專利名稱：作為NF-κB抑制劑的富馬酸衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種或多種富馬酸衍生物作為NF-кB(NF-kappaB)抑制劑的應(yīng)用。同時(shí)，本發(fā)明還涉及所述富馬酸衍生物在制備用于治療受NF-кB影響的疾病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
眾所周知，諸如富馬酸的藥物制劑在給藥后發(fā)生生物降解時(shí)進(jìn)入檸檬酸循環(huán)或者其一部分得到增強(qiáng)的治療顯著性，特別是在以高劑量給藥時(shí)，這是因?yàn)樗鼈兙徑饣蛘咧斡[原性病因?qū)е碌募膊?。另外，富馬酸在小鼠中可抑制Ehrlich腹水瘤的生長，降低絲裂霉素C和黃曲霉素的毒性作用，而且具有抗牛皮癬和抗菌活性。
最重要的臨床應(yīng)用是用各種富馬酸衍生物治療牛皮癬，這已經(jīng)在許多專利中有描述，例如EP 0 188 479、DE 25 30 372、DE 26 21 214或者EP 0 312 697。
DE 197 21 099.6和DE 198 53 487.6公開了某些富馬酸衍生物如富馬酸單烷基酯的其他應(yīng)用。根據(jù)上述文獻(xiàn)，這些特定的富馬酸衍生物可用于治療自身免疫疾病如多關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化以及移植物抗宿主反應(yīng)。另外，DE 198 53 487.6和DE 198 39 566.3教導(dǎo)了富馬酸單烷基酯和富馬酸二烷基酯在移植藥物中的應(yīng)用。雖然已經(jīng)對(duì)富馬酸衍生物在治療牛皮癬中的作用肌理進(jìn)行了個(gè)體研究，但是在此方面仍沒有具體的信息。
NF-кB(核因子кB)是真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子。NF-кB屬于Rel蛋白家族，是具有所謂Rel域特征的轉(zhuǎn)錄因子。Rel域是根據(jù)在作為癌基因的禽病毒中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)成員命名的。該同源性Rel域(RHD)是由300個(gè)氨基酸組成的，其特異性位點(diǎn)負(fù)責(zé)DNA連接在кB位點(diǎn)上，與Rel家族的其他蛋白發(fā)生二聚合以及與I-кB相互作用。
目前，在哺乳動(dòng)物中已知Rel家族有5個(gè)成員，它們是c-Rel、NF-кBl(p105/p50)、NF-кB2(p100/p52)和RelB。理論上，Rel蛋白家族中的這5個(gè)成員可結(jié)合成任意形式的均二聚體和雜二聚體，盡管在體內(nèi)僅觀察到幾種具體的結(jié)合。經(jīng)典而且最具特征的NF-кB分子是p50/65亞單位NF-кB1/RelA的雜二聚體。該雜二聚體是最常見的復(fù)合物，而且實(shí)際上在所有的細(xì)胞類型中都已發(fā)現(xiàn)。
在細(xì)胞活化以及I-кB的離解后，NF-кB雜二聚體p50/p65遷移至細(xì)胞核中，而且在此結(jié)合共有序列5′-GGGRNNYYCC-3′。在此過程中，p50亞單位主要起到DNA結(jié)合亞單位的作用，而p65亞單位則提供反式激活功能。
這些不同結(jié)合的結(jié)果是，每一種雜二聚體都具有獨(dú)特的特征，如細(xì)胞類型特異性、對(duì)于DNA結(jié)合的優(yōu)先性、與I-кB同種型的差別相互作用、差別活化需要以及活化作用的動(dòng)力學(xué)。
NF-кB的快速誘導(dǎo)性是因?yàn)樵撘蜃邮且允Щ畹男问酱嬖谟诎麧{中，即、與NF-кB抑制劑I-кB結(jié)合的復(fù)合物。因此，在活化時(shí)不需要新的蛋白合成，而僅僅是該與I-кB之復(fù)合物的溶解或者該抑制劑的降解以及新的活性NF-кB二聚體隨后轉(zhuǎn)移至核中。
NF-кB可被多種不同的生理和非生理刺激活化。這些刺激包括細(xì)胞因子、促分裂原、病毒、病毒產(chǎn)物、抗原受體在T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞上的交聯(lián)、鈣離子載體、佛波醇酯、UV射線、氧化壓力、磷酸酯酶抑制劑等。許多受NF-кB調(diào)節(jié)或活化的基因的范圍很廣泛，以至于這些基因的轉(zhuǎn)錄可通過該雜二聚體與上述共有序列的結(jié)合而被活化、誘導(dǎo)或者增強(qiáng)。特別地，TNF-α、IL-1、IL-2和脂多糖是重要的刺激物。
這些受調(diào)節(jié)的基因通常包括免疫功能、炎癥應(yīng)答、細(xì)胞粘著、細(xì)胞生長、以及細(xì)胞死亡中涉及的基因，具體而言包括細(xì)胞粘著分子的基因、細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體、急性期蛋白、生長因子以及病毒基因。NF-кB誘導(dǎo)的基因中特別是干擾素β的基因、免疫球蛋白的輕鏈的基因、T細(xì)胞受體的基因、TNF-α和TNF-β的基因、以及組織因子(CD142)的基因，以前稱為組織羌螨絲束蛋白(tromboplastin)或者因子III。
由于其在免疫反應(yīng)和炎癥應(yīng)答調(diào)節(jié)中的中心作用以及參與組織因子、細(xì)胞因子等的調(diào)節(jié)作用，可假設(shè)轉(zhuǎn)錄因子NF-кB的選擇性抑制劑具有與已知抗炎藥類似的優(yōu)點(diǎn)。甾體抗炎藥、干擾素或環(huán)孢菌素可作為例子。

發(fā)明內(nèi)容
令人驚奇地發(fā)現(xiàn)單個(gè)富馬酸衍生物或者它們的混合物具有NF-кB抑制作用。該作用優(yōu)選用于制備單獨(dú)包含這些富馬酸衍生物或者它們的混合物的藥物組合物，該藥物組合物可用于治療受NF-кB介導(dǎo)或者影響的疾病。具體而言，受NF-кB影響的疾病是漸進(jìn)性全身性硬皮病、梅毒性骨軟骨病(Wegener病)、大理石色皮(livedo reticularis)、Behcet病、全身動(dòng)脈炎、潰瘍性結(jié)腸炎、脈管炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、動(dòng)脈硬化、Reiter病、肺肉芽腫、多種類型的腦炎、內(nèi)毒素性休克(膿毒性休克)、膿毒癥、肺炎、腦脊髓炎、神經(jīng)性厭食癥、肝炎(急性肝炎、慢性肝炎、中毒性肝炎、酒精誘發(fā)的肝炎、病毒性肝炎、黃膽、肝功能不足、以及巨細(xì)胞病毒性肝炎)、Rennert T淋巴瘤病、腎小球腎炎、血管成形術(shù)后再狹窄、再灌注綜合癥、巨細(xì)胞病毒性視網(wǎng)膜病、腺病毒性疾病(例如腺病毒性感冒、腺病毒性咽結(jié)膜熱和腺病毒性眼炎)、AIDS、Guillain-Barre綜合癥、皰疹后或者帶狀皰疹后神經(jīng)痛、炎性多神經(jīng)根神經(jīng)瘤、多腦神經(jīng)病、胰管粘稠物阻塞癥、Bechterew病、Barett食管、EBV(Epstein-Barr病毒)感染、心臟重新再造、間質(zhì)性膀胱炎、II型糖尿病、人腫瘤放射致敏、惡性細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療劑的多重耐藥性(化療中的多藥物耐藥性)、環(huán)形肉芽腫以及癌癥(如乳腺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、原發(fā)性肝細(xì)胞癌、腺癌、卡波濟(jì)肉瘤、前列腺癌、白血病如急性髓細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤(漿細(xì)胞瘤)、Burkitt淋巴瘤和Castleman腫瘤)。
具體實(shí)施例方式
根據(jù)本發(fā)明，選自于以下組中的一種或多種富馬酸衍生物優(yōu)選用于NF-кB抑制以及制備藥物組合物富馬酸二烷基酯和游離酸或鹽形式的富馬酸單烷基酯以及它們的混合物。
富馬酸二烷基酯優(yōu)選符合以下結(jié)構(gòu)式 其中R1和R2可以相同或不相同，分別代表直鏈、支鏈、環(huán)狀、飽和或不飽和的C1-24烷基或C5-20芳基，而且這些基團(tuán)可以任選地被鹵素(F、Cl、Br、I)、羥基、C1-4烷氧基、硝基或氰基取代。
基團(tuán)R1和R2優(yōu)選為甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、環(huán)戊基、2-乙基己基、己基、環(huán)己基、庚基、環(huán)庚基、辛基、乙烯基、烯丙基、2-羥基乙基、2-或3-羥基丙基、2，3-二羥基丙基、2-甲氧基乙基、甲氧基甲基或者2-或3-甲氧基丙基。
富馬酸單烷基酯優(yōu)選對(duì)應(yīng)于以下結(jié)構(gòu)式
其中R1為以上定義的基團(tuán)；A為氫離子或者堿金屬或堿土金屬陽離子或者生理可接受的過渡金屬陽離子，優(yōu)選選自Li+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Fe2+、和Mn2+，n為1或2并相應(yīng)于A的價(jià)數(shù)。
優(yōu)選地，本發(fā)明所采用的一種或多種富馬酸衍生物選自于以下組中富馬酸二甲酯、富馬酸二乙酯、富馬酸甲基乙基酯、富馬酸甲基氫酯、富馬酸乙基氫酯、富馬酸甲酯鎂鹽、富馬酸乙酯鎂鹽、富馬酸甲酯鋅鹽、富馬酸乙酯鋅鹽、富馬酸甲酯鐵鹽、富馬酸乙酯鐵鹽、富馬酸甲酯鈣鹽和/或富馬酸乙酯鈣鹽。
優(yōu)選地，本發(fā)明富馬酸衍生物在藥物組合物之劑量單元中的用量為，一種或多種富馬酸衍生物的量相當(dāng)于或者等于1至500mg、優(yōu)選10至300mg、最優(yōu)選10至200mg的富馬酸。
藥物組合物為口服給藥、非腸道給藥、直腸給藥、經(jīng)皮給藥、皮膚給藥、鼻腔給藥、經(jīng)肺(吸入)給藥或經(jīng)眼給藥的劑型，優(yōu)選為口服給藥的劑型。
就口服給藥而言，本發(fā)明的藥物組合物的形式為單元?jiǎng)┝康钠瑒?，微片劑、微丸劑或顆粒劑，膠囊劑或供飲用的溶液，所述微片劑、微丸劑或顆粒劑可任選包膠或者填充在膠囊或袋中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，固體制劑或其它制劑包敷有腸溶包衣。這種包衣也可以用于膠囊或內(nèi)部充填的制劑中。
在通過注射(i.v.，i.m.，s.c.，i.p.)進(jìn)行非胃腸道給藥時(shí)，本發(fā)明的藥物組合物為合適的劑型?？墒褂萌魏芜m用于注射的常規(guī)液體載體。
本發(fā)明藥物組合物優(yōu)選可單獨(dú)或者以混合物的形式包含10至500mg的富馬酸二烷基酯，特別是富馬酸二甲酯和/或富馬酸二乙酯；10至500mg的富馬酸烷基酯鈣鹽，特別是富馬酸甲酯鈣鹽和/或富馬酸乙酯鈣鹽；0至250mg的富馬酸烷基酯鋅鹽，特別是富馬酸甲酯鋅鹽和/或富馬酸乙酯鋅鹽；0至250mg的富馬酸烷基氫酯，特別是富馬酸甲基氫酯和/或富馬酸乙基氫酯；以及0至250mg的富馬酸烷基酯鎂鹽，特別是富馬酸甲酯鎂鹽和/或富馬酸乙酯鎂鹽；總量相當(dāng)于10-500mg、優(yōu)選10-300mg、最優(yōu)選100mg的富馬酸。
本發(fā)明的優(yōu)選組合物僅包含富馬酸二甲酯，其用量為10至300mg。
根據(jù)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的組合物為微片劑或微丸劑的形式。丸劑的尺寸或者平均直徑優(yōu)選為小于等于5000μm，更優(yōu)選為300-2500μm，特別是300-1000μm；而微片劑則為1000-2500μm。通過給藥本發(fā)明優(yōu)選的微片劑形式的富馬酸衍生物，可進(jìn)一步減少在給藥常規(guī)的單劑量單元的片劑時(shí)不能避免的胃腸道刺激或者副作用。這有可能是因?yàn)橐韵略蛭⑵瑒?、?yōu)選具有腸溶包衣的微片劑已分散在胃中，并因此分批地到達(dá)腸道中，在此活性成分以局部較小劑量釋放，但總的劑量仍是相同的。這也有助于避免對(duì)腸上皮細(xì)胞的刺激作用，與常規(guī)片劑相比提高了微片劑的胃腸道耐受性。
例如，富馬酸衍生物可以依據(jù)EP 0 312 679中公開的方法制備。
原則上，本發(fā)明之片劑或者微片劑形式的口服藥物組合物可通過典型的壓片法制造。取代此等典型的壓片法，也可使用其他的片劑制造方法，例如直接壓片以及根據(jù)熔融法或者噴霧干燥法制備固體分散體的方法。
片劑可具有腸溶包衣。該腸溶包衣可在典型的包衣鍋中包敷或者噴涂上。包衣也可用Boegel包衣設(shè)備進(jìn)行包敷。另外，片劑可具有薄膜包衣。
為說明本發(fā)明的用途，以下列出了多個(gè)制備優(yōu)選藥物的實(shí)施例。這些實(shí)施例僅是用于說明，絕不是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例1含有腸溶包衣的薄膜衣片的制備，其中含有100.0mg的富馬酸單甲酯鈣鹽，相當(dāng)于78mg的富馬酸采取必要的防護(hù)措施(口罩、手套、防護(hù)衣等)，將10kg的富馬酸單甲酯鈣鹽粉碎，強(qiáng)烈混合并過800目篩混勻。然后制備以下組成的輔料混合物21kg的淀粉衍生物(STA-RX 1500)、2kg的微晶纖維素(Avicel PH 101)、0.6kg的聚乙烯吡咯烷酮(PVP，Kollidon25)、4kg的Primogel、0.3kg的膠體硅酸(Aerosil)。
將活性成份加到上述整個(gè)粉末混合物中，混合，過200目篩混合均勻，按常規(guī)方法采用2％聚乙烯吡咯烷酮(PVP，Kollidon25)水溶液制粒，然后在干燥狀態(tài)下與外層相混合。后者由2kg所謂的FST復(fù)合物組成，其中含有80％的滑石粉、10％的膠體硅酸和10％的硬脂酸鎂。
此后，用常規(guī)方法將混合物壓制成圓片，片重400mg，片徑10.0mm。除常規(guī)壓片方法外，其它方法如直接壓片或根據(jù)熔融法和噴霧干燥法進(jìn)行的固體分散也可用于制片。
腸溶包衣制備含有2.250kg的羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯(HPMCP，Pharmacoat HP50)的溶液，其中溶劑為2.50L的去離子水、13L的丙酮(Ph.Helv.VII)、以及13L的乙醇(濃度為94重量％)，然后加入0.240kg的蓖麻油(Ph.Eur.II)。按常規(guī)方法在包衣鍋中將溶液分份倒入或噴到素片上或采用適當(dāng)結(jié)構(gòu)的流化床。
干燥后進(jìn)行薄膜包衣。所述包衣由一種溶液構(gòu)成，其中含有4.8kg的Eudragit E 12.5％、0.34kg的滑石粉Ph.Eur.II、0.52kg的氧化鈦(VI)Cronus RN 56、0.21kg的藍(lán)顏料ZLT-2(Siegle)、以及0.12kg的聚乙二醇6000 Ph.Helv.VII，而溶劑包括8.2kg的異丙醇Ph.Helv.VII、0.06kg的甘油三乙酸酯(Triacetin)和0.2kg的去離子水。在包衣鍋或流化床中均勻分布后，按常規(guī)方法對(duì)混合物進(jìn)行干燥和拋光。
實(shí)施例2含有腸溶包衣的膠囊的制備，其中含有86.5mg富馬酸單乙酯鈣鹽和110.0mg富馬酸二甲酯，共相當(dāng)于150mg富馬酸采取必要的防護(hù)措施(口罩、手套、防護(hù)衣等)，將8.65kg的富馬酸單乙酯鈣鹽和11kg的富馬酸二甲酯粉碎，與一種混合物強(qiáng)烈混合，該混合物包含15kg的淀粉、6kg的乳糖(Ph.Helv.VII)、2kg的微晶纖維素(Avicel)、1kg的聚乙烯吡咯烷酮(Kollidon25)和4kg的Primogel，然后過800目篩混勻。
按常規(guī)方法用2％聚乙烯吡咯烷酮(Kollidon25)水溶液使上述整個(gè)化合物成粒，然后在干燥狀態(tài)下與外層相混合。所述的外層相含有0.35kg的膠體硅酸(Aerosil)、0.5kg的硬脂酸鎂和1.5kg的滑石粉(Ph.Helv.VII)。勻化的混合物按500.0mg的規(guī)格充填于適當(dāng)?shù)哪z囊中，然后用已知方法包附腸溶包衣(耐胃酸)，其中腸溶包衣由羥丙基乙基纖維素硬脂酸酯和作為軟化劑的蓖麻油組成。除硬明膠外，混合物也可以充填至適當(dāng)?shù)哪臀杆岬哪z囊中，該膠囊由乙酸鄰苯二甲酸纖維素(CAP)和羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯(HPMCP)的混合物組成。
實(shí)施例3含有腸溶包衣的微片膠囊的制備，其中含有87.0mg的富馬酸單乙酯鈣鹽、120mg的富馬酸二甲酯、5.0mg的富馬酸單乙酯鎂鹽和3.0mg的富馬酸單乙酯鋅鹽，共相當(dāng)于164mg富馬酸(forte片)采取必要的防護(hù)措施(口罩、手套、防護(hù)衣等)，將8.7kg的富馬酸單乙酯鈣鹽、12kg的富馬酸二甲酯、0.5kg的富馬酸單乙酯鎂鹽和0.3kg的富馬酸單乙酯鋅鹽粉碎，強(qiáng)烈混合并過800目篩混勻。然后按以下組成制備輔料混合物18kg的淀粉衍生物(STA-RX 1500)、0.3kg的微晶纖維素(Avicel PH 101)、0.75kg的PVP(Kollidon 120)、4kg的Primogel、0.25kg的膠體硅酸(Aerosil)。將整個(gè)混合物加到活性成份混合物中，過200目篩混勻。按常規(guī)方法用2％的聚乙烯吡咯烷酮(KollidonK25)水溶液制粒，然后在干燥狀態(tài)下與外層相混合，該外層相由0.5kg的硬脂酸鎂和1.5kg的滑石粉組成。將粉末混合物用常規(guī)方法壓制成圓片，片重10.0mg，片徑2.0mm。除常規(guī)壓片方法外，其它方法如直接壓片或根據(jù)熔融法和噴霧干燥法進(jìn)行的固體分散也可用于制片。
按常規(guī)方法將耐胃酸包衣液倒入或噴入包衣鍋中或采用適當(dāng)結(jié)構(gòu)的流化床。為獲得耐胃酸的功能，制備含有2.250kg的羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯(HPMCP，Pharmacoat HP50)的溶液，其中溶劑為13L的丙酮、13.5L用2％丙酮變性的乙醇(濃度為94重量％)和2.5L的去離子水。加入0.240kg作為軟化劑的蓖麻油構(gòu)成最終溶液，然后按常規(guī)方法分份包敷到素片上。
薄膜包衣干燥完成后，將以下組成的懸浮液在相同包衣裝置中進(jìn)行薄膜包衣0.340kg的滑石粉、0.4kg的氧化鈦(VI)Cronus RN56、0.324kg的紅顏料86837、4.8kg的Eudragit E 12.5％、以及0.12kg的聚乙二醇6000 pH 11 XI，其中溶劑包括8.17kg的異丙醇、0.2kg的去離子水和0.6kg的甘油三乙酸酯(Triacetin)按凈重500.0mg的規(guī)格將耐胃酸的微片裝入硬明膠膠囊中并密封。
實(shí)施例4制備在膠囊中的腸溶包衣的微片劑，其包含120.0mg的富馬酸二甲酯，相當(dāng)于96mg的富馬酸采取必要的防護(hù)措施(口罩、手套、防護(hù)衣等)，將12kg的富馬酸二甲酯粉碎，過800目篩混勻。然后按以下組成制備輔料混合物17.5kg的淀粉衍生物(STA-RX 1500)、0.30kg的微晶纖維素(Avicel PH101)、0.75kg的PVP(Kollidon120)、4kg的Primogel、0.25kg的膠體硅酸(Aerosil)。將活性成份加到整個(gè)粉末混合物中，混合，過200目篩混勻，然后按常規(guī)方法用2％的聚乙烯吡咯烷酮(KollidonK25)水溶液制粒，接著在干燥狀態(tài)下與外層相混合。該外層相含有0.5kg的硬脂酸鎂和1.5kg的滑石粉。
之后，將上述粉末混合物用常規(guī)方法壓制成圓片，片重10.0mg，片徑2.0mm。
為獲得耐胃酸的功能，制備含有2.25kg的羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯(HPMCP，Pharmacoat HP50)的溶液，其中溶劑為13L的丙酮、13.5L用2％丙酮變性的乙醇(濃度為94重量％)和1.5L的去離子水。加入0.24kg作為軟化劑的蓖麻油構(gòu)成最終溶液，然后按常規(guī)方法分份包敷到素片上。
干燥完成后，將以下組成的懸浮液在相同包衣裝置中進(jìn)行薄膜包衣0.34kg的滑石粉、0.4kg的氧化鈦(VI)Cronus RN56、0.324kg的紅顏料86837、4.8kg的Eudragit E 12.5％、以及0.12kg的聚乙二醇6000pH11 XI，其中溶劑包括8.17kg的異丙醇、0.2kg的去離子水和0.6kg的甘油三乙酸酯(Triacetin)按凈重400mg的規(guī)格將腸溶包衣的微片裝入硬明膠膠囊中并密封。
實(shí)施例5制備在膠囊中的腸溶包衣的微片劑，其包含120.0mg的富馬酸二甲酯，相當(dāng)于96mg的富馬酸如上所述將12kg的富馬酸二甲酯粉碎并混勻。然后按以下組成制備輔料混合物23.2kg的微晶纖維素(Avicel PH 200)、3kg的交聯(lián)羧甲基纖維素鈉(AC-Si-SOL-SD-711)、2.5kg的滑石粉、0.1kg的無水硅酸(Aerosil 200)以及1kg的硬脂酸鎂。之后，將上述粉末混合物用常規(guī)方法壓制成圓片，片重10.0mg，片徑2.0mm。
之后，制備0.94kg Eudragit L在異丙醇中的溶液，該溶液還包含0.07kg的鄰苯二甲酸二丁酯。將該溶液噴在素片上。制備17.32kg的EudragitL D-55以及2.8kg微滑石粉、2kg Macrogol 6000和0.07kg二甲硅油的混合物在水中的懸浮體，然后噴涂在上述芯上。
最后，按凈重650mg的規(guī)格將腸溶包衣的微片裝入硬明膠膠囊中并密封。
實(shí)施例6NF-кB向細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)移將NF-кB(p65)嵌于載體pEGFP-C1中，該載體包含與巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(Clontech)連接的EGFP(綠色熒光蛋白)。這導(dǎo)致熒光NF-кB的表達(dá)。HUVEC細(xì)胞平板接種在涂覆明膠的培養(yǎng)板的第3和第5通道之間，該培養(yǎng)板具有12個(gè)孔(Costar)，并分別生長至80或90％融合。使用磷酸鈣沉淀法對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理。具體而言，細(xì)胞用Dulbecco改良Eagles培養(yǎng)基(DMEM)調(diào)節(jié)，24小時(shí)后每個(gè)孔添加包含1μg DNA的沉淀物，然后該細(xì)胞再培養(yǎng)4小時(shí)。用HBSS(Hanks平衡鹽溶液)洗滌后，添加培養(yǎng)基，并在刺激前使細(xì)胞進(jìn)一步生長18小時(shí)。
在試驗(yàn)中，用40μM/1的富馬酸二甲酯調(diào)節(jié)細(xì)胞，不含有DNA的平行制劑作為對(duì)照。調(diào)節(jié)開始后2小時(shí)，用10ng/ml的TNF-α刺激所述細(xì)胞，時(shí)間如表1所示。
之后，細(xì)胞進(jìn)行溶解處理，棄掉上清液，細(xì)胞核收集在含有蛋白酶抑制劑的Dounce緩沖液(10mM tris-HCl，pH7.6、0.5mM MgCl、10μg/ml亮肽素、10μg/ml抑肽酶、1mM苯基甲基磺?；?、1.8mg/ml碘代乙酰胺)中。在1200g、4℃下離心10分鐘后，在FAC掃描流細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Becton Dickinson)上分析細(xì)胞核。
表1NF-кB(p65)陽性核的數(shù)量(基于所有用NF-кB進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù))

該表中的結(jié)果說明濃度為40μM/l的富馬酸二甲酯抑制TNF誘發(fā)的NF-кB向細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)移。
實(shí)施例7對(duì)NF-кB刺激的轉(zhuǎn)錄的抑制作用AP-1共有位點(diǎn)(鍵合位點(diǎn))的三重重復(fù)體(48bp，3×TGTGA-TGACTCAGGTT)以及NF-кB共有位點(diǎn)的三重重復(fù)體(60bp，3×AATCGTGGAATTTCCTCTGA)，與SpeI鍵合位點(diǎn)(未示出)相接，嵌入在pTK-UBT-luc載體(de Martin，Gene 124；137-138，1993)的SpeI位點(diǎn)中。由bp-1285延伸至bp+482的E-選擇蛋白啟動(dòng)子的1.3kb構(gòu)建體嵌入在pMAM Neu-luc載體(Clontech)的NdeI位點(diǎn)中。
HUVEC細(xì)胞用如上在實(shí)施例6中得到的構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在進(jìn)行所述轉(zhuǎn)染時(shí)，于每個(gè)孔中添加2.5μg相關(guān)的啟動(dòng)子構(gòu)建體。為證實(shí)轉(zhuǎn)染效率，在每個(gè)試樣中用500ng的pSV-β半乳糖苷酶對(duì)照載體(PromegaCorp.，Madison，WI，U.S.A.)作為對(duì)照。轉(zhuǎn)染后2天，用10ng/ml的TNF-α刺激細(xì)胞2小時(shí)，其中可添加或不添加6μg/ml的富馬酸二甲酯(DMF)。如下收集細(xì)胞胰蛋白酶化，沉淀，洗滌，并按照制造商的建議重新懸浮在200μl的“報(bào)道基因溶解緩沖液”(Promega)15分鐘。
使用蟲熒光素酶測(cè)試體系(Promega)通過Berthold AutoLumatLB9507測(cè)量蟲熒光素酶活性。使用Promega β-半乳糖苷酶測(cè)試體系測(cè)量β-半乳糖苷酶活性。用相關(guān)啟動(dòng)子構(gòu)建體得到的蟲熒光素酶活性相對(duì)于β-半乳糖苷酶活性進(jìn)行歸一化。β-半乳糖苷酶活性在每個(gè)試樣中的變動(dòng)寬度低于10％。表2顯示了相對(duì)于基線的單個(gè)結(jié)果×倍。
表2轉(zhuǎn)錄的增加在有或沒有40μM/l的富馬酸二甲酯(DMF)時(shí)用TNF刺激(10ng/ml)后蟲熒光素酶活性的相對(duì)增加(相對(duì)于基線的×倍增加)，n＝6

表2中的結(jié)果說明富馬酸二甲酯抑制TNF誘導(dǎo)的NF-кB依賴性基因的轉(zhuǎn)錄，但不抑制AP-1依賴性基因的轉(zhuǎn)錄。因此，富馬酸二甲酯的抑制作用是NF-кB特異性的。
權(quán)利要求
1.一種或多種富馬酸衍生物在制備用于治療受NF-κB影響之疾病的藥物組合物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述富馬酸衍生物選自于富馬酸二烷基酯、游離酸或鹽形式的并任選取代的富馬酸單烷基酯以及它們的混合物。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中所述富馬酸二烷基酯相應(yīng)于以下結(jié)構(gòu)式 其中R1和R2可以相同或不相同，分別代表直鏈、支鏈、環(huán)狀、飽和或不飽和的C1-24烷基或C5-20芳基，而且這些基團(tuán)可以任選被鹵素(F、Cl、Br、I)、羥基、C1-4烷氧基、硝基或氰基取代。
4.如權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于基團(tuán)R1和R2為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、環(huán)戊基、2-乙基己基、己基、環(huán)己基、庚基、環(huán)庚基、辛基、乙烯基、烯丙基、2-羥基乙基、2-或3-羥基丙基、2-甲氧基乙基、2，3-二羥基丙基、甲氧基甲基或者2-或3-甲氧基丙基。
5.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中所述富馬酸單烷基酯相應(yīng)于以下結(jié)構(gòu)式 其中-R1為權(quán)利要求3或4定義的基團(tuán)；-A為氫離子或者堿金屬或堿土金屬陽離子或者生理可接受的過渡金屬陽離子，優(yōu)選選自Li+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Fe2+、和Mn2+；-n為1或2并相應(yīng)于A的價(jià)數(shù)。
6.如權(quán)利要求1至5之一所述的應(yīng)用，其特征在于所述富馬酸衍生物為一種或多種選自于以下組中的衍生物富馬酸二甲酯、富馬酸二乙酯、富馬酸甲基乙基酯、富馬酸甲基氫酯、富馬酸乙基氫酯、富馬酸甲酯鈣鹽、富馬酸乙酯鈣鹽、富馬酸甲酯鎂鹽、富馬酸乙酯鎂鹽、富馬酸甲酯鋅鹽、富馬酸乙酯鋅鹽、富馬酸甲酯鐵鹽和富馬酸乙酯鐵鹽以及它們的混合物。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述富馬酸衍生物是富馬酸二甲酯。
8.一種或多種富馬酸衍生物在制備用于治療受NF-κB影響之疾病的藥物組合物中的應(yīng)用，所述疾病選自于以下組中漸進(jìn)性全身性硬皮病、梅毒性骨軟骨病(Wegener病)、大理石色皮(livedo reticularis)、Behcet病、全身動(dòng)脈炎、潰瘍性結(jié)腸炎、脈管炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、動(dòng)脈硬化、Reiter病、肺肉芽腫、多種類型的腦炎、內(nèi)毒素性休克(膿毒性休克)、膿毒癥、肺炎、腦脊髓炎、神經(jīng)性厭食癥、肝炎(急性肝炎、慢性肝炎、中毒性肝炎、酒精誘發(fā)的肝炎、病毒性肝炎、黃膽、肝功能不足、以及巨細(xì)胞病毒性肝炎)、Rennert T淋巴瘤病、腎小球腎炎、血管成形術(shù)后再狹窄、再灌注綜合癥、巨細(xì)胞病毒性視網(wǎng)膜病、腺病毒性疾病(例如腺病毒性感冒、腺病毒性咽結(jié)膜熱和腺病毒性眼炎)、AIDS、Guillain-Barre綜合癥、皰疹后或者帶狀皰疹后神經(jīng)痛、炎性多神經(jīng)根神經(jīng)瘤、多腦神經(jīng)病、胰管粘稠物阻塞癥、Bechterew病、Barett食管、EBV(Epstein-Barr病毒)感染、心臟重新再造、間質(zhì)性膀胱炎、II型糖尿病、人腫瘤放射致敏、惡性細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療劑的多重耐藥性(化療中的多藥物耐藥性)、環(huán)形肉芽腫以及癌癥(如乳腺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、原發(fā)性肝細(xì)胞癌、腺癌、卡波濟(jì)肉瘤、前列腺癌、白血病如急性髓細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤(漿細(xì)胞瘤)、Burkitt淋巴瘤和Castleman腫瘤)。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述富馬酸衍生物選自于富馬酸二烷基酯以及游離酸或鹽形式的富馬酸單烷基酯或者它們的混合物。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中所述富馬酸二烷基酯相應(yīng)于以下結(jié)構(gòu)式 其中R1和R2可以相同或不相同，分別代表直鏈、支鏈、環(huán)狀、飽和或不飽和的C1-24烷基或C5-20芳基，而且這些基團(tuán)可以任選被鹵素(F、Cl、Br、I)、羥基、C1-4烷氧基、硝基或氰基取代。
11.如權(quán)利要求9或10所述的應(yīng)用，其特征在于基團(tuán)R1和R2為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、環(huán)戊基、2-乙基己基、己基、環(huán)己基、庚基、環(huán)庚基、辛基、乙烯基、烯丙基、2-羥基乙基、2-或3-羥基丙基、2-甲氧基乙基、2，3-二羥基丙基、甲氧基甲基或者2-或3-甲氧基丙基。
12.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中所述富馬酸單烷基酯相應(yīng)于以下結(jié)構(gòu)式 其中-R1為權(quán)利要求3或4定義的基團(tuán)；-A為氫離子或者堿金屬或堿土金屬陽離子或者生理可接受的過渡金屬陽離子，優(yōu)選選自Li+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Fe2+、和Mn2+；-n為1或2并相應(yīng)于A的價(jià)數(shù)。
13.如權(quán)利要求1至5之一所述的應(yīng)用，其特征在于所述富馬酸衍生物在藥物組合物之單元?jiǎng)┝恐械暮肯喈?dāng)于1至500mg、優(yōu)選10至300mg、最優(yōu)選10至200mg的富馬酸。
14.如權(quán)利要求8-13之一所述的應(yīng)用，其中所述藥物組合物為口服給藥、非腸道給藥、直腸給藥、經(jīng)皮給藥、皮膚給藥、鼻腔給藥、經(jīng)肺(吸入)給藥或經(jīng)眼給藥的劑型，優(yōu)選為口服給藥的劑型。
15.如權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其中口服給藥的藥物組合物的劑型為單元?jiǎng)┝康钠瑒?，微片劑、微丸劑或顆粒劑，膠囊或供飲用的溶液，所述微片劑、微丸劑或顆粒劑可任選包膠或者填充在膠囊或袋中。
16.如權(quán)利要求15所述的應(yīng)用，其特征在于固體制劑包有腸溶包衣。
17.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在藥物組合物的單元?jiǎng)┝恐袉为?dú)或者組合含有一種或多種以下物質(zhì)10至500mg的富馬酸二烷基酯，特別是富馬酸二甲酯和/或富馬酸二乙酯；10至500mg的富馬酸烷基酯鈣鹽，特別是富馬酸甲酯鈣鹽和/或富馬酸乙酯鈣鹽；0至250mg的富馬酸烷基酯鋅鹽，特別是富馬酸甲酯鋅鹽和/或富馬酸乙酯鋅鹽；0至250mg的富馬酸烷基氫酯，特別是富馬酸甲基氫酯和/或富馬酸乙基氫酯；0至250mg的富馬酸烷基酯鎂鹽，特別是富馬酸甲酯鎂鹽和/或富馬酸乙酯鎂鹽；總量相當(dāng)于10-500mg、優(yōu)選10-300mg、最優(yōu)選100mg的富馬酸。
18.如權(quán)利要求15或16所述的應(yīng)用，其特征在于所述組合物為尺寸小于等于5000μm的微片劑或微丸劑，對(duì)于丸劑優(yōu)選為300-1000μm；而微片劑則為1000-2500μm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種或多種富馬酸衍生物作為NF－κB抑制劑的應(yīng)用。同時(shí)，本發(fā)明還涉及所述富馬酸衍生物在制備用于治療受NF－κB影響的疾病的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K47/04GK1520291SQ02803628
公開日2004年8月11日 申請(qǐng)日期2002年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月12日
發(fā)明者拉金德拉·庫馬爾·喬希, 漢斯－彼得·斯特雷貝里, 彼得·佩策爾鮑爾, 佩策爾鮑爾, 拉金德拉 庫馬爾 喬希, 說謾に固乩妝蠢 申請(qǐng)人:富瑪法姆股份公司