI)試驗SI試驗按File(1980)首次描述的進(jìn)行并已經(jīng)被在實驗室中確認(rèn)(Kask，Nguyen，Pabst，von Horsten，已投稿)。兩只大鼠，基因型和體重匹配，從飼養(yǎng)籠中取出并暴露在試驗環(huán)境中?；顒訄鏊卿X制的四方的開放場所(50×50×50cm)，放置在一個聲音隔離的盒子里(Coulborun Instruments，Lehigh Valley，PA)。設(shè)備的細(xì)節(jié)見我們以前的研究(yon Horsten等，1998c)。開放場所用紅的照相燈泡(Philips PF712E；1.3 Lux)照亮。大鼠對該設(shè)備不習(xí)慣。用一放置在試驗/隔離盒內(nèi)的場所上方的攝象機(jī)監(jiān)視行為。一個不知道大鼠亞系的觀察者(HPN)記錄下面的參數(shù)花費在嗅聞、跟隨、爬行在其他大鼠下面或上面的持續(xù)時間，但不包括非被動身體接觸(休息，睡覺)時間。SI時間的增加被認(rèn)為是一種抗焦慮樣效應(yīng)。
應(yīng)激誘導(dǎo)的體重下降在連續(xù)的三天，來自日本(JAP)、美國(USA)和德國(GER)種系的周齡匹配的動物被獨個地轉(zhuǎn)移至一個新的空間中并在該處停留達(dá)1小時。第一天使用新的裝有鋸屑的籠子，動物被放于標(biāo)準(zhǔn)動物架內(nèi)。第二天的采取同樣的過程，除了籠內(nèi)未裝鋸屑。第三天的應(yīng)激過程與第二天相同，但籠子被放置于新空間的底部。
數(shù)據(jù)分析用重復(fù)測定的差異的兩組分析(方差)來分析重復(fù)觀察獲得的數(shù)據(jù)(因素“亞系”和“應(yīng)激后體重的變化”象重復(fù)測定)。從單次測定中獲得的數(shù)據(jù)如DP IV活性或SI時間被單組(因素“亞系”)方差分析。星號表示通過Fisher’s PLSD獲得的相對于F344USA亞系(對照)的顯著的post hoc效應(yīng)。所有的數(shù)據(jù)用平均值±S.E.M.表示。
F344亞系中的DP IV活性與文獻(xiàn)符合，F(xiàn)344GER和F344JAP亞系缺乏內(nèi)在的DP IV活性(圖1)。因此，這些大鼠提供了研究DPIV在行為調(diào)節(jié)上的生理學(xué)作用的遺傳模型。
社交活動試驗中的焦慮這些缺乏DP IV活性的F344亞系(F344JAP和F344GER)花費了明顯更多的時間用于新環(huán)境中的主動性的社交活動(圖2)。因此，缺乏內(nèi)在的DP IV樣的活性介導(dǎo)了抗焦慮樣效應(yīng)。
應(yīng)激誘導(dǎo)的體重下降F344JAP和F344GER在反復(fù)的1小時的轉(zhuǎn)運應(yīng)激后下降了顯著少的體重。因此，這些亞系中內(nèi)在的DP IV樣活性的缺乏減少了中等應(yīng)激誘導(dǎo)的生理學(xué)改變(圖3)。
綜上，這些數(shù)據(jù)表明在DP IV缺乏的F344大鼠的遺傳模型的內(nèi)在的DP IV活性的缺乏造成了抗焦慮樣的和應(yīng)激保護(hù)的效應(yīng)。實施例2在前面的實施例中，我們已經(jīng)證實在DP IV缺乏的遺傳模型中焦慮和應(yīng)激反應(yīng)減少。在本實施例中，我們報道在嚙齒動物的一個廣泛認(rèn)可的焦慮試驗，elevated plus maze試驗中，中樞施用(腦室內(nèi)注射)DP IV抑制劑異亮氨酰噻唑烷導(dǎo)致抗焦慮樣效應(yīng)。我們進(jìn)一步報道通過開放場所范例(Denenberg等，1968)測定的大鼠對新鮮事物的情緒性在異亮氨酰噻唑烷處理的無反應(yīng)活性的大鼠上是少顯著的。
動物雄性WistarF/Han(WF)大鼠(中心動物實驗室，漢諾威醫(yī)學(xué)院，漢諾威，德國，細(xì)節(jié)見http/www.mh-hannover.de/institut/tierlabor/wf.htm)，體重350-390g，飼養(yǎng)在隔音的，溫度控制的(24.0±0.5℃)房間，在無病原體的條件和12/12h暗/亮周期(亮在07.00，照度為80勒克司水平)。食物(Altromin實驗食物碎屑)和自來水被隨意獲得。在氯胺酮/甲苯噻嗪(100/5mg/kg，腹腔注射)麻醉下，大鼠被Kopf立體支架固定和在側(cè)腦室上方植入管子(Plastic One，Inc.，Roanoke，VA，USA)。所有的研究和動物保護(hù)程序被Lower Saxony地方政府(漢諾威，德國)認(rèn)可并遵從歐洲委員會的1986年11月24的會議指導(dǎo)(86/609/EEC)中的原則。
外科和腦室內(nèi)注射應(yīng)用對于外科，大鼠被麻醉并按von Horsten等(1998a，b，c)詳細(xì)描述的標(biāo)準(zhǔn)的立體方法用腦室內(nèi)注射管處理(坐標(biāo)A-0.7mm頭部，L前囟點外側(cè)1.4mm；和V頭顱表面腹側(cè)3.2mm；牙嵴在耳嵴上方+3.0)。7天恢復(fù)期后，血管緊張素飲水反應(yīng)(von Horsten等，1998a，b，c)確認(rèn)成功的室的置管。表現(xiàn)出陽性飲水反應(yīng)的大鼠(n＝40)被然后通過每天假裝(sham)注射共7天來習(xí)慣于試驗操作。
動物被隨機(jī)地分成4個試驗組(n＝8-10/組)，它們完成不同的試驗性焦慮的行為實驗。每組中的動物在每一期按相同的方式處理，在行為實驗前-60分鐘接受腦室內(nèi)注射人造的腦脊液(aCSF)(對照)，異亮氨酰噻唑烷(0.05nmol)，異亮氨酰噻唑烷(5nmol)和異亮氨酰噻唑烷(500nmol)。異亮氨酰噻唑烷用緩沖的aCSF調(diào)整為最終濃度和按體積5μl/min注射到右側(cè)側(cè)腦室。套管用近30cm的聚乙烯管連接于Hamilton微注射器，所有的化合物被用TSE多通道注射泵(BadHomburg，德國)按5.0μl/min的速度灌注。
對新鮮事物的反應(yīng)(開放場所實驗)用開放場所(OF)實驗研究中樞施用DP IV拮抗物誘導(dǎo)的對新鮮事物的反應(yīng)的差異。通常的方法的細(xì)節(jié)已經(jīng)被描述在其他地方(von Horsten等，1993，1998d)。但進(jìn)行了以下的改良在暗期，大鼠被放置在用紅色照相燈照射的隔音的盒子里的一面積50×50cm的OF。用視頻通道分析系統(tǒng)(E61-21視頻通道分析系統(tǒng)，Coulbourn設(shè)備，PA，USA)記錄在15分鐘的單次連續(xù)實驗段的自發(fā)行為。分析系統(tǒng)確定在15個一分鐘間隔的行為，分析14個數(shù)據(jù)成分墻-，角落-，象限1-4-，移動-，休息-和后腿站立的時間(所有的按秒)，立的-，后腿站立-，順時針和反時針旋轉(zhuǎn)事件(所有整數(shù))，和移動距離(cm)。此外，在每段后記錄所有的大便boli次數(shù)，和通過一個不知道動物處理方式的人從視頻監(jiān)視中同時記錄梳理行為的次數(shù)與時間(秒)。
Elevated plus maze(EPM)實驗根據(jù)Femandes和File(1996)采用的elevated plus maze裝置和實驗方法基于對應(yīng)用于大鼠的通常的認(rèn)識和認(rèn)可。E+裝置(TSE系統(tǒng)，Bad Homburg，德國)用灰色的塑料制成和具有兩開放的臂(50×10cm)和兩閉合的相同大小的臂，具有40cm的墻，在地面上50cm。迷宮裝備有亮珠感受器能使得E+操作的計算機(jī)化的檢測。用放置在迷宮上30cm的紅色燈泡(philipsPF712E；1.5勒克司)按閉合臂仍在陰影中的方式照射迷宮。在實驗開始時，大鼠被放置在中央平臺(10×10cm)，它的頭面向閉合臂，和允許自由的探索迷宮5分鐘。下面的參數(shù)被計算臂進(jìn)入的總數(shù)目(TA)，閉合臂的進(jìn)入(CA)，開放臂的進(jìn)入(OA)，進(jìn)入開放臂的頻率的百分比(％OAOA×100/TA)；總的實驗時間(TT)300秒；停留在閉合臂的時間(閉合時間CLT)；CLT在總的臂停留時間的百分比(CLT×100/AT)；停留在開放臂的時間(開放時間OT)；OT在總的臂停留時間的百分比(OT×100/AT)；除了標(biāo)準(zhǔn)的時空的測定，“在中央?yún)^(qū)的花費時間和時間百分比”被記錄(中央時間，CT停留在平臺的按秒的時間；CT在實驗時間的百分比，％CTCT×100/TT)。在開放臂花費時間的增加表示抗焦慮反應(yīng)，該參數(shù)的減少是焦慮反應(yīng)，其中進(jìn)入閉合臂的數(shù)目提供了通常主動性的指標(biāo)(Pellow等，1985)。
數(shù)據(jù)分析對于數(shù)據(jù)分析，來自每個測定時間的行為的原始數(shù)據(jù)被用兩組差異分析(方差)分析重復(fù)測定(因素處理和重復(fù)測定的時間)。從每段獲得的做為總的數(shù)據(jù)用一組(因素處理)方差分析。用星號表示通過Fisher’s PLSD獲得的相對于aCSF(對照)的顯著的post hoc效應(yīng)。所有的數(shù)據(jù)用平均值±S.E.M.表示。
在開放場所對異亮氨酰噻唑烷的反應(yīng)異亮氨酰噻唑烷在很寬的劑量范圍內(nèi)對在開放場所的主動性沒有影響(圖4)。做為在開放場所的減少的情緒性的特征，異亮氨酰噻唑烷以劑量依賴性方式誘導(dǎo)減少了靠墻所花費的時間(圖5)。非常低的劑量(50pmol)已經(jīng)是有效的。
EPM對異亮氨酰噻唑烷的反應(yīng)在低劑量(50pmol)的異亮氨酰噻唑烷增加了花費在迷宮的開放臂的時間百分比提示為抗焦慮樣效應(yīng)(圖6)。綜上，這些數(shù)據(jù)第一次表明注射藥學(xué)劑量的DP IV抑制劑異亮氨酰噻唑烷在兩種焦慮的動物模型中產(chǎn)生了劑量依賴性的抗焦慮樣效應(yīng)。實施例3
在本實施例中，我們報道了中樞性施用(腦室內(nèi)注射)DP IV抑制劑異亮氨酰噻唑烷本身在焦慮的社交活動實驗中也有劑量依賴性的抗焦慮效應(yīng)。我們也報道異亮氨酰噻唑烷的抗焦慮的程度與NPY產(chǎn)生的相似。另外，我們表明聯(lián)合應(yīng)用異亮氨酰噻唑烷和NPY在SI實驗中有累加的抗焦慮效應(yīng)。最后，我們表明1h和12h的食物攝取是很少被異亮氨酰噻唑烷單獨和聯(lián)合處理所影響的。
動物雄性WistarF/Han(WF)大鼠(中心動物實驗室，漢諾威醫(yī)學(xué)院，漢諾威，德國，細(xì)節(jié)見http/www.mh-hannover.de/institut/tierlabor/wf.htm)，體重330-370g，飼養(yǎng)在隔音的，溫度控制的(24.0±0.5℃)房間，在無病原體的條件和12/12h暗/亮周期(亮在07.00，照度為80勒克司水平)。食物(Altromin實驗食物碎屑)和自來水可隨意獲得。在氯胺酮/甲苯噻嗪(100/5mg/kg，腹腔注射)麻醉下，大鼠被Kopf立體支架固定和在側(cè)腦室上方植入管子(Plastic one，Inc.，Roanoke，VA，USA)。所有的研究和動物保護(hù)程序被Lower Saxone地方政府(漢諾威，德國)認(rèn)可并遵從歐洲委員會的1986年11月24的會議指導(dǎo)(86/609/EEC)中的原則。
外科和腦室內(nèi)注射應(yīng)用對于外科，大鼠被麻醉和按象在別的地方(von Horsten等，1998a，b，c)細(xì)節(jié)描述的標(biāo)準(zhǔn)的立體方法用腦室內(nèi)注射管處理(坐標(biāo)A-0.7mm頭部，L前囟點外側(cè)1.4mm；和V頭顱表面腹側(cè)3.2mm；牙嵴在耳嵴上方+3.0)。7天恢復(fù)期后，血管緊張素飲水反應(yīng)(von Horsten等，1998a，b，c)確認(rèn)成功的腦室置管。表現(xiàn)出陽性飲水反應(yīng)的大鼠(n＝59)被然后通過每天假裝注射共7天來習(xí)慣于試驗操作。
動物被隨機(jī)地分成四個實驗組(n＝5-6/組)的兩套，來完成不同的連續(xù)的焦慮的SI實驗。每組中的動物在每一期按相同的方式處理，在行為實驗前-60分鐘和-45分鐘接受不同劑量(異亮氨酰噻唑烷(5pmol-500nmol；NPY50pmol-1.6nmol)腦室內(nèi)注射。異亮氨酰噻唑烷被用緩沖的aCSF調(diào)整為最終濃度和按體積5μl/min注射到右側(cè)側(cè)腦室。套管被用近30cm的聚乙烯管連接于Hamilton微注射器，所有的化合物被用TSE多通道注射泵(Bad Homburg，德國)按5.0μl/min的速度灌注。測定主動性社交活動花費的時間(SI時間)，1h和12h的食物攝取。動物用隨機(jī)選擇的處理和始終新的交往對象來重復(fù)測定。實驗被彼此分開至少4天和一直在暗循環(huán)中進(jìn)行。5個實驗系列被進(jìn)行。每個實驗，跨度4個組(aCSF+aCSF；aCSF+NPY；異亮氨酰噻唑烷+aCSF；異亮氨酰噻唑烷+NPY)的每個條件5-6只實驗動物。
社交活動(SI)試驗SI試驗按File(1980)首次描述的進(jìn)行并已經(jīng)在實驗室中得到確認(rèn)(Kask，Nguyen，Pabst，von Horsten，已投稿)。兩只大鼠，基因型和體重匹配，從home籠中取出和暴露在試驗環(huán)境中?；顒訄鏊卿X制的四方的開放場所(50×50×50cm)，放置在一個聲音隔離的盒子里(Coulborun Instruments，Lehigh Valley，PA)。設(shè)備的細(xì)節(jié)見我們以前的研究(yon Horsten等，1998c)。開放場所用紅的照相燈泡(Philips PF712E；1.3 Lux)照亮。大鼠對該設(shè)備不習(xí)慣。用一放置在試驗/隔離盒內(nèi)的場所上方的攝象機(jī)監(jiān)視行為。一個不知道大鼠亞系的觀察者(HPN)記錄下面的參數(shù)花費在嗅聞、跟隨、爬行在其他大鼠下面或上面的持續(xù)時間，但不包括非被動身體接觸(休息，睡覺)的時間。SI時間的增加被認(rèn)為是一種抗焦慮樣反應(yīng)。
數(shù)據(jù)分析用重復(fù)測定的差異的兩組分析(方差)來分析重復(fù)觀察(食物攝取)獲得的數(shù)據(jù)(因素“亞系”和“食物攝取”象重復(fù)測定)。從單次測定中獲得的數(shù)據(jù)如DP IV活性或SI時間被一組(因素“亞系”)方差分析。星號表示通過Fisher’s PLSD獲得的相對于aCSF+aCSF(對照)的顯著的post hoc效應(yīng)。所有的數(shù)據(jù)用平均值±S.E.M.表示。
在SI實驗中異亮氨酰噻唑烷的劑量依賴性的抗焦慮中樞性施用的DP IV抑制劑異亮氨酰噻唑烷(組aCSF+異亮氨酰噻唑烷5pmol-500nmol)在焦慮的社交活動實驗中產(chǎn)生了“鐘形”的劑量依賴性的抗焦慮樣效應(yīng)(圖7)。這表明異亮氨酰噻唑烷在SI實驗中也作用為一強的抗焦慮樣化合物，類似于EPM和開放場所實驗(見實施例2)。腦室內(nèi)注射應(yīng)用的NPY(0.05-1.6nmol)有相似的抗焦慮樣效應(yīng)(圖7)。這個發(fā)現(xiàn)重復(fù)了已知的NPY的抗焦慮樣作用，象在背景技術(shù)中描述的。異亮氨酰噻唑烷介導(dǎo)的效應(yīng)和NPY的比較提示抑制劑有著相似的作用。有趣的是，異亮氨酰噻唑烷的預(yù)處理和隨后的NPY產(chǎn)生了在廣泛劑量范圍的累加的效應(yīng)(圖7)，提示這些化合物通過相同的機(jī)制作用。如現(xiàn)有技術(shù)所描述的，這個機(jī)制最可能是激活CNS Y1受體。
異亮氨酰噻唑烷在喂養(yǎng)上的次要效應(yīng)圖8和圖9表明在1h NPY產(chǎn)生了一個“u形”的劑量依賴性喂養(yǎng)效應(yīng)(圖8)。異亮氨酰噻唑烷產(chǎn)生了弱的喂養(yǎng)效應(yīng)，僅在0.05nmol達(dá)到顯著(圖8)。異亮氨酰噻唑烷和隨后的NPY的聯(lián)合處理與單獨應(yīng)用NPY沒有不同(除了最高的非生理劑量)，提示NPY喂養(yǎng)效應(yīng)不是通過與異亮氨酰噻唑烷影響的相同的機(jī)制介導(dǎo)的。在現(xiàn)有技術(shù)的大多數(shù)數(shù)據(jù)提示NPY的暗循環(huán)的喂養(yǎng)效應(yīng)主要是Y5受體介導(dǎo)的。過夜的食物攝取不受任何處理的影響，除了在極高的劑量(圖9)。因此，中樞性施用的DP IV抑制劑異亮氨酰噻唑烷不影響大多數(shù)的喂養(yǎng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)(也就是NPY Y5受體)。實施例4在本實施例，我們報道了象實施例的圖7顯示的在中等劑量的NPY介導(dǎo)的抗焦慮效應(yīng)的增強的機(jī)制(異亮氨酰噻唑烷，50nmol；NPY，0.8nmol)。我們確信用NPY Y1受體拮抗劑BIBP3226預(yù)處理能阻斷在SI行為上異亮氨酰噻唑烷誘導(dǎo)的NPY介導(dǎo)的抗焦慮樣效應(yīng)的增強和因此顯示1h喂養(yǎng)效應(yīng)是僅僅被阻斷Y1R的部分影響。
動物雄性WistarF/Han(WF)大鼠(中心動物實驗室，漢諾威醫(yī)學(xué)院，漢諾威，德國，細(xì)節(jié)見http/www.mh-hannover.de/institut/tierlabor/wf.htm)，體重330±31g±SD，飼養(yǎng)在隔音的，溫度控制的(24.0±0.5℃)房間，在無病原體的條件和12/12h暗/亮周期(亮在07.00，照度為80勒克司水平)。食物(Altromin實驗食物碎屑)和自來水可隨意獲得。在氯胺酮/甲苯噻嗪(100/5mg/kg，腹腔注射)麻醉下，大鼠被Kopf立體支架固定和在側(cè)腦室上方植入管子(Plastic one，Inc.，Roanoke，VA，USA)。所有的研究和動物保護(hù)程序被Lower Saxone地方政府(漢諾威，德國)認(rèn)可并遵從歐洲委員會的1986年11月24的會議指導(dǎo)(86/609/EEC)中所述的原則。
外科和腦室內(nèi)注射應(yīng)用對于外科，大鼠被麻醉和按象在別的地方(von Horsten等，1998a，b，c)細(xì)節(jié)描述的標(biāo)準(zhǔn)的立體方法用腦室內(nèi)注射管處理(坐標(biāo)A-0.7mm頭部，L前囟點外側(cè)1.4mm；和V頭顱表面腹側(cè)3.2mm；牙嵴在耳嵴上方+3.0)。7天恢復(fù)期后，血管緊張素飲水反應(yīng)(von Horsten等，1998a)確認(rèn)成功的腦室置管。表現(xiàn)出陽性飲水反應(yīng)的大鼠(n＝56)被然后通過每天假裝注射共7天來習(xí)慣于試驗操作。
動物被隨機(jī)地分成8個實驗組(n＝6-8/組)，來完成一個焦慮的SI實驗(1)aCSF+aCSF+aCSF；(2)BIBP+aCSF+aCSF；(3)aCSF+異亮氨酰噻唑烷+aCSF；(4)BIBP+異亮氨酰噻唑烷+aCSF；(5)aCSF+aCSF+NPY；(6)BIBP+aCSF+NPY；(7)aCSF+P32/89+NPY；(8)BIBP+異亮氨酰噻唑烷+NPY。每組中的動物在每一期按相同的方式處理，在行為實驗前-60分鐘和-55分鐘接受腦室內(nèi)注射。試驗跨度兩晚和組在兩個暗循環(huán)中平衡。套管被用近30cm的聚乙烯管連接于Hamilton微注射器，所有的化合物被用TSE多通道注射泵(BadHomburg，德國)按5.0μl/min的速度灌注。測定主動性社交活動花費的時間(SI時間)，1h和12h的食物攝取。
肽和拮抗物大鼠的神經(jīng)肽Y1-36從多肽實驗室(Wolfenbuttel，德國)獲得。NPY Y1受體拮抗物BIBP3226購自美國肽公司，Sunnyvale，美國(60-1-22B)。所有藥品溶解在無菌水中，終溶液用aCSF制成。
社交活動(SI)試驗SI試驗按File(1980)首次描述的進(jìn)行并已經(jīng)在實驗室中得到確認(rèn)(Kask，Nguyen，Pabst，yon Horsten，已投稿)。兩只大鼠，基因型和體重匹配，從home籠中取出和暴露在試驗環(huán)境中。活動場所是鋁制的四方的開放場所(50×50×50cm)，放置在一個聲音隔離的盒子里(Coulborun Instruments，Lehigh Valley，PA)。設(shè)備的細(xì)節(jié)見我們以前的研究(von Horsten等，1998c)。開放場所用紅的照相燈泡(Philips PF712E；1.3 Lux)照亮。大鼠對該設(shè)備不習(xí)慣。用一放置在試驗/隔離盒內(nèi)的場所上方的攝象機(jī)監(jiān)視行為。一個不知道大鼠亞系的觀察者(HPN)記錄下面的參數(shù)花費在嗅聞、跟隨、爬行在其他大鼠下面或上面的持續(xù)時間，但不包括非被動身體接觸(休息，睡覺)的時間。SI時間的增加被認(rèn)為是一種抗焦慮樣反應(yīng)。
數(shù)據(jù)分析從SI時間和1h食物攝取測定獲得的數(shù)據(jù)通過一組(因素“處理”)方差分析。另外，三個因素的(因素“拮抗物”，“抑制物”，“NPY”)的方差被進(jìn)行來確定普遍的結(jié)論(數(shù)據(jù)沒有顯示)。星號表示相對于aCSF+aCSF+aCSF(對照)的顯著的post hoc效應(yīng)，而“#”號表示Fisher’s PLSD獲得的Y1R拮抗物的處理相對于相應(yīng)的無拮抗物的處理的顯著差異。在post hoc比較的顯著性水平用星號(“*”＝p＜0.05；“**”＝p＜0.01；“***”＝p＜0.001)和用“#”符號(“#”＝p＜0.05；“##”＝p＜0.0l；“###”＝p＜0.001)表示。所有的數(shù)據(jù)用平均值±S.E.M.表示。
NPY Y1受體介導(dǎo)的在異亮氨酰噻唑烷預(yù)處理的SI實驗中NPY誘導(dǎo)的抗焦慮的增強聯(lián)合中樞性施用50nmol劑量的異亮氨酰噻唑烷和0.8nmol劑量的NPY戲劇性地增強了NPY在SI實驗中的抗焦慮樣效應(yīng)(圖10)。這個發(fā)現(xiàn)重復(fù)了相應(yīng)劑量顯示在圖7的觀察。在這個劑量的異亮氨酰噻唑烷半延胡索酸(p32/98)單獨處理沒有抗焦慮樣作用。然而，內(nèi)在的社會的研究的行為，NPY的抗焦慮樣效應(yīng)和聯(lián)合異亮氨酰噻唑烷+NPY治療誘導(dǎo)的增強的抗焦慮都被Y1受體阻斷物所拮抗。這表明了在CNS通過NPY Y1受體的焦慮水平的增強的調(diào)節(jié)和因此證實NPY的抗焦慮樣效應(yīng)和聯(lián)合治療的增強的抗焦慮都是通過Y1受體介導(dǎo)的。自發(fā)喂養(yǎng)和NPY誘導(dǎo)的喂養(yǎng)部分是通過Y1R介導(dǎo)的和異亮氨酰噻唑烷處理誘導(dǎo)的喂養(yǎng)的輕度的非顯著的增加是被Y1R拮抗物所阻斷(圖11)。
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權(quán)利要求
1.二肽基肽酶IV(DP IV或CD 26)或DP IV樣酶的抑制劑在生產(chǎn)用于調(diào)節(jié)針對包括焦慮在內(nèi)的應(yīng)激的行為學(xué)和/或神經(jīng)學(xué)適應(yīng)性反應(yīng)性的藥物中的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，其在于生產(chǎn)用于減少內(nèi)源性的、定位于CNS的神經(jīng)肽Y(NPY)以及其他具有類似特性的底物的降解的藥物。
3.前述權(quán)利要求中任一項的用途，其在于生產(chǎn)用于治療心身性、抑郁性和神經(jīng)精神性疾病的藥物。
4.權(quán)利要求3的用途，其特征在于所述心身性、抑郁性和神經(jīng)精神性疾病選自焦慮癥、抑郁癥、失眠、慢性疲勞、精神分裂癥、癲癇、進(jìn)食障礙、痙攣和慢性疼痛。
5.前述權(quán)利要求中任一項的用途，其特征在于所述抑制劑與神經(jīng)肽Y組合使用。
6.前述權(quán)利要求中任一項的用途，其特征在于所述抑制劑存在于一種具有生理學(xué)相容性的藥物載體中。
7.前述權(quán)利要求中任一項的用途，其特征在于所述抑制劑被配制為所述抑制劑的前體藥物。
8.前述權(quán)利要求中任一項的用途，其特征在于所述抑制劑通過腸道外、腸道內(nèi)、口服、吸入或作為栓劑而使用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于治療動物(包括人)的心身性、抑郁性和神經(jīng)精神性疾病的治療方法，所述疾病例如為焦慮、抑郁、失眠、精神分裂、癲癇、痙攣和慢性疼痛。施用一種適當(dāng)?shù)腄P IV抑制劑可導(dǎo)致哺乳動物腦內(nèi)的神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)的降解減少。該治療可減少或減緩具有功能活性的神經(jīng)元NPY(1－36)的濃度的下降。這導(dǎo)致內(nèi)源性NPY(1－36)的穩(wěn)定性增加，其結(jié)果是NPY的活性延長，從而導(dǎo)致NPY Y1受體活性選擇性地功能性活化，從而有益于抗抑郁、抗焦慮、止痛、抗高血壓以及其他的神經(jīng)學(xué)作用。
文檔編號A61P25/28GK1471393SQ01818067
公開日2004年1月28日 申請日期2001年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月27日
發(fā)明者斯特凡·馮霍斯特恩, 安茨·卡斯克, 漢斯-烏爾里?！さ履绿? 馬蒂亞斯·赫夫曼, 蘇珊·克魯貝爾, 阮胡復(fù), 克魯貝爾, 卡斯克, 斯 赫夫曼, 斯特凡 馮霍斯特恩, 詼 鏘！さ履綠 申請人:前體生物藥物股份有限公司