專利名稱：對多種細(xì)胞具刺激增生作用的人血清白蛋白重組融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人血清白蛋白融合蛋白的基因重組及表達(dá)。并論述了單一融合蛋白或不同種類融合蛋白組合使用方法。特別集中闡述了利用酵母菌表達(dá)生產(chǎn)由人血清白蛋白與造血細(xì)胞增生刺激因子所形成的融合蛋白(HSA/CPSF)。血細(xì)胞增生刺激因子包括血紅細(xì)胞增生素(EPO)、白細(xì)胞增生介素(ILs)，干細(xì)胞因子(SCF)，血小板增生素(TPO)，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)和巨噬粒細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等。
背景技術(shù)：
人血清白蛋白(HSA)是一種可溶性單體蛋白質(zhì)，構(gòu)成血液中蛋白總量的一半，白蛋白作為一種基本載體，攜帶傳遞脂肪酸，類固醇和激素分子等。其穩(wěn)定的惰性性質(zhì)是維持血壓的一個重要組成部分。血清白蛋白是一個球狀非糖基化，分子量為65kd的血清蛋白質(zhì)。人血清白蛋白基因位于4號染色體上有16961堿基對，分為15個間隔區(qū)。經(jīng)RNA加工拼接后形成的mRNA可編碼一個具有585個氨基酸的蛋白質(zhì)。這一蛋白(白蛋白前體)在通過高爾基體的轉(zhuǎn)化加工，去除引導(dǎo)多肽，分泌到細(xì)胞外。血清白蛋白有35個胱氨酸，在血液中，白蛋白是一個有17個二巰健的單體(參見Brown JR，“白蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和應(yīng)用”Pergamon，紐約，1977)。當(dāng)沒有分泌多肽時，在酵母細(xì)胞內(nèi)的白蛋白產(chǎn)物是錯配狀態(tài)，將失去90％的抗原性(與血漿中自然狀態(tài)白蛋白相比)，并且是不溶性蛋白質(zhì)，并形成白蛋白聚合體?，F(xiàn)在用于臨床的白蛋白均是由人血漿中提取。利用微生物體重組表達(dá)白蛋白(rHSA)的生產(chǎn)已在專利EP330 451和EP361991中公開。
白蛋白具有多種多態(tài)體及30種不同的遺傳雜分子(Weikamp，CR等，人類遺傳年報，37219-226，1973)。血清白蛋白分子的三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)X-光衍射法測定(Carter，科學(xué)，244，1195-1198，1989)。白蛋白是血液中的主要成分，在人體內(nèi)含量為每升血液含40克。半衰期壽命為14-20天。綜上所述白蛋白具有極大的優(yōu)勢使之可抵御生物體內(nèi)酶的作用。并可使治療性蛋白質(zhì)以較高劑量使用。
利用基因工程技術(shù)將人血清白蛋白與人生長激素在酵母菌中表達(dá)為融合蛋白，其增加了人生長激素在血清中和儲存時的穩(wěn)定性。已在中國的專利申請CN1207131中公開。同理，人血清白蛋白與CD4蛋白受體形成融合蛋白后融合蛋白對HIV-1病毒的親和性與CD4受體蛋白質(zhì)單體相比有相同或更高的結(jié)合度(美國專利6,165,470)。在此均引為參考文獻(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明用動物和細(xì)胞體內(nèi)體外實驗證明了人血清白蛋白與細(xì)胞增生刺激因子形成的融合蛋白可刺激各種血液細(xì)胞增生，并具有比單體的細(xì)胞增生刺激因子在體內(nèi)停留有更長的時間(半衰期)，動物實驗還發(fā)現(xiàn)復(fù)合使用不同的HSA/CPSFs可同時刺激多種細(xì)胞的增生，并具協(xié)同增效作用。
本發(fā)明所涉及的造血細(xì)胞增生刺激因子(CPSF)包括但不局限于，白細(xì)胞介素11(IL-11)，紅細(xì)胞增生素(EPO)，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬粒細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬細(xì)胞集落因子(M-CSF)，血小板生素(TPO)以及白細(xì)介素-3(IL-3)?，F(xiàn)就其特性分別簡述如下①白細(xì)胞介素-11(IL-11)人白細(xì)胞介素-11(IL-11)是由早期分化的骨髓細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的(Paul等，1990，美國國家科學(xué)院院報，877512)。IL-11也在由間葉細(xì)胞中表達(dá)，如基質(zhì)母成纖維細(xì)胞，早期肺成纖維細(xì)胞以及滋養(yǎng)層細(xì)胞等。IL-11刺激血小板的增生。IL-11也稱為Adipogenesis抑制因子(AGIF)，其可作用于造血形成干細(xì)胞和基質(zhì)母細(xì)胞(Kawashima等，生長因子研究進(jìn)展，4191，1992).成熟IL-11是一個非糖基化蛋白。178個氨基酸長，分子量為23千道爾頓。人的IL-11座落在19號染色體，并有5個間隔區(qū)，IL-11的序列與具有類似功能的白細(xì)胞介素-6(IL-6)序列無同源性。IL-11是一種多效的生長因子可作用于多種造血干細(xì)胞的分化，并刺激T-Cell及分泌抗體的B-細(xì)胞發(fā)育。IL-11還可刺激紅細(xì)胞的增生與分化。(Que sniaux，VFJ，等血液，80，1218，1992)。
IL-11(商品名為Neurmaga由美國家庭產(chǎn)品公司生產(chǎn))已獲得FDA批準(zhǔn)，臨床上應(yīng)用于刺激造血干細(xì)胞分化和巨核細(xì)胞前體的增生和誘導(dǎo)骨髓巨核細(xì)胞成熟。結(jié)果是增加血小板的產(chǎn)生。IL-11已用于防止嚴(yán)重的血小板減少癥和化療后減少對血小板輸入的依賴。
②紅細(xì)胞增生素(EPO)EPO是一種糖蛋白，主導(dǎo)血紅細(xì)胞的增生和分裂(美國專利5,547,933)，EPO的產(chǎn)生貫穿人的發(fā)育的各個階段。EPO由腎細(xì)胞中合成，也決定了體內(nèi)紅細(xì)胞的數(shù)量，為各組織器官提供足夠的氧。紅細(xì)胞的增生是由骨髓細(xì)胞分化而來，并在EPO的作用控制下。
EPO是一種酸性糖蛋白分子量在30.4千道爾頓，基因長約582核苷酸由161個氨基酸組成，EPO有三種形式α-，β-和Asialo-EPO。α-和β-EPO只是在碳?xì)浠衔镄揎椛下杂胁煌?，而Asialo-EPO是無碳?xì)浠衔镄揎椀腅PO。在健康人體內(nèi)EPO的含量維持在一個極低的水平，這一數(shù)量是可滿足各器官組織對氧的需求，由于EPO在紅細(xì)胞形成上是必需的，所以EPO在診斷和治療血液病上有著極為重要的作用。由于在血液和尿液中EPO含量極低，大量分離純化EPO用于臨床目的是極為困難的。利用基因工程方法在中國倉鼠細(xì)胞(CHO)中生產(chǎn)制備EPO(美國專利5,547,933)已成為現(xiàn)實，并以Epogen的名稱由美國Amgen公司生產(chǎn)。僅在美國一年就有100萬人貧血而需要EPO治療。EPO還可用于治療許多重要的疾病，各種血液增生異常的病癥，特別是對愛滋病，腫瘤化療患者，藥物及化療，腎透析常常對患者的造血系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重的損害，因而臨床上對EPO的需求量是極大的。
③粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)是由單核細(xì)胞及成纖維細(xì)胞所產(chǎn)生的，它刺激粒細(xì)胞集落形成、增生?；罨戎行园准?xì)胞，分化特定的骨髓淋巴細(xì)胞。并對成熟粒細(xì)胞有極強的活化作用(Metcalf，細(xì)胞，435，1985及Groopman，細(xì)胞，505，1987)。天然的人G-CSF是196千道爾頓糖蛋白，并有177個氨基酸組成(Souza，LM等，科學(xué)，23262，1986)。人和鼠的G-CSF在氨基酸序列上有大約75％的同源性，重組的人G-CSF生物活性是以對NFS-60Cell刺激增生能力測定。重組的G-CSF是由大腸桿菌生產(chǎn)的非糖基化蛋白質(zhì)，商品為Neupogen，由美國Amgen公司生產(chǎn)。
將紅細(xì)胞增生刺激因子(EPO)與粒白細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)利用基因工程技術(shù)形成的融合蛋白使之具有較高的雙重生物活性的方法已在中國專利CN1311332中公開。在此引為參考文獻(xiàn)。
④巨噬粒細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)∶GM-CSF是由骨髓分化而成的骨髓前體細(xì)胞中分離得到的。其刺激巨噬和粒細(xì)胞形成集落。GM-CSF也可作用于刺激成熟巨噬細(xì)胞，嗜酸性白細(xì)胞，嗜中性白細(xì)胞而導(dǎo)致各種功能活性(Mazur E和Cohen J臨床藥學(xué)理論，46250，1989；Morstyn和Burgess癌癥研究，485624，1988)。GM-CSF是酸性蛋白[人18-22千道爾頓(Wong等，科學(xué)，228810，1986)鼠23千道爾頓(Metcalf，血液，67257，1986)]可與GM-CSF敏感細(xì)胞的受體有很高的親合性。雖然人和鼠的GM-CSF在氨基酸序列上有54％的同源性，但其生物活性則有屬種的特異性，其它生長因子和CSFs分子受體結(jié)合也與GM-CSF有共同的作用(Nicola，今日免疫學(xué)，8134。1987)。人的GM-CSF對細(xì)胞刺激增生作用是以TF-1細(xì)胞培養(yǎng)來測定的(Kitamura等，細(xì)胞生理學(xué)雜志，14032，1989)。人GM-CSF基因重組制品以商品名Leukine進(jìn)入市場并由Immunex公司制造和銷售.
⑤巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)M-CSF由單核細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中產(chǎn)生。M-CSF刺激巨噬細(xì)胞克隆的形成(Metcalf，血液，67257，1986)，并增強單粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對抗體依賴細(xì)胞的細(xì)胞毒性(Mufson等，細(xì)胞免疫學(xué)，119182，1989)，MCSF還抑制由骨母細(xì)胞產(chǎn)生的骨吸收效應(yīng)(Hattersley等，細(xì)胞物理雜志，137，199，1988)。M-CSF是一種糖蛋白，根據(jù)糖基化程度的不同而有不等的分子量。蛋白多肽有159個氨基酸組成(Kawasaki等，科學(xué)，230291，1988)。
⑥血小板增生素(TPO)TPO作用在刺激血小板巨核細(xì)胞前體的發(fā)育，作用類似于EPO，TPO作用的結(jié)果增強血小板的數(shù)量，EPO還影響整個造血系統(tǒng)進(jìn)程。尤其在后期具很強的作用。其它的造血系統(tǒng)細(xì)胞介素包括干細(xì)胞因子，白細(xì)胞介素-3、白細(xì)胞介素-6和白細(xì)胞介素-11。
TPO蛋白多肽為335氨基酸，而由于糖基化作用，在SDS-凝膠電泳中顯示分子量約為75千道爾頓，人、鼠、狗的TPO之間有69-75％的同源性。TPO前體為356個氨基酸，含有一個21氨基酸組成的信號多肽。重組表達(dá)的TPO生物活性是以刺激MOF細(xì)胞增生的能力來測定。
⑦白細(xì)胞介素-3(IL-3)白細(xì)胞介素-3是數(shù)目不斷增長的眾多的生長因子中的一員。白細(xì)胞介素-3支持造血系統(tǒng)細(xì)胞前體的增生和分化，并在體內(nèi)和體外作用于各種骨髓前體細(xì)胞。人IL-3成熟蛋白有133個氨基酸，糖基化與否對IL-3在體內(nèi)外的生物活性不具影響。人與鼠的IL-3之間同源性極低。IL-3是由活化的正常T-細(xì)胞產(chǎn)生的(Ihele和Weinstein，1986，Yang和Clark，1998)。IL-3的結(jié)構(gòu)，以及IL-3基因的結(jié)構(gòu)和其在染色體上的位置與其它造血干細(xì)胞生長因子相似。在臨床前和臨床試驗中，IL-3在人體內(nèi)觀察到的影響包括可明顯增加嗜中性白細(xì)胞計數(shù)(ANC)。在體外，IL-3與其它細(xì)胞介素組合使用，包括與干細(xì)胞因子(SCF)，IL-6，IL-1，IL-11，GCSF，EPO或TPO。在半固體培養(yǎng)基中，由IL-3誘導(dǎo)粒巨噬細(xì)胞集落形成單位(CFU-GM)，CFU-EO，CFU-Baso，紅細(xì)胞-Burst形成單位。巨核細(xì)胞集落形成單位(CFU-MK)和粒/紅/巨噬/巨核細(xì)胞形成單位(CFU-GEMM)的增長。IL-3與其它因子共同作用在懸浮培養(yǎng)中，還可刺激純化的CD34+細(xì)胞的增生(Eder等，干細(xì)胞，15327-333。1997)。
除以上所簡述的細(xì)胞增生刺激因子(CPSF)外，還有其它生長因子可以與人血清白蛋白形成融合蛋白用以刺激細(xì)胞增生以達(dá)到治療的目的。
對本發(fā)明的論述將集中在以下幾點1)HSA/CPSF融合蛋白在本發(fā)明中，由核苷酸編碼，HSA和一種CPSF形成融合蛋白，即HSA/CPSF融合，同時可以指出的是任何一種白蛋白均可與一種CPSF用本發(fā)明的方法來形成一種融合蛋白。
CPSF可以是任何一種蛋白，其可刺激細(xì)胞的分化和增生。最典型的一個例子為CPSF是一種造血活性細(xì)胞因子，CPSF的個例在Aggarwal和Puri(1995)“細(xì)胞因子在免疫機制調(diào)節(jié)中的作用”一文中有詳細(xì)的闡述，列為本發(fā)明的參考文獻(xiàn)之一。
本發(fā)明所指的CPSF可以是下列中的任何蛋白質(zhì)類別的一員，包括但不局限于，(1)集落刺激因子有粒白細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬性白細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，嗜酸性白細(xì)胞集落刺激因子(EOS-CSF)(即IL-5)，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF即CSF-1)，復(fù)合性CSF(即IL-3)和EPO。(2)白細(xì)胞介素有白細(xì)胞介素-1，-2，-4，-6，-7，-9，-10，-11，-12，-13和白細(xì)胞介素-18。(3)非集落刺激因子又非白細(xì)胞介素有Steel因子(SLFC-Kit類似物，干細(xì)胞因子和肥大細(xì)胞生長因子)，血紅增活性因子(EPA)，乳鐵蛋白(LF)，H-亞單位鐵蛋白(即酸性異鐵蛋白)，前列腺素(PG)E1和E2，腫瘤壞死因子(TNF)-α和-β，干擾素(IFN)-α，-β，和-γ，轉(zhuǎn)移因子(TGF)-β，活性素，抑制素，白血球抑制因子和Oncostatin-M。(4)Chemokines有巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP)-1-α(即干細(xì)胞抑制因子)，巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP)-1-β，巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP)-2-α(即GRO-β)，GRO-α，M1P-2-β(即GRO-γ)，血小板因子-4，巨噬細(xì)胞趨勢性和活性因子，以及IP-10因子。另外還有，(5)人生長因子如肝細(xì)胞生長因子；表皮細(xì)胞生長因子；神經(jīng)細(xì)胞生長因子；內(nèi)皮細(xì)胞生長因子等。
四種典型集落刺激因子能啟動骨髓前細(xì)胞，原細(xì)胞和母細(xì)胞的激活和增生的CPSF已經(jīng)被詳細(xì)地研究了。它們是GM-CSF，G-CSF，M-CSF和IL-3(多功能復(fù)合CSF)。GM-CSF和IL-3是復(fù)合強力生長因子，其可刺激多種造血系統(tǒng)細(xì)胞系的分裂。反之，G-CSF和M-CSF是非廣譜系限制性造血生長因子，其刺激最后的有絲分裂和結(jié)束部分造血前體細(xì)胞的成熟。紅細(xì)胞增生素則是一種造血生長因子，可刺激紅細(xì)胞前體的分化，增生和成熟。生長因子如干細(xì)胞因子，所有的白細(xì)胞介素和所有的干擾素均可以是CPSF。
CPSF可以直接以N末端與HSA的C-末端相聯(lián)以構(gòu)成融合蛋白，或可在HSA和CPSF之間增加一個聯(lián)接肽(Linker)，以構(gòu)成融合蛋白HSA/L/CPSF或CPSF/L/HSA(L＝Linker)。連接肽長度可為2-100，常用的是10-50個氨基酸，優(yōu)選的是14-30個氨基酸。連接短肽可以對HSA和CPSF之間有更大的變化空間并有更好的柔韌性或剛性或有更大的變化空間使CPSF與受體的結(jié)合更容易些，連接肽的結(jié)構(gòu)可為(G4S)3-4。
融合蛋白可以是分泌型，其可與特異識別的抗人血清白蛋白抗體相結(jié)合。融合蛋白也可與特異識別CPSF的抗體相結(jié)合。
具體地，利用遺傳工程方法構(gòu)建的一條核苷酸鏈其編碼一個人血清白蛋白與人白細(xì)胞介素11所組成的融合蛋白(HSA/hIL-11)，與Seq IDNo.1有至少90％的同源性，優(yōu)選的該核苷酸鏈與Seq ID No.1有95％地同源性，該核苷酸鏈編碼的蛋白質(zhì)氨基酸多肽序列為Seq ID No.2。
具體地，利用遺傳工程方法構(gòu)建一條核苷酸鏈其可編碼一個人血清白蛋白與人白細(xì)胞介素3所組成的融合蛋白(HSA/hIL-3)，與Seq ID No.3有至少90％的同源性，優(yōu)選的該核苷酸鏈與Seq ID No.3有至少95％序列同源性。優(yōu)選的，該核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)氨基酸多肽序列為SeqID No.4。
具體地，利用遺傳工程方法構(gòu)建一條核苷酸鏈其可編碼一個人血清蛋白與人紅細(xì)胞增生素(EPO)所組成的融合蛋白(HSA/hEPO)與Seq IDNo.5有至少90％地同源性。優(yōu)選的該核苷酸鏈與Seq ID No.5有至少95％地同源性。優(yōu)選地，該核苷酸編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列為Seq ID No.6。
具體地，利用遺傳工程構(gòu)建的一條核苷酸鏈，其可編碼一個人血清白蛋白與粒細(xì)胞集落刺激因子所組成的融合蛋白(HSA/hG-CSF)。該核苷酸序列與Seq ID No.7有至少90％同源性，優(yōu)選地，該核苷酸序列與Seq ID No.7有至少95％地同源性。優(yōu)選地，該核苷酸序列編碼一條蛋白質(zhì)氨基酸序列為Seq ID No.8。
再具體地，利用遺傳工程方法構(gòu)建的一條核苷酸鏈，其可編碼一個人血清白蛋白與巨噬粒細(xì)胞集落刺激因子所組成的融合蛋白(HSA/hGM-CSF)。該核苷酸序列與Seq ID9有至少90％同源性。優(yōu)選地，該核苷酸序列與Seq ID9有至少95％同源性。優(yōu)選地，該核苷酸序列編碼一條蛋白質(zhì)氨基酸序列為Seq ID 10。
與上述的核苷酸多肽是有一定程度的序列相似性是指例如，能編碼一種HSA/CPSF融合蛋白，也具有至少95％相似的核苷酸序列之間同源性。其包括核苷酸鏈序列每百個核苷酸有5個點突變，并也編碼HSA/CPSF融合蛋白核苷酸序列。換句話講，任何核苷酸多肽鏈與上述編碼HSA/CPSF融合蛋白的核苷酸鏈具有95％的同源性，即，即便有多達(dá)5％的核苷酸個體可以替換、刪減、新插入等均與本發(fā)明所指的核苷酸序列相同。突變不管是在5’或3’端，或在兩端之間的任何位點，以單體或多體發(fā)生的突變均在本發(fā)明范圍內(nèi)。
實踐上，不管任何特指的核酸分子只要在90％、95％、96％、97％、98％或99％相似即在本發(fā)明保護(hù)范圍。而且核苷酸鏈序列編碼HSA/CPSF融合蛋白也可由常規(guī)已知的計算機軟件，如Bestfit軟件(Wisconsin)序列分析軟件包)來獲得。Bestfit應(yīng)用區(qū)域同源性比較方法(文獻(xiàn)Smith和Waterman，應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展，2482-489(1981)來尋找兩個序列之間最佳的同源序列。當(dāng)應(yīng)用該軟件或其它任何具有類似的DNA序列對比分析下，某一特定的序列如與本發(fā)明所提出的序列有95％以上同源均視為與本發(fā)明所述的序列相同源。
當(dāng)在室溫或更高的溫度下，HSA和CPSF形成的融合蛋白與CPSF單體相比，在同樣條件下，可有2倍以上優(yōu)選地，達(dá)4倍或6倍或更優(yōu)選地達(dá)10倍以上的貯存期(Shelf-Life).
本發(fā)明涉及到白蛋白可用做載體攜帶治療性的蛋白質(zhì)藥物，如CPSF來處理，治療各種疾病或異常?；蚰切┮约訌娂?xì)胞增生以增加血細(xì)胞計數(shù)為目的的人，如癌癥病人。在本發(fā)明中，HSA/CPSF融合蛋白可以用于脊椎動物，優(yōu)選地是人類，并通過不同途徑，包括但不局限于口服，非經(jīng)腸胃，腹腔膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、舌下、肌內(nèi)、腸內(nèi)、唾液腺、鼻內(nèi)，脂質(zhì)法，通過吸入、注射。陰道、眼內(nèi)方法給藥。HSA/CPSF也可通過區(qū)域性釋放(如導(dǎo)管或Stent)，包括皮下、脂肪下，關(guān)節(jié)下及膜內(nèi)、并可以做成緩釋劑方式、具體地，融合蛋白主要通過注射法給藥。
本發(fā)明涉及關(guān)于將一個白蛋白分子或其變種或片段與一個CPSF分子或其變種或片段通過基因工程融合在一起，所形成的融合蛋白較未經(jīng)融合的CPSF延長在體內(nèi)循環(huán)半衰期。為方便起見，本發(fā)明只提及人血清白蛋白(HSA)和細(xì)胞增生刺激因子(CPSF)，即人IL-11，人EPO，人GCSF，人GM-CSF，人IL-3和人TPO等形成的融合蛋白。當(dāng)然其它脊椎動物的白蛋白與CPSF均可包括在內(nèi)。優(yōu)選地，含有CPSF，或其變種或片段的N-末端部分，或其變種，或片段的C-末端部分形成融合蛋白后，并使其與受體結(jié)合時所有負(fù)效應(yīng)達(dá)最小化?；蛘哂蒀PSF形成融合蛋白，含有CPSF或其一個變體或片段同樣具有信號傳導(dǎo)、受體結(jié)合作用均包括在本發(fā)明中。
本發(fā)明中的HSA/CPSF融合蛋白，或其配方均可通過傳統(tǒng)方法，包括非經(jīng)胃腸道(如皮下或肌肉)注射或靜脈輸注的方式給藥。治療包括在一段時間內(nèi)使用單一劑量或復(fù)合劑量。本發(fā)明中的融合蛋白HSA/CPSF可單獨使用，而優(yōu)選地，則為一個或多個可接受的載體或另一個HSA/CPSF或HSA或多個HSA/CPSF一起成藥物制劑的形式使用。載體特別是另一個HSA/CPSF或多個HSA/CPSF必需在與相互間的兼容性且不對受體自身產(chǎn)生有害意義的“可接受的”典型的載體為水和鹽水、無菌、無熱原也無額外免疫原性。不同HSA/CPSF之間相溶可有協(xié)同，增效或僅起協(xié)助制劑也可考慮共同使用。
HSA/CPSF融合蛋白可以制劑形式、單元劑量的便捷方式給藥，也可經(jīng)由任何藥學(xué)領(lǐng)域已知和認(rèn)可的方法制備包括將HSA/CPSF與具有一種或多種輔助成份的載體結(jié)合到一起的步驟。概括地講，將活性成分和液相載體或組合固相載體、助劑或其它，均勻地結(jié)合而制備該制劑，然后根據(jù)需要的話，將產(chǎn)品成型。
適合于非經(jīng)胃腸道途徑使用的HSA/CPSF制劑包含水相或不含水相的無菌注射液，可含抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和助溶劑，或增加藥物滲透性與平衡劑。含水或不含水的無菌懸浮液(包括懸浮劑和增稠劑)。該制劑可制成單元劑量或多元劑量的容量的容器中，如密封的安瓿瓶中和小管中。在冰干(凍干法)條件下貯存。使用前加入無菌液態(tài)載體，如注射用水，臨時性注射液和懸浮液。
優(yōu)選的單元劑量是那些包括有活性成分的日用劑量或單元。日用亞劑量或適當(dāng)?shù)男》荨?br> 將HSA/CPSF融合蛋白送入動物體內(nèi)后，與CPSF單體相比，HSA/CPSF在血液中的半衰期具有長約2倍。優(yōu)選地是長約4倍，優(yōu)選地為長約6倍，更優(yōu)選為長約10倍的半衰期。本發(fā)明的HSA/CPSF融合蛋白可以與由自然界分離的或重組型的人血清白蛋白共同使用。優(yōu)選為重組的人血清白蛋白，組成具有療效的劑量和比率。
可以相信融合后，治療性蛋白質(zhì)有較高的半衰期和在血液中停留較長的時間。在貯存和運輸時可以降低成本效益，同時也可減少藥品的使用劑量和使用次數(shù)。
相同的策略也可用于研發(fā)抗癌作用功效的穩(wěn)定的重組蛋白。例如將肺癌抑制因子，如p53、pRb、pRb2/p130，IL-2和KLF6等均可與HSA形成融合蛋白。選擇上還有胰島素，胰島素類的生長因子也可與HSA形成重組融合蛋白用于疾病的治療處理。由人體或其它途徑分離出的具有治療作用的抗體基因均可與HSA形成融合蛋白，以便于使用和具有治療目的。抗原性疫苗也可利用這一方法制備讓抗原與白蛋白形成融合蛋白釋放到體內(nèi)以增加抗原性，提高免疫反應(yīng)機能?？贵w也可利用與HSA形成融合蛋白釋放到體內(nèi)血液系統(tǒng)，引起機體的免疫反應(yīng)而達(dá)到對抗入侵的外源物，如細(xì)菌、真菌、寄生蟲、病毒等。另外，抗衰老的蛋白，也可與HSA形成融合蛋白并引入體內(nèi)對抗衰老。
2)用于HSA/CPSF融合蛋白表達(dá)的宿主系統(tǒng)本發(fā)明中的HSA/CPSF核苷酸多肽可利用重組克隆技術(shù)引入宿主細(xì)胞，以使融合蛋白得以表達(dá)。
一般來說，宿主細(xì)胞經(jīng)遺傳工程(轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)方式將攜帶有本發(fā)明中所提到的各種可能組合的HSA/CPSF載體質(zhì)粒侵入方式，病毒感染“噬菌體等形式”轉(zhuǎn)入宿主系統(tǒng)中。工程宿主細(xì)胞可以培養(yǎng)在含常規(guī)營養(yǎng)物的培養(yǎng)基中，并經(jīng)過適當(dāng)修改后已利于啟動子，選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增編碼HSA/CPSF的核苷酸鏈，培養(yǎng)條件，如溫度，PH和選擇表達(dá)細(xì)胞均以適當(dāng)操作方式控制。
按本發(fā)明所述，重組載體攜帶有包含編碼HSA/CPSF融合蛋白的核苷酸多肽。重組載體可以是一個表達(dá)載體，可在宿主細(xì)胞內(nèi)由攜帶的核苷酸多肽編碼來表達(dá)融合蛋白。形式可為，但不局限于，HSA/CPSA，CPSF/HSA，HSA/L/CPSF或CPSF/L/HSA(L＝Linker).宿主生物體及體細(xì)胞包括，但不局限于，脊椎動物(如人，猴、鼠、兔等)魚、雞、昆蟲、植物、酵母、真菌和細(xì)菌等。
編碼HSA/CPSF的核苷酸多肽是在適當(dāng)?shù)膯幼幼饔孟卤磉_(dá)HSA/CPSF融合蛋白?？衫玫倪m合啟動子包括，但不局限于，腺病毒啟動子，如腺病毒主要的后期啟動子；或異源啟動子，如CMV啟動子，RSV啟動子，誘導(dǎo)型啟動子可有MMT啟動子，熱刺激啟動子。白蛋白啟動子，ApoAI啟動子，人球蛋白啟動子。病毒胸腺嘧啶脫氧核苷酶啟動子則有皰疹病毒胸腺激酶啟動子。反轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟動子(包括經(jīng)修飾后的LTR啟動子)，β-肌動蛋白啟動子，人生長激素啟動子。也可用天然啟動子來控制核苷多肽編碼表達(dá)HSA/CPSF融合蛋白。
根據(jù)本發(fā)明，重組細(xì)胞具有表達(dá)編碼HSA/CPSF融合蛋白核酸序列的能力。重組工程細(xì)胞可以持續(xù)地或在有或無誘導(dǎo)劑的存在狀態(tài)下表達(dá)HSA/CPSF，HSA/L/CPSF或CPSF/L/HSA.重組工程細(xì)胞形式包括，但不局限于脊椎動物，(即人，猴、鼠、兔等)魚、雞、昆蟲、植物、酵母、真菌和細(xì)菌等細(xì)胞。
優(yōu)選的用于表達(dá)HSA/CPSF的酵母屬宿主包括，但不局限于，釀酒酵母屬(Saccharomyces)，畢氏酵母屬(Phichia)，克魯維酵母屬(Kluyveromyces)，念珠菌屬(Candida)，孢園酵母屬(Tarulaspora)和裂殖酵母屬等。更優(yōu)選地，宿主系統(tǒng)可為畢氏酵母屬巴斯德菌種(保藏單位ATCC，保藏號PTA-4607，保藏日2002年8月21日)。具體地講重組載體質(zhì)?？蔀閜PICZ-A，B或C.
根據(jù)選用不同的宿主用來表達(dá)HSA/CPSF融合蛋白，本發(fā)明中表達(dá)的蛋白多肽，可以是糖基化或非糖基化。優(yōu)選地，當(dāng)在宿主系統(tǒng)中得到表達(dá)時，HSA/CPSF在脊椎動物細(xì)胞如中國倉鼠(CHO)中得到表達(dá)的蛋白為糖基化蛋白。當(dāng)表達(dá)在畢氏酵母菌中則為非糖基化或部分糖基化。
如上所述，在本發(fā)明中提到的白蛋白融合蛋白，優(yōu)選的使用基因工程技術(shù)構(gòu)建來表達(dá)。獲得融合蛋白的優(yōu)選方法是利用載體質(zhì)粒，通過轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染或感染的方式來表達(dá)融合蛋白。特別是利用可轉(zhuǎn)化酵母的表達(dá)載體，來轉(zhuǎn)化畢氏酵母，并使融合蛋白分泌到培養(yǎng)液中。
利用酵母菌表達(dá)HSA/CPSF的優(yōu)勢為，酵母菌系統(tǒng)允許產(chǎn)生高質(zhì)量成熟的融合蛋白，并分泌到培養(yǎng)液中便于純化。
酵母菌遺傳工程的進(jìn)展使外源基因可以在酵母菌中得到表達(dá)并分泌蛋白產(chǎn)品到細(xì)胞外。利用酵母菌表達(dá)分泌型蛋白的優(yōu)點為，但不局限于，高表達(dá)產(chǎn)量、蛋白質(zhì)為可溶性，正確的折迭和易于大規(guī)模生產(chǎn)和純化。
經(jīng)由白蛋白天然信號肽，HSA/CPSF融合蛋白可分泌到酵母菌培養(yǎng)液中。HSA/CPSF融合蛋白的多肽可由信號肽主導(dǎo)并通過分泌途徑而得到加工。白蛋白的前導(dǎo)肽序列可用在酵母菌中，使融合蛋白分泌到酵母菌外。其它分泌肽，如天然的釀酒酵母的α-因子分泌信號肽，也可用于分泌本發(fā)明中的融合蛋白。
酵母表達(dá)的HSA是可溶性的并且顯示出與由血漿中分離的HSA是有相同的二巰健結(jié)構(gòu)。當(dāng)用于臨床時，HSA的用量為克級。因而重組的HSA要具有等同于自然界中分離的HSA。由酵母分泌到培養(yǎng)液中的HSA/CPSF是通過與HSA表達(dá)一致的途徑來加工。并避免了由酵母細(xì)胞抽提物中分離純化蛋白的難題。酵母細(xì)胞是難于裂解的。另外，分泌出的蛋白質(zhì)純度也易于提高，因為由酵母分泌出的蛋白僅占全部酵母蛋白的0.5-1％，而且酵母無毒性蛋白伴隨。
優(yōu)選實例為，應(yīng)用巴斯德酵母菌系統(tǒng)來表達(dá)本發(fā)明中提及的HSA/CPSF融合蛋白。巴斯德酵母菌是由SALK生物技術(shù)工業(yè)研究與菲力蒲石油工業(yè)研究協(xié)作發(fā)展出的一個高效重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。有關(guān)畢氏酵母菌的應(yīng)用技術(shù)已在有關(guān)專利中詳細(xì)闡述了。
利用畢氏酵母菌來表達(dá)HSA或HSA/CPSF融合蛋白優(yōu)于利用其它表達(dá)系統(tǒng)。畢氏酵母菌是有許多高等真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)所具有的優(yōu)點。例如蛋白質(zhì)的加工、折迭，轉(zhuǎn)錄后的修飾以及如同培養(yǎng)細(xì)菌或釀酒酵母一樣的易于大規(guī)模培養(yǎng)。與其它系統(tǒng)如桿狀病毒、脊椎動物細(xì)胞培養(yǎng)相比更具有簡捷、快速表達(dá)，產(chǎn)量更高。畢氏酵母還有另外一個優(yōu)勢是可以10-100倍高的表達(dá)水平。這些特性使得畢氏酵母變成十分有力的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。
由于畢氏酵母與釀酒酵母的相關(guān)性，許多由釀酒酵母研究發(fā)展出的方法和技術(shù)均可用于畢氏酵母，包括轉(zhuǎn)化、基因插入、基因取代。更進(jìn)一步的在釀酒酵母上發(fā)展出的遺傳專用術(shù)語，也可用于畢氏酵母菌。如，組氨酸脫氫酶、在釀酒酵母和畢氏酵母中均是由HIS4基因編碼的。畢氏酵母做為甲醇利用酵母能夠以甲醇為單一碳源進(jìn)行代謝。其過程為首先甲醇的代謝是氧化甲醇，變?yōu)榧兹┦怯梢掖佳趸笇⒎肿友跫拥郊状挤肿由?。這一反應(yīng)形成氧化氫。為了避免過氧化氫的毒性。甲醇代謝發(fā)生在一個特殊的細(xì)胞組織中，叫做過氧質(zhì)體。其可將過氧化氫的毒性與細(xì)胞其它部分隔絕。乙醇氧化酶與氧的親和性極差，使得畢氏酵母菌為了代謝的進(jìn)行而大量生產(chǎn)乙醇氧化酶(AOX)調(diào)控乙醇氧化酶生產(chǎn)的啟動子被用來驅(qū)動外源(HSA或HSA/CPSF)蛋白在畢氏酵母菌中的表達(dá)。
畢氏酵母菌與釀酒酵母菌相比，畢氏酵母菌在對分泌的蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化的程度上有著更大的優(yōu)點。即畢氏酵母不會有過度糖基化現(xiàn)象。釀酒酵母和畢氏酵母均有N-聯(lián)接糖基甘露糖修飾。然而寡糖化物鏈加在表達(dá)的蛋白上，在畢氏酵母菌中只有8-14個糖基，而遠(yuǎn)短于在釀酒酵母中的50-150甘露糖鏈。在畢氏酵母菌中聯(lián)接糖基化較少發(fā)生。釀酒酵母的核心糖化帶有α-1，3聯(lián)接末端物。而在畢氏酵母菌則沒有。研究表明由釀酒酵母產(chǎn)生的糖基化蛋白具有較強的抗原反應(yīng)，而使得這些蛋白不適于用在特別是治療目的上的使用。當(dāng)然也表明這又減少了一個對畢氏酵母菌用來表達(dá)蛋白在糖基化上的擔(dān)憂。
利用畢氏酵母做為表達(dá)系統(tǒng)有許多試劑盒可以使用。如Invitrogen的易選EasySelectTM畢氏酵母表達(dá)試盒。表達(dá)載體上有一個AOX1啟動子可以使外源基因在畢氏酵母中利用甲醇來誘導(dǎo)表達(dá)。同時還有一個抗生素Zeocin抗性基因，可做為選擇重組子的標(biāo)記。在本發(fā)明中，表達(dá)融合蛋白啟動子是非常重要的因素。
在畢氏酵母系統(tǒng)中，AOX1基因啟動子是十分強勁的啟動子。特別是在畢氏酵母菌中，在畢氏酵母里共編碼兩種乙醇氧化酶，AOX1和AOX2。AOX1是負(fù)責(zé)在細(xì)胞中產(chǎn)生合成巨量的乙醇氧化酶(AOX1)活性。AOX1基因的表達(dá)是受到緊密控制并由甲醇誘導(dǎo)而達(dá)到極高的水平。典型地當(dāng)用甲醇做為唯一碳源時，在所有的可溶性蛋白中AOX1基因的產(chǎn)物就達(dá)30％。AOX1基因已分離得到。AOX1基因啟動子也用于本發(fā)明中載體質(zhì)粒中用以驅(qū)動編碼有目的基因的外源蛋白的表達(dá)(Ellis等，1985；Koutz等，1989，Tschopp等，1987a)。而AOX2和AOX1基因有97％的同源性。在甲醇中的生長速度比AOX1基因為慢。這種緩慢生長狀態(tài)，可以分離到Mut+(AOX1)株。除了AOX1基因啟動子外，在酵母菌中其它啟動子也可用于驅(qū)動HSA/CPSF融合蛋白。這些啟動子包括，但不局限于PGK1，Gall，Ca110，Cycl，PH05，TRP1、ADH1或ADH2基因啟動子。
表達(dá)質(zhì)粒也可同時用于細(xì)菌宿主，如大腸肝菌DH5α(Gibcol/BRL)和酵母宿主中。抗生素Zeocin作為選擇標(biāo)記已應(yīng)用在本發(fā)明的各實施例中。
表達(dá)載體含有編碼HSA或HSA/CPSF融合蛋白的核苷酸多肽，按Invitrogen試劑盒所描述的方法轉(zhuǎn)化酵母菌。經(jīng)過抗性選擇出轉(zhuǎn)化的酵母菌菌落。這些細(xì)胞可表達(dá)HSA/CPSF融合蛋白，當(dāng)接種于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液中，分析這些酵母菌表達(dá)分泌融合蛋白于培養(yǎng)基中的能力。蛋白質(zhì)的收獲可在細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)中進(jìn)行?；蛟谂颗囵B(yǎng)結(jié)束后一并收獲，本發(fā)明所述的融合蛋白經(jīng)培養(yǎng)的酵母菌表達(dá)后，以能維持蛋白活性，藥力活性的蛋白提純方法來加以分離純化。
在此還需提及的是，其它表達(dá)系統(tǒng)也可用于本發(fā)明中所提到HSA/CPSF融合蛋白的表達(dá)。包括，但不局限于，細(xì)菌、枯草桿菌(B.Subtitis)、釀酒酵母(S.Cerevisiae)、克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)、念珠菌屬(Candida)，孢圓酵母屬(Tourlaspora)、裂殖酵母屬(Schizosaromyces)、固囊酵母屬(Citeromyces)、Pachysoler，德巴利酵母屬(Debaromyces)、梅奇酵母屬(Metschumikowia)、紅冬孢屬(Rhodosporidium)、無色擔(dān)子孢子屬(Leucosporiduum)、葡狀子囊菌屬(Botryoascus)、鎖擲酵母屬(Sporidiobolcus)、擬內(nèi)孢霉屬(Endomyucopsis)、動物、植物和昆蟲細(xì)胞等。
3)HSA/CPSF融合蛋白組合治療本發(fā)明還提供了一種不同HSA/CPSF融合蛋白組合應(yīng)用。
這種獨特的融合蛋白組合可以提供刺激患者身體內(nèi)的多種細(xì)胞的同時增生，分化成熟，或具有對某一特定類細(xì)胞具有協(xié)同增效作用。特別地，本發(fā)明中的人血清白蛋白和具有不同造血活性的細(xì)胞介素形成融合蛋白，共同組合使用的結(jié)果是同時刺激多種血細(xì)胞和血小板的增生和成熟。應(yīng)用HSA/CPSF的定向作用于不同類型的血細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑或多種血細(xì)胞的產(chǎn)生途徑，這樣在只需一次注射使用于患者身上后，使諸如血小板，紅細(xì)胞和巨噬白細(xì)胞，粒白細(xì)胞等都得到大幅增加。
在本發(fā)明中，白蛋白的血漿傳遞功能和CPSF的治療功能因蛋白發(fā)生融合而得到整合。當(dāng)在血液中循環(huán)時，由于與白蛋白融合而授與CPSF一個抵抗蛋白酶降解的超級穩(wěn)定性，結(jié)果大大延長CPSF在血液中的半衰期。由于大量白蛋白的存在，不同的CPSF與白蛋白形成融合蛋白，經(jīng)組合可以減少并形成較小的生物學(xué)功能上的相互干擾現(xiàn)象。這種干擾現(xiàn)象常出現(xiàn)在“CPSF單體”之間的組合。進(jìn)一步來說，一個與白蛋白融合的CPSF，可以在血液系統(tǒng)中停留相當(dāng)長的一段時間而得到緩慢釋放，因而減低了在常規(guī)方法下，單獨使用大劑量單一CPSF時，帶來的急性反應(yīng)，毒性及副作用。這種融合蛋白緩慢釋放作用形式，以本發(fā)明中的使用劑量，注射次數(shù)減少，而更進(jìn)一步降低CPSF注射的付作用。特別是對癌癥病人實施化學(xué)或放射性治療前或后，這種組合式使用，在刺激多重血細(xì)胞分化增生上是十分有用的。癌癥病人常需忍受多次高劑量的CPSF注射，給病人帶來極大的損害。例如，在動物和臨床試驗中，人TPO，SCF和IL-3都表現(xiàn)出極強的體內(nèi)毒性作用。由于嚴(yán)重的體內(nèi)毒性作用，SCF已被FDA批準(zhǔn)僅用于體外細(xì)胞的處理，從而阻礙了SCF被研發(fā)為一種有用的臨床藥物。IL-3的付作用極為明顯是劑量依賴型。當(dāng)病人使用劑量達(dá)5毫微克/kg時，付作用有發(fā)燒、紅疹、腹瀉、寒戰(zhàn)、肌骨痛、頭痛、結(jié)膜炎、浮腫、胸痛、呼吸困難、血小扳計數(shù)減少、哮堿性細(xì)胞計數(shù)增加，骨髓纖維化以及肺水腫等(文獻(xiàn)，Eder等1997)“IL-3臨床研究”干細(xì)胞雜志，15327-333) 。
根據(jù)本發(fā)明，血清白蛋白與此類CPSF形成融合蛋白后，可在進(jìn)入體內(nèi)后因緩慢釋放而減少上述局限性。另外，這樣的融合蛋白可以與相對大量的白蛋白組合，可進(jìn)一步減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)對直接注射CPSF進(jìn)入體內(nèi)，所引起的強烈可預(yù)見的反應(yīng)。
已知，貯存“裸露”的細(xì)胞介質(zhì)是相當(dāng)不穩(wěn)定的，并且在血液中有極短的壽命。十分清楚地是，治療性蛋白質(zhì)具有的如此脆弱穩(wěn)定性在體內(nèi)是相當(dāng)不便的。事實上重復(fù)注射蛋白產(chǎn)品或由灌注點滴法給藥，此達(dá)到藥物的有效強度，對病人來講是十分昂貴和不便的。
本發(fā)明使得HSA/CPSF融合蛋白在血液中半衰期延長，穩(wěn)定性增加。復(fù)合型的HSA/CPSFs即HSA與IL-11，hEPO、hGCSF、和hGM-CSF共同作為可刺激血液中多種血細(xì)胞的增生。
具體地，HSA/hIL-11融合蛋白可以和HSA/hEPO融合蛋白形成復(fù)合刺激作用于血液異常的病人，其結(jié)果病人的紅細(xì)胞和血小板分化增生，結(jié)果是計數(shù)的增加。
例如，在癌癥病人化療處理之前或之后，注射HSA/hIL-11和HSA/hEPO融合蛋白，刺激細(xì)胞和血小板的增生，不必輸血病人即可進(jìn)入下一階段化療程序，有利于消滅癌細(xì)胞的再生與轉(zhuǎn)移。
具體地，HSA/hIL-3融合蛋白可以和HSA/hEPO融合蛋白共同組合給與血液異常病人，以增加EPO誘導(dǎo)的血紅細(xì)胞的增生。具體地，HSA/hIL-3可以和HSA/hGCSF融合蛋組合使用，其結(jié)果是，使用后血液異常的病人血細(xì)胞，嗜中型白細(xì)胞和嗜酸性白細(xì)胞數(shù)目計數(shù)增加。
可替代的，根據(jù)病人的需要，一種HSA/CPSF可以與另一種或多種HSA/CPSFs同時或先后的方式給藥。這種組合是以療效和達(dá)到治療目的劑量，并對病人的治療效果具有協(xié)同增效的作用的有效劑量。
本發(fā)明提供了成套的使用HSA/CPSFs組合治療的描述與實踐，成套組合包括第一個HSA/CPSF和第一個CPSF與第二個可以是相同或不同的HSA/CPSFs。例如，第一個HSA/CPSF中CPSF可以是IL-11和第二個CPSF是EPO；或第一個CPSF是IL-3，第二個CPSF是EPO；或第一個CPSF是IL-11，第二個CPSF是GCSF等。
HSF/CPSF融合蛋白和它們的組合可用于處理各種疾病，包括但不局限于，造血系統(tǒng)異常，如血紅素減少，低色素性小，紅血球性貧血和一般性貧血；血小板減少，HIV感染，癌癥、腎衰弱，以及組織器官移植等。優(yōu)選地，融合蛋白應(yīng)不含有能引起人類免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)序列。
本發(fā)明還提供了對需要CPSF病人的一種使用方法，這種方法是將HSA與CPSF基因融合而形成融合蛋白并按一定的配比組合而成有效的復(fù)合組成制劑。這種藥學(xué)配方可由藥劑學(xué)上接受的賦形劑和劑型以達(dá)到增加HSA/CPSF的穩(wěn)定性。當(dāng)然醫(yī)學(xué)上能接受的劑型，也包括天然和重組的人血清白蛋白以及或另外一種或多種HSA/CPSF融合蛋白。
除此外，本發(fā)明也提供了利用酵母菌來更有效地及節(jié)省費用的生產(chǎn)制造重組融合的HSA/CPSF蛋白。


附圖1.人血清白蛋白，各種細(xì)胞增生刺激因子，血清白蛋白與細(xì)胞增生刺激因子形成融合蛋白的DNA核苷酸序列和蛋白質(zhì)氨基酸序列。附圖2.含有人血清白蛋白基因的質(zhì)粒DNA，并以此質(zhì)粒構(gòu)建人血清白蛋白與細(xì)胞增生刺激因子形成融合蛋白的基因表達(dá)載體質(zhì)粒。附圖3.以鼠抗人血清白蛋白單克隆抗體(Sigma公司)所做的蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)實驗。蛋白質(zhì)上樣量為100納克A)分離自人體血液制品中的血清白蛋白(65kd)；B)酵母菌表達(dá)的人血清白蛋白(65kd)；C)人血清白蛋白與粒細(xì)胞集落刺激因子形成的融合蛋白(84.2kd)；D)人血清白蛋白與紅細(xì)胞增生素形成融合蛋白(83.5kd)；以及E)人血清白蛋白與白細(xì)胞介素-11形成的融合蛋白(84.5kd)。附圖4.以羊抗人白細(xì)胞介素-11的多抗抗體(R&D系統(tǒng)公司)以及鼠抗羊單克隆抗體(R&D系統(tǒng)公司)所做的蛋白質(zhì)印跡實驗。上樣量為100納克A)由細(xì)菌表達(dá)制備的人白細(xì)胞介素-11；B)由酵母菌表達(dá)的人血清白蛋白和人白細(xì)胞介素-11形成的融合蛋白。附圖5.以鼠抗人巨噬粒細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)單克隆抗體(R&D系統(tǒng)公司)所做的蛋白質(zhì)印跡實驗。蛋白質(zhì)上樣量為20納克A)
由細(xì)菌表達(dá)制備的GM-CSF；B)由酵母菌表達(dá)的人血清白蛋白和GM-CSF形成的融合蛋白。附圖6.人血清白蛋白與白細(xì)胞介素-11形成的融合蛋白刺激T1165細(xì)胞增生的生物活性測定。測定培養(yǎng)液中含有(A)或不含有(B)抗人白細(xì)胞介素-6的單克隆抗體。附圖7.對人血清白蛋白與紅細(xì)胞增生素形成的融合蛋白與紅細(xì)胞增生素單體所做的生物活性測定結(jié)果比較。附圖8.生物活性測定結(jié)果顯示在37℃(A)或50℃(B)下融合蛋白在不同溫度下的存活期。附圖9.動物體內(nèi)實驗比較合并使用不同融合蛋白比單獨使用融合蛋白或單獨使用細(xì)胞增生刺激因子對多種血細(xì)胞具有增生刺激的協(xié)同增效作用。附圖10.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示純化的人血清白蛋白與細(xì)胞增生刺激因子形成的融合蛋白的純度。上樣量分別為2微克。A)人血清白蛋白分離自血液制品；B)由酵母菌表達(dá)的人血清白蛋白制品；C)人血清白蛋白與粒細(xì)胞集落刺激因子形成的融合蛋白；D)人血清白蛋白與紅細(xì)胞增生素形成融合蛋白；以及E)人血清白蛋白與白細(xì)胞介素-11形成的融合蛋白。
具體實施例方式
實施例1 分子克隆技術(shù)簡述常規(guī)分子克隆技術(shù)包括DNA、RNA的提取，瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳，DNA片段的聯(lián)接，限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)均參照文獻(xiàn)(Maniatis，et al.，“分子克隆實驗手冊”冷泉港實驗室出版，冷泉港，紐約，1982)。質(zhì)粒DNA的純化，DNA片段的回收等均采用商品純化柱制備。DNA聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(參照文獻(xiàn)Saikiet al.，科學(xué)，2301350，1985)所用的酶及反應(yīng)所需PCR儀均為Perkin Elmer產(chǎn)品。并參照廠家操作程序。DNA測序和DNA擴(kuò)增所需用的寡聚核苷酸引物由專門機構(gòu)完成。轉(zhuǎn)受態(tài)E.coli細(xì)菌由GIBCO/BRL公司購得。本發(fā)明所使用的酵母菌菌種均購自Invitrogen公司。轉(zhuǎn)化酵母菌是由電脈沖方式進(jìn)行，并參照廠家(Bio-Rad)操作程序。
實施例2 人血清白蛋白(HSA)基因表達(dá)及載體質(zhì)粒的構(gòu)建以人胎肝中提取的總RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈聚合反映來合成、擴(kuò)增HSA基因。5微克總RNA在反轉(zhuǎn)錄酶(購自GIBCO/BRL公司)的作用下，合成相對應(yīng)的DNA鏈，寡聚核苷酸引物為18個T+1N(N為隨機核苷酸)。反應(yīng)條件為45℃20分鐘，而后升溫至55℃，繼續(xù)保溫40分鐘。用于擴(kuò)增HSA的寡聚核苷酸引物是按GenBank中V00494的DNA序列所設(shè)計。
其寡聚核苷酸引物序列為Seq.ID NO.235’-GAATTCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCC-3’，和Seq.ID NO.245’-GAATTCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC-3’兩個EcoR I識別位點分別加在HSA基因的兩端以用于DNA片段插入適當(dāng)?shù)妮d體。PCR反應(yīng)條件為94℃ 4分鐘以滅活反轉(zhuǎn)錄酶并變性DNA。然后進(jìn)入如下35個循環(huán)反應(yīng)94℃30秒，58℃30秒，72℃擴(kuò)增2分30秒。循環(huán)反應(yīng)結(jié)束時，再給予72℃10分鐘的延長反應(yīng)。凝膠電泳顯示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長約1850堿基對。PCR產(chǎn)物利用TA克隆的方法插入PCRII載體(Invitrogen公司)。所得質(zhì)粒命名為PCR-HSA。DNA測序結(jié)果表明其與發(fā)表的人血清白蛋白DNA序列相同。附圖1 Seq ID NO.11為HSA基因DNA序列。附圖1 Seq ID NO.12為HSA基因蛋白質(zhì)氨基酸序列。
使用EcoR I酶酶切質(zhì)粒pCR-HSA，然后經(jīng)電泳分離純化HSA DNA，再克隆如pPIC Z-A酵母菌轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒(Invitrogen)中。經(jīng)轉(zhuǎn)染DH5α感受態(tài)細(xì)菌，在含有抗生素Zeocin的低鹽LB-瓊脂平板上選擇出的細(xì)菌克隆，其經(jīng)檢定對HSA基因插入的質(zhì)粒命名為pYZ-HSA(Y酵母菌；Z含Zeocin抗生素抗性)。其基因插入方向經(jīng)Xho I/Nde I酶切決定。pYZ-HSA載體質(zhì)粒的物理圖譜列于附圖2。
該質(zhì)粒具有如下優(yōu)點1)帶有Zeocin抗性基因可使受其轉(zhuǎn)化的細(xì)菌或酵母菌在含有Zeocin抗性素的培養(yǎng)基上生長。Zeocin抗性素是一種新型廣譜抗生素。在結(jié)構(gòu)上屬于Bleomycin/Phleomycin家族，對于細(xì)菌、真菌(包括酵母菌)，植物、脊椎動物細(xì)胞均具較強的毒性。但Zeocin對真菌的毒性小于Bleomycin。攜帶有Zeocin抗性基因的質(zhì)粒即可在細(xì)菌中，又可在真菌的轉(zhuǎn)化中做為選擇標(biāo)記。2)在HSA基因插入的下游，載體帶有多個酶切位點。這些酶切位點便于以基因工程方法直接插入功能蛋白基因，與HSA形成融合蛋白。3)在HSA基因插入的下游，還有兩個常用短肽myc和6個組氨酸組成的多肽。當(dāng)其與未知基因融合表達(dá)后，可用已知的短肽特異抗體來鑒別蛋白質(zhì)的表達(dá)。也可用商品化的親合柱層析來純化所表達(dá)的未知蛋白。pYZ-HSA載體質(zhì)粒為本發(fā)明中所有HSA融合蛋白的表達(dá)載體。
實施例3 人白細(xì)胞介素-11，紅細(xì)胞增生素，粒細(xì)胞集落刺激因子和巨噬粒細(xì)胞集落刺激因子的分子克隆人白細(xì)胞介素-11(hIL-11)，紅細(xì)胞增生素(hEPO)，粒細(xì)胞集落刺激因子(hG-CSF)和巨噬粒細(xì)胞集落刺激因子(hGM-CSF)的分子克隆應(yīng)用相似于實施例1中所表述的RT-PCR方法，從不同來源的總RNA制備物中擴(kuò)增，并克隆于PCRII載體質(zhì)粒中，并經(jīng)DNA測序分析。
hIL-11克隆自人骨髓分裂細(xì)胞總RNA樣品中。PCR合成寡聚核苷酸引物分別為Seq.ID NO.255’-CATATGAACTGTGTTTGCCGCCTGGTCC-3’，和Seq.ID NO.265’-GATATGTATGACACATTTAATTCCC-3’引物的設(shè)計是根據(jù)文獻(xiàn)Paul，SR et al.，PNAS，877512-7516，1990而設(shè)計。PCR產(chǎn)物也包括hIL-11的編碼區(qū)域及3’-末端非編碼區(qū)域。并在5’端引入一個新的限制性內(nèi)切酶Nde I位點?？寺〉膆IL-11基因DNA序列(Seq ID NO.13)列于附圖1，蛋白質(zhì)氨基酸序列(Seq ID NO.14)列于附圖1。
hEPO全長序列是由人胎腎mRNA制品(Clonetech Inc)中克隆擴(kuò)增而來。(參照文獻(xiàn)Lin，F(xiàn)K et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，827580，1985)，EPO的PCR合成寡聚核苷酸引物的DNA序列為Seq.ID NO.275’-GGATCCATGGGGGTGCACGAATGTCC-3’，和Seq.ID NO.285’-GAATTCTCATCTGTCCCCTGTCCTGC-3’RT-PCR的產(chǎn)物經(jīng)擴(kuò)增后克隆入pCRII載體質(zhì)粒中，經(jīng)DNA序列分析，證明其與文獻(xiàn)報道相同。內(nèi)切酶BamHI和EcoRI識別位點已分別加在EPO基因兩端。EPO基因的DNA序列(Seq ID NO.15)列于附圖1，蛋白質(zhì)氨基酸序列(Seq ID NO.15)列于附圖1。
hG-CSF基因全長序列是從人胎肝總RNA中，用RT-PCR的方法擴(kuò)增、克隆擴(kuò)增而得。PCR所需的引物DNA序列是根據(jù)文獻(xiàn)Nagata，S et al.，Nature，319415，1986)來設(shè)計的。寡聚核苷酸引物序列為Seq.ID NO.295’-GGATCCATGGCTGGACCTGCCACCC-3’，和Seq.ID NO.305’-GAATTCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGC-3’BamHI和EcoRI識別位點人為加在克隆的G-CSF基因兩端，經(jīng)擴(kuò)增的G-CSF基因DNA序列(Seq ID NO.17)列于附圖1，蛋白質(zhì)氨基酸序列(Seq ID NO.18)列于附圖1。
hGM-CSF基因全長以上述方式克隆于人胎肝細(xì)胞總RNA中，參照文獻(xiàn)Wong，GG et al.，科學(xué)，228810，1985)設(shè)計的PCR寡聚核苷酸引物序列為Seq.ID NO.315’-GGATCCATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGC-3’，和
Seq.ID NO.325’-GAATTCTCACTCCTGGACTGGCTCC-3’RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，克隆于pCRII載體，并經(jīng)DNA序列分析鑒定。其DNA序列(Seq ID NO.19)列于附圖1，蛋白質(zhì)氨基酸序列(Seq ID NO.20)列于附圖1。
實施例4. 人血清白蛋白與各種細(xì)胞增生刺激因子基因的融合及表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建在HSA的C-末端含有一個限制性內(nèi)切酶Bsu36I識別位點，細(xì)胞增生刺激生長因子hIL-11，hEPO，hG-CSF和hGM-CSF均通過基因工程方式將成熟蛋白序列與HSA C-末端蛋白質(zhì)序列相聯(lián)，而形成HSA的融合蛋白，做法是用特異的寡聚核苷酸為引物，以各種細(xì)胞增生刺激因子基因為模板，在PCR方法下修飾各基因的N-末端，使之增加一個Bsu36I酶切位點。在C-末端增加一個XhoI位點。然后將修飾的各種基因再克隆到經(jīng)Bsu36I/XhoI雙酶切取pYZ-HSA載體質(zhì)粒中。新插入的各因子蛋白質(zhì)序列與HSA C-末端蛋白質(zhì)序列編碼順序相連接，而形成新HSA/CPSF DNA分子序列。其可表達(dá)HSA融合蛋白，并具有血細(xì)胞增生刺激因子的生物功能。
形成HSA/hIL-11融合基因是采用寡聚核苷酸引物Seq.ID NO.335’-CTGCCTTAGGCTTACCTGGGCCACCACCTGGCC-3’，(hIL-11成熟蛋白基因序列以下橫線示出)和Seq.ID NO.345’-TGTCGACTCACAGCCGAGTCTTCAGCAGC-3’由于在hIL-11基因編碼區(qū)有一個XhoI位點。一個新的SalI限制性內(nèi)切酶位點加在3’-末端。SalI和XhoI識別序列具有互補性。當(dāng)PCR產(chǎn)物經(jīng)鑒定酶切與pYZ-HSA質(zhì)粒連接后，SalI和XhoI識別位點均消失。新構(gòu)建成的DNA表達(dá)質(zhì)粒，pZY-HSA/hIL-11。用此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的酵母菌可表達(dá)一種新的HSA與IL-11融合的蛋白質(zhì)，HSA/hIL-11的DNA序列(SeqID NO.1)和融合蛋白氨基酸序列(Seq ID NO.2)列于附圖1。
EPO基因與HSA基因融合是由寡聚核苷酸引物Seq.ID NO.355’-CTGCCTTAGGCTTAATCTGTGACAGCCGAGTCC-3’，(hEPO的蛋白編碼區(qū)用下橫線示出)和Seq.ID NO.365’-CACTCGAGTCATCTGTCCCCTGTCCTGC-3’一起修飾EPO基因DNA片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)鑒定后，插入經(jīng)Bsu36I/XhoI酶切后的pYZ-HSA載體質(zhì)粒中而形成pZY-HSA/hEPO質(zhì)粒。經(jīng)該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的酵母菌，表達(dá)一種HSA與EPO融合蛋白。該融合蛋白的DNA序列Seq IDNO.5，而蛋白質(zhì)的氨基酸序列Seq ID NO.6列于附圖1。
G-CSF基因與HSA基因形成融合分子也是利用PCR引物來完成的Seq.ID NO.375’-CTGCCTTAGGCTTAACCCCCCTGGGCCCTGCCAGC-3’(hG-CSF編碼區(qū)用下橫線示出)和Seq.ID NO.385’-CTCGAGTCAGGGCTGGGCAAGGTGG-3’(XhoI位點已加在G-CSF的3’-末端)。PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切膠純化后插入pYZ-HSA載體的Bsu36I和XhoI酶切位點處，構(gòu)建成pZY-HSA/hGCSF。用此質(zhì)粒來轉(zhuǎn)化酵母菌表達(dá)的HSA與GCSF融合蛋白的DNA序列(Seq IDNO.7)和蛋白質(zhì)的氨基酸序列(Seq ID NO.8)列于附圖1。
GM-CSF基因經(jīng)過PCR方法修飾后也可形成HSA與GMCSF融合序列。寡聚核苷酸引物序列為，Seq.ID NO.395’-ACTCCTTAGGCTTAGCACCCGCCCGCTCGCCCAGC-3’(hGM-CSF成熟蛋白的DNA序列以下橫線示出)和引物Seq.ID NO.405’-CTCGAGTCACTCCTGGACTGGCTCC-3’(XhoI位點也以下橫線示之)。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)酶切凝膠電泳純化后，插入pYZ-HSA載體的Bsu36I/XhoI酶切位點處而形成pZY-HSA/hGM-CSF的融合基因的DNA序列(Seq ID NO.9)和該基因產(chǎn)物的編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列(Seq ID NO.10)列于附圖1。
實施例5 酵母菌的轉(zhuǎn)化將畢氏酵母菌菌株GS115菌落接種于含5ml YPD培養(yǎng)液的50ml培養(yǎng)基中，以250轉(zhuǎn)/分的速度于30℃下培養(yǎng)過夜。次日取0.2ml過夜培養(yǎng)物再轉(zhuǎn)接入500ml YPD的培養(yǎng)液中，置于2升的三角培養(yǎng)瓶中。在30℃下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)2-3小時之細(xì)胞密度達(dá)到OD600＝1.3-1.5。酵母菌經(jīng)離心方法收集，再重懸于500ml冰預(yù)冷的無菌水中洗滌兩次。然后酵母菌懸于20ml冰預(yù)冷的1M Sortbitol溶液洗滌一次。
實例2中構(gòu)建的質(zhì)粒pYZ-HSA和實施例4中構(gòu)建的質(zhì)粒pZY-HSA/hIL-11，pZY-HSA/hEPO，pZY-HSA/hGCSF和pZY-HSA/hGMCSF均經(jīng)Pme I限制性內(nèi)切酶處理后，形成線性質(zhì)粒分子。取5ug線性質(zhì)粒DNA與80ul處理后的酵母菌相混合并置于0.2厘米厚的電極杯內(nèi)，置于點脈沖儀上。電脈沖條件為電壓7500V/CM，電極間隔時間為5-10(ms)。電擊處理后，立即加入1ml冰預(yù)冷的1M Sorbitol溶液于酵母菌中，然后轉(zhuǎn)入15ml試管中。轉(zhuǎn)化的酵母菌置于30℃培養(yǎng)箱中放置2小時，然后接種涂布在含Zeocin抗生素的YPD平板培養(yǎng)基上。經(jīng)抗性選擇而生長出的克隆，再用分子生物學(xué)方法鑒定其基因的插入。蛋白質(zhì)的表達(dá)與分泌則以SDS-PAGE或用特異抗體做蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)檢測。不同的畢氏酵母菌菌株，如X-33，KM71以及蛋白酶缺陷型酵母菌株，如SMD1168均可用來表達(dá)和分泌重組的HSA/CPSF融合蛋白。
實施例6 酵母菌表達(dá)及分泌的HSA和HSA/CPSF融合蛋白的特性將數(shù)個含有待表達(dá)基因的酵母菌落分別培養(yǎng)在含有Zeocin抗生素，具有緩沖能力及甘油的基本培養(yǎng)液中。以300轉(zhuǎn)/分的速度培養(yǎng)至菌體密度達(dá)到OD600＝2-6。培養(yǎng)物經(jīng)1500轉(zhuǎn)/分，5分鐘條件下離心收集菌體，菌體再重懸于同種基本培養(yǎng)液但不含甘油，改含0.5％甲醇，繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到OD600＝1.0。酵母菌在甲醇的誘導(dǎo)下，外源蛋白在啟動子的作用下開始表達(dá)。其后，每24小時加入100％甲醇至最終濃度為0.5％。在不同的時間點分別收集培養(yǎng)上清液。利用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳或蛋白質(zhì)免疫印跡法測定HSA或HSA/CPSF蛋白質(zhì)的表達(dá)。
結(jié)果表明，HSA及HSA/CPSF融合蛋白均由酵母菌表達(dá)，并被分泌到培養(yǎng)液中。鼠抗人血清白蛋白的單克隆抗體(Sigma)用蛋白質(zhì)免疫印跡實驗的確定被表達(dá)的蛋白質(zhì)為HSA或HSA/CPSF融合蛋白。
典型的蛋白質(zhì)免疫印跡實驗是將變性(SDS)凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)，經(jīng)電泳儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到尼龍或醋酸纖維膜上，再以特異抗體(第一抗體)識別相對應(yīng)的蛋白質(zhì)。然后帶有熒光功能基因的第二抗體，識別并結(jié)合于第一抗體，經(jīng)熒光顯色后，整個特異性結(jié)合的復(fù)合物，即特異蛋白質(zhì)在X光片上留下印記。標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量用于決定未知蛋白的分子量。附圖3為經(jīng)酵母菌表達(dá)分泌的HSA及HSA/hIL-11、HSA/hEPO、HSA/hGCSF和HSA/hGMCSF均得到表達(dá)，并顯示具有與從人體血清中分離到的血清白蛋白(Sigma)，在分子量及抗原性上均相同。以抗人白細(xì)胞介素-11的單克隆抗體所做的蛋白質(zhì)免疫印跡實驗表明，融合蛋白HSA/hIL-11與純品hIL-11(R&D System公司)具有相同的抗原性，并顯示二者之間在免疫反應(yīng)強度與分子大小上具有相同的比率，見附圖4。同理，以抗人GM-CSF抗體進(jìn)行檢測，相同結(jié)果也得到證實，見附圖5。
實施例7 分泌型HSA/CPSF的純化與特性重組的酵母菌細(xì)胞(ZY-HSA/CPSF)培養(yǎng)上清液中含有分泌出的血清白蛋白或血清白蛋白的融合蛋白HSA/CPSF，經(jīng)收集、濃縮并降低鹽濃度后，調(diào)整PH至7.5左右，濃縮液通過Bio-Rad公司制造的Affi-GelBlue-Gel層析柱。HSA或HSA/CPSF則與層析柱上的功能集團(tuán)結(jié)合而掛在柱體上。經(jīng)過洗滌，HSA或HSA/CPSF則可經(jīng)由1-5M NaCl梯度洗脫，得到具有75-85％純的蛋白制劑。如有需要則進(jìn)一步通過分子篩層析柱，可得純度提高至95-99％或更純。用于動物試驗的樣品則將可能的熱源如內(nèi)毒素，借助Affi-Prep polymyxin Support層析柱(Bio-Rad)來去除，以符合體內(nèi)試驗需要。利用常規(guī)方法來決定蛋白質(zhì)的濃度，如Bio-Rad生產(chǎn)的蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒。最后純化的蛋白質(zhì)通過0.2uM濾膜以達(dá)無菌要求。
實施例8 人白細(xì)胞介素-11的細(xì)胞分化生物活性的測定實驗所用的細(xì)胞株T1165是鼠細(xì)胞，其為白介素-6依賴型。利用T1165細(xì)胞來測定IL-11的生物學(xué)活性是由Paul.SR(PNAS 877512)在1990建立的。細(xì)胞株培養(yǎng)于RPM1培養(yǎng)基中，含有10％熱滅活處理的牛胎血清，2m Mglutamine，抗生素為盤尼西林(100U/ml)和慶大霉素(100mg/ml)(均購自GIBCD/BRL公司)。50μUM巰基乙醇(SIGMA公司)以及重組人白介素-6(IL-6)(GIBCL/BRL)生物測定則是在96孔接種1×105細(xì)胞加入200μl不含IL-6的培養(yǎng)基，然后加入不同稀釋度的待測樣品，在37°5％CO2的條件下放置48小時。最后6小時時，取出加入10μl含0.5mCi的3H-Thymidine進(jìn)行瞬間標(biāo)記。處在細(xì)胞分化中的新合成的DNA，吸收并將3H-Thymidine摻入DNA鏈中。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞并通過一種玻璃纖維膜。經(jīng)洗滌后將膜置于Beckman公司制造的放射性測定儀來測定放射活性。試驗分成平行的兩組，一組含有抗人IL-6的中和抗體，一組不含中和抗體。加入抗體可消除IL-6對細(xì)胞的分化功能。各種對照一并考慮加以設(shè)置。附圖6顯示了各種樣品對該細(xì)胞分化的刺激生物活性。試驗顯示融合蛋白與純品IL-11的生物活性在數(shù)值上有著與其分子量大小相一致比例，這一結(jié)果表明HSA/IL-11融合蛋白與純品IL-11具有相同的生物活性。
實施例9 應(yīng)用酶聯(lián)免疫(ELISA)方法測定EPO和HSA融合蛋白的生物活性應(yīng)用免疫酶聯(lián)反應(yīng)(ELISA)測定未知樣品中EPO的活性并與已知生物活性的EPO標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較測定是一種常規(guī)方法。R/D系統(tǒng)公司出品的EPO ELISA試劑盒是雙抗體夾心方法。在多孔塑料板中，加入EPO抗體(鼠單克隆抗體)，并用共價法將其與孔壁相聯(lián)。然后加入待測樣品或標(biāo)準(zhǔn)品與該抗體反應(yīng)，EPO分子被特異抗體結(jié)合而留在孔板上，經(jīng)洗滌后抗人EPO多抗(兔)抗體，其與過氧化物酶共價結(jié)合，再與被單抗俘獲的EPO分子相結(jié)合。成為一個復(fù)合體，這一復(fù)合體決定了EPO在樣品標(biāo)準(zhǔn)品中的含量，隨后一種化合物加入孔中，經(jīng)酶的作用而形成一種蘭色復(fù)合物。反應(yīng)的終止是加入適量的酸。并由蘭色變成穩(wěn)定的黃色，光吸收值(OD450)測定的結(jié)果就顯示出樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中EPO的含量。與標(biāo)準(zhǔn)品曲線相比較，可以計算出未知樣品中的EPO生物活性及含量。計算方法參照“第二版國際標(biāo)準(zhǔn)制備(WHO，67/343)。并以由尿液中分離的人EPO融合蛋白的生物活性相比較。結(jié)果表明其生物活性僅為EPO單體生物活性的1/10，見附圖7。原因可能是HSA分子過大，阻止了EPO融合蛋白與特異抗體相結(jié)合。而降低了該檢測方法的靈敏度。用蛋白質(zhì)免疫印跡法則顯示出二者之間僅有三倍的差異，其與兩者在分子量上的差異相類似。
實施例10 測定融合蛋白(HSA/CPSF)在體外生物活性的穩(wěn)定性以HSA/IL-11為例，對HSA/CPSF融合蛋白在37℃和50℃條件下，在不同停留時間內(nèi)，對HSA/CPSF的穩(wěn)定性進(jìn)行了測定。取5微克由細(xì)菌表達(dá)的人白介素11和5微克HSA/HIL-11融合蛋白，置于含有200微升，不含血清及其它組分的RPM1培養(yǎng)液于200微升薄壁試管中，每溫度共有10個重復(fù)。其中一組置于37℃條件下保溫，另一組置于50℃水溶中保溫。每7天從各組中取出一支，立即放在-80℃冰箱中保存。待全部樣品收集后，以這些樣品對T1165的細(xì)胞分化刺激能力進(jìn)行生物活性測定，同樣以新合成的細(xì)胞中DNA合成吸收的3H-Thymidine水平來衡量IL-11的含量及活性。試驗同時設(shè)置對照。附圖8顯示hIL-11與HSA形成融合分子后，在37℃條件下5周后仍保存其原有的生物活性。而hIL-11單體在兩周內(nèi)即完全喪失生物活性，結(jié)果顯示細(xì)胞增生刺激因子(CPSF)與血清白蛋白融合后，使之保存，儲存時間延長。對環(huán)境有更強的抗性及生物穩(wěn)定性。
實施例11 HSA/CPSF組合使用可刺激多種細(xì)胞增生并具有協(xié)同增效作用選用2.3-2.6公斤兔子(White-BC)，分別在第一，第三和第六天時，注射200微升重組蛋白制劑。兔A注射150U EPO(大約10微克蛋白質(zhì)量)和100微克重組血清白蛋白(rHSA)混合制劑；兔B注射120微克IL-11和100微克rHSA的混合物制劑；兔C注射120微克HSA/IL-11和27微克HSA/EPO融合蛋白制劑。兔D注射120微克HSA/IL-11融合蛋白制劑。兔E則注射27微克HSA/EPO和150微克rHSA。
注射后，每5天收集血樣一次，然后用血球計數(shù)器對紅細(xì)胞和血小板數(shù)量統(tǒng)計計數(shù)。結(jié)果列于附圖9(A、B、C)。以第一天的細(xì)胞計數(shù)為基點來判讀紅細(xì)胞和血小板計數(shù)的變化并制圖9。
在附圖9中表明，EPO和HSA/EPO融合蛋白均具有刺激紅細(xì)胞在兔A、兔C中的增生，計數(shù)得以增加。兔A注射的是裸露的EPO，在第35天時，形成一個峰值，隨后迅速下降，在第55天時回到基點附近。而兔C注射HSA/EPO后，在35天時達(dá)到其最高點，但維持其計數(shù)值直到試驗結(jié)束。這些結(jié)果表明HSA/EPO融合蛋白在體內(nèi)比裸露的EPO有更長的半衰期。這一變化趨勢在白細(xì)胞介素IL-11的動物體內(nèi)實驗中也有相似的表現(xiàn)。在兔B實驗中IL-11在刺激血紅細(xì)胞的增生上也有一些作用。
IL-II和HSA/IL-II融合蛋白刺激血小板增生上在兔B和C中有明顯的作用，注射裸露的IL-II于兔B時，在注射20天后形成一個峰值，隨后快速下降到第43天時回復(fù)到基點附近。而注射HSA/IL-II的兔C已在40天時達(dá)到最高值，但血小板計數(shù)維持這一數(shù)值，直到試驗結(jié)束。這些結(jié)束顯示HSA/CPSF融合蛋白與裸露的CPSF相比有更長的血液停留作用效果。
附圖9中比較了HSA/EPO和HSA/IL-II組合注射后第35天時，產(chǎn)生對血紅細(xì)胞和血小板計數(shù)增加的明顯協(xié)同增效作用。以HSA/EPO為例，HSA和EPO的注射量與兔A相比僅為2.7倍。因而如果HSA/EPO的使用也增加到5倍于裸露的EPO蛋白量時，其刺激紅細(xì)胞增生的能力，將更為強烈。動物實驗中表明HSA/CPSFs組合作用對于血液中的紅細(xì)胞和血小板的增生具有更佳的協(xié)同增效作用。據(jù)此表明，本發(fā)現(xiàn)在臨床上應(yīng)具有極大的應(yīng)用價值。
實施例12 應(yīng)用發(fā)酵技術(shù)大規(guī)模表達(dá)制備HSA/CPSF融合蛋白實驗中表明應(yīng)用畢氏酵母表達(dá)和規(guī)模化生產(chǎn)重組融合蛋白比起其它任何系統(tǒng)都要容易的多。重組株分離到后，重組蛋白表達(dá)株可有Mut+和Muts兩種形式。從小規(guī)模培養(yǎng)開始，甲醇誘導(dǎo)，在不同培養(yǎng)時間點取樣測試蛋白的表達(dá)。對于分泌型蛋白在細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)液中的含量均用SDS-PAGE方法進(jìn)行分析，對表達(dá)產(chǎn)物的生物活性，表達(dá)水平和純度在每一步中均進(jìn)行監(jiān)測。附圖10展示了經(jīng)純化后的各種HSA/CPSFs融合蛋白。
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序列表<110>于在林<120>對多種細(xì)胞具刺激增生作用的人血清白蛋白重組融合蛋白<130>ZYU-0602<160>40<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2363<212>DNA<213>智人<400>1atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt60gtgtttcgtc gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa120gaaaatttca aagccttggt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt180gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgttgctgat240gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca300gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct360gggagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc ccgattggtg420agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa480aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccgga actccttttc540tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc600tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gatgaaggga aggcttcgtc tgccaaacag660agactcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc atgggcagta720gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa 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130 135 140Thr Thr Leu Ser Leu Ala Ile Phe145 150<210>23<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>23gaattcatga agtgggtaac ctttatttcc 30<210>24<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>24gaattcttat aagcctaagg cagcttgact tgc 33<210>25<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>25catatgaact gtgtttgccg cctggtcc 28<210>26<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>26gatatgtatg acacatttaa ttccc 25<210>27<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>27ggatccatgg gggtgcacga atgtcc 26<210>28<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>28gaattctcat ctgtcccctg tcctgc 26<210>29<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>29ggatccatgg ctggacctgc caccc 25<210>30<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>30gaattctcag ggctgggcaa ggtggc 26<210>31<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>31ggatccatgt ggctgcagag cctgctgc 28<210>32<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>32gaattctcac tcctggactg gctcc 25<210>33<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>33ctgccttagg cttacctggg ccaccacctg gcc 33<210>34<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>34tgtcgactca cagccgagtc ttcagcagc 29<210>35<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>35ctgccttagg cttaatctgt gacagccgag tcc 33<210>36<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>36cactcgagtc atctgtcccc tgtcctgc 28<210>37<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>37ctgccttagg cttaaccccc ctgggccctg ccagc 35<210>38<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>38ctcgagtcag ggctgggcaa ggtgg 25<210>39<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>39actccttagg cttagcaccc gcccgctcgc ccagc 35<210>40<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>40ctcgagtcac tcctggactg gctcc 2權(quán)利要求
1.一種用基因工程方法生產(chǎn)的人血清白蛋白(HSA)和細(xì)胞增生刺激因子(CPSF)融合蛋白，其特征是由一個核苷酸多肽編碼的人血清白蛋白(HSA)和一種細(xì)胞增生刺激因子(CPSF)構(gòu)成的一種融合蛋白；這種融合蛋白的核苷酸序列與Seq ID No.1，3，5，7，或9有至少90％序列同源性；由Seq IDNo.1，3，5，7，或9編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列則與Seq ID No.2，4，6，8，或10有至少90％序列同源性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所要求的融合蛋白是由HSA(第一核苷酸多肽)和CPSF(第二核苷酸多肽)共同相連在生物體內(nèi)得到表達(dá)。第一核苷酸序列與Seq IDNo.11有至少90％序列同源性，而由其編碼的一個蛋白質(zhì)氨基酸序列多肽與Seq ID No.12有至少90％序列同源性；第二核苷酸序列其編碼一個CPSF處于第一核苷酸序列的5′或3′末端；第二核苷酸序列與Seq ID.No.13，15，17，19或21有至少90％序列同源性；由第二核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列與Seq ID No.14，16，18，20或22有至少90％序列同源性。
3.一種用基因工程方法生產(chǎn)的人血清白蛋白(HSA)和細(xì)胞增生刺激因子(CPSF)融合蛋白，其特征是由一個核苷酸多肽編碼的人血清白蛋白(HSA)和一種細(xì)胞增生刺激因子(CPSF)構(gòu)成的一種融合蛋白，CPSF可以是下列中的任何蛋白質(zhì)類別的一員，包括但不局限于，1)集落刺激因子有粒白細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬性白細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，嗜酸性白細(xì)胞集落刺激因子(EOS-CSF)(即IL-5)，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF即CSF-1)，復(fù)合性CSF(即IL-3)和EPO；2)白細(xì)胞介素有白細(xì)胞介素-1，-2，-4，-6，-7，-9，-10，-11，-12，-13和白細(xì)胞介素-18；3)非集落刺激因子又非白細(xì)胞介素有Steel因子(SLFC-Kit類似物，干細(xì)胞因子和肥大細(xì)胞生長因子)，血紅增活性因子(EPA)，乳鐵蛋白(LF)，H-亞單位鐵蛋白(即酸性異鐵蛋白)，前列腺素(PG)E1和E2，腫瘤壞死因子(TNF)-α和-β，干擾素(IFN)-α，-β，和-γ，轉(zhuǎn)移因子(TGF)-β，活性素，抑制素，白血球抑制因子和Oncostatin-M；4)Chemokines有巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP)-1-α(即干細(xì)胞抑制因子)，巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP)-1-β，巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP)-2-α(即GRO-β)，GRO-α，M1P-2-β(即GRO-r)，血小板因子-4，巨噬細(xì)胞趨勢性和活性因子，以及IP-10因子；另外還有，5)人生長因子如肝細(xì)胞生長因子；表皮細(xì)胞生長因子；神經(jīng)細(xì)胞生長因子；內(nèi)皮細(xì)胞生長因子等。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所指出的核苷酸序列，進(jìn)一步地可有第三個核苷酸序列編碼一個聯(lián)接氨基酸多肽(LINKER)，來聯(lián)接HSA和CPSF，以構(gòu)成融合蛋白HSA-L-CPSF或CPSF-L-HSA.這個氨基酸多肽聯(lián)接鏈(L)可以是(G4S)3-4聯(lián)接物或可以是2-100個氨基酸鏈長，或可以是5-50個氨基酸鏈長。優(yōu)選地可以是14-30個氨基酸鏈長。
5.根據(jù)權(quán)利要求1中由Seq ID No.1，3，5，7，或9核苷酸序列所編碼的Seq IDNo.2，4，6，8，或10蛋白質(zhì)氨基酸序列的融合蛋白可以和人血清白蛋白特異抗體相結(jié)合。
6.任何重組表達(dá)載體質(zhì)粒攜帶有權(quán)利要求1中的核苷酸序列用于在宿主系統(tǒng)中表達(dá)融合蛋白；宿主系統(tǒng)包括但不局限于，脊椎動物，魚，昆蟲，植物、酵母菌和細(xì)菌體或其細(xì)胞。
7.權(quán)利要求6中的宿主系統(tǒng)中的酵母菌其可以是釀酒酵母(Saccharomyces)，畢氏酵母(Pichia)，念珠菌屬(Candida)，克魯維亞酵母(Kluverornyces)，孢圓母屬(Torulaspora)和裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)等；優(yōu)選地是畢氏巴斯德酵母(Pichia pastoris)(保藏單位ATCC，保藏號PTA-4607，保藏日2002年8月21日)。
8.根據(jù)上述權(quán)利要求1中的重組融合蛋白，其蛋白質(zhì)是由重組酵母菌表達(dá)和糖基化；這一重組融合蛋白也可在脊椎動物細(xì)胞中得到相同的表達(dá)；脊椎動物細(xì)胞可以是中國倉鼠(Chinese Hamster Ovary，CHO)細(xì)胞。
9.根據(jù)上述權(quán)利要求1中的重組融合蛋白，當(dāng)儲存在相同條件下融合蛋白與CPSF單體相比，其貨架壽命至少長2-10倍；融合蛋白與CPSF單體相比在體內(nèi)給藥后在血液中至少有2-10倍長的半衰期。
10.一種制劑組合其含有至少兩種不同的HSA/CPSFs融合蛋白在臨床中使用。
11.根據(jù)上述權(quán)利要求10中的制劑組合，其可是HSA/hIL-11融合蛋白和HSA/hEPO融合蛋白的組成，或也可以是HSA/hIL-3融合蛋白和HSA/hEPO融合蛋白的組合，或是HSA/hIL-11，HSA/hEPO，HSA/hG-CSF和HSA/hGM-CSF的組合使用；組合使用具有治療療效并有協(xié)同增效作用。
12.人血清白蛋白與人的具治療作用蛋白均可利用基因工程方法重組形成融合蛋白并可用于治療目的，或延長具治療作用蛋白質(zhì)在體內(nèi)的半衰期，或降低具治療作用蛋白質(zhì)對生物體的毒性或刺激性；重組形成的融合蛋白對治療目的具正相關(guān)性。
13.在上述權(quán)利要求12中延長半衰期，降低對生物體的毒性或刺激性，是指融合蛋白與具治療作用蛋白質(zhì)單體相比具相同療效時的使用劑量。
全文摘要
本發(fā)明提供了能刺激體內(nèi)細(xì)胞增生的重組融合蛋白的表達(dá)，生產(chǎn)的成套技術(shù)和方法，用以改善公眾健康或用于疾病的治療處理。特別是發(fā)明了人血清白蛋白(HSA)和一種細(xì)胞增生刺激因子(CPSF)利用基因工程方法重組形成融合蛋白，其可，1)刺激多種細(xì)胞增生，特別是可使造血系統(tǒng)中的各種血細(xì)胞發(fā)育成型；2)HSA/CPSF融合蛋白可在體內(nèi)得到緩慢釋放，以達(dá)到細(xì)胞增生刺激因子最大臨床治療效果，并且還包括3)能夠最大限度減低由于單獨使用細(xì)胞增生刺激因子所帶來的潛在副作用及毒性。本發(fā)明還提供了利用酵母菌來生產(chǎn)這種重組融合蛋白的高效\低成本的制造方法。
文檔編號A61P7/00GK1467224SQ0214288
公開日2004年1月14日 申請日期2002年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月1日
發(fā)明者于在林 申請人:美國福源集團(tuán)