專利名稱：擾亂膜結(jié)合性化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新穎的化合物、藥物組合物和采用它們的新穎的治療與診斷方法。
參考文獻列表下列參考文獻被視為有助于理解本發(fā)明的背景Bevers，E.M.，等，Biochim.Biophys.Acta，1439317-330，1999；Bombeli，T.，等，Blood，892429-2442，1997；Bratton，D.L.，等，J.Biol.Chem.，27226159-26165，1997；Bursch，W.，等，Trends Pharmacol. Sci.，13245-251，1992；Kockx M.M.，等，Cardiovasc.Res.，45736-746，2000；Mallat，Z.，等，Circulation，96424-428，1997；Martin，S.，等，J.Exp。Med.，1821545-1556，1995；Pugsley，W.，等，Stroke，251393-1399，1994；Sims，P.J.，等，Thromb.Haemost.，86266-275，2001；Stary，H.C.，等，Circulation，921355-1374，1995；Van den Eijnde，S.M.，等，Cell Death Diff.，4311-316，1997.
下文在對上述參考文獻進行引用時將在括號內(nèi)指出第一作者和出版年份。
背景技術(shù)：
完整真核生物細胞的生物膜是以高度組織化的結(jié)構(gòu)為特征的。這種高水平的組織化尤其由下列因素決定構(gòu)成膜的特定脂質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)；組成膜的各種脂質(zhì)之間的比例；磷脂在膜的外部與內(nèi)部小葉之間的分布；和膜的蛋白質(zhì)組分。
維持高水平的膜組織化是正常細胞生理學的基礎(chǔ)，正常膜組織化的實質(zhì)性擾亂和改變(PNOM)發(fā)生在大量生理學和病理學條件中，表現(xiàn)為多種疾病(Martin，S.等，1995)。這類改變和擾亂可能在形態(tài)水平上(在經(jīng)歷細胞程序死亡的細胞中所觀察到的膜起泡)和分子水平上都是明顯的。伴有細胞活化、細胞疾病或細胞死亡的擾亂的范圍尚未得到充分闡明。它們尤其包括膜磷脂的混雜和再分布，同時氨基磷脂向細胞表面運動，主要為磷脂酰絲氨酸(PS)和磷脂酰乙醇胺(PE)，它們在正常情況下幾乎完全被限制在膜雙分子層的內(nèi)部小葉，還有鞘磷脂和磷脂酰膽堿從膜的外部小葉向內(nèi)部小葉運動(Sims，P.J.等，2001)。這種再分布在本文中被稱為細胞膜脂質(zhì)不對稱性(CMLA)的喪失。這些改變在使細胞表面成為若干凝血因子配合物(例如tenase和凝血酶原酶配合物)裝配的催化平臺中扮演不可缺少的角色(Bevers，E.M.等，1999)。因而，血小板在活化后經(jīng)歷PNOM，這些改變在正常血液凝固中以及在大量障礙中的異常、過度凝血的引發(fā)和/或傳播中構(gòu)成重要的因素。這些障礙尤其包括動脈或靜脈血栓形成或血栓栓塞(例如腦中風、心肌梗塞、深靜脈血栓形成(DVT)、播散性血管內(nèi)凝血(DIC)、血栓性血小板減少性紫癜等)；不穩(wěn)定的動脈粥樣硬化斑、鐮刀細胞疾?。沪?地中海貧血；抗磷脂抗體綜合征；系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)；與膜微粒脫落有關(guān)的障礙，例如與心肺旁路有關(guān)的神經(jīng)功能障礙。
細胞程序死亡是發(fā)生細胞膜改變/擾亂的另一種主要情形(Bratton，D.L.，等，1997)。細胞程序死亡是細胞自我破壞或“自殺”的內(nèi)在程序，這是每種真核生物細胞所固有的。響應于激發(fā)性刺激，細胞經(jīng)歷細胞皺縮、細胞膜起泡、染色質(zhì)凝縮與碎裂、最后細胞轉(zhuǎn)化為膜結(jié)合性粒子簇(細胞程序死亡體)等事件的高度特征性級聯(lián)，然后被巨噬細胞吞噬(Bursch，W.，等，1992)。PNOM是細胞程序死亡的普遍現(xiàn)象，它發(fā)生在細胞程序死亡級聯(lián)的早期，很可能在細胞進入死亡過程之時，還已顯示是吞噬細胞對細胞程序性死亡的識別和除去中的重要因素(Vanden Eijnde，S.M.，等，1997)。
最近發(fā)現(xiàn)在PNOM與細胞程序死亡性細胞的有力促凝血活性之間存在密切關(guān)系(Bombeli，T.，等，1997)。細胞程序死亡性內(nèi)皮細胞中的PNOM(例如在動脈粥樣硬化斑中(Mallat，Z.，等，1997))很可能在血栓形成性血管障礙的發(fā)病機理中扮演重要角色。PNOM還是炎性細胞(即淋巴細胞、巨噬細胞)的特征，受各種激發(fā)物的活化。
與PNOM膜選擇性結(jié)合的化合物因此充當重要的工具，用于檢測和定向經(jīng)歷活化、損傷或死亡過程、尤其是細胞程序死亡的細胞。在臨床意義上，與所述膜結(jié)合可以用于(1)診斷(例如診斷疾病進程、監(jiān)測疾病的過程與進展、監(jiān)測各種治療方法對疾病過程的效果)；(2)治療(例如定向于PNOM細胞的藥物，和/或與PNOM有關(guān)的障礙的調(diào)節(jié))；和(3)廓清(選擇性結(jié)合和除去體液中的PNOM要素)。
發(fā)明概述本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)這樣的化合物，它能夠與經(jīng)歷正常膜組織化擾亂(PNOM)的細胞選擇性結(jié)合，而與維持正常膜組織化的細胞結(jié)合的程度則低得多。
用于本發(fā)明的術(shù)語PNOM涉及具有至少一種下列特征的細胞(i)膜磷脂的混雜，伴有磷脂在細胞膜內(nèi)部與外部小葉之間分布的正常不對稱性下降；(ii)氨基磷脂暴露在外部細胞表面上(主要是磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺的暴露)；(iii)膜成分包裝的減低；(iV)脂質(zhì)在每種膜小葉內(nèi)的正常分布減低，例如單側(cè)區(qū)域的形成，分別是特定脂質(zhì)膜成分的富集或貧乏，例如磷脂酰絲氨酸或膽固醇。
術(shù)語“擾亂膜結(jié)合性化合物”(PMBC)涉及這樣一種化合物，它與以PNOM為特征的膜選擇性結(jié)合，而與正常膜結(jié)合的程度則較低。
PMBC在本發(fā)明中用于制備與擾亂膜選擇性結(jié)合的藥物。PMBC類化合物被指定為“NST700”。PMBC類包括新化合物和已知化合物。
因而，按照一個方面，本發(fā)明提供擾亂膜結(jié)合性化合物(PMBC)在藥物制備中的用途，該藥物用于與經(jīng)歷其正常膜組織化擾亂的細胞選擇性結(jié)合，所述PMBC具有式Ce，其中e選自1、2和3，C是具有式(I)的基團
或式(I)結(jié)構(gòu)的藥學上可接受的鹽和水合物，其中所述C基團可以各自是相同或不同的；Z代表由環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基或這類基團的組合構(gòu)成的環(huán)系，所述環(huán)系由5-10個原子組成；X代表CH、CH2、N、NH、O或S；n、m、r和p各自獨立地是0或1；其中n+r＝1；m+p＝1；R1可以各自是相同或不同的，獨立地選自由A和L-A組成的組，其中L可以各自是相同或不同的，獨立地選自由D、U、U-D、D-U、D-U-O、O-U-D、D-U-NH、NH-U-D、D-U-D和U-D-U組成的組；U代表氫或者選自可選被取代的C1-C6亞烷基、C2-C6亞烯基、C3-C6支鏈亞烷基、C3-C6支鏈亞烯基、C3-C6亞環(huán)烷基、亞環(huán)烯基、芳基、亞雜環(huán)烷基、亞雜環(huán)烯基、雜芳基和所述基團的任意組合；D選自由O、S、SO、SO2、SO2NH、NHSO2、NH、PO、PO2、POOH、PO(NH)2、NHPOOH、CO、C(O)O、NHCO、CONH、SO2NHCHCOOH、SO2NHCO或當D是二價原子團時上述列表的對應含義組成的組；A可以各自是相同或不同的，當e是1時，A是在pH約7下帶電的部分；或者當e是2或3時，A獨立地選自極性不帶電部分和在pH約7下帶電的部分，所述帶電部分是帶正電的、帶負電的或兩性離子形式；R2是WR3b，其中W缺無或者選自由仲或叔胺、氧、硫、碳和D組成的組，其中D是如上所定義的；
R3代表氫或C1-C6烷基、C2-C6鏈烯基、C3-C8支鏈烷基、C3-C8支鏈烯基；R3部分可以是相同或不同的；b是1、2或3；當e是2或3時，C基團是彼此直接或者通過L部分連接的，其中L是如上所定義的。
在一種優(yōu)選的實施方式中，e是2。
在另一種優(yōu)選的實施方式中，上述式IPMBC的Z代表由環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基構(gòu)成的環(huán)系，所述環(huán)系由5或6個原子組成；U代表可選被取代的C1-C6亞烷基、C2-C6亞烯基、C3-C6支鏈亞烷基、C3-C6支鏈亞烯基和所述基團的任意組合；和R2由WR3b組成，其中W缺無或者選自由仲或叔胺、氧和硫組成的組，R3和b是如上所定義的。
優(yōu)選地，b是2，R3獨立地選自下列組合(a)甲基，(b)丁基，(c)己基，(d)丁基與甲基，(e)己基與甲基的組合。
在式(I)的PMBC中，每個R1和R2可選地可以包含Y，所述Y是連接基團，與任意下列連接1、固體載體；2、成像標志，例如熒光、X-射線、CT掃描、磁共振成像(MRI)、正電子發(fā)射斷層照相術(shù)(PET)或放射性同位素掃描的檢測劑；3、另一種藥物，醫(yī)學上可用于預防或治療特定疾病，經(jīng)由與PMBC連接定向于病患細胞或組織。優(yōu)選地，該藥物可以是細胞程序死亡抑制劑(例如天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶抑制劑、抗氧化劑、Bcl-2系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑)或細胞毒劑，例如細胞程序死亡激活劑(例如抗癌藥)；作為替代選擇，該藥物優(yōu)選地是抗凝血劑、抗血栓形成劑或血管溶解劑。在這類情況下，所述藥物優(yōu)選地選自抗血小板劑、肝素、小分子肝素、糖蛋白IIb/IIIa拮抗劑、組織纖溶酶原激活劑(tPA)、或凝血因子抑制劑，例如凝血酶抑制劑或Xa因子抑制劑；進而作為替代選擇，該藥物優(yōu)選地是抗炎藥或免疫調(diào)節(jié)藥。
優(yōu)選地，當e是整數(shù)2或3時，PMBC的C基團是彼此直接或者通過L部分連接的，其中L是如上所定義的。
在另一種優(yōu)選的實施方式中，用在本發(fā)明中的PMBC包含具有下式(II)的C基團 包括式(II)結(jié)構(gòu)的藥學上可接受的鹽和水合物，其中R1、R2、n、m、r和p都具有與上述定義相同的含義。
在另一種優(yōu)選的實施方式中，式(I)的PMBC包含這樣的C基團，其中所述C基團由萘基組成(也就是說Z是苯基環(huán))，該萘基的一個環(huán)與選自結(jié)構(gòu)-SO2-(NH)-(CH2)v-A、-SO2-O-(CH2)v-A的單元連接，其中v代表整數(shù)1-5；該萘基的第二個環(huán)與單烷基或二烷基氨基連接；A是由氨基和/或酸性基團構(gòu)成的帶電基團，酸性基團例如羧酸、磷酸、磷酸鹽、磺酸或硫酸。
優(yōu)選地，R3選自下列組合(a)兩個甲基，(b)兩個丁基，(c)兩個己基，(d)丁基與甲基的組合，(e)己基與甲基的組合。
按照另一種優(yōu)選的實施方式，用在本發(fā)明中的PMBC具有下式(III)的C基團
包括其藥學上可接受的鹽和水合物，其中A是由氨基和/或羧酸基團構(gòu)成的帶電基團，至少一個R3是C2-C6烷基，L是-SO2-(NH)-(CH2)v(v代表整數(shù)1-5)。
更具體地，PMBC具有下式(IV)，被指定為NST701 有些PMBC是新化合物，代表本發(fā)明的第二方面。這些新化合物具有結(jié)構(gòu)Ce，其中C是如上所定義的，e是2(也就是說新化合物是二聚物)或1；其中在e＝1的情況下，PMBC包含除-(CH2)5-以外的L基團。
下列PMBC不是新化合物N2，N6-雙[[5-(二甲氨基)-1-萘基]磺?；鵠-J-賴氨酸、N，N’-雙[[5-(二甲氨基)-1-萘基]磺?；鵠-L-胱氨酸、N，O-雙[[5-(二甲氨基)-1-萘基]磺酰基]-L-酪氨酸和N，N”-雙[[2-(5-(二甲氨基)萘-1-磺?；?氨基乙基]氨基甲?；谆鵠二亞乙基三胺-N，N’，N-三乙酸。
優(yōu)選地，本發(fā)明的新化合物具有下式(V) 其中G1、G2、G3和G4可以是相同或不同的，獨立地選自氫、COOH、C(O)NH2、NH2和-N+(CH3)3；M選自缺無、NHC(O)、C(O)NH、NH、O、S、S-S、CH2、(CH2)2、NH-(CH)2NH、N(CH2)kCOOH和N+(CH3)(CH2)kCOOH；Q1、Q2、Q3和Q4可以是相同或不同的，獨立地選自缺無或(CH2)k；k是整數(shù)1-6；R3代表氫或C1-C6烷基。
優(yōu)選地，R3是甲基、丁基或己基。
在特定的實施方式中，本發(fā)明的新化合物具有下式(VI)，被指定為NST740
在另一種實施方式中，本發(fā)明的新化合物具有下式(VII) 包括其藥學上可接受的鹽和水合物，其中R3具有與上述定義相同的含義，y是整數(shù)2-6，z是整數(shù)1-6，T選自缺無、氫和甲基。
優(yōu)選地，R3選自甲基、丁基或己基，y是2或3，z是1、2或3。
在另一種特定的實施方式中，本發(fā)明的新化合物具有下式(VIII)，被指定為NST750 在另一種特定的實施方式中，本發(fā)明的新化合物具有下式(IX) 包括其藥學上可接受的鹽和水合物，其中R3可以是相同或不同的，具有上述相同含義。
優(yōu)選地，新化合物具有式(IX)結(jié)構(gòu)，其中R3是甲基，被指定為NST751。
在特定的實施方式中，用在本發(fā)明中的PMBC具有下式(X)，被指定為DDL 在另一種特定的實施方式中，用在本發(fā)明中的PMBC具有下式(XI)，被指定為
在另一種優(yōu)選的實施方式中，用在本發(fā)明中的PMBC具有下式(XII) 包括其藥學上可接受的鹽和水合物，其中R3選自甲基、丁基和己基。
與經(jīng)歷正常組織化擾亂的細胞膜(PNOM)選擇性結(jié)合而基本上不與維持其正常組織化的膜結(jié)合或者結(jié)合程度低得多的PMBC可以用在本發(fā)明的三種不同方法中。
按照第一種方法，以下稱為“檢測方法”，選擇性結(jié)合可以用于檢測細胞或細胞派生粒子，它們含有擾亂的膜(PM)。這可以用于診斷其中細胞經(jīng)歷PNOM的疾病，下文將有解釋。
按照第二種方法，以下稱為“治療方法”，與PM選擇性結(jié)合的性質(zhì)可以用于使用PMBC作為定向部分治療疾病、定向治療用藥物于其中發(fā)生PNOM的體內(nèi)器官和組織，例如細胞死亡、血栓形成或炎癥的區(qū)域。
按照被稱為“廓清方法”的本發(fā)明第三種方法，本發(fā)明化合物與PM的選擇性結(jié)合用于從具有PM的細胞或包含這類膜的更大結(jié)構(gòu)(例如在血液中循環(huán)的栓子)中廓清體液。
按照檢測方法，本發(fā)明涉及組合物，包含如上所定義的PMBC作為有效成分，用于體外、來自體內(nèi)或體內(nèi)檢測生物細胞樣本中的擾亂膜。根據(jù)本發(fā)明檢測方法的PMBC能夠與存在于測定樣本中的PM選擇性結(jié)合。然后，可以通過本領(lǐng)域已知的任意手段鑒別所述結(jié)合。PMBC可以具有其自身的可檢測性質(zhì)，例如熒光發(fā)射，這些可檢測性質(zhì)例如可以通過熒光顯微鏡或流式細胞測定設備加以檢測。
術(shù)語“以PM為特征的疾病”涉及這樣一種疾病，其表現(xiàn)之一是正常膜組織化的擾亂。這并不意味著這種擾亂必然是疾病的原因或唯一后果，而是它的表現(xiàn)之一。
按照優(yōu)選的發(fā)明實施方式，PMBC可以包含可檢測標記或者經(jīng)由Y部分與之結(jié)合，例如熒光發(fā)射部分、放射性標記、能夠經(jīng)歷酶反應產(chǎn)生可檢測顏色的標記、用于X-射線、MRI、放射性同位素成像或PET掃描的標記，以生成PMBC-標記加合物。這類加合物使可檢測標記能夠通過本發(fā)明化合物與PM以選擇性方式結(jié)合。然后，可以通過本領(lǐng)域已知的任意方式檢測可檢測標記，根據(jù)所用的特定標記，例如熒光、放射性發(fā)射、顯色、MRI、X-射線等。術(shù)語“結(jié)合”涉及共價或非共價(例如靜電)結(jié)合，連接PMBC與可檢測標記。作為替代選擇，由于其結(jié)構(gòu)的化學屬性，PMBC可以具有其自身的可檢測性質(zhì)，使其能夠被任意上述技術(shù)檢測。
優(yōu)選地，所述可檢測標記選自金屬離子用于放射性同位素掃描的Tc-99m和In-111，用于MRI的Gd。有利地，Y包含金屬螯合基團，所述金屬是可檢測標記，其中所述螯合基團選自任意下列結(jié)構(gòu)
其中該螯合基團經(jīng)由其氨基之一與化合物連接。
進而有利地，Y連接基團包含L單元，連接螯合基團與PMBC的羧基、胺或磺酰胺部分；所述L單元是如上所定義的。上述加合物能夠用于檢測和診斷多種以PM的形成為特征的生理學條件(包括正常條件)、病理學條件、疾病或障礙。
以PM為特征的條件的實例如下以過度細胞程序死亡的發(fā)生為特征的疾病，例如變性障礙、神經(jīng)變性障礙(例如帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓舞蹈病)、AIDS、脊髓發(fā)育不良綜合征、缺血或毒性發(fā)作、移植排斥期間移植細胞丟失；腫瘤、尤其是高度惡性/侵襲性腫瘤，除了過度組織增生以外，也經(jīng)常是以增強的細胞程序死亡為特征的。
表現(xiàn)為過度凝血的疾病，其中PNOM發(fā)生在血小板活化期間和/或其他細胞要素(例如內(nèi)皮細胞)的活化或損傷期間。這些疾病尤其包括動脈或靜脈血栓形成、血栓栓塞(例如心肌梗塞、腦中風、深靜脈血栓、播散性血管內(nèi)凝血(DIC)、血栓形成性血小板減少性紫癜(TTP))、鐮刀細胞疾病、地中海貧血、抗磷脂抗體綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
炎癥和/或與免疫介導的病因?qū)W或發(fā)病機理有關(guān)的疾病，例如自體免疫障礙，例如抗磷脂抗體綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡；結(jié)締組織障礙，例如類風濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮??；甲狀腺炎；皮膚病學障礙，例如天皰瘡或結(jié)節(jié)性紅斑；自體免疫性血液病學障礙；自體免疫性神經(jīng)病學障礙，例如重癥肌無力；多發(fā)性硬化；炎性腸障礙，例如潰瘍性結(jié)腸炎；結(jié)節(jié)性脈管炎。
動脈粥樣硬化斑、尤其是不穩(wěn)定的、易損的和有破裂傾向的斑，也是以PM結(jié)構(gòu)為特征的，包含細胞程序死亡的巨噬細胞、細胞程序死亡的平滑肌細胞、細胞程序死亡的內(nèi)皮細胞、活化的血小板和活化的炎性細胞。
經(jīng)由檢測有關(guān)的PNOM來檢測這些病理學條件、障礙或疾病可以是單獨的目標，僅僅用于診斷特定個體中疾病條件的存在。
所述檢測還可以對已知患有疾病的個人進行，目的是評價疾病嚴重性和監(jiān)測對各種治療藥征的響應。這類監(jiān)測的實例是評價對抗癌療法的響應。由于大多數(shù)抗腫瘤治療——化療法或放療法通過誘導細胞程序死亡發(fā)揮作用，療法誘導的腫瘤細胞程序死亡的PMBC檢測基本上可以縮短抗癌治療給藥時間與適當評價其功效時間之間的遲滯期。
而且，所述檢測可以用于監(jiān)測抗癌治療的副作用。大部分這類副作用是由于事與愿違的治療對正常而敏感的細胞誘導細胞程序死亡，例如胃腸上皮或骨髓造血系統(tǒng)的細胞。這類細胞程序死亡的PMBC檢測可以允許早期檢測這種事與愿違的組織損傷，更好地優(yōu)化治療方案。
另外，所述檢測可以致力于鑒定腫瘤內(nèi)部細胞程序死亡的負載，鑒定腫瘤的發(fā)展水平，和測定轉(zhuǎn)移。
同樣，本發(fā)明化合物或組合物可用于監(jiān)控器官移植后的移植存活，因為可由PMBC潛在檢測的細胞程序死亡在移植排異期間的細胞損失中起主要作用。
另外，所述檢測可以致力于監(jiān)測對細胞保護性治療的響應，從而通過使細胞死亡成為評價量度，有助于篩選和開發(fā)能夠抑制各種疾病(例如上文引用的那些)中的細胞丟失的藥物。
所述檢測還可以用于檢測動脈粥樣硬化斑，因為這類斑的去穩(wěn)定化賦予它們易損的、有破裂的傾向、血栓形成和栓塞化，是以若干要素的參與為特征的，它們共同具有擾亂的膜(i)細胞程序死亡的細胞不穩(wěn)定的斑是以細胞程序死亡的巨噬細胞、細胞程序死亡的平滑肌細胞和細胞程序死亡的內(nèi)皮細胞為特征的；(ii)活化的血小板；(iii)活化的炎性細胞。脂質(zhì)內(nèi)核、包含脂質(zhì)的細胞外蓄積，也是動脈粥樣硬化斑經(jīng)歷去穩(wěn)定化的證明之一(Kockx M.M.，等，2000；Stary，H.C.，等，1995)。PMBC和本發(fā)明化合物由于它們的疏水性芳族組分，還可以用于鑒別這類易損的動脈粥樣硬化斑的脂質(zhì)內(nèi)核。
檢測還可以在組織培養(yǎng)和動物模型的細胞程序死亡研究中用于基礎(chǔ)研究目的，還可以幫助確定細胞程序死亡在各種組織的正常發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中的角色，例如在胚胎發(fā)生期間的中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中，以及在正常老化等情形期間。
按照這種方法，本發(fā)明進一步涉及檢測生物細胞中PM的方法，該方法包含(i)使細胞樣本與PMBC在使所述PMBC能夠與生物膜結(jié)合的條件下接觸；(ii)檢測化合物與所述細胞的結(jié)合；顯著量所結(jié)合的化合物的存在說明在所述細胞中存在PM。
本發(fā)明的方法可以用于診斷以PNOM的存在為特征的疾病，例如任意一種上述疾病。
本發(fā)明的方法還可以用于監(jiān)測各種治療藥征對所述疾病或醫(yī)學條件的效果，或者作為替代選擇用于如上所解釋的基礎(chǔ)科學研究目的。
按照本發(fā)明的第二種方法“治療方法”，本發(fā)明涉及藥物組合物，包含活性成分，可選地和藥學上可接受的載體；所述活性成分包含由(i)藥學活性藥物和(ii)PMBC構(gòu)成的PMBC-綴合物。所述藥物組合物發(fā)揮定向藥物于經(jīng)歷PNOM的細胞的作用，因此能夠用于治療如上所定義的以PM的存在為特征的疾病。
術(shù)語“PMBC-綴合物”用于表示這樣一種綴合物，包含與PMBC的互補單元締合的藥物，其中所述綴合物能夠充當PMBC。所述締合作用可以通過共價結(jié)合、非共價結(jié)合(例如靜電力)或載體粒子(例如脂質(zhì)體)的形成，其中包含在其表面具有PMBC的藥物，定向該配合物于PM。
PMBC-綴合物的目的是使藥物僅選擇性指向表現(xiàn)PNOM或表現(xiàn)顯著量PNOM的細胞、組織或器官。一旦藥物到達靶，它應當能夠發(fā)揮其生理活性，無論仍然作為PMBC的一部分處于配合物中、從互補性PMBC單元分離(例如通過裂解、破壞、天然酶的活性)、在其膜上具有PMBC的含藥脂質(zhì)體的吞噬作用、還是通過任意其他已知的機理。
在選擇藥物時應當根據(jù)組合物適用的特定疾病。
關(guān)于表現(xiàn)為異常與過度凝血的引發(fā)或傳播的疾病(例如動脈或靜脈血栓形成、血栓栓塞、鐮刀細胞疾病、β-地中海貧血、抗磷脂抗體綜合征、播散性血管內(nèi)凝血(DIC)、血栓形成性血小板減少性紫癜(TTP)、系統(tǒng)紅斑狼瘡)的治療或預防，藥物應當是這樣一種化合物，已知它抑制血塊的形成或者溶解已經(jīng)產(chǎn)生的血塊，例如抗血小板劑、肝素、小分子肝素、糖蛋白IIB/IIIA拮抗劑、組織纖溶酶原激活劑(tPA)、或凝血因子抑制劑，例如凝血酶抑制劑或Xa因子抑制劑。
若疾病表現(xiàn)為不適當?shù)暮瓦^度的細胞程序死亡，例如變性障礙、神經(jīng)變性障礙(例如帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓舞蹈病)、AIDS、脊髓發(fā)育不良綜合征、缺血或毒性發(fā)作、移植排斥期間的移植細胞丟失，則藥物應當能夠抑制細胞程序死亡。這類藥物尤其可以是天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶抑制劑、Bcl-2系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑或抗氧化劑。
若疾病是炎癥和/或與免疫介導的病因?qū)W或發(fā)病機理有關(guān)的疾病，例如自體免疫障礙，例如抗磷脂抗體綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡；結(jié)締組織障礙，例如類風濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮??；甲狀腺炎；皮膚病學障礙，例如天皰瘡或結(jié)節(jié)性紅斑；自體免疫性血液病學障礙；自體免疫性神經(jīng)病學障礙，例如重癥肌無力；多發(fā)性硬化；炎性腸障礙，例如潰瘍性結(jié)腸炎；結(jié)節(jié)性脈管炎，則藥物應當是抗炎藥或免疫調(diào)節(jié)藥。
關(guān)于不穩(wěn)定的動脈粥樣硬化斑(以血栓形成、炎癥或細胞程序死亡為特征)的治療或預防，藥物可以選自上述各組。
本發(fā)明的綴合物可以包含抗癌藥，目的是增強抗癌方案的功效?？拱┓桨傅脑鰪娮饔檬沁@樣實現(xiàn)的(1)定向所述綴合物于以異常過度細胞程序死亡負荷為特征的腫瘤組織(后者經(jīng)常與腫瘤侵襲水平有關(guān))；或(2)使用兩波細胞程序死亡第一波使用標準的化學治療劑或放射治療劑，致力于引發(fā)腫瘤內(nèi)的細胞程序死亡過程；繼之以第二波細胞程序死亡，其中給以PMBC-藥物綴合物形式的抗癌藥，它被定向于由第一波產(chǎn)生的細胞程序死亡的細胞。因而，實現(xiàn)抗癌藥在腫瘤塊內(nèi)的局部濃度增加，所以增強局部腫瘤殺死過程。
本發(fā)明的藥物組合物可以通過任意已知途徑給藥，尤其是口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、舌下、眼內(nèi)、鼻內(nèi)或局部給藥。在選擇載體時應當根據(jù)所需的給藥方式，包括任意已知組分，例如溶劑；乳化劑、賦形劑、滑石；矯味劑；著色劑等。如果需要的話，藥物組合物還可以包含其他藥學活性化合物，它們用于治療疾病、消除副作用或增加活性組分的活性。
本發(fā)明還涉及包含藥物的PMBC、即PMBC-綴合物在藥劑制備中的用途。
根據(jù)本發(fā)明的用途優(yōu)選地用于制備這樣一種藥劑，它治療和檢測以PM的存在為特征的疾病和/或其中PM扮演病因?qū)W或致病角色的疾病。這類疾病的實例參見上文。
按照這個方面，本發(fā)明更進一步涉及改善表現(xiàn)為PM的疾病治療的方法，包含對需要這樣一種治療的個體給以有效量的PMBC-綴合物，所述綴合物包含對所述疾病有治療活性的藥物。綴合物允許選擇性定向藥物于承受PNOM的組織，從而增加其局部濃度，潛在地增強其對靶部位的治療效果。這類醫(yī)學障礙是如上所定義的。
術(shù)語“有效量”涉及能夠在可測量的程度上減少至少一種疾病不利表現(xiàn)的量，在選擇時應當根據(jù)所用的藥物、給藥方式、患者的年齡與體重、疾病嚴重性等。
第三種方法稱為“廓清方法”，利用PMBC與PM特異性結(jié)合的性質(zhì)廓清細胞、粒子、微粒或任意含有PM的結(jié)構(gòu)的體液。優(yōu)選地，體液是血液或血液產(chǎn)物。
很多需要體外循環(huán)的外科或內(nèi)科干預與血液要素暴露于外源性人工環(huán)境有關(guān)。這經(jīng)常引起血液細胞的活化與損傷、全身炎癥和血栓栓塞現(xiàn)象，潛在地具有嚴重的臨床后果，例如神經(jīng)功能障礙。因此需要檢測和除去所述被損傷的、被活化的或細胞程序死亡的血液細胞。
因而，本發(fā)明涉及固定在固體載體上的PMBC。所述固定化可以是直接附著，通過共價或非共價結(jié)合，或者是通過間隔基團附著。被固定的PMBC打算廓清體液中的PM細胞或含有PM的結(jié)構(gòu)。
術(shù)語“PM細胞”涉及膜經(jīng)歷PNOM的細胞。通常關(guān)于血液或血液產(chǎn)物，這包括活化的、細胞程序死亡的或損傷的紅細胞、白細胞、血小板、血小板派生微粒、組織巨噬細胞和內(nèi)皮細胞。
術(shù)語“含有PM的結(jié)構(gòu)”涉及細胞和/或非細胞組分的聚集體，它含有具有PNOM的膜。該術(shù)語通常涉及微栓子，它們是促凝血的粒子和促凝血的細胞。所述微栓子包含活化的血小板、血小板派生微粒、血小板-纖維蛋白凝塊、損傷的細胞、衰老的細胞、細胞程序死亡的內(nèi)皮與血液細胞、細胞程序死亡的尸體和細胞碎屑。這些要素是以PM為特征的，所述微栓子可以沉積在遠端小血管中，使它們閉塞和/或引發(fā)局部血栓形成，從而導致局部缺血。事實上，這些微栓子在各種器官——特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)——毛細血管中的廣泛沉積目前被視為在心臟手術(shù)期間心肺旁路后器官損傷與功能障礙發(fā)病機理中的主要因素(Pugsley，W.，等，1994)。
術(shù)語“固體載體”在本發(fā)明的上下文中涉及固體基質(zhì)、不溶性基質(zhì)和不溶性載體。根據(jù)本發(fā)明的固體載體可以形成各種結(jié)構(gòu)，例如微粒、微濾器或微毛細管的堆積體，可以由各種材料組成，例如氧化鋁、硅藻土、C鹽、碳酸鈣、硫酸鈣、離子交換樹脂、硅膠、木炭、安伯來特、dowex、Eupergit和乙磺酰氧基纖維素。
按照優(yōu)選的本發(fā)明實施方式，固體載體具有大量與PMBC結(jié)合的珠粒。優(yōu)選地，這些珠粒是涂有樹脂的珠粒。作為替代選擇，這些珠粒可以是磁性珠粒。
若固體載體包括大量纖維或微毛細管，體液流過其中和/或其間，則其內(nèi)部和/或外部表面被PMBC覆蓋。
固定在固體載體上的化合物構(gòu)成過濾裝置的一部分。因而按照廓清方法，本發(fā)明進一步涉及過濾裝置，包含容器、流體入口和流體出口，容器含有固定在所述固體載體上的PMBC。體液、例如血液或血液產(chǎn)物通過所述入口進入容器，與容器中所含有的固定化PMBC接觸和粘附。因而，體液被廓清了，除去具有擾亂膜的循環(huán)細胞，例如損傷或死亡的細胞，或者除去更大的結(jié)構(gòu)，例如具有擾亂膜的栓子。所以，從所述出口流出的流體減少了所述含有PM的細胞或含有PM的結(jié)構(gòu)的含量或者基本上沒有它們。
過濾裝置可以構(gòu)成體外循環(huán)儀器的可替換的、永久的或添加的部分。因而，本發(fā)明還涉及包含所述過濾裝置的體外循環(huán)儀器，其中循環(huán)通過該儀器的血液也穿過該裝置。
這類儀器的實例是心肺旁路儀；血液透析儀；血漿除去儀和輸血儀，例如本領(lǐng)域現(xiàn)有的輸血袋。
廓清方面還提供從生物流體、優(yōu)選體液中除去含有PM的細胞或含有PM的結(jié)構(gòu)的方法。該方法包含使體液與固定在固體載體上的PMBC接觸，接觸的條件和時間足以使含有PM的細胞或含有PM的結(jié)構(gòu)與PMBC結(jié)合，由此從體液中除去至少一部分所述含有PM的細胞或粒子。
體液(例如血液或血液派生產(chǎn)物)與固定化PMBC的接觸可以通過本領(lǐng)域已知的任意方法進行，以從流體中除去粒子，具體方法為使體液流經(jīng)本發(fā)明的過濾裝置，由此廓清血液，除去至少一部分其中存在的微栓子。
本發(fā)明的方法可以用于通過從血液中除去潛在有害的含有PM的細胞或含有PM的結(jié)構(gòu)(主要是微栓子)，改善牽涉體外循環(huán)的操作的臨床結(jié)果，例如需要心肺旁路的手術(shù)，由此減少操作期間的血栓栓塞事件的危險。在實踐中，過濾裝置可以置于體外循環(huán)機與患者之間，從而從血液中濾出PM細胞或聚集物。作為替代選擇，可以將血液暫時轉(zhuǎn)移到包含過濾裝置的系統(tǒng)中，進行PM要素的過濾，然后將純化后的血液返回到全身循環(huán)中。該方法還可以用于從經(jīng)歷血液透析的患者或經(jīng)歷血漿除去的患者的循環(huán)中廓清含有PM的細胞或含有PM的結(jié)構(gòu)。
該方法還可以用于在輸血前處理所貯存的血液，以便最小化其中存在的含有PM的細胞或含有PM的結(jié)構(gòu)的量，從而最小化與輸血有關(guān)的各種并發(fā)癥。關(guān)于所貯存的血液的處理，可以采用所述過濾方法作為血庫血液加工的一部分，或者用在向患者輸血期間，在這種情況下所述濾器可以置于輸血袋與患者之間。
附圖的簡要說明為了理解本發(fā)明和了解如何在實踐中實施，現(xiàn)在將描述優(yōu)選的實施方式，其中評價了本發(fā)明化合物與由于細胞程序死亡或活化作用而經(jīng)歷PNOM的細胞結(jié)合的檢測。通過熒光顯微鏡檢查或流式細胞測定(FACS)分析，監(jiān)測化合物內(nèi)在熒光的強度，測量結(jié)合作用。現(xiàn)在將借助非限制性實施例描述所述優(yōu)選的實施方式，并參照附圖，其中

圖1DDL與活化紅細胞(RBC)的選擇性結(jié)合；流式細胞測定分析；圖2熒光顯微鏡檢查，顯示DDC與細胞程序死亡的細胞的選擇性結(jié)合；圖3DDC與活化紅細胞(RBC)的選擇性結(jié)合；流式細胞測定分析；圖4DDC與活化血小板的選擇性結(jié)合；流式細胞測定分析；圖5用DDC體內(nèi)檢測肝細胞程序死亡；圖6用DDC體內(nèi)檢測腫瘤內(nèi)細胞程序死亡的細胞，與TUNEL來自體內(nèi)測定法對比；圖7用NST750體內(nèi)檢測化療法誘導的小腸上皮細胞程序死亡。
附圖的詳細解釋圖1DDL與活化紅細胞(RBC)的選擇性結(jié)合；流式細胞測定分析在Ca2+的存在下，將RBC用N-乙基馬來酰亞胺(NEM)和鈣離子載體A23187處理進行活化(Kuypers A.等，1996，Blood，87，1179-1187)。向活化組或?qū)φ战M(未處理的RBC)加入DDL(最終濃度1μM)。然后使用Beckton-Dickinson細胞分類器和CellQuest軟件，對細胞進行流式細胞測定(FACS)分析。激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長530nm。完整的RBC不表現(xiàn)顯著的DDL結(jié)合(藍線，類似于基礎(chǔ)的背景熒光(黑線))，而活化的RBC表現(xiàn)顯著的DDC結(jié)合，反映在峰顯著漂移到更高的熒光值(紅線)。X軸代表530nm下的熒光，Y軸代表所統(tǒng)計的RBC數(shù)。
圖2熒光顯微鏡檢查，顯示DDC與細胞程序死亡的細胞的選擇性結(jié)合暴露于500μM多巴胺達18小時，誘導HeLa細胞經(jīng)歷細胞程序死亡，然后用DDC(100μM)培育。未處理的細胞充當對照。利用IX70熒光顯微鏡(Olympus)進行細胞肉眼檢查，測量DDC化合物的固有熒光強度(激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長530nm)。在對照培養(yǎng)物(a)中，完整的細胞保持未被染色。相形之下，在細胞程序死亡的培養(yǎng)物(b)中，大多數(shù)細胞特異性結(jié)合DDC。對照培養(yǎng)物內(nèi)小部分細胞結(jié)合了DDC，這代表天然存在的細胞死亡過程，是細胞培養(yǎng)生長所常見的(放大率X400)。
圖3DDC與活化紅細胞(RBC)的選擇性結(jié)合；流式細胞測定分析向?qū)φ张c活化的RBC加入DDC(最終濃度500μM)，使用Becton-Dickinson細胞分類器和CellQuest軟件，對細胞進行FACS分析。激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長530nm。在加入DDC(藍線)后，完整的RBC(黑線)不表現(xiàn)顯著的向更高熒光值漂移，而活化的RBC是以顯著更高的DDC結(jié)合為特征的，反映在峰漂移到更高的熒光值(紅線)。X軸代表530nm下的熒光，Y軸代表RBC數(shù)。
圖4DDC與活化血小板的選擇性結(jié)合；流式細胞測定分析暴露于膠原和凝血酶，使血小板活化。(a)顯示DDC與活化血小板選擇性結(jié)合的FACS斑點分析Y軸顯示530nm下的熒光強度，說明DDC結(jié)合，X軸顯示前角光散射，這與細胞直徑有關(guān)。對照血小板如左欄所示，表現(xiàn)低水平的熒光，說明缺少顯著的DDC結(jié)合。相形之下，用膠原和凝血酶活化的血小板(如右欄所示)表現(xiàn)明顯增加的熒光值，說明大部分血小板被DDC標記。每欄頂部矩形中的數(shù)字表示顯示熒光值增加的總體內(nèi)血小板的百分率。(b)顯示結(jié)果的FACS直方圖X軸顯示530nm下的熒光強度，Y軸顯示事件的次數(shù)；黑線代表未用DDC處理的對照血小板的熒光，紅線代表DDC染色的活化血小板。一旦活化，對照血小板的峰顯示向更高熒光值強烈漂移，反映了DDC與這些細胞的明顯的選擇性結(jié)合。
圖5用DDC體內(nèi)檢測肝細胞程序死亡按照Ogasawara等的模型，通過抗Fas抗體的靜脈內(nèi)給藥誘導小鼠肝細胞程序死亡(Nature，364806-809，1993)。然后向抗Fas抗體處理的和對照未處理的動物注射DDC(70mg/kg)。兩小時后，處死動物，取出肝臟，冷凍。然后制備低溫切片，用于病理組織學分析，這是利用熒光顯微鏡檢查法進行的(放大率X600)。(a)對照肝臟，(b)用抗Fas抗體處理的肝臟。箭頭指向經(jīng)歷細胞程序死亡的肝細胞。
圖6用DDC體內(nèi)檢測腫瘤內(nèi)細胞程序死亡的細胞，與TUNEL來自體內(nèi)測定法對比向c57 black小鼠皮下注射D122(小細胞肺癌)細胞。腫瘤發(fā)育至2-3mm后，靜脈內(nèi)給以DDC(70mg/kg)。兩小時后，切下腫瘤，冷凍。然后制備低溫切片，利用熒光顯微鏡檢查法(放大率X600)進行病理組織學分析。肉眼觀察到單一細胞程序死亡的細胞是藍綠色熒光的細胞——圖6A。為了證明DDC與細胞結(jié)合與細胞程序死亡過程之間的聯(lián)系，也制備了低溫切片，用于來自體內(nèi)的細胞程序死亡評價，使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導的dUTP-生物素缺口端標記(TUNEL)染色，這是一種被普遍接受的用于檢測特征性細胞程序死亡DNA裂解的方法。觀察到DDC與腫瘤內(nèi)經(jīng)歷細胞程序死亡的細胞特異性結(jié)合，與TUNEL染色對比——圖6B。
圖7用NST750體內(nèi)檢測化療法誘導的小腸上皮細胞程序死亡將Balb/c小鼠用紫杉醇(300mg/kg)與環(huán)磷酰胺(27mg/kg)的單一劑量組合處理。24小時后，向動物靜脈內(nèi)注射13mg/ml NST750。兩小時后處死動物，對小腸組織進行熒光病理組織學分析。通過NST750檢測，在化療法治療的小鼠小腸腺管中觀察到單一細胞程序死亡的上皮細胞(A)，但是在沒有化療法的小鼠組織中則不然(B)。
實施例實施例1DDL與活化紅細胞(RBC)的選擇性結(jié)合DDL與活化/損傷RBC的選擇性結(jié)合是這樣證明的，在Ca2+的存在下，用N-乙基馬來酰亞胺(NEM)與鈣離子載體A23187聯(lián)合處理，活化新鮮的RBC(Kuypers A.等，1996，Blood，871179-1187)。通過檢測膜結(jié)合后其固有的熒光強度，測量DDL的結(jié)合(激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長530nm)。
將新鮮包裝的紅細胞用緩沖液A(143mM NaCl，2mM KCl，0.1％葡萄糖，10mM NaH2PO4，Ph＝7.4)稀釋至最初體積的0.1，在上述緩沖液中洗滌4次。然后將細胞再懸浮在緩沖液B(55mM NaCl，90mM KCl，0.1％葡萄糖，10mM hepes，Ph＝7.4)中。使用如上制備的細胞作為完整紅細胞對照。關(guān)于活化，將細胞用2mM CaCl2、5μM鈣離子載體A23187與5mM NEM的組合處理。在37℃下培育15-60分鐘。然后將細胞用含有0.1％BSA的緩沖液B洗滌兩次，最后再懸浮在含有2mMCaCl2的緩沖液B中。加入DDL，最終濃度為1μM，通過FACS分析進行所結(jié)合的DDL評價。
如圖1所示，對照RBC不顯著結(jié)合DDL。相形之下，活化RBC表現(xiàn)明顯的DDL結(jié)合，實際上大多數(shù)細胞漂移至更高的熒光值(圖1)。
DDL因此表現(xiàn)與承受PNOM的RBC的選擇性結(jié)合，在本例中PNOM是通過細胞活化誘導的。
實施例2DDC與細胞程序死亡的細胞的選擇性結(jié)合使HeLa S3細胞(ATCC CCL-2.2)生長在Dulbecco氏改性Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)中，培養(yǎng)基補充有2mM L-谷氨酰胺、100單位/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、12.5單位/ml制霉菌素或10％胎牛血清(FCS)。將細胞按5×106細胞/平板的密度接種在10cm3培養(yǎng)平板上，體積10ml，在誘導細胞程序死亡之前培育24小時。
細胞程序死亡是這樣誘導的，在低血清含量培養(yǎng)基(2％FCS)的存在下，用多巴胺(500μM)處理18小時，多巴胺是確證無疑的細胞程序死亡引發(fā)物(Lou J.等，J.Biol.Chem.1998，2733756-3764)。未處理的細胞充當對照，供養(yǎng)在沒有多巴胺的生長培養(yǎng)基中。處理后，用細胞刮器收獲細胞，穿過帶有18G針頭的注射器分離為單一的細胞，按106細胞/ml的密度再懸浮在pH＝7.4的PBS緩沖液中。
使培養(yǎng)物如上所述生長，用HBS(HEPES緩沖鹽水10mMHEPES，150mM NaCl，pH＝7.4)洗滌兩次。通過檢測膜結(jié)合后化合物的固有熒光強度，測量DDC的結(jié)合(激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長530nm)。關(guān)于所述結(jié)合的測量，將細胞用TBS(Tris緩沖鹽水10mMTris，pH 7.4，150mM NaCl)洗滌兩次。將DDC懸浮在pH＝7.4的0.1MNaPPi中，濃度1mM，然后將細胞用最終濃度100μM的DDC培育2-10分鐘，總體積為50μL。然后對細胞進行熒光顯微鏡檢查。利用Olympus熒光顯微鏡(IX70型，激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長530nm)進行觀察。
在用細胞程序死亡引發(fā)物處理的HeLa細胞培養(yǎng)中檢測到單一細胞程序死亡的細胞的強烈熒光(圖2B)。在細胞程序死亡培養(yǎng)物內(nèi)被DDC染色的這部分細胞是很多的。相形之下，未處理的HeLa細胞培養(yǎng)物表現(xiàn)非常低的染色細胞部分，反映了培養(yǎng)物內(nèi)天然存在的細胞死亡過程(圖2A)。DDC通過其與PNOM膜的選擇性結(jié)合，因此表現(xiàn)與培養(yǎng)物中經(jīng)歷細胞程序死亡的細胞的選擇性結(jié)合。
實施例3DDC與活化紅細胞(RBC)的選擇性結(jié)合；流式細胞測定分析研究或證明了DDC與活化或損傷紅細胞(RBC)和對照健康RBC的選擇性結(jié)合。在Ca2+的存在下，用N-乙基馬來酰亞胺(NEM)和鈣離子載體聯(lián)合處理，誘導完整RBC的活化(Kuypers A.等，1996，Blood，87，1179-1187)。
得到新鮮的RBC，用緩沖液A(143mM NaCl，2mM KCl，0.1％葡萄糖，10mM NaH2PO4，Ph＝7.4)稀釋至最初體積的0.1，在上述緩沖液中洗滌4次。然后將細胞再懸浮在緩沖液B(55mM NaCl，90mM KCl，0.1％葡萄糖，10mM Hepes，pH＝7.4)中。然后使用這些細胞作為對照細胞。關(guān)于活化，將細胞在37℃下用2mM CaCl2、5μM鈣離子載體A23187與5mM NEM的組合處理15-60分鐘。然后將細胞用含有0.1％牛血清白蛋白的緩沖液B洗滌兩次，最后再懸浮在含有2mMCaCl2的緩沖液B中。關(guān)于DDC與細胞結(jié)合的檢查，將DDC溶于0.1MNaPPi，pH＝7.4，儲備濃度為1mM。在50μM的最終濃度下進行結(jié)合測定，通過流式細胞測定法評價結(jié)合的水平。
如圖3所示，完整的紅細胞基本上不被DDC染色。不過，作為RBC活化的結(jié)果，全體細胞群經(jīng)歷向更高熒光水平的實質(zhì)性漂移，反映了DDC結(jié)合。因此，DDC表現(xiàn)與活化/損傷RBC的選擇性結(jié)合。
實施例4DDC與活化血小板的選擇性結(jié)合利用流式細胞測定(FACS)分析測定DDC與活化血小板的選擇性結(jié)合。
從健康志愿者獲取富含血小板的血漿。將109新鮮血小板離心(5分鐘，380Xg)，洗滌，再懸浮在臺羅德氏緩沖液(137mM NaCl，2.8mMKCl，1mM MgCl2，12mM NaHCO3，0.4mM Na2HPO4，5.5mM D-葡萄糖，10mM Hepes pH 7.4，0.35％BSA)中。將純化后的血小板保存在冰上，充當對照。
關(guān)于活化，在2mM CaCl2的存在下，將200μl洗滌后的血小板用0.05單位/ml凝血酶與5μg/ml膠原的混合物在37℃下培育5分鐘，最終體積為1ml。培育后，將血小板離心(2分鐘，104rpm)，再懸浮在1ml臺羅德氏緩沖液中。
將活化的和對照未處理的血小板用10μM DDC在室溫下培育5分鐘。然后使用Beckton-Dickinson細胞分類器和CellQuest軟件，對血小板進行流式細胞測定(FACS)分析。在360nm下激發(fā)，在530nm下測量發(fā)射。圖4A顯示活化后結(jié)合DDC的血小板部分。僅有小部分對照血小板表現(xiàn)DDC的結(jié)合(占總體的3.6％)，而血小板活化導致血小板總體的81％獲得明顯的DDC結(jié)合，反映為清楚地漂移至更高熒光強度。如圖4B的FACS直方圖所示，活化作用與全體血小板主要向更高熒光強度漂移有關(guān)。DDC通過其對PNOM的檢測，因此能夠充當有效的藥物，標志和區(qū)分活化的和未活化的血小板。
實施例5體內(nèi)DDC與細胞程序死亡的細胞的選擇性結(jié)合體內(nèi)細胞程序死亡的細胞的選擇性檢測具有大量診斷性和治療性臨床應用。為了證明DDC在完成這項任務中的潛力，采用由抗Fas抗體靜脈內(nèi)給藥誘導的體內(nèi)肝細胞程序死亡的成熟模型(OgasawaraJ.，等，Nature364806-809，1993)。用抗Fas單克隆激動性抗體處理小鼠，誘導肝細胞的細胞程序死亡，引起動物在數(shù)小時內(nèi)死亡。研究包括DDC向抗Fas抗體注射的小鼠以及對照未處理動物的靜脈內(nèi)給藥。然后進行熒光病理組織學研究，以評價DDC結(jié)合的水平。
向五周齡雄性BALB/c小鼠靜脈內(nèi)注射10μg/動物的純化倉鼠抗Fas單克隆抗體(Jo2，PharMingen，San Diego，CA)。然后向小鼠靜脈內(nèi)注射70mg/kg DDC。注射是在抗體處理后30分鐘進行的。向?qū)φ談游飪H注射DDC，沒有抗體給藥。在抗體給藥后三小時處死全部動物，然后取出器官。將肝臟橫向切片，穿過每葉中部，立即浸入液氮中，然后轉(zhuǎn)移至-80℃下達24小時。然后將器官轉(zhuǎn)移至OCT溶液中，制備低溫切片(5μm)。對這些切片進行熒光顯微鏡檢查。將平行切片用蘇木精/曙紅(H&E)染色，同時評價表現(xiàn)DDC結(jié)合的細胞的特征性細胞程序死亡形態(tài)學。
用DDC注射的對照動物肝切片不表現(xiàn)顯著的熒光，也就是說觀察到?jīng)]有顯著的DDC結(jié)合(圖5A)。相形之下，在用抗Fas抗體處理的動物肝臟中觀察到明顯的、DDC與大量細胞程序死亡的細胞的特異性結(jié)合(圖5B，箭頭標示若干細胞程序死亡的細胞)。與H&E染色比較，確認了表現(xiàn)DDC結(jié)合的細胞的確具有特征性細胞程序死亡形態(tài)學。
這些實驗因此證明DDC在全身給藥后體內(nèi)檢測和選擇性結(jié)合細胞程序死亡的細胞的潛力。
實施例6用DDC體內(nèi)檢測腫瘤內(nèi)細胞程序死亡的細胞原發(fā)性腫瘤的特征之一是存在腫瘤細胞的細胞程序死亡，同時存在瘤性細胞的增殖?，F(xiàn)已清楚，原發(fā)性腫瘤內(nèi)增殖與細胞程序死亡之間的凈平衡是重要的預后因素和轉(zhuǎn)移瘤的預示(Naresh，K.Y.，等，Cancer，91578-594，2001)。非常普遍的細胞程序死亡的細胞與更加惡性的腫瘤和更差的預后有關(guān)。因此，用以體內(nèi)評價腫瘤內(nèi)細胞程序死亡負荷的非侵入性診斷與預測工具在臨床腫瘤學中具有潛在的重要的應用。
DDC因此用于檢測腫瘤內(nèi)細胞程序死亡的細胞。通過皮下注射0.5×106細胞/動物的D122腫瘤細胞，在12周齡c57 black小鼠中誘發(fā)Lewis肺癌(3LL)的原發(fā)性腫瘤。如Eisenbach L，等供養(yǎng)腫瘤細胞系(Int.J.Cancer，34.567-573，1984)。注射后兩周，當觀察到2-3mm的腫瘤時，向動物靜脈內(nèi)注射70mg/kg DDC。兩小時后取出腫瘤，迅速冷凍在液氮中。然后制備低溫切片，利用熒光顯微鏡進行病理組織學分析(放大率X600)。
圖6A證明了DDC在全身給藥后體內(nèi)檢測腫瘤內(nèi)細胞程序死亡的細胞的能力。這類檢測允許計算腫瘤的細胞程序死亡指數(shù)(AI)。為了證明利用DDC實現(xiàn)的這種指數(shù)的確反映腫瘤內(nèi)的細胞程序死亡負荷，使用TUNEL進行平行染色，這是一種被充分接受的用于檢測特征性細胞程序死亡核小體間DNA裂解的方法(圖6B)。利用這兩種檢測方法，可以在腫瘤內(nèi)觀察到相似數(shù)量的細胞程序死亡的細胞。DDC因此能夠體內(nèi)檢測腫瘤內(nèi)的細胞程序死亡負荷。它在全身靜脈內(nèi)給藥后體內(nèi)測量腫瘤AI的靈敏性類似于TUNEL操作對來自體內(nèi)的組織切片的直接鑒定。
實施例7NST750檢測化療法誘導的小腸上皮細胞程序死亡在對癌癥患者施用化療法期間經(jīng)常觀察到胃腸損傷。具體而言，小腸腺管表現(xiàn)上皮細胞程序死亡，是對化療法和輻射的早期反應(Keefe，D.M.K.，等，Gut，47632-637，2000)。因此評價了NST750化合物體內(nèi)檢測用單一劑量化療法處理的健康小鼠小腸細胞程序死亡過程的能力。
向12周齡Balb/c小鼠或瑞士小鼠靜脈內(nèi)給以紫杉醇(300mg/kg)與環(huán)磷酰胺(27mg/kg)的單一劑量組合。不接受化療法的動物充當對照。24小時后，向全部動物靜脈內(nèi)注射13mg/kg的NST750。兩小時后處死動物，將小腸冷凍，制備低溫切片，用于熒光顯微鏡檢查。
在化療法處理的小鼠小腸腺管中檢測到強烈結(jié)合NST750的大量細胞程序死亡的細胞(圖7A)。相形之下，在對照未處理的動物中觀察到?jīng)]有顯著的NST750染色(圖7B)。NST750因此表現(xiàn)對化療法誘導的小腸上皮細胞程序死亡的選擇性結(jié)合和檢測。這為這種化療副作用的早期與靈敏監(jiān)測提供了工具(單一劑量抗癌治療后僅24小時)。NST750的這種活性因此可以在抗癌治療的優(yōu)化中具有重要的臨床應用。
實施例8NST750的合成按照下列流程合成NST750 在二異丙基乙胺(DIPEA)的存在下，使L-天冬酰胺與芐酯基(Z)氯反應，收率63％。將Z-保護的天冬酰胺2(50g)在500mL二甲基甲酰胺(DMF)/100mL水混合物中冷卻至0℃，一次性用85g雙-三氟乙酰氧基碘苯處理。在0℃下攪拌10分鐘后，歷時15分鐘向反應滴加31mL吡啶。將溶液在RT下攪拌過夜。在45℃真空中濃縮反應，將所得油溶于500mL水與200mL乙醇的混合物。用吡啶調(diào)節(jié)溶液的pH至5.0，通過真空過濾收集所得大量沉淀。將固體用200mL二氯甲烷洗滌，在40℃真空中干燥，得到3(31g)，收率70％。將Z-保護的衍生物3(31g)轉(zhuǎn)化為中間體4，收率80％。類似地，在二氮雜二環(huán)十一碳烯(BDU)的存在下應用碘代甲烷，幾乎定量地得到甲基酯5。通過氫化作用除去Z-保護基團后得到2-氨基-4-Boc氨基甲基丁酸酯(6)。
在氮下，向預形成的甲醇與乙酰氯的溶液加入異絲氨酸11。回流2小時后，判斷反應完全。將反應混合物濃縮至干，將所得油溶于甲醇/二噁烷混合物，用DIPEA處理，然后加入丁氧羰基(Boc)-酸酐。通常的操作后，粗反應混合物經(jīng)過快速柱色譜純化，使用30％EtOAc/庚烷作為洗脫劑，得到13，收率95％。然后使用Dess Martin試劑氧化化合物13，得到2-酮基-4-Boc氨基甲基丁酸酯7a，收率60％。
在1.3-1.5當量胺6、乙酸和硫酸鎂的存在下，在40℃下進行酮基酯7a的還原性偶聯(lián)。隨后氫化(披鈀碳，50psi，12小時)，得到8，為非對映體的混合物(收率53％)。
化合物8(0.25g)是非對映體的混合物，在RT下使用2N NaOH的二噁烷溶液水解甲基酯達2小時。將反應混合物進一步濃縮至干，得到0.4g白色固體。將對應的固體懸浮在6mL二噁烷中，用5mL 2MHCl/乙醚溶液處理。然后濃縮反應，將殘余物溶于水/二噁烷，用DIPEA調(diào)節(jié)pH至9.2。將所得溶液用丹磺酰氯(2eq.)溶液處理，同時保持反應的pH在9.2左右。完成后，將反應用水(10mL)稀釋，用乙醚洗滌。棄去醚層，含水層用乙酸乙酯回收，用2M HCl酸化至pH 4.0。將有機層用鹽水洗滌，經(jīng)無水硫酸鎂干燥。濃縮至干后，分離到160mg亮黃色固體。使固體從甲醇/乙醚混合物中結(jié)晶，得到100mg黃色固體亞氨基-雙2-(3-丹磺酰氨基)-丙酸(NST750)。1H NMR(300MHz，CD3OD)，δ8.58(bm，2H)，8.4-8.2(b，4H)，7.6(b，4H)，7.25(b，2H)3.5-3.0(b，4H)，2.9(s，12H)，1.4(m，2H).MS(ESI)658.2(M+H).
實施例9NST740的合成按照下列流程合成NST740 使用雙-三氟乙酰氧基碘苯，將芐酯基(cbz)-D-天冬酰胺1轉(zhuǎn)化為2-cbz保護的2，3-二氨基丙酸2，收率非常良好。使2(7.2g)在乙酰氯與甲醇的溶液中回流，得到定量收率的甲基酯鹽酸鹽。將該鹽進一步懸浮在無水二氯甲烷中，用2.5當量三乙胺處理。一旦得到澄清溶液，將所得溶液用丹磺酰氯溶液處理。在RT下攪拌過夜后，反應完全。將反應混合物用100mL二氯甲烷(DCM)稀釋，連續(xù)用含水飽和碳酸氫鈉(2×100mL)、水(100mL)和鹽水洗滌。將所得有機溶液干燥(MgSO4)，濃縮至干。所得油經(jīng)過硅膠色譜純化(10％EtOAc/CHCl3)，得到3，收率72％。將一部分該原料(3.5g)在四氫呋喃(THF)/MeOH混合物中水解，普通的操作后得到3.4g的4，為亮黃色固體。同時，將5.6g的3除去氨基甲酸芐基酯，得到氨基酯5，收率良好。將4(0.5g)用1當量二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)處理5小時，導致完全轉(zhuǎn)化為所需的NHS酯，收率83％。將該酯進一步溶于無水THF，用等摩爾量5處理。6小時后，將反應混合物用乙酸乙酯稀釋，用飽和NH4Cl洗滌，除去NHS副產(chǎn)物。有機層進一步經(jīng)硫酸鎂干燥，濃縮至干，得到0.8g二肽6，收率77％，HPLC分析純度＞95％。隨后在氫氧化鈉的二噁烷溶液中水解甲基酯，以通常的方式(H2/Pd)除去芐酯基保護基團，得到2-(3-丹磺酰氨基-2-氨基丙酰氨基)-3-丹磺酰氨基丙酸(NST740)。1H NMR(300MHz，CD3OD)，δ8.53(dd，2H，J＝8.5，8.6 Hz)，8.34(d，J＝8.67 Hz，1H)，8.24(dd，J＝8.6，7.3 Hz，2H)，8.12(d，7.32 Hz，1H)，7.5(m，4H)，7.26(d，J＝7.56 Hz，1H)，7.19(d，J＝6.98 Hz，1H)，4.18(t，J＝4.34 Hz，1H)，3.65(t，J＝3.45 Hz，1H)，3.2(m，4H)，2.85(s，12H).MS(ESI)657.16(M+H).
實施例10NST751的合成按照下列流程合成NST751 在甲苯中回流4-環(huán)己烯-1，2-二羧酸酐1(30g)與催化量的硫酸以及10當量異丙醇。在回流下攪拌6小時后，分離到30g二異丙基-4-環(huán)己烯-1，2-琥珀酸酯2。將化合物2(7g)用四氧化鋨、再用乙酸鉛進行氧化性裂解。普通的操作之后，得到7g二異丙基雙-1，2-(2-乙醛)間琥珀酸酯3，直接用于下一步。將化合物3(6.8g)溶于乙醇，用1當量硼氫化鈉處理。在0℃下攪拌1小時后，反應完全(Rf30.4，Rf40.1∶40％EtOAc/庚烷)，小心地加入1M HCl猝滅反應。在真空中除去有機層，含水層用乙酸乙酯萃取。經(jīng)硫酸鎂干燥和在真空中濃縮后，得到二異丙基雙-1，2-(2-乙醇)間琥珀酸酯4(6.8g)，收率90％。1H NMR 1.3 ppm(14H，異丙基酯)，3.6ppm(4H，羥甲基)將二醇4(6.8g)溶于無水二氯甲烷，用3當量三乙胺處理，然后在0℃下緩慢加入2當量甲磺酰氯達兩小時。加入飽和氯化銨溶液猝滅反應混合物，收集有機層，用鹽水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，過濾。濃縮濾液至干，然后硅膠色譜純化，得到二異丙基雙-1，2-(2-甲磺?；一?間琥珀酸酯5(4g)，收率55％。
在40℃下，將雙甲磺酸酯5用疊氮化鈉的二甲基甲酰胺(DMF)溶液處理3小時。通常的操作之后，分離到二異丙基雙-1，2-(2-疊氮乙基)間琥珀酸酯6，收率93％。將化合物6(2.1g)溶于乙醇/水(3∶1)混合物，在30℃下用氫氧化鈉(2eq)處理過夜。將反應用水稀釋，在真空中除去大量乙醇，含水層用乙醚洗滌。將含水層用乙酸乙酯(100mL)回收，用3M HCl酸化至pH 2.5。在真空中濃縮后，得到1.5g二元酸。將所得疊氮基酸溶于乙醇/2M NaOH(10∶1)混合物，在50psi氫下經(jīng)過披鈀碳氫化兩小時。完全轉(zhuǎn)化為二胺，反應混合物經(jīng)C鹽過濾，濃縮濾液至干，得到1.5g粘性固體，隨后與丹磺酰氯反應，得到雙-1，2-(丹磺?；?3-氨基乙基)間琥珀酸(NST751)。1H NMR(300 MHz，CD3OD)，δ8.50(d，J＝8.6 Hz，2H)，8.35(d，J＝8.8 Hz，2H)，8.15(t，J＝4.5 Hz，2H)，7.51(m，4H)，7.19(d，J＝8.3 Hz，2H)，2.87(s，12H)，2.75(m，4H)，2.3(m，1H)，2.2(m，1H)，1.5(m，2H)，1.29(m，2H).MS(ESI)671.0(M+H).
權(quán)利要求
1.擾亂膜結(jié)合性化合物(PMBC)在藥物制備中的用途，該藥物用于與經(jīng)歷其正常膜組織化擾亂的細胞選擇性結(jié)合，所述PMBC具有式Ce，其中e選自1、2和3，C是具有式(I)的基團 包括式(I)結(jié)構(gòu)的藥學上可接受的鹽和水合物，其中所述C基團可以各自是相同或不同的；Z代表由環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基或這類基團的組合構(gòu)成的環(huán)系，所述環(huán)系由5-10個原子組成；X代表CH、CH2、N、NH、O或S；n、m、r和p各自獨立地是0或1；其中n+r＝1；m+p＝1；R1可以各自是相同或不同的，獨立地選自由A和L-A組成的組，其中L可以各自是相同或不同的，獨立地選自由D、U、U-D、D-U、D-U-O、O-U-D、D-U-NH、NH-U-D、D-U-D和U-D-U組成的組；U代表氫或者選自可選被取代的C1-C6亞烷基、C2-C6亞烯基、C3-C6支鏈亞烷基、C3-C6支鏈亞烯基、C3-C6亞環(huán)烷基、亞環(huán)烯基、芳基、亞雜環(huán)烷基、亞雜環(huán)烯基、雜芳基和所述基團的任意組合；D選自由O、S、SO、SO2、SO2NH、NHSO2、NH、PO、PO2、POOH、PO(NH)2、NHPOOH、CO、C(O)O、NHCO、CONH、SO2NHCHCOOH、SO2NHCO或當D是二價原子團時上述列表的對應含義組成的組；A可以各自是相同或不同的，當e是1時，A是在pH約7下帶電的部分；或者當e是2或3時，A獨立地選自極性不帶電部分和在pH約7下帶電的部分，所述帶電部分是帶正電的、帶負電的或兩性離子形式；R2是WR3b，其中W缺無或者選自由仲或叔胺、氧、硫、碳和D組成的組，其中D是如上所定義的；R3代表氫或C1-C6烷基、C2-C6鏈烯基、C3-C8支鏈烷基、C3-C8支鏈烯基；R3部分可以是相同或不同的；b是1、2或3；當e是2或3時，C基團是彼此直接或者通過L部分連接的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述Ce結(jié)構(gòu)的PMBC中的e是2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其中在所述PMBC中，Z代表由環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基構(gòu)成的環(huán)系，所述環(huán)系由5或6個原子組成；U代表可選被取代的C1-C6亞烷基、C2-C6亞烯基、C3-C6支鏈亞烷基、C3-C6支鏈亞烯基和所述基團的任意組合；R2由WR3b組成，其中W缺無或者選自由仲或叔胺、氧和硫組成的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項的用途，其中在所述PMBC中，b是2，R3獨立地選自下列組合(a)甲基，(b)丁基，(c)已基，(d)丁基與甲基，(e)己基與甲基的組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2的、如權(quán)利要求1或2所定義的Ce結(jié)構(gòu)PMBC的用途，其中C具有式(II) 包括其藥學上可接受的鹽和水合物，其中R1、R2、n、m、r和p具有與權(quán)利要求1定義相同的含義。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的、如權(quán)利要求3所定義的Ce結(jié)構(gòu)PMBC的用途，其中C具有式(II)，包括其藥學上可接受的鹽。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的、如權(quán)利要求4所定義的Ce結(jié)構(gòu)PMBC的用途，其中C具有式(II)，包括其藥學上可接受的鹽。
8.Ce結(jié)構(gòu)的化合物，其中C是如權(quán)利要求1所定義的，e是1，其條件是L不是-(CH2)5-。
9.Ce結(jié)構(gòu)的化合物，其中C是如權(quán)利要求1所定義的，e是2，C基團是彼此直接或者通過L部分連接的，其中L具有與權(quán)利要求1定義相同的含義，下列化合物除外N2，N6-雙[[5-(二甲氨基)-1-萘基]磺酰基]-L-賴氨酸；N，N’-雙[[5-(二甲氨基)-1-萘基]磺?；鵠-L-胱氨酸；N，O-雙[[5-(二甲氨基)-1-萘基]磺?；鵠-L-酪氨酸；和N，N”-雙[[2-(5-(二甲氨基)萘-1-磺?；?氨基乙基]氨基甲酰基甲基]二亞乙基三胺-N，N’，N-三乙酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的化合物，其中Z代表由環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基構(gòu)成的環(huán)系，所述環(huán)系由5或6個原子組成；U代表可選被取代的C1-C6亞烷基、C2-C6亞烯基、C3-C6支鏈亞烷基、C3-C6支鏈亞烯基和所述基團的任意組合；R2由WR3b組成，其中W缺無或者選自由仲或叔胺、氧和硫組成的組。
11.根據(jù)權(quán)利要求8-10任意一項的化合物，其中b是2，R3獨立地選自下列組合(a)甲基，(b)丁基，(c)己基，(d)丁基與甲基，(e)己基與甲基的組合。
12.根據(jù)權(quán)利要求8的Ce結(jié)構(gòu)化合物，其中e是1，C具有式(II) 包括其藥學上可接受的鹽和水合物，其中R1、R2、n、m、r和p具有與權(quán)利要求1定義相同的含義，其條件是L不是-(CH2)5-。
13.根據(jù)權(quán)利要求9的Ce結(jié)構(gòu)化合物，其中e是2，C具有式(II) 包括其藥學上可接受的鹽和水合物，其中R1、R2、n、m、r和p具有與權(quán)利要求1定義相同的含義。
14.根據(jù)權(quán)利要求10的化合物，其中C具有式(II)，包括其藥學上可接受的鹽。
15.根據(jù)權(quán)利要求11的化合物，其中C具有式(II)，包括其藥學上可接受的鹽。
16.根據(jù)權(quán)利要求12-15任意一項的化合物，其中C具有式(II)，其中萘基的一個環(huán)與選自結(jié)構(gòu)-SO2-(NH)-(CH2)v-A和-SO2-O-(CH2)v-A的單元連接，其中v代表整數(shù)1；該萘基的第二個環(huán)與單烷基或二烷基氨基連接；A是由氨基和/或酸性基團構(gòu)成的帶電基團，其中酸性基團選自羧酸、磷酸、磷酸鹽、磺酸和硫酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求8或9的Ce結(jié)構(gòu)化合物，其中C具有下式(III) 包括其藥學上可接受的鹽和水合物，其中A是由氨基和/或羧酸基團構(gòu)成的帶電基團，至少一個R3是C1-C6烷基，L是-SO2-(NH)-(CH2)v單元，其中v代表整數(shù)1-5。
18.根據(jù)權(quán)利要求8的式(IV)化合物 包括其藥學上可接受的鹽和水合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-7任意一項的用途，其中在所述PMBC中，當e＞1時，C基團是彼此直接或者通過L部分連接的，其中L具有與權(quán)利要求1定義相同的含義。
20.根據(jù)權(quán)利要求9-17任意一項的化合物，其中當e＞1時，C基團是彼此直接或者通過L部分連接的，其中L具有與權(quán)利要求1定義相同的含義。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的、下列通式(V)PMBC的用途 包括其藥學上可接受的鹽和水合物，其中G1、G2、G3和G4可以是相同或不同的，獨立地選自氫、COOH、C(O)NH2、NH2和-N+(CH3)3；M選自缺無、C(O)NH、NH、O、S、S-S、CH2、(CH2)2、NH-(CH2)2NH、N(CH2)kCOOH和N+(CH3)(CH2)kCOOH；Q1、Q2、Q3和Q4可以是相同或不同的，獨立地選自缺無或(CH2)k；k是整數(shù)1-6；R3代表氫或C1-C6烷基。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的式(V)化合物，其中M、G1、G2、G3、G4、Q1、Q2、Q3、Q4、k和R3是如權(quán)利要求21所定義的。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的下式(VI)化合物 包括其藥學上可接受的鹽和水合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的下式(VII)化合物 包括其藥學上可接受的鹽和水合物，其中R3具有與權(quán)利要求1定義相同的含義，y代表整數(shù)2-6，z代表整數(shù)1-6，T選自缺無、氫和甲基。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的化合物，其中R3選自甲基、丁基和己基，y是2或3，z是1、2或3。
26.根據(jù)權(quán)利要求22的下式(VIII)化合物 包括其藥學上可接受的鹽和水合物。
27.根據(jù)權(quán)利要求22的下式(IX)化合物 包括其藥學上可接受的鹽和水合物，其中R3代表氫或甲基。
28.根據(jù)權(quán)利要求21的式(X)PMBC的用途 包括其藥學上可接受的鹽和水合物。
29.根據(jù)權(quán)利要求21的式(XI)PMBC的用途 包括其藥學上可接受的鹽和水合物。
30.根據(jù)權(quán)利要求19的式(XII)PMBC的用途 包括其藥學上可接受的鹽和水合物，其中R3獨立地選自甲基、丁基和己基。
31.如權(quán)利要求1所定義的PMBC或根據(jù)權(quán)利要求8或9的化合物的用途，它們是直接或者通過連接基團Y與選自固體載體、成像標志和藥物的成員連接的。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的用途，包含連接所述PMBC或化合物與固體載體，用于制造藥物，該藥物用于廓清具有擾亂膜的循環(huán)細胞或細胞結(jié)構(gòu)的體液。
33.根據(jù)權(quán)利要求31的用途，包含連接所述PMBC或化合物與成像標志，用于制造藥物，該藥物用于檢測生物細胞中的擾亂膜。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的用途，其中該標志用于熒光、X-射線、CT掃描、MRI、放射性同位素掃描或PET掃描的檢測。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的用途，其中該標志選自金屬離子用于放射性同位素掃描的Tc-99m和In-111，用于MRI的Gd。
36.根據(jù)權(quán)利要求31、33-35任意一項的用途，其中Y連接基團包含金屬螯合基團，用于螯合可檢測的標記；所述螯合基團選自任意下列結(jié)構(gòu) 其中所述螯合基團經(jīng)由其氨基之一與化合物連接。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的用途，其中所述Y連接基團包含如權(quán)利要求1所定義的L單元。
38.根據(jù)權(quán)利要求31的用途，包含連接所述PMBC或化合物與藥物，用于制造藥物，該藥物用于治療以細胞、組織或細胞結(jié)構(gòu)擾亂膜的存在為特征的疾病。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的用途，其中該藥物選自細胞程序死亡抑制劑、細胞毒劑、抗血小板劑、抗凝劑、纖維蛋白溶解劑、抗炎藥和免疫調(diào)節(jié)藥。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的用途，其中該藥物選自天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶抑制劑、Bcl-2系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑、抗癌劑、抗凝劑、抗血小板劑、肝素、小分子肝素、糖蛋白IIb/IIIa拮抗劑、組織纖溶酶原激活劑(tPA)或凝血因子抑制劑，例如凝血酶抑制劑或Xa因子抑制劑。
41.檢測生物細胞中擾亂膜(PM)的方法，該方法包含(i)使細胞與如權(quán)利要求1所定義的式(I)PMBC接觸；(ii)檢測與所述細胞結(jié)合的PMBC的存在；顯著量所結(jié)合的化合物的存在說明在細胞中存在PM。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，用于檢測經(jīng)歷死亡過程的細胞。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，用于檢測經(jīng)歷細胞程序死亡的細胞。
44.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，用于檢測促凝血粒子，選自活化的血小板、血小板派生的微粒和細胞程序死亡的尸體。
45.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，用于檢測活化的炎性細胞，選自活化的白細胞和活化的組織巨噬細胞。
46.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，用于檢測疾病，選自以過度細胞程序死亡的發(fā)生為特征的疾病；變性障礙、神經(jīng)變性障礙、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓舞蹈病、AIDS、脊髓發(fā)育不良綜合征、缺血或毒性發(fā)作、移植排斥期間移植細胞丟失；表現(xiàn)為過度凝血的疾?。粍用}或靜脈血栓形成、血栓栓塞、心肌梗塞、腦中風、深靜脈血栓、播散性血管內(nèi)凝血(DIC)、血栓形成性血小板減少性紫癜(TTP)、鐮刀細胞疾病、地中海貧血、抗磷脂抗體綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡；炎癥和/或與免疫介導的病因?qū)W或發(fā)病機理有關(guān)的疾??；自體免疫障礙、抗磷脂抗體綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、結(jié)締組織障礙，例如類風濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮?。患谞钕傺?；皮膚病學障礙、天皰瘡、結(jié)節(jié)性紅斑；自體免疫性血液病學障礙；自體免疫性神經(jīng)病學障礙、重癥肌無力；多發(fā)性硬化；炎性腸障礙、潰瘍性結(jié)腸炎；結(jié)節(jié)性脈管炎。
47.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，用于檢測動脈粥樣硬化斑。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，用于檢測不穩(wěn)定的動脈粥樣硬化斑。
49.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，用于檢測腫瘤內(nèi)的細胞程序死亡、監(jiān)測腫瘤的侵襲或者檢測腫瘤的轉(zhuǎn)移。
50.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，用于監(jiān)測腫瘤對抗癌治療的響應，選自化療法和放療法。
51.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，用于監(jiān)測抗癌治療的副作用，它們是由于誘導事與愿違的正常細胞程序死亡而引起的。
52.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，用于監(jiān)測移植器官在移植術(shù)后的存活。
53.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，用于監(jiān)測以過度細胞程序死亡為特征的疾病中對細胞保護療法的響應。
54.藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求8或9的化合物作為活性成分，和藥學上可接受的載體。
55.用于檢測生物細胞中擾亂膜的藥物組合物，該組合物包含如權(quán)利要求1所定義的PMBC作為活性成分，以及藥學上可接受的載體。
56.根據(jù)權(quán)利要求55的藥物組合物，其中該活性成分一種標志結(jié)合，該標志用于熒光、X-射線、CT掃描、MRI、放射性同位素掃描或PET掃描的檢測。
57.根據(jù)權(quán)利要求56的藥物組合物，其中該標志選自金屬離子用于放射性同位素掃描的Tc-99m和In-111，用于MRI的Gd。
58.用于治療疾病的藥物組合物，該疾病是以細胞、組織或細胞結(jié)構(gòu)中擾亂膜的存在為特征的，該組合物包含藥學上可接受的載體和有效量的活性成分，所述活性成分包含由如權(quán)利要求1所定義的PMBC和醫(yī)用藥物構(gòu)成的藥物-綴合物。
59.根據(jù)權(quán)利要求58的藥物組合物，其中所述藥物選自天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶抑制劑、Bcl-2系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑、細胞毒劑、抗凝劑、抗血小板劑、肝素、小分子肝素、糖蛋白IIb/IIIa拮抗劑、組織纖溶酶原激活劑、抗炎藥或免疫調(diào)節(jié)藥。
60.根據(jù)權(quán)利要求59的藥物組合物，其中該藥物是凝血因子抑制劑。
61.根據(jù)權(quán)利要求60的藥物組合物，其中該藥物是凝血酶抑制劑或Xa因子抑制劑。
62.根據(jù)權(quán)利要求58的藥物組合物，用于檢測、預防或治療疾病，選自以過度細胞程序死亡的發(fā)生為特征的疾??；變性障礙、神經(jīng)變性障礙、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓舞蹈病、AIDS、脊髓發(fā)育不良綜合征、缺血或毒性發(fā)作、移植排斥期間移植細胞丟失；表現(xiàn)為過度凝血的疾?。粍用}或靜脈血栓形成、血栓栓塞、心肌梗塞、腦中風、深靜脈血栓、播散性血管內(nèi)凝血(DIC)、血栓形成性血小板減少性紫癜(TTP)、鐮刀細胞疾病、地中海貧血、抗磷脂抗體綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡；炎癥和/或與免疫介導的病因?qū)W或發(fā)病機理有關(guān)的疾??；自體免疫障礙、抗磷脂抗體綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、結(jié)締組織障礙，例如類風濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮?。患谞钕傺?；皮膚病學障礙、天皰瘡、結(jié)節(jié)性紅斑；自體免疫性血液病學障礙；自體免疫性神經(jīng)病學障礙、重癥肌無力；多發(fā)性硬化；炎性腸障礙、潰瘍性結(jié)腸炎；結(jié)節(jié)性脈管炎；動脈粥樣硬化斑；不穩(wěn)定的動脈粥樣硬化斑。
63.根據(jù)權(quán)利要求32的用途，其中所述PMBC或化合物被固定在涂有樹脂的珠粒上。
64.用于廓清體液中的具有擾亂膜的循環(huán)細胞或細胞結(jié)構(gòu)的過濾裝置，包含被固定的權(quán)利要求32的PMBC或化合物、流體入口和流體出口。
65.用于廓清血液中的具有擾亂膜的循環(huán)細胞或細胞結(jié)構(gòu)的體外循環(huán)儀器，包含權(quán)利要求64的過濾裝置。
66.從體液中除去含有PM的細胞或含有PM的結(jié)構(gòu)的方法，該方法包含使體液與固定在固體載體上的、如權(quán)利要求1所定義的PMBC或如權(quán)利要求8或9所定義的化合物接觸，接觸的條件和時間足以使含有PM的細胞或含有PM的結(jié)構(gòu)與被固定的化合物結(jié)合，由此從體液中除去至少一部分所述含有PM的細胞或粒子。
67.治療或預防疾病的方法，該疾病選自以過度細胞程序死亡的發(fā)生為特征的疾病；變性障礙、神經(jīng)變性障礙、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓舞蹈病、AIDS、脊髓發(fā)育不良綜合征、缺血或毒性發(fā)作、移植排斥期間移植細胞丟失；表現(xiàn)為過度凝血的疾病；動脈或靜脈血栓形成、血栓栓塞、心肌梗塞、腦中風、深靜脈血栓、播散性血管內(nèi)凝血(DIC)、血栓形成性血小板減少性紫癜(TTP)、鐮刀細胞疾病、地中海貧血、抗磷脂抗體綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡；炎癥和/或與免疫介導的病因?qū)W或發(fā)病機理有關(guān)的疾??；自體免疫障礙、抗磷脂抗體綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、結(jié)締組織障礙，例如類風濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病；甲狀腺炎；皮膚病學障礙、天皰瘡、結(jié)節(jié)性紅斑；自體免疫性血液病學障礙；自體免疫性神經(jīng)病學障礙、重癥肌無力；多發(fā)性硬化；炎性腸障礙、潰瘍性結(jié)腸炎；結(jié)節(jié)性脈管炎；動脈粥樣硬化斑；不穩(wěn)定的動脈粥樣硬化斑；所述方法包含對需要這樣一種治療的受治療者給以治療有效量的如權(quán)利要求1所定義的PMBC，所述PMBC包含藥物或者與藥物結(jié)合，以構(gòu)成根據(jù)權(quán)利要求38的藥物綴合物，從而定向醫(yī)用藥物于患有疾病的細胞或組織。
68.治療癌癥的方法，包含對需要這樣一種治療的受治療者給以治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求38的PMBC-藥物綴合物，其中與PMBC結(jié)合或者包含在PMBC內(nèi)的藥物是細胞毒劑。
69.治療癌癥的方法，該方法包含(i)對需要這樣一種治療的受治療者給以化療法和/或放療法，所述療法致力于增強腫瘤內(nèi)的內(nèi)在細胞程序死亡負荷，隨后(ii)對所述受治療者給以治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求38的PMBC-藥物綴合物，其中與PMBC結(jié)合或者包含在PMBC內(nèi)的藥物是細胞毒劑。
70.如權(quán)利要求8-18、20和22-27任意一項所定義的化合物在藥劑制備中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供化合物的用途，這些化合物與經(jīng)歷其正常膜組織化擾亂與改變的細胞選擇性結(jié)合，而與具有正常組織化膜的細胞結(jié)合的程度則低得多。這些化合物被稱為擾亂膜結(jié)合性化合物(PMBC)。PMBC類化合物包括新化合物和已知化合物。
文檔編號A61P25/00GK1484526SQ01821435
公開日2004年3月24日 申請日期2001年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月6日
發(fā)明者I·齊夫, A·舍范, S·埃伯納, , I 齊夫 申請人:Nst神經(jīng)存活技術(shù)有限公司