專利名稱：用于治療癌癥的e2f－1/細(xì)胞周期蛋白相互作用的抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的來說涉及一種新型的肽化合物，其可以抑制E2F-1細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白與細(xì)胞周期蛋白A的結(jié)合。本發(fā)明提供了新型化合物、新型組合物、它們的應(yīng)用方法以及制備方法，其中該類化合物一般是藥理學(xué)上有用的物質(zhì)，可以在治療中作為治療物質(zhì)，其作用機(jī)理是抑制E2F-1/細(xì)胞周期蛋白A的相互作用，更特別地是用于治療癌癥。
本發(fā)明的背景技術(shù)最近的研究證明E2F-1轉(zhuǎn)錄活性在細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)中有著重要的作用，特別是在G1/S相轉(zhuǎn)變期間起著重要的作用。其功能由G1細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cdks)所調(diào)控的Rb族蛋白質(zhì)控制著E2F族成員的活性。在人癌癥發(fā)展期間，這種控制途徑中各種組分的破壞是正常發(fā)生的事件。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期的進(jìn)展是由cdks的依次活化所驅(qū)動(dòng)的。Cdk活性又在轉(zhuǎn)移后的修飾中受到調(diào)控并且是通過與調(diào)節(jié)蛋白如細(xì)胞周期蛋白的相互作用而調(diào)控的。各細(xì)胞周期蛋白與所首選的cdks的子集結(jié)合，然后所形成的細(xì)胞周期蛋白-cdk復(fù)合體一般在細(xì)胞周期的特定時(shí)期內(nèi)一般表現(xiàn)出最高的激酶活性。
將對(duì)主體的毒性降到最低的一種癌癥治療方法是研制優(yōu)先殺死細(xì)胞周期途徑中發(fā)生了改變的細(xì)胞的藥物。使用體外的激酶結(jié)合抑制試驗(yàn)和體內(nèi)的生長抑制試驗(yàn)可以對(duì)治療癌癥用的化合物進(jìn)行鑒別，或者可進(jìn)一步用其為其它新的肽或非肽抑制劑的設(shè)計(jì)體提供一種骨架。
除了在細(xì)胞增殖中的作用外，近來一些觀測表明在細(xì)胞凋亡(程序細(xì)胞死亡)中也可能涉及E2F-1。具體地講，細(xì)胞周期蛋白A/cdk2對(duì)E2F-1 DNA-結(jié)合活性的抑制與依次進(jìn)行的S期進(jìn)展有關(guān)；破壞這種聯(lián)系可導(dǎo)致S期延遲和繼發(fā)細(xì)胞凋亡的細(xì)胞周期停止。因此，E2F-1/細(xì)胞周期蛋白A/cdk2復(fù)合體的破壞是抗腫瘤藥物研發(fā)的有吸引力的靶點(diǎn)。
建立了ELISA來鑒別E2F-1/細(xì)胞周期蛋白A相互作用的拮抗劑。這種方法是以三種蛋白，即E2F-1、細(xì)胞周期蛋白A和cdk2之間的相互作用為基礎(chǔ)的，并且是通過比色法來進(jìn)行分析的。用這種試驗(yàn)方法來測定生物學(xué)試驗(yàn)所用的各種合成肽的IC50值，并進(jìn)行SAR研究。
這些合成肽可被用作對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控進(jìn)行進(jìn)一步研究的研究工具或是用作制備新的結(jié)合(嵌合)肽或其它修飾的肽的中間體，并且在細(xì)胞生長抑制試驗(yàn)中進(jìn)行了測試。可以用能夠在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系中造成細(xì)胞生長抑制和細(xì)胞死亡的肽來對(duì)其腫瘤對(duì)該化合物有反應(yīng)的患者進(jìn)行癌癥治療，并且可將其用于癌癥患者的治療方案中。
發(fā)明概述本發(fā)明的化合物是包含選自通式Ia、Ib、Ic和Id的氨基酸序列的肽或其可藥用的鹽
其可抑制轉(zhuǎn)錄因子E2F-1與細(xì)胞周期蛋白A的相互作用。作為E2F-1/細(xì)胞周期蛋白A相互作用的拮抗劑，本發(fā)明的化合物可用于癌癥的治療中。在文獻(xiàn)中還沒有有關(guān)用環(huán)狀肽或非肽抑制E2F-1/細(xì)胞周期蛋白A相互作用的先例。
因此，本發(fā)明的目的是提供能抑制E2F-1/細(xì)胞周期蛋白A相互作用的化合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用式Ia-d的化合物來治療癌癥的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的還在于提供包含式Ia-d的化合物的藥物組合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的還在于提供一種用式Ia-d的化合物來在體外抑制E2F-1/細(xì)胞周期蛋白A相互作用的方法。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種分離的包含選自通式Ia、Ib、Ic和Id的氨基酸序列的肽及其可藥用的鹽
其中AA1選自(a)甘氨酸(Gly)，(b)丙氨酸(Ala)，(c)亮氨酸(Leu)，和(d)小的脂肪族氨基酸；AA2選自(a)苯丙氨酸(Phe)，(b)噻吩丙氨酸(Tha)，(c)環(huán)己基丙氨酸(Cha)，(d)酪氨酸(Tyr)，(e)吡啶基丙氨酸(Pya)，(f)色氨酸(Trp)，和(g)另一種芳族氨基酸；
AA3選自(a)Leu，(b)環(huán)丙基丙氨酸(Cpa)，和(c)一種天然或非天然的脂肪族氨基酸；AA4選自(a)賴氨酸(Lys)，(b)被C1-C17烷基、C5-C20芳基烷基或C6-C20芳基所取代的Lys，(c)被C1-C17烷基、C5-C20芳基烷基或C6-C20芳基所取代或未被取代的鳥氨酸(Orn)，和(d)被C1-C17烷基、C5-C20芳基烷基或C6-C20芳基所取代或未被取代的高賴氨酸(hLys)；AA5選自(a)精氨酸(Arg)，(b)Lys，(c)Orn，(d)hLys，和(e)組氨酸(His)；AA6選自(a)Lys，(b)hLys，(c)Orn，(d)其中Nε被一或兩個(gè)選自C5-C20烷基、直鏈或支鏈C1-C6基、環(huán)化的飽和或不飽和C5-C20烷基、C5-C20芳基烷基如苯甲基以及C6-C20芳基如苯基的基團(tuán)所取代的Lys，和(e)其中Nδ被一或兩個(gè)選自C5-C20烷基、直鏈或支鏈C1-C6酰基、環(huán)化的飽和或不飽和C5-C20烷基、C5-C20芳基烷基如苯甲基以及C6-C20芳基如苯基的基團(tuán)所取代的Orn；AA7選自(a)Ala，(b)纈氨酸(Val)，和(c)一種天然或非天然的氨基酸，或其擬似物或等排物；AA8選自(a)脯氨酸(Pro)，(b)一種天然或非天然的氨基酸，或其擬似物或等排物；且Cap不存在或優(yōu)選地是非限制性地選自(a)C1-C8?；?，和(b)C3-C8環(huán)烷基烷酰基或呋喃基乙?；?；該肽優(yōu)選連接到核定位肽序列上，其中所說的核定位肽序列是，例如但不僅限于HIV-1 Tat或觸角足(antennapedia)肽序列(penetratin)。符號(hào)(*)表示一個(gè)用于分子內(nèi)鍵合的位置。該分子內(nèi)鍵合是經(jīng)由一個(gè)酰胺鍵、取代的酰胺鍵或其等排物而進(jìn)行的。當(dāng)上述肽中的任何一種通過用星號(hào)標(biāo)明的(*)氨基酸進(jìn)行連接時(shí)，該化合物是環(huán)狀的5肽、6肽、7肽或8肽。與線性鏈肽相比，優(yōu)選環(huán)狀的肽。這些肽還可以是與其它所需氨基酸相連的聚氨基酸片段。各肽序列的N-末端可以以同樣的方式被一個(gè)“Cap”基團(tuán)所加帽。任何氨基酸都可以被其擬似物、等排物或類似物所代替。
優(yōu)選地，本發(fā)明涉及分離的包含選自通式Ia、Ib、Ic和Id的氨基酸序列的肽及其可藥用的鹽
其中AA1選自(a)Gly，(b)Ala，和(d)Leu；AA2選自(a)Phe，(b)Tha，(c)Cha，(d)Tyr，(e)Pya，和(f)Trp；AA3選自(a)Leu，(b)Cpa，和(c)一種天然的脂肪族氨基酸；AA4選自(a)Lys，(b)Orn，和(c)hLys；AA5選自(a)Arg，(b)Lys，
(c)Orn，(d)hLys，和(e)His；AA6選自(a)Lys，(b)hLys，(c)Orn；AA7選自(a)Ala，(b)Val，和(c)一種天然的氨基酸；AA8選自(a)Pro，(b)一種天然的氨基酸；且Cap不存在或優(yōu)選地選自(a)乙?；?Ac)、環(huán)丙基羰基、環(huán)丙基乙?；?Cpr)、新戊?；惐驶?、異丙基乙?；?，2-二甲基丁?；?Dmb)、乙酰丙?；h(huán)丙基甘氨?；?Cpg)、二甲基甘氨?；?Dmg)，和(b)環(huán)戊基乙?；?、環(huán)己基乙酰基、環(huán)庚基乙?；?、呋喃基乙?；?；該肽可以任選地連接于核定位肽序列HIV-1 Tat或觸角足肽序列(penetratin)上；并且符號(hào)(*)表示一個(gè)經(jīng)由酰胺鍵而進(jìn)行連接的任選的分子內(nèi)鍵合位置；所形成的化合物可以分別是環(huán)狀5肽、6肽、7肽或8肽。
本發(fā)明優(yōu)選化合物的實(shí)例非限制性地包括如下的化合物環(huán)狀5肽Ac-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，或Ac-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)；
環(huán)狀6肽Ac-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，Ac-Lys-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)，Cpr-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，Cpr-Lys-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)，Cpr-Lys-(C5-C20)-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)，Cpr-Lys-(C5-C20)-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，Cpr-Lys-(CH(CH3)(C13H27))-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)，[見實(shí)施例1]Dmb-Lys-(C5-C20)-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，或Dmb-Lys-(C5-C20)-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)；環(huán)狀7肽Ac-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，Ac-Ala-Lys-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)，Cpr-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，或Cpr-Ala-Lys-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)；環(huán)狀8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，[見實(shí)施例2]Ac-Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，Ac-Pro-Ala-Lys-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)，Cpr-Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，或Cpr-Pro-Ala-Lys-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)；其中的圓括號(hào)表示在環(huán)化中所涉及的殘基；以及它們可藥用的鹽。
本發(fā)明的化合物參照如下通式的八肽來進(jìn)行命名Cap-AA8-AA7-AA6-AA5-AA4-AA3-AA2-AA1其中“AAX”代表在從C-末端上的AA1開始的八肽中的“第x”(x＝1-8)位上的氨基酸。‘Cap’是一種連接于N-末端上的非氨基酸基團(tuán)。AA1是羧基末端殘基。命名是以如下的形式給出的氨基末端‘cap’，接著是第一殘基的三個(gè)字母代碼，然后是一個(gè)連字符和第二殘基的三個(gè)字母代碼，再然后是一個(gè)連字符和第三殘基的三個(gè)字母代碼，等等(三個(gè)字母代碼是標(biāo)準(zhǔn)的肽命名法參見氨基酸和肽命名法J.Biol.Chem 260，14-42以及IUPAC-IUB命名法推薦)。用可接受的命名來稱呼非天然的氨基酸。
這里所用的“肽”的定義在適宜的情況中還包括多肽。
這里所用的“烷基”包括具有特定碳原子數(shù)的直鏈和支鏈的飽和或不飽和脂肪族烴?！磅；北硎就ㄟ^-C(O)-橋相連的具有所標(biāo)明碳原子數(shù)目的烷基。
這里所用的“分離的”是指是如果其是天然存在的話則將該物質(zhì)從其原始環(huán)境例如自然環(huán)境中分離出來。
本發(fā)明的化合物是序列Ac-Pro-Ala-Lys-Arg-Lys-Leu-Phe-Gly的線性或環(huán)狀類似物。該線性序列是一些與細(xì)胞周期蛋白A進(jìn)行結(jié)合的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的共有序列，可有效抑制E2F-1與細(xì)胞周期蛋白A的結(jié)合。確定了許多可提供所需抑制活性水平的化合物。
最初所確定的序列如表1所示表I最初確定的序列
在這些序列中，測定了抑制E2F-1/細(xì)胞周期蛋白A相互作用所需的最小肽長度，并將其列于下面的表II中
表II線性和環(huán)狀類似物的IC50
該肽是在Lys*的氨基側(cè)鏈和Gly*的羧基之間進(jìn)行環(huán)化的。注意按照普遍接受的規(guī)則，在下文中將Pro-Ala-Lys-Arg-Lys-*Leu-Phe-Gly*用Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)表示，其中，括號(hào)內(nèi)的殘基是涉及成環(huán)的殘基。獲得有效抑制作用所需的最小序列是5-8個(gè)殘基。該環(huán)狀類似物一般是比相應(yīng)的線性類似物好50-100倍的抑制劑。在共有序列——Pro8-Ala7-Lys6-Arg5-Lys4-Leu3-Phe2-Gly1中抑制E2F-1/細(xì)胞周期蛋白A相互作用所需的關(guān)鍵殘基是Lys6、Arg5、Leu3以及Phe2。最佳的活性肽是該環(huán)化的共有序列，但是，Pro8、Ala7和/或Lys6可以被其它的氨基酸、擬似物、等排物或類似物代替。在Lys6的情況中，其可以用其它的胺和硫醇代替，如可用半胱氨酸(Cys)、5-氨基戊酸、6-氨基己酸以及乙酰丙酸所代替。其還可以被hLys、Orn或帶有Nε的Lys和帶有Nδ取代基的Orn所代替，所述取代基是C5-C20線性或支鏈、直鏈或環(huán)化的飽和或不飽和烷基，或可以被C6-C20芳基如苯基、C5-C20芳基烷基如苯甲基或Arg所代替。Ala7可以被Pro、直鏈或支鏈?；妗?br> 在Arg5的情況中，雖然該肽中可以有Arg擬似物、等排物或類似物，但是對(duì)Arg5的替換對(duì)活性不利。Leu3對(duì)于活性而言很關(guān)鍵。Phe2的存在也很關(guān)鍵，雖然其也可以有其它的擬似物、等排物或類似物，優(yōu)選芳基或疏水性基團(tuán)。Gly1是環(huán)狀肽所需要的。
在環(huán)狀8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)中關(guān)鍵殘基的鑒別為了評(píng)估環(huán)狀8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)中各氨基酸在與細(xì)胞周期蛋白A結(jié)合中的作用，將各氨基酸用一種等排物進(jìn)行替換，然后用體外ELISA來測定抑制活性。
A.苯丙氨酸(Phe，F(xiàn))的替換用各種Phe等排物來合成一些環(huán)狀8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)的類似物并對(duì)它們的活性進(jìn)行測定。數(shù)據(jù)表明所用的所有Phe的氨基酸等排物都不能增加原始的先導(dǎo)物環(huán)狀8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)的活性。但是，可用非天然的氨基酸如Tha和Cha代替Phe而不會(huì)使該環(huán)狀8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)的活性有很大降低。
B.亮氨酸(Leu，L)的替換用各種Leu等排物來合成一些環(huán)狀8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)的類似物并對(duì)它們的活性進(jìn)行測定。所得結(jié)果表明用于替換Leu的所有氨基酸等排物都不會(huì)使原始的先導(dǎo)物2的活性增加。但是，可用非天然的氨基酸如Cpa替換Leu而不會(huì)使活性降低。
C.抑制作用所需最小序列的鑒別環(huán)狀肽是通過從環(huán)狀8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)的N-末端上依次除去氨基酸，然后用一個(gè)乙?；舛藖磉M(jìn)行合成的，然后在體外ELISA中對(duì)這些肽的抑制活性進(jìn)行分析(表III)。E2F-1/細(xì)胞周期蛋白A相互作用所需的絕對(duì)最小序列是環(huán)狀6肽，4。
表III各種肽的IC50
將4的乙酰基用一些其它的?；M(jìn)行替換，并且在ELISA中對(duì)各種類似物的活性進(jìn)行測定。將乙酰基用異丙基羰基、異丙基乙酰基-、新戊酰基-、環(huán)丙基羰基、環(huán)丙基乙?；?進(jìn)行替換得到與環(huán)狀8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)等效的6肽類似物。這種對(duì)第二個(gè)疏水性袋狀殘基的處理可以從環(huán)狀8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)上除去兩個(gè)氨基酸而不會(huì)喪失抑制活性。
本發(fā)明的化合物可以用蛋白質(zhì)合成的標(biāo)準(zhǔn)方法，用其組成的氨基酸來進(jìn)行制備，其中所說的蛋白質(zhì)合成的標(biāo)準(zhǔn)方法為例如Schroeder等人，“肽”，第I卷，Academic Press，1965，或Bodanszky等人，“肽合成”，IntersciencePublishers 1966，或McOmie(ed.)，“有機(jī)化學(xué)中的保護(hù)基”，Plenum Press1973，以及“肽、分析、合成、生物學(xué)”2，第1章，George Barany和R.B.Merrifield，Academic Press，1980，紐約。
兩個(gè)氨基酸或一個(gè)氨基酸和一個(gè)肽以及兩個(gè)肽的縮合可以用常用的縮合方法來進(jìn)行，如疊氮化物法，混合酸酐法、碳二亞胺法、活性酯法(對(duì)-硝基苯基酯法、BOP[苯并三唑-1-基氧基-三-(二甲基氨基)-磷鎓六氟磷酸鹽]法、N-羥基琥珀酸亞氨基酯法等等)、伍德沃德試劑K法或HBTU法。在固相法中將肽鏈延長的情況中，將該肽在C末端氨基酸的位置上連接一種不溶性的載體。對(duì)于不溶性的載體而言，可以使用可與該C-末端氨基酸的羧基進(jìn)行反應(yīng)從而形成一個(gè)以后易于裂解的鍵的物質(zhì)，例如，可以使用一種鹵代甲基樹脂如氯甲基樹脂和溴甲基樹脂、羥基甲基樹脂、氨基甲基樹脂、對(duì)-羥基甲基苯基乙酰胺(PAM)樹脂、二苯甲基胺樹脂、叔烷氧基羰基-酰肼樹脂或SASRIN、Wang樹脂或三苯甲基樹脂。
肽化學(xué)合成的共同之處在于用適宜的保護(hù)基團(tuán)對(duì)各種氨基酸部分的反應(yīng)性側(cè)鏈在需要保護(hù)的部位進(jìn)行保護(hù)，直至該鏈被完全組裝好后才最終除去該保護(hù)基團(tuán)。共同之處還在于氨基酸或片段上α-氨基的保護(hù)，從而可以在羧基上進(jìn)行實(shí)體反應(yīng)然后選擇性地除去該α-氨基保護(hù)基以使得該位置上發(fā)生后面的反應(yīng)。因此，作為合成中的共同步驟，生產(chǎn)了一種中間體化合物，其包括位于帶有這些具有側(cè)鏈保護(hù)基的各種殘基的肽鏈的所需序列中的各氨基酸殘基。然后，通常基本上同時(shí)除去這些保護(hù)基以制備出所需產(chǎn)物，隨后進(jìn)行純化。
適于保護(hù)該α-和ω-側(cè)鏈氨基的保護(hù)基團(tuán)有，例如芐氧基羰基、異煙酰氧基羰基(iNOC)、鄰-氯芐氧基羰基、對(duì)-硝基芐氧基羰基、對(duì)-甲氧基芐氧基羰基、叔-丁氧基羰基(Boc)、叔戊氧基羰基(Aoc)、異冰片氧基羰基、金剛烷氧基羰基、2(4，4-聯(lián)苯)-2-丙氧基羰基(Bpoc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、甲基磺酰基乙氧基羰基(Msc)、三氟乙酰基、鄰苯二酰、甲?；?-硝基苯基硫(NPS)、二苯基硫膦基(Ppt)、二甲基硫膦基(Mpt)等等。
作為羧基的保護(hù)基團(tuán)，可以列舉的實(shí)例有例如苯甲基酯(Bzl)、叔-丁基環(huán)酯(t-Bu)、4-吡啶基甲基酯(OPic)等等。希望在必要時(shí)用適宜的保護(hù)基團(tuán)將特定氨基酸所具有的除氨基和羧基外的其它功能基保護(hù)起來，其中所說的特定氨基酸為例如Arg、Cys和絲氨酸(Ser)。例如Arg中的胍基可以用硝基、對(duì)-甲苯磺?；⑵S氧基羰基、金剛烷氧基羰基、對(duì)-甲氧基苯磺酰基、4-甲氧基-2，6-二甲基苯磺?；?Mds)、1，3，5-三甲基苯磺?；?Mts)、2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基(PBF)、三苯甲基等等來進(jìn)行保護(hù)。在半胱氨酸中的巰基可以用對(duì)-甲氧基苯甲基、三苯基甲基、乙?；被谆⒁一被柞；?-甲基苯甲基、2，4，6-三甲基苯甲基(Tmb)等等來進(jìn)行保護(hù)，在Ser中的羥基可以用苯甲基、叔-丁基、乙酰基、四氫吡喃基等等來進(jìn)行保護(hù)。
Stewart和Young在“固相肽合成”，Pierce Chemical Company，Rockford，III.(1984)中給出了有關(guān)肽制備的詳細(xì)信息。α-氨基的保護(hù)在第14-18頁進(jìn)行了描述，側(cè)鏈阻斷在第18-28頁進(jìn)行了描述。在第149-151頁上給出了用于胺、羥基和巰基官能團(tuán)的保護(hù)基的表格。這些描述在這里被引入作為參考。
本發(fā)明的肽還可以用制造商所提供的方案用自動(dòng)的肽合成儀來進(jìn)行制備，其中所說的自動(dòng)的肽合成儀為例如Beckman，Applied BiosystemsInc.，或使用采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案的Milligen Co.An Applied BiosystemsABI 433A肽合成儀。所需的氨基酸衍生物和樹脂通過商業(yè)來源購得。反相HPLC用市售的HPLC系統(tǒng)在YMC C18柱上進(jìn)行，使用乙腈/0.1％TFA水溶液的線性梯度洗脫。在215、230、254和280nm對(duì)洗脫進(jìn)行監(jiān)測。用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)經(jīng)過提純的肽進(jìn)行分析。用在DMF中的熒光黃-5-馬來酰亞胺和DIEA(4當(dāng)量)在肽的Cys殘基上對(duì)該肽用熒光黃進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明的化合物可以根據(jù)如下的實(shí)施例或其變體用易于獲得的起始材料、試劑和常規(guī)的合成方法來容易地進(jìn)行制備。在這些反應(yīng)中，其還可進(jìn)行各種變型，這些變型對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言都是公知的，在這里不再進(jìn)行詳細(xì)的描述。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種抑制E2F-1細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白與細(xì)胞周期蛋白A結(jié)合的方法，該方法包括給需要進(jìn)行該種治療的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的本發(fā)明的肽或其可藥用的鹽。
本發(fā)明的肽及其可藥用的鹽抑制E2F-1細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白與細(xì)胞周期蛋白A結(jié)合的能力可以用這三種蛋白，即E2F-1、細(xì)胞周期蛋白A和cdk2之間的相互作用為基礎(chǔ)的ELISA來進(jìn)行證實(shí)。這種試驗(yàn)可測定用于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)或SAR研究的各種合成肽的IC50值。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療癌癥的方法，該方法包括給需要進(jìn)行該種治療的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的本發(fā)明的肽或其可藥用的鹽。
本發(fā)明還包括用于抑制E2F-1細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白與細(xì)胞周期蛋白A的結(jié)合的藥物組合物，該藥物組合物包含可藥用的載體或稀釋劑和治療有效量的本發(fā)明的肽或其可藥用的鹽。
本發(fā)明還提供了用于哺乳動(dòng)物的治療方法中的本發(fā)明的肽或其可藥用的鹽。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含本發(fā)明的肽或其可藥用的鹽和可藥用載體的藥物組合物。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于治療哺乳動(dòng)物癌癥的藥物組合物，該藥物組合物包含治療有效量的本發(fā)明的肽或其可藥用的鹽和可藥用的載體。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的肽或其可藥用的鹽在制備用于治療癌癥的藥物組合物中的用途。
本發(fā)明還進(jìn)一步涉及本發(fā)明的肽或其可藥用的鹽在治療癌癥中的用途。
本發(fā)明的化合物可以以可藥用鹽的形式來進(jìn)行給藥。術(shù)語“可藥用的鹽”是指所有可接受的鹽，如醋酸鹽、乳糖酸鹽、苯磺酸鹽、月桂酸鹽、苯甲酸鹽、realate、碳酸氫鹽、馬來酸鹽、硫酸氫鹽、扁桃酸鹽、酒石酸氫鹽、甲磺酸鹽、硼酸鹽、溴化物、甲基硝酸鹽、乙二胺四乙酸鈣鹽、甲基硫酸鹽、樟腦磺酸鹽、粘酸鹽、碳酸鹽、萘磺酸鹽、氯化物、硝酸鹽、棒酸鹽、N-甲基葡糖胺、枸櫞酸鹽、銨鹽、二鹽酸鹽、油酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、草酸鹽、乙二磺酸鹽、雙羥萘酸鹽(撲酸鹽)、丙酸酯十二烷基硫酸鹽、棕櫚酸鹽、乙磺酸鹽、泛酸鹽、延胡索酸鹽、磷酸鹽/二磷酸鹽、葡庚糖酸鹽、聚半乳糖醛酸鹽、葡萄糖酸鹽、水楊酸鹽、谷氨酸鹽、硬脂酸鹽、乙醇酰對(duì)氨基苯胂酸鹽、硫酸鹽、己基間苯二酚鹽、堿式乙酸鹽、哈胺鹽、琥珀酸鹽、氫溴酸鹽、單寧酸鹽、鹽酸鹽、酒石酸鹽、羥基萘甲酸鹽、8-氯茶堿鹽、碘化物、甲苯磺酸鹽、異硫代硫酸鹽、乳酸鹽、panoate、戊酸鹽等等，這些鹽可以以劑型的形式被應(yīng)用，以改變?nèi)芙舛然蛩馓匦?，或者可以以緩釋或前體藥物制劑的形式被應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明化合物的特定官能團(tuán)，本發(fā)明化合物的可藥用鹽包括那些由陽離子所形成的鹽和由堿所形成的鹽，其中所說的陽離子如鈉、鉀、鋁、鈣、鋰、鎂、鋅，所說的堿如氨、乙二胺、N-甲基谷酰胺、賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、膽堿、N，N′-二苯甲基乙二胺、氯普魯卡因、二乙醇胺、普魯卡因、N-苯甲基苯乙胺、二乙胺、哌嗪、三-(羥基甲基)氨基甲烷以及氫氧化四甲基銨。
這些鹽可以用標(biāo)準(zhǔn)的方法來進(jìn)行制備，例如通過將游離酸與適宜的有機(jī)或無機(jī)堿進(jìn)行反應(yīng)來進(jìn)行制備。在存在堿性基團(tuán)如氨基的情況中，可以用酸鹽，即鹽酸鹽、氫溴酸鹽、三氟醋酸鹽、醋酸鹽、雙羥萘酸鹽等等作為劑型。
在存在酸性基團(tuán)(-COOH)或醇基團(tuán)的情況中，還可以使用可藥用的酯，例如醋酸酯、馬來酸酯、新戊酰氧基甲基酯等等，這些酯在現(xiàn)有技術(shù)中已知可改善溶解度或水解特性，可用作緩釋或前體藥物制劑。
本發(fā)明的化合物或其衍生物除了那些在式Ia-d中對(duì)其立體化學(xué)進(jìn)行了描述的中心外還可以具有其它手性中心，從而其可以以外消旋體、外消旋混合物的形式以及各旋光對(duì)映體或非對(duì)映異構(gòu)體的形式存在，所有這些同分異構(gòu)形式及其混合物都被包括在本發(fā)明中。此外，本發(fā)明化合物或其衍生物的一些結(jié)晶可以以多晶型物的形式存在，其也包括在本發(fā)明中。此外，本發(fā)明的一些化合物可以與水或常用的有機(jī)溶劑形成溶劑化物。該類溶劑化物也屬于本發(fā)明的范疇。
術(shù)語“治療有效量”是指能引起組織、系統(tǒng)、動(dòng)物或人的生物學(xué)或醫(yī)學(xué)反應(yīng)的藥物或藥用物質(zhì)的數(shù)量，該數(shù)量由研究人員、獸醫(yī)、醫(yī)生或其它臨床醫(yī)師來確定，所說的生物學(xué)或醫(yī)學(xué)反應(yīng)包括所治療疾病癥狀的緩解。本發(fā)明的新治療方法用于本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的病癥。
術(shù)語“哺乳動(dòng)物”包括人。
根據(jù)各種因素來對(duì)使用本發(fā)明化合物的劑量方案進(jìn)行選擇，其中所說的各種因素包括患者的類型、種屬、年齡、體重、性別和身體情況；所治療病癥的嚴(yán)重程度；給藥途徑；患者的腎功能和肝功能；以及其所使用的特定化合物。普通的醫(yī)生或獸醫(yī)可以容易地開出預(yù)防、對(duì)抗或阻止疾病進(jìn)展所需的藥物有效量。獲得在起效而不產(chǎn)生毒性的范圍內(nèi)的藥物濃度的最佳精確度需要一種以靶部位藥物生物利用度的動(dòng)力學(xué)為基礎(chǔ)的方案。這包括要考慮藥物的分布、平衡以及消除情況。
每個(gè)成人每天所用的該產(chǎn)品的日劑量可以在0.01至500mg的范圍內(nèi)變化。對(duì)于口服給藥而言，該組合物優(yōu)選地以包含0.01至500mg活性成分的片劑的形式被提供，該片劑優(yōu)選包含0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0或50.0mg的活性成分，根據(jù)癥狀對(duì)所治療患者的劑量進(jìn)行調(diào)整。藥物的有效量可以通過每天約0.001mg/kg體重至約50mg/kg體重的劑量來獲得。該范圍特別是每天約0.01mg/kg體重至10mg/kg體重。
對(duì)于癌癥的治療而言，本發(fā)明的化合物可以與用于治療癌癥的已知物質(zhì)一起使用。
對(duì)于使用一種以上的活性物質(zhì)的聯(lián)合治療而言，在活性物質(zhì)在不同制劑中的情況中，這些活性物質(zhì)可以同時(shí)給藥，或其可以各自獨(dú)立地在錯(cuò)開的時(shí)間進(jìn)行給藥。
本發(fā)明的化合物可以在載體或陪伴載體中進(jìn)行口服給藥、靜脈內(nèi)給藥、鞘內(nèi)給藥或通過非腸道的方式來進(jìn)行給藥，從而將該化合物有效地傳遞到體內(nèi)的靶部位。
本發(fā)明的目的還在于提供用于本發(fā)明新型治療方法中的適宜的口服、全身和非腸道的藥物制劑?！爸委煛钡亩x包括改善癥狀和/或阻止已知患有癌癥或認(rèn)為其患有癌癥的個(gè)體的癌癥進(jìn)程?；衔锏摹敖o藥”是指將一種本發(fā)明的化合物或本發(fā)明化合物的前體藥物給予需要進(jìn)行治療的患者。治療上述病癥所用的包含作為活性成分的本發(fā)明化合物的組合物可以在全身給藥用的常規(guī)賦形劑中以各種治療劑型來進(jìn)行給藥。例如，該化合物可以以口服劑型如片劑、膠囊(各自還分別包括定時(shí)釋放制劑和緩釋制劑)、丸劑、粉末、顆粒劑、酏劑、酊劑、溶液、混懸劑、糖漿和乳劑的形式來進(jìn)行給藥，或可以通過注射來進(jìn)行給藥。它們還可以以靜脈內(nèi)給藥(包括推注和輸液)、腹膜內(nèi)給藥、鞘內(nèi)給藥、皮下給藥、閉合或不閉合的局部給藥或肌內(nèi)給藥的形式來進(jìn)行給藥，所有的應(yīng)用形式對(duì)于藥學(xué)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言都是眾所周知的。
在本發(fā)明的方法中，這里所詳細(xì)描述的化合物可以形成該活性成分，并且一般是以與適宜的藥用稀釋劑或賦形劑形成的混合物的形式來進(jìn)行給藥，所說的稀釋劑或賦形劑可以根據(jù)給藥的形式來適宜的進(jìn)行選擇，即可以根據(jù)口服片劑、膠囊、酏劑、糖漿等等來進(jìn)行選擇，并且與常規(guī)的藥學(xué)實(shí)踐相一致。
例如，對(duì)于片劑或膠囊的口服給藥形式而言，該活性藥物成分可以與一種口服的無毒可藥用的惰性載體如乙醇、甘油、水等合用。此外，當(dāng)需要或必需使用時(shí)，還可以向該混合物中加入適宜的粘合劑、潤滑劑、崩解劑和著色劑。適宜的粘合劑非限制性地包括淀粉、明膠、天然的糖如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味劑、天然膠和合成膠如阿拉伯膠、黃蓍膠或海藻酸鈉、羧甲基纖維素、聚乙二醇、蠟等等。在這些劑型中所用的潤滑劑非限制性地包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、醋酸鈉、氯化鈉等等。崩解劑非限制性地包括淀粉、甲基纖維素、瓊脂、膨潤土、黃原膠等等。
液體在適當(dāng)矯味的助懸劑或分散劑如合成膠和天然膠，例如黃蓍膠、阿拉伯膠、甲基纖維素等中形成?？梢允褂玫钠渌稚┌ǜ视偷鹊?。對(duì)于非腸道給藥而言，需要無菌的混懸液和溶液。當(dāng)需要進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥時(shí)，通常使用包含適宜防腐劑的等滲制劑。
本發(fā)明的化合物還可以以脂質(zhì)體傳遞系統(tǒng)如小單層囊、大單層囊和多層囊的形式進(jìn)行給藥?？梢杂酶鞣N磷脂來形成脂質(zhì)體，如膽固醇、硬脂胺或磷脂酰膽堿。
本發(fā)明的化合物可以與一些可生物降解的聚合物合用以便于實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物的控制釋放，所說的聚合物為例如聚乳酸、聚ε己內(nèi)酯、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚縮醛、聚二氫吡喃、聚氰基丙烯酸酯和交聯(lián)或兩親性的水凝膠嵌段共聚物。
常規(guī)方法在下面實(shí)施例中所給出的所有溫度均為攝氏度。除非特別說明，所有從商業(yè)上獲得的化合物在使用時(shí)都不需要進(jìn)行進(jìn)一步的純化。當(dāng)沒有特別說明時(shí)，天然和非天然的氨基酸都是(L)構(gòu)型。
肽合成肽是用Applied Biosystems ABI433A肽合成儀，用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc方案來組裝的。氨基酸衍生物和樹脂購自Bachem Bioscience和MidwestBiotech。反相HPLC使用采用YMC C18柱的Waters HPLC系統(tǒng)，用乙腈/0.1％TFA水溶液來進(jìn)行線性梯度洗脫。在215、230、254和280nm下對(duì)洗脫進(jìn)行監(jiān)測。用質(zhì)譜T(SCIEX API III質(zhì)譜儀)對(duì)進(jìn)行了純化的肽進(jìn)行分析。
在表IV和V中列出了通常所用縮寫的實(shí)例表IV在本文中所用的縮寫
表V通用的單氨基酸代碼
生物學(xué)試驗(yàn)測定特定的肽對(duì)腫瘤細(xì)胞生長抑制的材料和方法細(xì)胞系(表VI)將MDA-MB-435、U2OS、A549、MDA-MB-231細(xì)胞在另外添加了10％FCS的DMEM中培養(yǎng)。將SW480和HCT-116在另外添加了10％FCS的RPMI 1640中培養(yǎng)。
表VI在試驗(yàn)中所用的人細(xì)胞系
*所有的細(xì)胞系都得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD。
肽處理和熒光顯微鏡檢查以4×104細(xì)胞/孔的數(shù)量將細(xì)胞在48孔板中用10％FCS培養(yǎng)過夜。棄去培養(yǎng)介質(zhì)，然后將細(xì)胞用Opti-MEM洗滌一次。將該細(xì)胞的單分子層在37℃下用各種濃度的肽溶液培養(yǎng)24小時(shí)。對(duì)于用熒光黃進(jìn)行了標(biāo)記的肽的檢測而言，將細(xì)胞用PBS(pH＝7.3)清洗一次，然后用熒光顯微鏡(Axiovert 135，320倍)目測檢驗(yàn)。
生長抑制作用的評(píng)估以3×103細(xì)胞/孔的數(shù)量將細(xì)胞在96孔板中用10％FCS培養(yǎng)過夜。棄去培養(yǎng)介質(zhì)，然后將細(xì)胞用Opti-MEM洗滌一次。將該細(xì)胞的單分子層在37℃下用各種濃度的肽溶液進(jìn)行培養(yǎng)。用由3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓；MTS(得自Promega)和吩嗪硫酸二甲酯；PMS(得自Sigma)所組成的溶液對(duì)生長抑制作用進(jìn)行評(píng)估。在24小時(shí)后，計(jì)算將生長抑制50％所需的濃度(IC50)。
肽Tat-肽是在Applied Biosystems 433A肽合成儀上通過固相化學(xué)過程來進(jìn)行合成的。將肽用熒光黃馬來酰亞胺在它們的半胱氨酸殘基上進(jìn)行標(biāo)記。Penetratin-肽是用可以獲得的技術(shù)來進(jìn)行合成的。肽的氨基酸序列如表VII所示。
表VII各種肽的序列
在將氨基酸用其通用的單氨基酸代碼表示的情況中，F(xiàn)lu是熒光黃，Mal是馬來酰亞氨基，X是Gly或Gly-Gly連接體。
結(jié)果E2F-1/細(xì)胞周期蛋白A結(jié)合抑制作用。因?yàn)閬碜訣2F-1的8-殘基肽(87-94)可以破壞細(xì)胞周期蛋白A-cdk2復(fù)合體與E2F-1和p21的結(jié)合，所以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中引入這些肽可以提供一種評(píng)估使E2F-1/細(xì)胞周期蛋白A雜二聚體滅活的生理學(xué)后果的方法。已經(jīng)證實(shí)得自HIV-tat 47-56或由果蠅觸角足同源結(jié)構(gòu)域蛋白的第三螺旋獲取的16個(gè)氨基酸殘基的內(nèi)化序列(表VII)可以通過生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)。將Tat序列連接到E2F-1Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Leu-Asp-Leu、環(huán)化的共有系列Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)或雜亂的線性8肽上以生成Tat-線性、Tat-環(huán)狀或Tat-mt。對(duì)penetratin系列進(jìn)行相同的命名(表VII)。測定了這些融合肽對(duì)E2F-1/細(xì)胞周期蛋白A結(jié)合的抑制活性。Tat-線性、Tat-環(huán)狀和penetratin-線性在0.1-1μM的范圍內(nèi)對(duì)E2F-1/細(xì)胞周期蛋白A結(jié)合試驗(yàn)表現(xiàn)出50％的抑制作用。
該IC50值比那些未進(jìn)行核定位序列融合的物質(zhì)高約1-100倍。相反，Tat、雜亂的-Tat或penetratin肽在高至100μM時(shí)仍未表現(xiàn)出抑制作用。用體外轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)進(jìn)行的GST-破壞試驗(yàn)獲得了類似的結(jié)果。
Tat肽的攝取和細(xì)胞內(nèi)區(qū)室化對(duì)用熒光黃馬來酰亞胺在半胱氨酸殘基上進(jìn)行了標(biāo)記的Tat-mt肽的內(nèi)化進(jìn)行了研究。用質(zhì)譜對(duì)進(jìn)行了標(biāo)記的肽進(jìn)行檢驗(yàn)并在使用前用HPLC進(jìn)行純化。當(dāng)加入到MDA-MB-435細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)最優(yōu)介質(zhì)中時(shí)，在僅僅培養(yǎng)30分鐘后，該肽就可以主要從帶有核仁積聚物的核中進(jìn)行回收。我們通過將骨肉瘤U2OS細(xì)胞用30和100μM的肽培養(yǎng)24小時(shí)而進(jìn)一步的重復(fù)了該實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明對(duì)核100％的滲透。在直接用熒光黃馬來酰亞胺進(jìn)行標(biāo)記后，在相同的條件下對(duì)該肽進(jìn)行了試驗(yàn)。與Tat-肽相比，發(fā)現(xiàn)在內(nèi)化肽的數(shù)量和定位上沒有變化。
生長抑制作用。當(dāng)將U2OS不同時(shí)期的培養(yǎng)物用Tat-線性或Tat-環(huán)狀進(jìn)行處理時(shí)，在處理后約3小時(shí)開始并且其后一直持續(xù)，該細(xì)胞采用了一種圓形的形態(tài)。正如在環(huán)狀肽的情況中具有更顯著作用的MTS試驗(yàn)所測定的那樣，它們表現(xiàn)出劑量依賴性的抑制作用。正如用線性肽進(jìn)行了處理的細(xì)胞那樣，該作用對(duì)于融合的肽具有特異性，環(huán)狀物(沒有另外的核定位序列)沒有表現(xiàn)出任何形態(tài)學(xué)上的改變。類似地，引入Tat本身或具有雜亂的或不相關(guān)序列的Tat融合肽也不會(huì)造成任何形態(tài)學(xué)的改變，并且MTS讀數(shù)高至300μM。其它的細(xì)胞類型，如MDA-MB435、MDA-MB231乳癌細(xì)胞、HCT-116、SW480結(jié)腸癌細(xì)胞、WI38/V A13 SV40轉(zhuǎn)化的肺成纖維細(xì)胞也對(duì)Tat-線性和環(huán)狀肽敏感，而Rat1和HeCat除外。當(dāng)向A549肺癌細(xì)胞和其它的腫瘤細(xì)胞類型中引入penetratin-wt序列時(shí)可以觀察到類似的抑制作用。
計(jì)算不同肽的IC50值并將其概括的列于表VIII中。在細(xì)胞中，Tat-環(huán)狀肽比Tat-線性肽更有效，這與它們的體外IC50值是一致的。此外，腫瘤細(xì)胞系受到的抑制比無限增殖化正常細(xì)胞系所受到的抑制作用更強(qiáng)。正如前面的免疫印跡法所表現(xiàn)出來的那樣，腫瘤細(xì)胞中E2F-1的內(nèi)源性基礎(chǔ)水平可能更高。
表VIII各種肽的IC50(μM)
*NT，未進(jìn)行試驗(yàn)各種肽對(duì)E2F-1/細(xì)胞周期蛋白A/cdk2結(jié)合的抑制作用為了評(píng)估與細(xì)胞周期蛋白A結(jié)合所需的最小序列，制備出各種長度的肽并對(duì)其在E2F-1/細(xì)胞周期蛋白A/cdk2 ELISA中的抑制活性進(jìn)行了試驗(yàn)。環(huán)狀8肽和環(huán)狀6肽的IC50值分別為1nM和20nM。但是，環(huán)狀5肽的IC50值為3μM，或比環(huán)狀8肽高2個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，6個(gè)氨基酸的肽似乎是活性肽所需的最小長度。此外，環(huán)狀肽比相應(yīng)的線性肽更有效。
ELISA將Nunc Immulon II ELISA板用250μL 4mg/mL在碳酸氫鹽緩沖液中的抗-GST抗體(Pharmacia Biotech)進(jìn)行涂布并在4℃下放置一夜。在用由50mM Tris(pH＝7.5)、0.15M NaCl和0.01％Tween-20(TBST)所組成的緩沖液對(duì)其洗滌五次后，用300μL由50mM HEPES(pH＝7.5)、0.15MNaCl、0.1％Triton X-100和5％牛血清白蛋白(BSA)所組成的試驗(yàn)緩沖液對(duì)其非特異性部位進(jìn)行阻斷。然后將板用TBST洗滌五次，吸氣干燥，然后用100μL在TBS中的GST-E2F-1(25nM)進(jìn)行處理。將GST-E2F-1在室溫下培養(yǎng)至少1小時(shí)，非特異性結(jié)合(NSB)對(duì)照孔接受不含蛋白的試驗(yàn)緩沖液。然后將板用TBST洗滌五次，將用試驗(yàn)緩沖液進(jìn)行稀釋的多種試驗(yàn)化合物濃度與用試驗(yàn)緩沖液稀釋的5nM細(xì)胞周期蛋白A/cdk2共同進(jìn)行培養(yǎng)。在將其加到試驗(yàn)板之前，通過將兩種蛋白以1∶1的比例在4℃下混合30分鐘來新制備該細(xì)胞周期蛋白A/cdk2復(fù)合體。在室溫下培養(yǎng)2小時(shí)后，將板用TBST洗滌五次，然后向所有的孔中加入100μL用試驗(yàn)緩沖液進(jìn)行了稀釋的兔子抗-cdk2抗體(Santa Cruz)的1∶500稀釋液。將其在室溫下培養(yǎng)半小時(shí)，將該板用TBST洗滌五次，吸氣干燥，然后通過加入100μL在枸櫞酸鈉緩沖液(pH＝4.2)中所制備的HRP底物ABTS而使其顯影，用微板讀數(shù)器在405nm下讀取吸光度。
雖然已經(jīng)參考其某些特定的實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述和解釋，但現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)人員顯然可以對(duì)其進(jìn)行各種改變、修飾和替換而不會(huì)脫離本發(fā)明的主旨和范圍。例如，對(duì)于本發(fā)明上述化合物的任何適應(yīng)癥而言，除了上述特定的劑量外，還可以根據(jù)所治療哺乳動(dòng)物的響應(yīng)能力的變化而使用有效的劑量。同樣，所觀察到的特定藥理學(xué)反應(yīng)可以根據(jù)并依賴于所選擇的特定活性化合物、是否存在藥用載體以及制劑類型和所用給藥方式而進(jìn)行變化，并根據(jù)本發(fā)明的目標(biāo)和實(shí)踐來考慮結(jié)果中該類可預(yù)期的變化或差異。因此，將用下面的權(quán)利要求對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行定義，并合理地對(duì)該類權(quán)利要求進(jìn)行盡可能寬的解釋。
實(shí)施例1環(huán)狀6肽Cpr-Lys-(CH(CH3)(C13H27))-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)的合成該環(huán)狀6肽的合成利用商業(yè)上可獲得的Fmoc-Gly-SASRIN樹脂作為起始點(diǎn)。將該6肽的鏈在‘C’至‘N’方向上通過依次用25％的哌啶脫保護(hù)然后與Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Lys(Mtt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Lys(Dde)-OH進(jìn)行由HBTU介導(dǎo)的偶聯(lián)來進(jìn)行加工，最后與環(huán)丙烷甲酸進(jìn)行偶聯(lián)。在Applied Biosystems ABI433A肽合成儀中將肽組裝在固相上以后，用30mL在DMF中的2％NH2NH2對(duì)該進(jìn)行了保護(hù)的肽-樹脂(2mM)處理兩次(30分鐘和90分鐘)。用DMF(2X)、CH2Cl2(2X)、MeOH(1X)和CH2Cl2將該樹脂充分洗滌。將該肽樹脂在Lys-1上用在THF/MeOH(50mL，1∶1)中的十七烷酮和NaBH3CN(0.75g)和催化量的AcOH(3滴)還原烷基化。用在CH2Cl2中的1％的TFA選擇性地除去Lys-4上的Mtt基團(tuán)(3次，每次60mL)。這些條件還可以將被保護(hù)的肽從樹脂上裂解下來，將肽濃縮。然后將粗制的被保護(hù)的直鏈肽在Lys-4的側(cè)鏈氨基和Gly的α-羧基間用HBTU(11.25mM)/HOBt(11.25mM)/DIEA(12mL)DMF(25mL)環(huán)化30分鐘。在冷水(2L)中使該環(huán)狀肽析出沉淀，然后過濾。用50％的TFA/H2O(100mL)將該環(huán)狀肽脫保護(hù)2小時(shí)，從而得到粗制的肽，將其在冷的二乙醚中進(jìn)行沉淀。用使用C8柱的反相HPLC對(duì)該粗品(1.2g)進(jìn)行純化，用CH3CN(+0.1％TFA)的H2O(+0.1％TFA)溶液梯度洗脫。合并包含同一物質(zhì)的級(jí)分然后冷凍干燥，得到一種白色的絮狀粉末。純凈6肽的m/z(MH+)為1008.7，總收率為24％(480mg)。
實(shí)施例2環(huán)狀8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)的合成描述了環(huán)狀8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)的合成方法。環(huán)狀8肽ProAlaLysArg(LysLeuPheGly)的合成使用商業(yè)上可獲得的Fmoc-Gly-SASRIN樹脂作為起始點(diǎn)。將環(huán)狀8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)的鏈在‘C’至‘N’的方向上通過依次用25％哌啶脫保護(hù)然后與Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Lys(Mtt)-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Lys(t-Boc)-OH、Fmoc-L-Ala-OH進(jìn)行由HBTU-介導(dǎo)的偶聯(lián)來進(jìn)行加工，最后與Boc-L-Pro-OH進(jìn)行偶聯(lián)。在將肽組裝在固相上之后，用1％TFA的CH2Cl2溶液選擇性地除去Lys-5上的Mtt基團(tuán)。這些條件還可以將被保護(hù)的肽從該樹脂上裂解下來。然后，將該粗制的被保護(hù)的直鏈肽(FAB-MS，m/z 1168)在Lys-5的側(cè)鏈氨基和Gly-8的α-羧基間用HBTU/HOBt/DMF進(jìn)行環(huán)合。將該環(huán)狀肽用95％TFA/H2O脫保護(hù)1小時(shí)，得到粗制的環(huán)狀8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)。將粗品通過反相HPLC進(jìn)行純化，用CH3CN(+0.1％TFA)的H2O(+0.1％TFA)溶液進(jìn)行梯度洗脫。合并包含同一物質(zhì)的級(jí)分然后冷凍干燥，得到一種白色的絮狀粉末。該純凈的環(huán)狀8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)顯示出與所計(jì)算的該環(huán)狀8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)的分子量相一致的m/z(MH+)899.13，F(xiàn)AB-MS，C43H71N13O8的MH+。
該環(huán)狀8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly的結(jié)構(gòu)如下
序列表<110>諾瓦提斯公司<120>用于治療癌癥的E2F-1/細(xì)胞周期蛋白相互作用的抑制劑<130>4-31664A/USN<160>19<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>1Pro Ala Lys Arg Lys Leu Phe Gly1 5<210>2<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>2Pro Val Lys Arg Arg Leu Asp Leu1 5<210>3<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白
<400>3Ser Ala Cys Arg Asn Leu Phe Gly1 5<210>4<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白<400>4Ala Lys Arg Lys Leu Phe Gly1 5<210>5<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白<400>5Lys Arg Lys Leu Phe Gly1 5<210>6<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白<400>6Arg Lys Leu Phe Gly1 5<210>7<211>12<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白<400>7Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly1 5 10<210>8<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白<400>8Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Pro Val Lys Arg1 5 10 15Arg Leu Asp Leu20<210>9<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白<400>9Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Pro Ala Lys Arg1 5 10 15Lys Leu Phe Gly20<210>10<211>23<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白
<400>10Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Arg Leu Asp Leu1 5 10 15Pro Lys Val Arg Lys Arg Ser20<210>11<211>23<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白<400>11Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Glu Thr Asp His1 5 10 15Gln Tyr Leu Ala Glu Ser Ser20<210>12<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白<400>12Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys1 5 10 15<210>13<211>24<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白<400>13Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys1 5 10 15
Pro Val Lys Arg Arg Leu Phe Gly20<210>14<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白<400>14Lys Lys Lys Leu Phe Gly1 5<210>15<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白<400>15Lys Lys Leu Phe Gly1 5<210>16<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白<400>16Ala Lys Arg Lys Leu Phe Gly1 5<210>17<211>6<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>合成蛋白<400>17Lys Arg Lys Leu Phe Gly1 5<210>18<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白<400>18Ala Lys Lys Lys Leu Phe Gly1 5<210>19<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白<400>19Pro Ala Lys Lys Lys Leu Phe Gly1 權(quán)利要求
1.一種分離的包含選自通式Ia、Ib、Ic和Id的氨基酸序列的肽及其可藥用的鹽
其中AA1選自(a)Gly，(b)Ala，(c)Leu，和(d)小的脂肪族氨基酸；AA2選自(a)Phe，(b)Tha，(c)Cha，(d)Tyr，(e)Pya，(f)Trp，和(g)另一種芳族氨基酸；AA3選自(a)Leu，(b)Cpa，和(c)一種天然或非天然的脂肪族氨基酸；AA4選自(a)Lys，(b)被C1-C17烷基、C5-C20芳基烷基或C6-C20芳基所取代的Lys，(c)被C1-C17烷基、C5-C20芳基烷基或C6-C20芳基所取代或未被取代的Orn，和(d)被C1-C17烷基、C5-C20芳基烷基或C6-C20芳基所取代或未被取代的hLys；AA5選自(a)Arg，(b)Lys，(c)Orn，(d)hLys，和(e)His；AA6選自(a)Lys，(b)hLys，(c)Orn，(d)其中Nε被一個(gè)或兩個(gè)選自C5-C20烷基、直鏈或支鏈C1-C6?；h(huán)化的飽和或不飽和C5-C20烷基、C5-C20芳基烷基和C6-C20芳基的基團(tuán)所取代的Lys，和(e)其中Nδ被一個(gè)或兩個(gè)選自C5-C20烷基、直鏈或支鏈C1-C6酰基、環(huán)化的飽和或不飽和C5-C20烷基、C5-C20芳基烷基和C6-C20芳基的基團(tuán)所取代的Orn；AA7選自(a)Ala，(b)Val，和(c)一種天然或非天然的氨基酸，或其擬似物或等排物；AA8選自(a)Pro，(b)一種天然或非天然的氨基酸，或其擬似物或等排物；且Cap不存在或選自(a)C1-C8酰基，和(b)C3-C8環(huán)烷基烷酰基或呋喃基乙?；辉撾目扇芜x地連接于核定位肽序列HIV-1 Tat或觸角足肽序列(penetratin)上；并且符號(hào)(*)表示一個(gè)任選的分子內(nèi)鍵合位置，該鍵合是通過一個(gè)酰胺鍵取代的酰胺鍵或它們的等排物而進(jìn)行的；所得化合物可以分別是環(huán)狀5肽、6肽、7肽或8肽。
2.如權(quán)利要求1所述的分離的肽及其可藥用的鹽，其中AA1選自(a)Gly，(b)Ala，和(c)Leu；AA2選自(a)Phe，(b)Tha，(c)Cha，(d)Tyr，(e)Pya，和(f)Trp；AA3選自(a)Leu，(b)Cpa，和(c)一種天然的脂肪族氨基酸；AA4選自(a)Lys，(b)Orn，和(c)hLys；AA5選自(a)Arg，(b)Lys，(c)Orn，(d)hLys，和(e)His；AA6選自(a)Lys，(b)hLys，(c)Orn；AA7選自(a)Ala，(b)Val，和(c)一種天然的氨基酸；AA8選自(a)Pro，(b)一種天然的氨基酸；且Cap不存在或選自(a)乙酰基(Ac)、環(huán)丙基羰基、環(huán)丙基乙酰基(Cpr)、新戊?；?、異丙基羰基、異丙基乙?；?，2-二甲基丁?；?Dmb)、乙酰丙?；?、環(huán)丙基甘氨?；?Cpg)、二甲基甘氨?；?Dmg)，和(b)環(huán)戊基乙?；h(huán)己基乙?；h(huán)庚基乙?；?、呋喃基乙酰基；該肽可任選地連接于核定位肽序列HIV-1 Tat或觸角足肽序列(penetratin)上；并且符號(hào)(*)表示一個(gè)任選的分子內(nèi)鍵合位置，該鍵合是通過一個(gè)酰胺鍵而進(jìn)行的；所得化合物可以分別是環(huán)狀5肽、6肽、7肽或8肽。
3.如權(quán)利要求1或2所述的分離的肽及所述肽的可藥用鹽，包括環(huán)狀5肽Ac-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，或Ac-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)；環(huán)狀6肽Ac-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，Ac-Lys-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)，Cpr-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，Cpr-Lys-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)，Cpr-Lys-(C5-C20)-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)，Cpr-Lys-(C5-C20)-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，Cpr-Lys-(CH(CH3)(C13H27))-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)，Dmb-Lys-(C5-C20)-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，或Dmb-Lys-(C5-C20)-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)；環(huán)狀7肽Ac-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，Ac-Ala-Lys-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)，Cpr-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，或Cpr-Ala-Lys-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)；或環(huán)狀8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，Ac-Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，Ac-Pro-Ala-Lys-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)，Cpr-Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，或Cpr-Pro-Ala-Lys-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)；其中圓括號(hào)表示在環(huán)化中所涉及的殘基。
4.一種用于哺乳動(dòng)物治療方法中的如權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的肽或其可藥用的鹽。
5.一種包含如權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的肽或其可藥用的鹽和可藥用載體的藥物組合物。
6.一種用于治療哺乳動(dòng)物癌癥的藥物組合物，該組合物包含治療有效量的如權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的肽或其可藥用的鹽和可藥用的載體。
7.如權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的肽或其可藥用的鹽在制備用于治療癌癥的藥物組合物的用途。
8.如權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的肽或其可藥用的鹽在治療癌癥中的用途。
9.一種治療癌癥的方法，該方法包括給需要進(jìn)行該類治療的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的如權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的肽或其可藥用的鹽。
10.一種抑制E2F-1細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白與細(xì)胞周期蛋白A結(jié)合的方法，該方法包括給需要進(jìn)行該類治療的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的如權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的肽或其可藥用的鹽。
全文摘要
本發(fā)明的新型化合物具有通式Ia－d的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的化合物涉及具有如下氨基酸序列的8肽、7肽、6肽和5肽或它們的可藥用鹽或酯，其被統(tǒng)稱為具有“式Ia－d”，該化合物可以抑制轉(zhuǎn)錄因子E2F－1與細(xì)胞周期蛋白A的相互作用。作為E2F－1/細(xì)胞周期蛋白A相互作用的拮抗劑，本發(fā)明的化合物可以用于癌癥的治療。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1592752SQ01821010
公開日2005年3月9日 申請(qǐng)日期2001年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月20日
發(fā)明者K·W·貝爾, Y-N·P·陳, T·M·拉姆齊, M·L·薩比奧, S·K·夏爾馬 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司