專利名稱：貯存穩(wěn)定的人纖維蛋白原溶液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及貯存穩(wěn)定的、濃縮人纖維蛋白原制劑，及其用于防止失血、促進(jìn)傷口愈合和許多其它的治療性和非治療性應(yīng)用的使用方法。
相關(guān)申請參考本申請要求2001年10月3日提交的美國臨時申請No.60/326,962的優(yōu)先權(quán)，這里全文引入。
背景技術(shù)：
纖維蛋白原是一種血漿蛋白，它在哺乳動物體內(nèi)血凝的最后階段起著重要的作用從而保持止血和防止失血。人體內(nèi)凝塊的形成，即，血液凝固，是以復(fù)雜級聯(lián)方式進(jìn)行的，在血凝的最后步驟中單體形式的纖維蛋白原在鈣離子存在的情況下與凝血酶和激活因子VIII反應(yīng)，形成了包括交聯(lián)纖維蛋白聚合體的纖維蛋白凝塊。
血漿蛋白中濃度為2-4克/升的纖維蛋白原單體，由三對經(jīng)二硫鍵相連的多肽鏈構(gòu)成。這些鏈稱之為(Aα)2和(Bβ)2(分別表示α鏈、β鏈的兩個小的氨基末端肽)以及γ2。凝血酶從纖維蛋白原切割纖維蛋白肽A形成化合物纖維蛋白I，隨后切割纖維蛋白肽B形成最終的化合物纖維蛋白II。該切割只是略微地將纖維蛋白原的分子量從340,000道爾頓減少至334,000，但該過程卻暴露出重要的形成匯聚且交聯(lián)的纖維蛋白凝塊的聚合反應(yīng)位點。參見Jackson，Ann.Rev.Biochem 49765-811(1980)；Furie等，Cell 53505-518(1988)。
近來，已開發(fā)出含有纖維蛋白原、凝血酶和其它成分的生物膠粘劑，這類生物膠粘劑模擬自然凝血過程的最后階鼠，因而形成纖維蛋白凝塊。對所謂的纖維蛋白密閉劑或組織密閉劑、生物密閉劑、纖維蛋白膠或組織膠、生物膠粘劑等(這里合稱為“纖維蛋白密閉劑”)這類物質(zhì)的試驗表明抗張強(qiáng)度與最終的纖維蛋白原濃度有正比關(guān)系(日本專利未審公開申請，Kokai No.Sho 61-293443)。因此，獲得濃縮的纖維蛋白原對于制備常規(guī)的纖維蛋白密閉劑是很重要的。
以纖維蛋白原為基礎(chǔ)的組織膠粘劑是已知的，例如美國專利No.6,117,425(MacPhee等)。除纖維蛋白原和因子XIII外，這類制劑也可含有其它的蛋白，如纖連蛋白、白蛋白以及任選地含有抗生素、生長因子等。所需的催化(凝血酶介導(dǎo)的)活性可源于它所應(yīng)用的宿主組織(傷口的表面)，或在應(yīng)用的過程中以含凝血酶和Ca++離子的溶液或粉末形式加入組織膠粘劑中。這類纖維蛋白密閉劑已用于人或動物組織或器官部分的無縫和/或有縫粘合、用于傷口閉合、止血和促進(jìn)傷口愈合、用于包埋假體裝置、及用于許多其它的治療或非治療性應(yīng)用。
纖維蛋白密閉劑的纖維蛋白原成分來源于收集的人血漿，通常作為人的因子VIII制備過程中的廢棄產(chǎn)物。纖維蛋白原能由人血漿通過冷沉淀而濃縮，或用各種試劑例如聚乙二醇、乙醚、乙醇、硫酸銨或甘氨酸通過已知的方法沉淀而濃縮。例如Brennan在Blood Reviews 5240-244(1991)中、Gibble等在Transfusion 30741-747(1990)中、Matras在J.Oral Maxillofac.Surg.43605-611(1985)中、Lerner等在J.Surg.Res.48165-181(1990)中對纖維蛋白密閉劑進(jìn)行了綜述。
從制備的角度看，按照美國專利No.5,290,552的描述，早期的外科膠粘劑制劑必須包含高含量的纖維蛋白原(約8-10％)，極難由其制備凍干物。這類冷沉淀物相對不穩(wěn)定且要求在使用前一直貯存在-20℃以下。改進(jìn)冷沉淀物穩(wěn)定性的配方包括添加血纖蛋白溶酶原激活劑的抑制劑或白蛋白。
在足夠高的纖維蛋白原的濃度下，該制劑在傷口愈合過程中能提供有效的止血性能、對傷口和/或組織區(qū)域良好的密閉粘附性、高強(qiáng)度的粘附和/或傷口密閉性以及膠粘劑的完全可再吸收能力。對于最佳的粘附作用，要求即用型組織膠粘劑溶液中纖維蛋白原的濃度為約15-60mg/ml(MacPhee，personalcommunication，1995)。
組織膠粘劑或以深度冷凍溶液的形式出售，或以凍干物的形式出售。這是因為已知液體溶液中高濃度的纖維蛋白原是極不穩(wěn)定的(httpwww.tissuesealing.com/us/products/biological/monograph.cfm/)，即它會自發(fā)凝固。因此，市售的凍干的和/或深度冷凍的纖維蛋白原濃縮物，如Tissucol，目前必須在應(yīng)用前液化，即慢慢融解(“熔化”)或由凍干的形式重構(gòu)。然而，兩種液化過程都很費事并在產(chǎn)品使用前要耽誤很長的時間，這會使受傷的病人處于生命受到威脅的狀態(tài)。
深度冷凍濃縮物的“液化溫度”，例如制劑由冷凍的固態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時的溫度，要求溶液的溫度緩慢上升—通常達(dá)到至少25℃，更常見的是37℃以上，同時要求劇烈攪拌或振蕩多至30-60分鐘(http//www.tissuesealing.com/us/products/biological/monograph.cfm/)。因此，現(xiàn)有技術(shù)中纖維蛋白原制劑的重構(gòu)要求使用水浴或其它加熱裝置(典型的是在37℃)，以盡可能在最短的時間內(nèi)將深度冷凍物質(zhì)變成即用型纖維蛋白原溶液。然而，因為產(chǎn)品需要必要的雙層包裝以便例如在整個困難、繁瑣的解凍過程中保持產(chǎn)品的無菌狀態(tài)，所以典型地使得熱交換更加困難。例如，預(yù)填充、即用型、無菌一次性注射器中的深度冷凍的纖維蛋白密閉劑制劑必須以塑料膜雙層密封以保持無菌。
由深度冷凍的固態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐簯B(tài)不是突然發(fā)生的，而是經(jīng)歷升高溫度的步驟，經(jīng)歷膠狀的和粘性的過渡狀態(tài)。根據(jù)至少一種試驗，當(dāng)傾斜試管形成水平的液體水平面時，即樣品流動時不會突然形成可見的突起時樣品才稱為“液態(tài)”。因此，現(xiàn)有技術(shù)中在貯備的纖維蛋白原制劑使用前，測試產(chǎn)品以確定其什么時候達(dá)到均勻的“液體”即用型狀態(tài)需要增加額外的耗費時間的步驟。而且，一定程度的操作者誤差的不確定性和可能性也會顯然影響纖維蛋白原產(chǎn)品的有用性和有效性。
配制凍干的纖維蛋白原需要花費的時間也造成使用前要耽擱相當(dāng)長的時間，這成為當(dāng)前以纖維蛋白原為基礎(chǔ)的止血劑應(yīng)用中的實際問題。所以，已經(jīng)進(jìn)行了許多努力試圖改善凍干的纖維蛋白原制劑的溶解性。例如，制造者需要使用加入到裝蛋白的小瓶中的磁性攪拌子，以便加熱時提供顯著的振蕩。這樣，溶解時間比得不到充分混合的同樣產(chǎn)品短，但也仍然需要30-60分鐘的配制時間以僅僅得到即用型的纖維蛋白原。
通常，病毒失活方法的使用使現(xiàn)有技術(shù)中的纖維蛋白原制劑的溶解性進(jìn)一步降低。這些方法優(yōu)選以對凍干材料進(jìn)行熱處理的方式實施，例如按照EP0159311的方法。
已知凍干物的重構(gòu)能通過加入某些添加劑得到改善。例如，EP-0345246描述了一種凍干的纖維蛋白原制劑，它除含纖維蛋白原外還至少含一種生物學(xué)上可接受的添加劑(表面活性劑)。表面活性劑加入的結(jié)果是溶劑對凍干物的濕潤性得到改善，因而一定溫度下的溶解速率隨之改善，但纖維蛋白原本身的溶解度不會改變。因此，這類制劑的重構(gòu)也必須在高于25℃通常37℃的環(huán)境溫度下進(jìn)行。
為克服在使用前必須重構(gòu)或液化凍干的或深度冷凍的纖維蛋白原產(chǎn)品，尤其是濃縮制劑的這一缺陷，已經(jīng)介紹了某些在室溫下能溶解的纖維蛋白原制劑。然而，現(xiàn)有技術(shù)的這類產(chǎn)品具有細(xì)胞毒性(Beriplast.Biocol，Bolheal HG-4)。
美國專利No.5,962,405提供了一種貯存穩(wěn)定的、凍干的或深度冷凍的液體纖維蛋白原制劑，它能重構(gòu)或液化成即用型纖維蛋白原和/或組織膠粘劑溶液，——優(yōu)選不用額外的方式如加熱和/或攪拌裝置來產(chǎn)生即用型組織膠粘劑溶液，其中纖維蛋白原的濃度至少為70mg/ml。然而，該制劑包含纖維蛋白原和至少一種能改善制劑的溶解性、和/或降低其液化溫度和降低即用型組織膠粘劑溶液室溫下粘度的其它物質(zhì)。用于增加溶解度的物質(zhì)選自下列物質(zhì)中的一種或多種苯、吡啶、哌啶、嘧啶、嗎啉、吡咯、咪唑、吡唑、呋喃、噻唑、嘌呤化合物或維生素、核堿基、核苷或核苷酸，按0.03-1.4毫摩爾/克纖維蛋白原的比例加入，雖然推薦使用相對更高的增溶物質(zhì)/纖維蛋白原比例。也可存在其它的蛋白、佐劑和添加劑。然而，與以前要求37℃的加溫條件相反，因為其液化的溫度降低，該‘405專利聲稱深度冷凍的纖維蛋白原濃縮溶液在20-23℃(室溫)的環(huán)境溫度下液化是有利的。不過，該方法仍然要求在深度冷凍的條件下(溫度維持在-25℃至-15℃以下)貯存，且制劑的液化還要花費15分鐘。
關(guān)于解決組織密閉劑制劑中纖維蛋白原溶液早期凝固問題的另一種方法，美國專利No.5985315提供了一種包含至少一種活化的凝固因子和纖維蛋白原的穩(wěn)定的生物預(yù)活化的生物膠粘劑，其中凝固因子的活化不依賴于鈣離子。該預(yù)活化的膠粘劑在水溶液中是穩(wěn)定的，即，溶液在20℃的溫度下在至少一小時內(nèi)不會自發(fā)凝固；但簡單地加入鈣離子能使其在約5分鐘內(nèi)凝固。不需要加入另外的活化劑。因而，所得到的生物膠粘劑既不需要加入凝血酶也不需要加入凝血酶原就能凝固。然而不幸的是，這樣慢的凝固時間使該纖維蛋白密閉劑不適于用于任何類型的流血的或搏動的傷口。
因此，從醫(yī)療的觀點看，快速獲得即用型、生物學(xué)的、組織膠粘劑是重要的，尤其在外科的緊急情況下。此外，為了在制備即用型纖維蛋白原密閉劑溶液時使助理人員的負(fù)擔(dān)減至最小，也要求盡可能地減少操作。纖維蛋白密閉劑制劑要求貯存的纖維蛋白原成分，但目前纖維蛋白原只能以凍干物、深度冷凍的濃縮液或以含其它成分的混合物的形式獲得，這些其它成分可能對以纖維蛋白原為基礎(chǔ)的組織膠粘劑有負(fù)面效力或?qū)颊叩陌踩褂糜胁焕绊?。因此，需要一種貯存穩(wěn)定的、即用型人纖維蛋白原溶液，雖然它濃度高，但能以液體的形式獲得，且能快速、簡單地制成用于患者的組織膠粘劑制劑。
發(fā)明概要本發(fā)明包括穩(wěn)定貯存即用型、生物相容性人纖維蛋白原的方法，雖然濃度高，但仍能以液體的形式獲得，且能快速、簡易地加工成組織膠粘劑制劑。本發(fā)明也提供使用該方法制得的無菌的、貯存穩(wěn)定的纖維蛋白原的含水產(chǎn)品，其中纖維蛋白原保持即用的液體形式，它不自發(fā)凝結(jié)(即，甚至在無激活劑如凝血酶/Ca++的存在下形成凝塊)，且能保持其生物活性(即，一旦暴露于凝血酶和Ca++中并與之劇烈混合時能快速形成纖維蛋白凝塊的能力)。所述貯備的、濃縮的、即用型的生物相容性人纖維蛋白原完全溶解，溶液為水溶液，且其穩(wěn)定性是pH和溫度依賴性的。
本發(fā)明的方法提供穩(wěn)定的、濃縮的、即用型、生物相容性的人纖維蛋白原溶液，該溶液在初始制備后至少一天到一年或多年的貯存期內(nèi)能保持其穩(wěn)定性。該產(chǎn)品能被冷凍、解凍、再冷凍和再解凍而不影響組合物的凝結(jié)性質(zhì)。
按照優(yōu)選的方法，本發(fā)明提供即用型纖維蛋白原溶液，該溶液是新鮮制備的、或從血漿中新鮮分離和純化的，或為上述其中一種的冷凍制劑，該溶液在室溫或冷藏(約4℃)以及pH6.32-8.04的條件下無菌保存于適宜的容器中。能保持穩(wěn)定性至少一年或多年。本發(fā)明還進(jìn)一步提供按本發(fā)明的方法保存的即用型、無菌的、穩(wěn)定的纖維蛋白原水溶液。
根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選方法，將蛋白酶抑制劑加入上述即用型纖維蛋白原溶液中以增加其貯存的穩(wěn)定性。在某些實施方案中也可將其它的添加劑或成分加入上述貯備穩(wěn)定的、即用型纖維蛋白原溶液中以增加所得的纖維蛋白原在隨后的應(yīng)用或由其生產(chǎn)的產(chǎn)品或材料中的效力。本發(fā)明進(jìn)一步提供接這類供選擇的方法保存的即用型、無菌的、穩(wěn)定的纖維蛋白原水溶液。
這樣制備和貯存的即用型、人纖維蛋白原的濃溶液可以被中和和使用，而在配制生物組織膠粘劑或密閉劑(包括即溶的纖維蛋白密閉劑制劑)時不需要額外的步驟或程序，并可用于其它藥物或化妝品方面的用途，包括例如傷口愈合、凝血、纖維蛋白原血癥、阻止手術(shù)或手術(shù)后的后遺癥、包埋人工血管、或注輸，也用于體內(nèi)或體外其它的輔助或非輔助的治療或非治療性應(yīng)用。
本發(fā)明的其它目的、優(yōu)點和新的特點將在說明書、實施例和后面的附圖
中部分地闡明，并且部分內(nèi)容對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的或通過本發(fā)明的實踐是可以獲知的。
本發(fā)明優(yōu)選實施方案的描述本發(fā)明提供穩(wěn)定貯存即用型人纖維蛋白原的方法，雖然濃度高但仍能以液體的形式獲得，且能快速和簡單地制成組織膠粘劑制劑。本發(fā)明也提供使用該方法制得的貯存穩(wěn)定的纖維蛋白原水溶液產(chǎn)品。
本發(fā)明即用型纖維蛋白原水溶液是貯存穩(wěn)定的，當(dāng)貯存一段時間后仍能以液態(tài)的形式保持穩(wěn)定，不自發(fā)凝結(jié)(即，甚至在無激活劑如凝血酶/Ca++的存在下形成凝塊)，且保持其生物活性(即，一旦暴露于凝血酶和Ca++中并與之劇烈混合時能快速形成纖維蛋白凝塊的能力)。所公開的方法闡明了人纖維蛋白原以即用型水溶液貯存相當(dāng)長的時間保持活性和穩(wěn)定性(貯存穩(wěn)定)的條件。
本文中所述貯存穩(wěn)定的人纖維蛋白原溶液的“活性”是指蛋白的“生物活性”“生物活性”是指已知的與人纖維蛋白原或其亞群(subset)相關(guān)的一種或多種體內(nèi)和/或體外的活性，例如上面所述的快速形成纖維蛋白凝塊的能力。評估生物活性的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法。
本文中，假如沒有進(jìn)行其它的定義，所有的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語均為本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義。
本發(fā)明的貯存方法可適用于任何的人纖維蛋白原制劑，無論它是從血漿中分離和純化的還是重組制備的，無論是新鮮分離的還是由凍干或深度冷凍的制劑新鮮配制的。不管纖維蛋白原制劑被凍干或深度冷凍的時間有多長，只要這種新鮮制備的纖維蛋白原溶液具有與由血漿中分離和純化的纖維蛋白原對照樣品相等的生物活性且在溶液中沒有被誘導(dǎo)自發(fā)凝結(jié)，均可應(yīng)用本發(fā)明的方法。
本發(fā)明優(yōu)選的實施方案適用于制備過程中的纖維蛋白原粗產(chǎn)品，或適用于具有大于90％的蛋白純度和含大于95％的可凝結(jié)蛋白的最終的纖維蛋白原濃縮制劑，或適用于介于兩者之間任何濃度的纖維蛋白原。例如，在隨后的實施例中，纖維蛋白原制劑具有53％的蛋白純度和95％的可凝結(jié)蛋白，而在發(fā)明人采用非人纖維蛋白原所做的其它實施例(沒有給出數(shù)據(jù))中，制劑具有61％的蛋白純度和97％的可凝結(jié)蛋白。不過，本發(fā)明的方法對兩者均適用。
在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，將貯存方法應(yīng)用到濃縮的人纖維蛋白原制劑中。本發(fā)明的貯存穩(wěn)定的纖維蛋白原制劑盡管是高度濃縮的，但仍能溶于水溶液中，使纖維蛋白原尤其適用于制備補(bǔ)充性或非補(bǔ)充性即用型生物組織膠粘劑。當(dāng)其用于制備即用型組織膠粘劑制劑時，纖維蛋白原理想的貯存濃度為10-85mg/ml，更優(yōu)選的濃度為15-75mg/ml，更優(yōu)選的濃度為30-70mg/ml，最優(yōu)選的濃度為40-65mg/ml。
而且，本發(fā)明貯存穩(wěn)定的水溶液中纖維蛋白原或含纖維蛋白原的蛋白的濃度范圍通常為2-10w/v％，優(yōu)選4-7w/v％。通過蛋白吸收測定法在280nm處測定纖維蛋白原的濃度(用14作為1％的纖維蛋白原溶液的消光系數(shù))。
本發(fā)明貯存穩(wěn)定的纖維蛋白原完全溶解在水溶液中，即，以水為基礎(chǔ)的溶液。制劑的最佳溫度和pH可根據(jù)本發(fā)明獲得，或由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員用已知的方法快速測定。然而，水基凝膠也能用于本發(fā)明中，只要該物質(zhì)能使其中的纖維蛋白原完全溶解，且只要制劑具有足夠的流動性能允許快速制備按本發(fā)明公開方法貯存后的即用型生物組織膠粘劑或其它應(yīng)用。本發(fā)明的關(guān)鍵是纖維蛋白原溶液以即用型的液體形式貯存；它既不以凍干的制劑貯存，也不以深度冷凍的狀態(tài)貯存。
在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，新鮮的纖維蛋白原溶液為自由流動的液體，雖然其粘度典型地比水大，但它能很容易地沿倒立的試管流動。具有生物活性(即，存在凝血酶和Ca離子時凝結(jié))的貯存后樣品本質(zhì)上具有與新鮮的樣品同樣的物理特性。當(dāng)制備并使用組織膠粘劑時，這類凝結(jié)產(chǎn)生由活性纖維蛋白原形成的可控凝塊。為了便于討論，這類凝塊在本文中簡稱“纖維蛋白凝塊”以使這一過程區(qū)別“自發(fā)凝塊”，其中后者可在不穩(wěn)定的纖維蛋白原濃溶液中發(fā)生，甚至在沒有凝血酶或其它激活劑存在時發(fā)生。
然而，本文使用該術(shù)語僅僅是為了將貯存的纖維蛋白原溶液期望的用途與自發(fā)凝塊區(qū)分開，在期望的用途中當(dāng)?shù)攘康睦w維蛋白原與凝血酶/Ca++劇烈混合時纖維蛋白凝塊的快速形成能迅速證明穩(wěn)定貯存的纖維蛋白原溶液的活性，而自發(fā)凝塊是現(xiàn)有技術(shù)中纖維蛋白原溶液不穩(wěn)定性的標(biāo)志。在已知的現(xiàn)有技術(shù)中，新鮮制備的人纖維蛋白原水溶液是極不穩(wěn)定的且在貯存時傾向于自發(fā)形成凝塊，這一事實使得用先前認(rèn)識到的方法以即用型液體形式貯存纖維蛋白原即使一天或兩天也不現(xiàn)實。
“自發(fā)凝結(jié)”被認(rèn)為是人纖維蛋白原水溶液制劑的粘度增加(沒有暴露在激活劑如凝血酶和Ca離子中)，導(dǎo)致混合時可見的移動性(流動性)降低。該過程是不可逆的，使得纖維蛋白原在如制備纖維蛋白密閉劑時毫無用處。在現(xiàn)有技術(shù)中新鮮制備的纖維蛋白原的水溶液通常在低于1天的時間內(nèi)，常只在幾個小時或更短的時間內(nèi)發(fā)生自發(fā)凝結(jié)。這種不穩(wěn)定性使得纖維蛋白原用現(xiàn)有的方法以即用型形式貯存的時間完全不可預(yù)測，因而不可靠。
在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，貯存穩(wěn)定的纖維蛋白原貯存在聚合物、塑料或以塑料為基礎(chǔ)的容器中，雖然更優(yōu)選的塑料容器是聚丙烯。不用玻璃貯存纖維蛋白原或血小板，因為玻璃能促進(jìn)自發(fā)凝結(jié)的形成。
加入凝血酶和鈣離子并劇烈攪拌也不結(jié)塊的即用型人纖維蛋白原的貯存溶液，稱為“凝血酶不敏感”。這類凝血酶不敏感的制劑保持流體的形式(具有與水相似的粘度)。然而，用SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)對這類凝血酶不敏感的制劑樣品的分析顯示，纖維蛋白原蛋白不可逆地降解為小分子量的片段。因而這類制劑不再含有活性的纖維蛋白原，它不是本發(fā)明的主題。
將凝血酶/Ca++加入到即用型纖維蛋白原溶液中后，可觀察到粘度的迅速增加和液體的流動性下降，稱之為“凝膠”。在凝膠狀態(tài)下，纖維蛋白原溶液不再自由流動，但攪動能迫使其流動。雖然這種測定具有主觀性，但其估計誤差只有±2秒。
“凝塊”是纖維蛋白原溶液的突然固化形成的，此后攪動也不能使液體從固化的物質(zhì)中流出。這種不流動的物質(zhì)通常變成肉眼可觀察到的不透明白色并具有粘塑性。例如，典型的生理或非生理的纖維蛋白凝塊的電子掃描顯微(SEM)照片由Redl等發(fā)表在Medizinische Welt 36769-76(1985)中。凝塊通常粘附在試管壁上，在固體表面上急劇輕敲試管也不能使其移走。這樣的測量方法與凝膠的形成相比受主觀性影響小，且估計的不確定性對于快速凝固的樣品(8-12秒)只有±1秒，雖然對于凝結(jié)較慢的樣品(＞100秒)可能略高些。
溶液的貯存溫度沒有特別嚴(yán)格的限制，只要其中所含的纖維蛋白原保持穩(wěn)定即可(即，既不失活也不自發(fā)凝結(jié))。本發(fā)明纖維蛋白原溶液優(yōu)選的貯存溫度范圍為1至25℃，更優(yōu)選約4至約23℃。冷藏時，最佳溫度為約4℃±1℃。當(dāng)在室溫貯存時，理想的溫度范圍為約20至25℃，更優(yōu)選約22至24℃，最優(yōu)選約23℃±1℃。
為評估冷凍后凝塊形成的效力，在試驗前將纖維蛋白原溶液的樣品也進(jìn)行冷凍和解凍，研究表明一個或多個冷凍/融解循環(huán)似乎不會對人纖維蛋白原溶液的凝結(jié)能力產(chǎn)生負(fù)面影響，即使在冷凍前在4℃下貯存了5個月。同時，這些數(shù)據(jù)充分表明很容易配制保存期限為至少一年的纖維蛋白原液體產(chǎn)品，假如液態(tài)纖維蛋白原制備初期就冷凍，可能還會增加幾年的保存期。
貯存期間優(yōu)選將纖維蛋白原水溶液的pH值調(diào)節(jié)為約pH5-8，更優(yōu)選pH6.2-7.5。具體的纖維蛋白原溶液貯存的最佳pH值部分地依賴于該物質(zhì)的貯存溫度，這一點顯示在實施例所附的表中。然而，從本發(fā)明提供的信息看，知道決定因素是其中所含的蛋白質(zhì)是否保持穩(wěn)定(即，既不失活也不自發(fā)凝結(jié))，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠根據(jù)計劃的貯存溫度和條件選擇最佳的纖維蛋白原溶液的pH值。
例如，即用型人纖維蛋白原在室溫(約23℃)貯存(不含蛋白酶抑制劑)的理想pH為6.3-7.1，優(yōu)選的pH約為6.32，以保持貯存后的制劑被中和和暴露于凝血酶/Ca++中時快速形成凝塊的能力。當(dāng)即用型人纖維蛋白原(不含蛋白酶抑制劑)在冷藏溫度(約4℃)貯存時，理想pH為6.32-8.0，優(yōu)選約pH6.3-7.5以保持貯存后的制劑在被中和和暴露于凝血酶/Ca++中時快速形成凝塊的能力(參見表1)。
貯存穩(wěn)定的人纖維蛋白原溶液的pH由其中的緩沖液決定。例如，在后面的實施例中，在以下的一種0.1M緩沖液中新鮮制備人纖維蛋白原溶液(40mg蛋白/mL)組氨酸，pH為6.0或7.2；三羥甲基氨基甲烷，pH為8.16；甘氨酸，pH為9.3；或碳酸鹽，pH為9.1或9.9。
在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，在組氨酸緩沖液中制備貯存穩(wěn)定的人纖維蛋白原溶液，雖然已經(jīng)認(rèn)識到的、本領(lǐng)域技術(shù)中已知的生理上可接受的其它緩沖液也可以用于制備貯存穩(wěn)定的纖維蛋白原，只要所得的纖維蛋白原溶液的pH維持在上述規(guī)定范圍內(nèi)，這樣能維持其活性但又不自發(fā)凝結(jié)。
目前市售的纖維蛋白原含有在分離和純化過程中使用的鹽。正如實施例中提到的，其包括檸檬酸鈉和氯化納，但純化過程中殘留鹽的存在似乎不會影響所得制劑的貯存穩(wěn)定性。既然本發(fā)明的目的是生產(chǎn)貯存穩(wěn)定的、即用型人纖維蛋白原溶液，它能保持與新鮮制備的人纖維蛋白原溶液相當(dāng)?shù)奶匦?，所以纖維蛋白原的純化過程對兩者的影響是相同的。不過，高濃度的檸檬酸鹽和/或鈉可能影響貯存后的纖維蛋白原制劑的凝結(jié)。因此，即使鑒定到的鹽或其它螯合劑存在于新鮮制備的溶液中，本發(fā)明的方法也是有效的，并且只要在貯存期間保持其活性和不被鹽或螯合劑誘導(dǎo)自發(fā)凝結(jié)，該貯存穩(wěn)定的制劑將保持與新鮮制備的溶液相當(dāng)?shù)奶匦院突钚浴?br> 后面的實施例中，將疊氮化鈉(0.025％)作為抗微生物劑加入每份樣品中。雖然該抗微生物劑從某種程度上可能誘導(dǎo)自發(fā)凝結(jié)，但它似乎還沒有表現(xiàn)出這種效果。在本發(fā)明優(yōu)選的一個實施方案中，沒有加入抗微生物劑，而用已知的技術(shù)保持無菌。然而，在另一實施方案中，根據(jù)例子中給出的程度加入了抗微生物劑以避免纖維蛋白原溶液在長時間的貯存期間受到微生物污染。任何已知的、生理學(xué)上的抗微生物劑對本發(fā)明來說都是可接受的，只要在整個貯存期間能保持纖維蛋白原溶液的活性，不誘導(dǎo)自發(fā)凝結(jié)，且該試劑不會對人的應(yīng)用有相反的作用。
本發(fā)明貯存穩(wěn)定的人纖維蛋白原溶液可以補(bǔ)充下列物質(zhì)，并可用作這類物質(zhì)的載體媒介生長因子、藥物或其它化合物或其混合物，只要上面提到的在整個貯存期間能保持纖維蛋白原溶液的活性且不誘導(dǎo)自發(fā)凝結(jié)。例如，當(dāng)即用型纖維蛋白原用于制備纖維蛋白密閉劑或組織膠粘劑制劑時，可向纖維蛋白原制劑中補(bǔ)充生長因子以加速、促進(jìn)、或改善傷口的愈合、組織的再生。這樣的補(bǔ)充制劑也可以含有其它的成分，例如藥物、抗體、抗凝劑和其它化合物(1)用于增強(qiáng)、刺激或介導(dǎo)生長因子或其它添加劑或成分的生物活性的化合物；(2)用于降低補(bǔ)充有生長因子的人纖維蛋白原或纖維蛋白密閉劑或組織膠粘劑中一種或多種添加劑或成分的活性的化合物，其中該活性會抑制或破壞制劑中的生長因子；(3)能從制劑中長期運輸添加劑或成分的化合物，所述制劑例如由本發(fā)明纖維蛋白原溶液制得的纖維蛋白密閉劑或組織膠粘劑；(4)具有其它期望性質(zhì)的化合物。所考慮的添加劑或補(bǔ)充劑還包括它們的任何突變體、衍生物、縮截物或其它由其修飾的形式、或其亞群，它們具有與它們所衍生自的化合物或組合物相似的生物活性。
一種以上的添加劑或成分可以同時添加或補(bǔ)充到本發(fā)明貯存穩(wěn)定的纖維蛋白原溶液中。雖然纖維蛋白原溶液中這樣的添加劑或成分的濃度隨其目的而變化，但其濃度必須足以使這些化合物和/或組合物完成其預(yù)期的或所述的目的。添加的這類補(bǔ)充劑的量可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員憑經(jīng)驗決定，通過試驗多種濃度而選擇對預(yù)期的目的和應(yīng)用部位有效的量。例如，也可加入染料、示蹤物、標(biāo)示物等，以檢查加入了纖維蛋白原的材料隨后的運輸。
本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，在貯存前將有效量的蛋白酶抑制劑(PI)，比如但不限于抑酶肽(例如，5μg/mL的終濃度)或PPACK(例如，25μM的終濃度)加入到貯存的人纖維蛋白原水溶液中。其它蛋白酶抑制劑(PI)為本領(lǐng)域已知，也可代替實施例中公開的抑酶肽和PPACK。值得注意的是，所用的抑酶肽是市售的Tisseal產(chǎn)品。蛋白酶抑制劑的“有效量”是指能抑制纖維蛋白原樣品蛋白水解的PI量。此量將根據(jù)所用的PI或PI的組合而變化，但很容易由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定。然而，雖然在PI存在時所貯存的纖維蛋白原溶液可長時間保持穩(wěn)定，但已經(jīng)知道PI的效力會隨時間而衰減。
例如，雖然向貯存穩(wěn)定的人纖維蛋白原中加入PI抑制了在約4℃長期貯存的蛋白中形成不期望的自發(fā)凝塊，但PI的加入似乎不會因為殘留的抑制劑活性而對產(chǎn)生快速的纖維蛋白原/凝血酶產(chǎn)物(纖維蛋白凝塊)有影響。該產(chǎn)品在最低的pH值貯存7天后不用測試。然而，在室溫(約23℃)pH6.3-7.0保存至少149天后的貯存穩(wěn)定的人纖維蛋白原溶液樣品中可以觀察到測試樣品中纖維蛋白原/凝血酶凝塊迅速形成。
如表1和表2中顯示的，“抑制”的含義等同于“阻止”，即PI最初在本發(fā)明公開的條件下是有活性的(即，凝結(jié)被抑制/阻止)，但接著其活性衰減，隨后其抑制活性逐漸消失并最終停止。纖維蛋白原溶液中PI活性的衰減速率依賴于pH和溫度。
本發(fā)明隨后的實施例通過連續(xù)的觀察和試驗表明本發(fā)明的纖維蛋白原溶液在優(yōu)選的條件下(有活性且不自發(fā)凝結(jié))，貯存在室溫(約23℃)或冷藏溫度(約4℃)，在pH6.3-8.0時能保持穩(wěn)定至少97天，在pH6.3時能保持穩(wěn)定至少149天。在存在蛋白酶抑制劑時，盡管沒有進(jìn)行更長時間的試驗，人纖維蛋白原制劑貯存在約23℃時能保持貯存穩(wěn)定至少22天。因此，本發(fā)明優(yōu)選實施方案中的人纖維蛋白原溶液在室溫下不管是否存在PI都能保持穩(wěn)定多年。
從已證實的至少149天的穩(wěn)定性看，與已知的深度冷凍的或凍干的沒有顯著失去活性(即，在混合時仍迅速形成纖維蛋白原/凝血酶纖維蛋白凝塊)的蛋白濃縮制劑相比，表明該產(chǎn)品在極長的時間內(nèi)甚至在纖維蛋白原產(chǎn)品最初貯存后的幾年仍是穩(wěn)定的。因此，“長期貯存”是指即用型人纖維蛋白原溶液在本申請公開的條件下沒有顯著失去活性地貯存至少3天，優(yōu)選至少3周，更優(yōu)選至少13周，更優(yōu)選至少149天，更優(yōu)選至少1年，最優(yōu)選多于1年。此外，該術(shù)語除以即用型形式貯存外還包括冷凍貯存的時間，這使產(chǎn)品的貯存期額外增加了幾年。
本發(fā)明的制劑是“人”纖維蛋白原，但本發(fā)明的方法也適用于穩(wěn)定貯存源自其它物種的即用型纖維蛋白原的水溶液，最優(yōu)選的是其它哺乳動物。另一方面，哺乳動物中使用貯存的人纖維蛋白原似乎沒有出現(xiàn)物種相容性的問題。例如，人纖維蛋白原在以水溶液的形式貯存后可以用來制備，如生物相容的可用于任何哺乳動物物種的組織膠粘劑制劑。然而，可以理解本發(fā)明的人纖維蛋白原制劑的有利應(yīng)用還是將其即用型制劑用于人類受試者。
作為血漿蛋白，纖維蛋白原通常伴有被血液傳播性病原體(如那些可能污染人血漿蛋白的病原體，尤其是肝炎病毒或HIV)污染的危險。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易制備纖維蛋白原以除去可能的感染物。通常實現(xiàn)該目的的技術(shù)包括但不限于超濾、巴氏滅菌(加熱)、溶劑去污劑處理、放射照射和紫外線處理。盡管通過高溫加熱或蒸汽的方法使病毒失活對于生物活性的蛋白溶液(包括本發(fā)明的纖維蛋白原溶液)是不實際的，但納米過濾對于本發(fā)明的人纖維蛋白原溶液置入無菌貯存容器之前是一種可選擇的處理方法。
不過，雖然纖維蛋白原對熱不穩(wěn)定因而在常規(guī)的液體加熱過程中易失活，但已開發(fā)出加熱纖維蛋白原使任何潛在的污染病毒，如肝炎病毒或HIV失活，而不使纖維蛋白原本身失活的技術(shù)。美國專利No.5,116,950(Miyano等，1992年5月26日發(fā)表)提供了加熱纖維蛋白原的方法，該方法包括在至少一種糖、氨基酸和鎂鹽存在下加熱含纖維蛋白原的水溶液，直到使可能污染所述纖維蛋白原的病毒失活。
在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，如有需要，這種加熱過的纖維蛋白原的水溶液可以用常規(guī)的方法如透析、滅菌或過濾進(jìn)一步純化和處理。也能通過本領(lǐng)域已知的方法運用多種洗滌步驟除去穩(wěn)定性的添加劑。
本發(fā)明的纖維蛋白原溶液理想地適于在暴露于激活劑溶液中時形成一種生理纖維蛋白結(jié)構(gòu)并迅速形成纖維蛋白凝塊。這可以通過將貯存的纖維蛋白原溶液與等體積的凝血酶/CaCl2溶液(包含，如2.5單位凝血酶/mg纖維蛋白原(100單位/ml)和過量于檸檬酸鹽和可加入到溶液中的其它螯合劑3-6mM的CaCl2)混合得到證實，這一點在隨后的實施例中闡明。如果所得的凝塊顯示出生理的纖維蛋白結(jié)構(gòu)，當(dāng)凝血酶在生理條件下(即，在離子強(qiáng)度約為0.15和pH約為中性的條件下)作用于新鮮制備或新鮮分離和純化的人纖維蛋白原而形成凝塊時，凝塊將顯示出典型的、立體支化的原纖維結(jié)構(gòu)。
纖維蛋白原和凝血酶的濃度決定凝塊形成的時間、凝塊的強(qiáng)度、凝塊的粘著性和其止血作用。
而且，根據(jù)本發(fā)明的纖維蛋白原制劑和/或其所要加入的基于纖維蛋白原的組織膠粘劑在用作組織膠粘劑時沒有細(xì)胞毒性，即，它是“生物相容的”，這意味著它能被細(xì)胞很好地耐受、允許細(xì)胞的良好生長并為傷口的良好愈合提供理想的先決條件。這已經(jīng)通過用等體積的半等滲或等滲的氯化納溶液稀釋組織膠粘劑并加入到成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基中得到證實。沒有檢測到對成纖維細(xì)胞的破壞作用(參見Redl等，1985)。
因此，以能滿足組織膠粘劑所有要求的方式制備本發(fā)明的貯存穩(wěn)定、即用型人纖維蛋白原溶液，即具有生物相容性、病毒安全性和高粘附強(qiáng)度，并且它具有可由即用型人纖維蛋白原產(chǎn)品快速和簡單配制的優(yōu)點。可以任何已知的方式應(yīng)用由本發(fā)明貯存穩(wěn)定的人纖維蛋白原制備的組織膠粘劑，用于使用生物學(xué)制備的、補(bǔ)充或非補(bǔ)充的組織膠粘劑如藥物或化妝品方面的用途，包括用于輸液如抗生素、抗腫瘤藥、麻醉劑等的輸送；用于傷口愈合、凝血和纖維蛋白原血癥；用于抑制手術(shù)或手術(shù)后后遺癥；用于包埋假肢；用于可敷性傷口封閉和用于安全持續(xù)的止血，即封閉流體和/或空氣泄漏等，以及病人身上的類似用途。
本發(fā)明進(jìn)一步用實施例加以描述。然而，這些實施例的目的是作為示范性的例子提供給本領(lǐng)域的技術(shù)人員，而不是將本發(fā)明限于這些實施例。而且，不能認(rèn)為這些實施例限定了所附權(quán)利要求的范圍。因此，絕不能認(rèn)為本發(fā)明限于下面的實施例，但可以認(rèn)為本發(fā)明包括了任何和所有根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)來說是顯而易見的變化。
實施例為了評估本發(fā)明的纖維蛋白原溶液的貯存穩(wěn)定性，在包含不同的緩沖液(pH值)、溫度和添加劑如蛋白酶抑制劑的一定范圍的貯存條件下對纖維蛋白原溶液的穩(wěn)定性、溶解性和凝結(jié)活性進(jìn)行了評估。牛纖維蛋白原、牛凝血酶、抑酶肽、緩沖溶液、氯化鈣、氫氧化鈉和鹽酸購自Sigma Chemical公司，St.Louis，MO。PPACK由Calbiochem，San Diego，CA提供。人纖維蛋白原經(jīng)檢驗含有53％的蛋白(95％是可凝結(jié)的)和47％的鹽。
標(biāo)準(zhǔn)研究等級的纖維蛋白原包含分離和純化過程中使用的鹽。它包括檸檬酸鈉和氯化納。因而，例如，40mg/ml的纖維蛋白原溶液除含纖維蛋白原外還含有54mM檸檬酸鈉和419mM氯化鈉。此外，疊氮化鈉(0.025％)作為抗微生物劑加入到每份樣品中。
以下列方式完成凝結(jié)分析，基本與Kasper，Proc.Symposium on RecentAdvances in Hemophilia Care，Los Angeles，CA，1989年4月13-15日(in Liss，New York，1990)所述方法一致。將等份量(100μl)的每一纖維蛋白原樣品加入到4ml的聚丙烯試管中。每份樣品用0.1M的氫氧化鈉、0.2M的組氨酸緩沖液(pH6.0)或0.1M的鹽酸中和(pH7.0-7.3)(用較大的體積在初始研究階段測定)。凝血酶按200單位/ml與1M氯化鈣一起配制(其中鈣比纖維蛋白原制劑中的檸檬酸納過量3-6mM)。然后將凝血酶制劑用0.1M的組氨酸緩沖液(pH7.2)稀釋至凝血酶的終濃度為100單位/ml(25單位的凝血酶/mg纖維蛋白原)。所有的樣品均在室溫下檢測(23±2℃)。
將100μl的凝血酶加入到纖維蛋白原樣品(100μl)中，并將混合物劇烈混合，記錄所發(fā)生反應(yīng)的時間來對凝結(jié)進(jìn)行測量。記尿溶液變?yōu)檎承阅z體(液體混合時突然變慢)和變?yōu)楣腆w凝塊的時間(混合時所有液體流動停止的時間點)。固體凝塊形成的時間通常是膠體形成時間的兩倍。
為評估纖維蛋白原水溶液長時間的貯存能力，在以下條件貯存149天(超過21周)對人纖維蛋白原溶液的穩(wěn)定性、溶解性和凝結(jié)活性進(jìn)行評估一定范圍內(nèi)的5個pH值(pH6.30-pH9.8)、含有或不含蛋白酶抑制劑(PI)、室溫(約23℃)和冷藏溫度(約4℃)。在貯存的第1天在以下的一種0.1M緩沖液中新鮮制備雙份的人纖維蛋白原溶液(40mg蛋白/ml)組氨酸pH6.0或7.2；三羥甲基氨基甲烷pH8.16；甘氨酸pH9.3；或碳酸鹽pH9.1或9.9。在貯存前將蛋白酶抑制劑PPACK(最終濃度為25μM)和抑肽酶(最終濃度為5μg/ml)加入到該雙份溶液的一半溶液中。
為評估凝結(jié)能力，將樣品按前述預(yù)定的方案中和，然后按上面描述的方法測試。
表1和表2顯示了所給條件下人纖維蛋白原的凝結(jié)測試結(jié)果。
表1.不含蛋白酶抑制劑的人纖維蛋白原在23℃和4℃貯存的凝結(jié)時間
NT＝?jīng)]有測試?！澳Y(jié)”是指未加入凝血酶時的自發(fā)凝結(jié)。
表2.含蛋白酶抑制劑的人纖維蛋白原在23℃和4℃貯存的凝結(jié)時間
NT＝?jīng)]有測試。
所有在室溫下貯存的人纖維蛋白原樣品都是清澈的且不含自發(fā)凝塊。冷藏的人纖維蛋白原樣品(約4℃)也是清澈的并不含自發(fā)凝塊(除在測試的最高pH值的某個時間點有一無關(guān)的響應(yīng))。
然而，在室溫下貯存97天后，只有在pH6.32的人纖維蛋白原樣品保持了凝結(jié)能力。通過比較，在約4℃，pH6.32、pH7.13和pH8.04貯存97天后的人纖維蛋白原還能結(jié)塊(9-11秒，相當(dāng)于新鮮制備的對照品)。
在更深入的分析中，在pH約7.1于4℃下保存整一年的穩(wěn)定貯存的人纖維蛋白原樣品仍保持可溶性且完全能凝結(jié)(用凝血酶激活)。根據(jù)前述和我們的其它數(shù)據(jù)(沒有給出)，表明纖維蛋白原液體制劑在pH約6.3時將進(jìn)一步增加產(chǎn)品的穩(wěn)定性。
在存在PI時，室溫下，只有pH7.13的人纖維蛋白原樣品凝結(jié)(pH6.32的樣品已經(jīng)蒸發(fā)，不能被測試)。約4℃存在PI時，所有的人纖維蛋白原樣品保持凝結(jié)能力，但速度慢。結(jié)塊的能力減弱可能是由于纖維蛋白原溶液中PI殘留的能力抑制了加入的凝血酶。然而，由于PI成分也隨時間而衰減，含PI(PPACK或抑酶肽)的樣品在約23℃或約4℃下貯存后評估的結(jié)果顯示出pH的依賴性。
凝結(jié)能力的減弱似乎是由于纖維蛋白原溶液中PI殘留的能力抑制了加入的凝血酶。因此，在約4℃的短期貯存(4-22天)基本上抑制了凝血酶依賴性的凝結(jié)，即，加入凝血酶后樣品不凝結(jié)，因為凝血酶的活性被溶液中殘留的PI抑制劑所抑制。然而，因為PI成分隨時間而衰減，其活性也隨之下降。在較長時間(22-149天)的貯存后，PI的活性已經(jīng)衰減，因而允許加入凝血酶以引發(fā)纖維蛋白原樣品凝結(jié)。再者，該反應(yīng)是pH依賴性的。
可得出這樣的結(jié)論在pH范圍為6.32-8.04且不含蛋白酶抑制劑的情況下，冷藏(約4℃)貯存至少149天后，人纖維蛋白原在水溶液中還能完全溶解并保持凝結(jié)的能力。如果在加入凝血酶之前該貯存穩(wěn)定的制劑保存在(4℃)下，在pH7.13-8.04條件下貯存至少149天后，活性的(可凝結(jié)的)人纖維蛋白原也能得到恢復(fù)。
前面說明書中引用的各專利、專利申請和專利公開的內(nèi)容在此全文引入作為參考。
有關(guān)某些優(yōu)選的實施方案前面的說明書已作了描述，作為示范還闡明了許多詳細(xì)的內(nèi)容，在本領(lǐng)域技術(shù)人員看來，似乎可以對本發(fā)明進(jìn)行多種修改并運用其它的實施方案，本文中某些具體的細(xì)節(jié)可在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下進(jìn)行相當(dāng)大的變化，這些修改、等同的變化和額外的實施方案也落入在所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.貯存穩(wěn)定的、濃縮的、即用型、生物相容的人纖維蛋白原溶液，其中纖維蛋白原溶液的穩(wěn)定性是pH和溫度依賴性的。
2.權(quán)利要求1的纖維蛋白原溶液，其中纖維蛋白原是完全溶解的、且溶液為水溶液。
3.權(quán)利要求1或2之一的纖維蛋白原溶液，其中保持穩(wěn)定性的貯存期可從初始制備后的至少1天到一年或多年。
4.權(quán)利要求1-3之一的纖維蛋白原溶液，其中纖維蛋白原溶液包括選自組氨酸、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸或碳酸鹽的控制pH的緩沖液。
5.權(quán)利要求1-4之一的纖維蛋白原溶液，其中將溶液緩沖至pH6.53-8.04、貯存溫度維持在約4℃的冷藏溫度。
6.權(quán)利要求1-5之一的纖維蛋白原溶液，其中貯存的緩沖液為組氨酸。
7.權(quán)利要求1-6之一的纖維蛋白原溶液，其中穩(wěn)定性保持至少約7天。
8.權(quán)利要求1-6之一的纖維蛋白原溶液，其中穩(wěn)定性保持至少22天。
9.權(quán)利要求1-6之一的纖維蛋白原溶液，其中穩(wěn)定性保持至少97天。
10.權(quán)利要求1-6之一的纖維蛋白原溶液，其中穩(wěn)定性保持至少149天。
11.權(quán)利要求1-6之一的纖維蛋白原溶液，其中穩(wěn)定性保持至少一年。
12.權(quán)利要求1-4之一的纖維蛋白原溶液，其中將溶液緩沖至pH6.3-8.04、貯存溫度維持在室溫。
13.權(quán)利要求12所述的纖維蛋白原溶液，其中貯存的穩(wěn)定性維持至少22天。
14.權(quán)利要求12所述的纖維蛋白原溶液，其中貯存的pH值維持在約pH6.3至少97天。
15.以即用型、水溶液形式穩(wěn)定貯存人纖維蛋白原的方法，包括在無菌的條件下，制備新鮮制得的纖維蛋白原溶液或從血漿中新鮮分離和純化纖維蛋白原溶液或由冷凍的纖維蛋白原制劑配制纖維蛋白原溶液；和在冷藏溫度下貯存纖維蛋白原溶液，其中纖維蛋白原溶液保持在液態(tài)、pH6.32-8.04和能維持纖維蛋白原的生物相容性和生物活性的條件下。
16.權(quán)利要求15所述的纖維蛋白原溶液，進(jìn)一步包括在初始制備后至少1天到一年或多年的貯存期內(nèi)保持穩(wěn)定。
17.權(quán)利要求15-16之一的方法，其中冷藏溫度維持在約4℃。
18.權(quán)利要求15-17之一的方法，其中穩(wěn)定性保持至少7天。
19.權(quán)利要求15-17之一的方法，其中穩(wěn)定性保持至少22天。
20.權(quán)利要求15-17之一的方法，其中穩(wěn)定性保持至少97天。
21.權(quán)利要求15-17之一的方法，其中穩(wěn)定性保持至少149天。
22.權(quán)利要求15-17之一的方法，其中穩(wěn)定性保持至少一年。
23.權(quán)利要求15-22之一的方法，其中纖維蛋白原制劑在制成穩(wěn)定的、即用型纖維蛋白原水溶液之前被冷凍、然后解凍并再冷凍至少一次。
24.以即用型、水溶液形式穩(wěn)定貯存人纖維蛋白原的方法，包括在無菌的條件下，制備新鮮制得的纖維蛋白原溶液或從血漿中新鮮分離和純化纖維蛋白原溶液或由冷凍的纖維蛋白原制劑配制維蛋白原溶液；和在室溫、pH6.32-8.04和能維持纖維蛋白原的生物相容性和生物活性的條件下貯存纖維蛋白原溶液，
25.權(quán)利要求24所述的纖維蛋白原溶液，進(jìn)一步包括在初始制備后至少1天到一年或多年的貯存期內(nèi)保持穩(wěn)定。
26.權(quán)利要求24-25之一的方法，其中溫度維持在約23℃。
27.權(quán)利要求24-26之一的方法，其中穩(wěn)定性保持至少7天。
28.權(quán)利要求24-26之一的方法，其中穩(wěn)定性保持至少22天。
29.權(quán)利要求24-26之一的方法，其中穩(wěn)定性保持至少97天。權(quán)利要求24-26之一的方法，其中穩(wěn)定性保持至少一年。
全文摘要
本發(fā)明提供穩(wěn)定貯存即用型、生物相容的人纖維蛋白原的方法，盡管該纖維蛋白原濃度高，但它能以液體的形式獲得，且能長期快速、簡單地制成組織膠粘劑的制劑。本發(fā)明也提供由該方法制得的無菌的、貯存穩(wěn)定的纖維蛋白原水溶液產(chǎn)品，其中纖維蛋白原長期保持即用型的液態(tài)形式，它不自發(fā)凝結(jié)(即，在不存在激活劑如凝血酶/Ca
文檔編號A61P17/02GK1599616SQ02824195
公開日2005年3月23日 申請日期2002年10月3日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月3日
發(fā)明者克里斯托弗·J·伍爾弗頓 申請人:克里斯托弗·J·伍爾弗頓