專利名稱：人胎兒背根神經(jīng)節(jié)干細(xì)胞的分離、制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了利用有絲分裂因子EGF和bFGF，首次從周圍神經(jīng)系統(tǒng)分離出背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)干細(xì)胞，并進(jìn)行體外和誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。這類細(xì)胞具有明顯的干細(xì)胞特征，能分化為大小感覺神經(jīng)元、衛(wèi)星細(xì)胞和雪旺氏細(xì)胞的潛能。體內(nèi)定位分布和周圍神經(jīng)損傷后的活性研究表明，DRG干細(xì)胞主要定位在成熟節(jié)細(xì)胞周圍，受損傷刺激后部分細(xì)胞進(jìn)入增殖分裂期。另外，DRG干細(xì)胞能夠進(jìn)行體外-196℃保存和復(fù)蘇，復(fù)蘇后細(xì)胞仍具有干細(xì)胞特性。這就為體外大量擴(kuò)增、儲(chǔ)存干細(xì)胞，用于治療各種先天性或獲得性神經(jīng)系統(tǒng)疾病引起的神經(jīng)細(xì)胞缺損、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤以及周圍神經(jīng)損傷特別是神經(jīng)根性撕脫傷提供了新途徑。
目前，神經(jīng)系統(tǒng)很多部位都分離出了神經(jīng)干細(xì)胞，包括嚙齒類成年和胚胎個(gè)體的腦室下區(qū)、端腦、海馬、紋狀體、脊髓，甚至人神經(jīng)組織的大腦、脊髓和嗅球，這些科學(xué)進(jìn)展為研究神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和治療神經(jīng)系統(tǒng)的疾病帶來了前所未有光明前景。然而，這些神經(jīng)干細(xì)胞都來自于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，治療研究的方向也集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)。實(shí)際上，我國乃至整個(gè)世界上，每年因各種原因所導(dǎo)致的周圍神經(jīng)損傷的病人不計(jì)其數(shù)。目前，周圍神經(jīng)損傷，特別是根部撕脫性損傷尚無很好的治療解決辦法。本實(shí)驗(yàn)小組在國際上首次體外培養(yǎng)出了周圍神經(jīng)來源的人背根神經(jīng)節(jié)干細(xì)胞(dorsal root ganglion stem cell，DRG stem cell)，并發(fā)現(xiàn)了體外誘導(dǎo)分化、儲(chǔ)存的有效方法及體內(nèi)的定位，為DRG用于治療周圍神經(jīng)損傷，特別是根性撕脫傷打下基礎(chǔ)。
本發(fā)明的目的是通過下述方法實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明通過分離流產(chǎn)胎兒脊髓兩側(cè)的DRG，制成單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)于加有EGF和bFGF的DMEM/F12(GIBCO)無血清完全培養(yǎng)基中，3-5天后聚集形成懸浮生長的神經(jīng)球，并可進(jìn)行傳代擴(kuò)增。其中膠質(zhì)細(xì)胞占大部分，神經(jīng)元僅占2-10％。免疫組化結(jié)果顯示神經(jīng)球細(xì)胞表達(dá)nestin蛋白--一種神經(jīng)干/祖細(xì)胞表達(dá)的神經(jīng)內(nèi)皮中間纖維絲蛋白；膠質(zhì)細(xì)胞GFAP和S100染色陽性，神經(jīng)元NF染色陽性。本發(fā)明顯示，DRG干細(xì)胞對(duì)血清很敏感，少量血清能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生分化，即具有多潛能分化特性。DRG干細(xì)胞能夠進(jìn)行體外-196℃保存和復(fù)蘇，復(fù)蘇后細(xì)胞仍具有干細(xì)胞特性。胎兒DRG經(jīng)過固定后進(jìn)行石蠟切片，采用nestin單克隆抗體和熒光標(biāo)記的二抗對(duì)組織切片進(jìn)行免疫顯色檢測，發(fā)現(xiàn)DRG干細(xì)胞分布在成熟節(jié)細(xì)胞的周邊；從后肢根部切斷SD大鼠坐骨神經(jīng)，腹腔注射BrdU，對(duì)組織切片進(jìn)行免疫熒光檢測，顯示相應(yīng)DRG的節(jié)細(xì)胞周邊出現(xiàn)S期細(xì)胞，說明當(dāng)受到損傷刺激后，這些細(xì)胞被激活進(jìn)入分裂增生期。
細(xì)胞凍存15天后，迅速37℃溫水復(fù)蘇，復(fù)蘇后細(xì)胞仍具有干細(xì)胞特性。五.背根神經(jīng)節(jié)干細(xì)胞在體研究為研究DRG干細(xì)胞的體內(nèi)分布，我們把16-26周人胎兒DRG經(jīng)過固定后進(jìn)行石蠟切片，采用nestin單克隆抗體和熒光(FITC)標(biāo)記的二抗對(duì)組織切片進(jìn)行免疫顯色檢測，發(fā)現(xiàn)DRG干細(xì)胞分布在成熟節(jié)細(xì)胞的周邊，為研究DRG干細(xì)胞在體內(nèi)的增殖，我們采用成年的SD大鼠(150g左右)，從動(dòng)物后肢根部切斷坐骨神經(jīng)，經(jīng)腹腔注射BrdU，處死動(dòng)物，免疫熒光顯示相應(yīng)DRG的節(jié)細(xì)胞周邊出現(xiàn)S期細(xì)胞，說明部分細(xì)胞被激活進(jìn)入增殖期。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明首次報(bào)道人胎兒背根神經(jīng)節(jié)干細(xì)胞的分離和擴(kuò)增過程，并證明了DRG細(xì)胞的多分化潛能，操作方法簡單可行；2.本發(fā)明確定了DRG干細(xì)胞體外保存和復(fù)蘇的條件，復(fù)蘇后細(xì)胞仍具有干細(xì)胞特性，這就為干細(xì)胞移植治療各種周圍神經(jīng)損傷、先天性神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤打下基礎(chǔ)；3.本發(fā)明為神經(jīng)干細(xì)胞的研究增加了一個(gè)新來源，使神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性研究成為可能；4.本發(fā)明為分子生物學(xué)、藥理學(xué)提供了一種工具細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.首次從周圍神經(jīng)系統(tǒng)分離出背根神經(jīng)節(jié)(dorsal rootganglion，DRG)干細(xì)胞，并利用有絲分裂因子EGF和bFGF進(jìn)行體外和誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。其特征在于這類細(xì)胞具有明顯的干細(xì)胞特征，具有分化為大小感覺神經(jīng)元、衛(wèi)星細(xì)胞和雪旺氏細(xì)胞的潛能。體內(nèi)定位分布和周圍神經(jīng)損傷后的活性研究表明，DRG干細(xì)胞主要定位在成熟節(jié)細(xì)胞周圍，受損傷刺激后部分細(xì)胞進(jìn)入增殖分裂期。另外，DRG干細(xì)胞能夠進(jìn)行體外-196℃保存和復(fù)蘇，復(fù)蘇后細(xì)胞仍具有干細(xì)胞特性。實(shí)現(xiàn)了體外大量擴(kuò)增、儲(chǔ)存干細(xì)胞，作為治療各種先天性或獲得性神經(jīng)系統(tǒng)疾病引起的神經(jīng)細(xì)胞缺損、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤以及周圍神經(jīng)損傷特別是神經(jīng)根性撕脫傷的新途徑。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于人胎兒背根神經(jīng)節(jié)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化、凍存和復(fù)蘇；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于人胎兒背根神經(jīng)節(jié)干細(xì)胞作為一種細(xì)胞模型研究神經(jīng)系統(tǒng)的正?；蚧伟l(fā)育過程，用于研究感覺神經(jīng)元、衛(wèi)星細(xì)胞和Schwann Cells的分化調(diào)節(jié)過程，還可作為分子生物學(xué)、藥理學(xué)的工具細(xì)胞；
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于背根神經(jīng)節(jié)干細(xì)胞用于治療各種先天性或獲得性神經(jīng)系統(tǒng)疾病引起的神經(jīng)細(xì)胞缺損、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤以及周圍神經(jīng)損傷特別是神經(jīng)根性撕脫傷。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)干細(xì)胞的制備及分離方法。涉及了利用有絲分裂因子EGF和bFGF，首次從周圍神經(jīng)系統(tǒng)分離出背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)干細(xì)胞，并進(jìn)行體外和誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。這類細(xì)胞具有明顯的干細(xì)胞特征，能分化為大小感覺神經(jīng)元、衛(wèi)星細(xì)胞和雪旺氏細(xì)胞的潛能。體內(nèi)定位分布和周圍神經(jīng)損傷后的活性研究表明，DRG干細(xì)胞主要定位在成熟節(jié)細(xì)胞周圍，受損傷刺激后部分細(xì)胞進(jìn)入增殖分裂期。另外，DRG干細(xì)胞能夠進(jìn)行體外－196℃保存和復(fù)蘇，復(fù)蘇后細(xì)胞仍具有干細(xì)胞特性。這就為體外大量擴(kuò)增、儲(chǔ)存干細(xì)胞，用于治療各種先天性或獲得性神經(jīng)系統(tǒng)疾病引起的神經(jīng)細(xì)胞缺損、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤以及周圍神經(jīng)損傷特別是神經(jīng)根性撕脫傷提供了新途徑。
文檔編號(hào)A61K35/12GK1458273SQ0210261
公開日2003年11月26日 申請(qǐng)日期2002年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月16日
發(fā)明者趙春華, 張帆, 譚耀紅 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)血液學(xué)研究所